CN109055345A - 一种兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶及应用 - Google Patents

一种兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶及应用，涉及生物化学领域，用于提升热稳型碳酸酐酶的CO2催化转化活性，本发明将人的碳酸酐酶II的65位的丙氨酸、198、202位和203位的亮氨酸，243位天冬酰胺、244位组氨酸和245位精氨酸中的一个或一个以上进行突变，突变位点为一个或一个以上，操作步骤为：首先对碳酸酐酶结构的性质进行分析，在此基础上对残基进行突变，构建含有目的基因的载体，然后对蛋白进行表达，分离纯化和复性，最后对酶活进行测定，本发明可有效提高在高温条件下CO2捕集转化效率。

Description

一种兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶及应用
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶及应用。
背景技术
碳酸酐酶(CA)是含Zn2+的金属酶，可将CO2催化转化为HCO3-的水合酶催化剂。CO2的水合可逆反应在没有催化剂存在的条件下非常缓慢，相反，在碳酸酐酶存在的条件下，CO2的水合可逆反应速率可以从15秒提升到每秒106个反应。正是由于CA具备高效专一、环境友好等特点，近年来利用碳酸酐酶的CO2捕集技术受到越来越多的重视。
在CO2吸附过程中使用人碳酸酐酶II可以大幅降低化学吸附解析过程的能源消耗，但过程中的高温工作环境、体系内重金属离子的存在都对人碳酸酐酶II的稳定性和活性产生极大影响，严重制约其应用。同通常人CAII的失活温度在50℃左右，在此温度下停留15分钟后酶活几乎完全消失。而对于CO2吸附，通常操作温度是在50℃,甚至以上，因此人碳酸酐酶II不能满足使用要求。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶及应用，以氨基酸作基本单元对人碳酸酐酶II进行突变改造，以获得具备构建高活性的高温碳酸酐酶。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶，将人碳酸酐酶II的65位的丙氨酸、198、202位和203位的亮氨酸，243位天冬酰胺、244位组氨酸和245位精氨酸中的一个或一个以上进行突变。
优选地，所述65位丙氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
优选地，所述198的亮氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
优选地，所述202位的亮氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
优选地，所述203位的亮氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
优选地，所述243位天冬酰胺由谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
优选地，所述244位组氨酸由谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、酪氨酸或苏氨酸中的一种取代。
优选地，所述245位的精氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、酪氨酸、苏氨酸或赖氨酸中的一种取代。
上述兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应。
(三)有益效果
本发明提供了一种兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶及应用，具有以下有益效果：
针对现有技术中，碳酸酐酶在实际应用上，无法在高温环境下保持酶活性的问题，本发明通过使用氨基酸作基本单元，对人碳酸酐酶II进行突变改造，得到改性人碳酸酐酶II，使其在50-70℃的高温下仍然能保持一定的酶活性，充分满足促进CO2水合可逆反应的需要。
同时，在低温下具有高活性，酶活是现有技术中的普通碳酸酐酶的10倍。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)将人碳酸酐酶的65位的丙氨酸203位亮氨酸进行突变，由谷氨酸和赖氨酸取代。
(2)根据目的基因设计引物后提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)暴露在50℃下15分钟后进行酶活测试，酶活保持率达到100％。
实施例2：
(1)将人碳酸酐酶的202位的亮氨酸和243位的天冬酰胺进行突变，由精氨酸氨酸和苏氨酸取代。
(2)根据目的基因设计引物，提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.5mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)暴露在55℃下保存1h后进行测试碳酸酐酶的酶活，酶活保持率为100％。
实施例3：
(1)将人碳酸酐酶的198位亮氨酸和245位的甘氨酸进行突变，由精氨酸和甘氨酸取代。
(2)根据目的基因设计引物后并提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.6mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)暴露在60℃保存1h后进行测试碳酸酐酶的酶活，酶活保持率为98％。
实施例4：
(1)将人碳酸酐酶的243位天冬酰胺和65位丙氨酸进行突变，分别由甘氨酸和苏氨酸进行取代。
(2)根据目的基因设计引物后从BacillusClausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.5mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)暴露在37℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应，突变型碳酸酐酶的酶活是为野生型人碳酸酐酶II的10倍。
实施例5：
(1)将人碳酸酐酶的203位亮氨酸进行突变，由赖氨酸取代。
(2)根据目的基因设计引物，提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)暴露在60℃保存15天后进行测试碳酸酐酶的酶活，酶活保持率为75％
实施例6：
(1)将人的碳酸酐酶的198位亮氨酸和245位精氨酸进行突变，由天冬氨酸和酪氨酸取代。
(2)根据目的基因设计引物后提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)暴露在37℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应，经计算得出，突变体的碳酸酐酶水合转化速率是野生型的10倍。
实施例7：
(1)将人碳酸酐酶的203位亮氨酸和245位精氨酸进行突变，由精氨酸和谷氨酰胺取代。
(2)根据目的基因设计引物后，提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)暴露在50℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合反应，经计算得出，野生型无水和合能力，突变型的CO2的水合能力维持了90％。
实施例8：
(1)将人碳酸酐酶的243位天冬氨酸进行突变，由谷氨酸取代。
(2)根据目的基因设计引物，提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)暴露在60℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合反应，经计算得出，突变型的CO2的水合能力维持了80％。
实施例9：
(1)将人的碳酸酐酶的65位、202位和244位的丙氨酸、亮氨酸和组氨酸进行突变，由谷氨酸、苏氨酸氨酸和丝氨酸分别取代。
(2)根据目的基因设计引物后从提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)暴露在70℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合反应，经计算得出，突变型的CO2的水合能力维持了68％。
实施例10：
(1)将人的碳酸酐酶的65位、203位和243位的丙氨酸、亮氨酸和位天冬酰胺进行突变，由谷氨酸、苏氨酸氨酸和谷氨酰胺分别取代。
(2)根据目的基因设计引物后从提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
(3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
(4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
(5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
(6)在50℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合反应，经计算得出，突变型的CO2的水合能力维持了70％。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，包括语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶，其特征在于，将人碳酸酐酶II的65位的丙氨酸、198、202位和203位的亮氨酸，243位天冬酰胺、244位组氨酸和245位精氨酸中的一个或一个以上进行突变。
2.如权利要求1所述的兼具热稳定性和高活性的碳酸酐酶，其特征在于，所述65位丙氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
3.如权利要求1所述的具热稳定性和高活性的碳酸酐酶，其特征在于，所述198的亮氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
4.如权利要求1所述的具热稳定性和高活性的碳酸酐酶，其特征在于，所述202位的亮氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
5.如权利要求1所述的具热稳定性和高活性的碳酸酐酶，其特征在于，所述203位的亮氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
6.如权利要求1所述的具热稳定性和高活性的碳酸酐酶，其特征在于，所述243位天冬酰胺由谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
7.根据权利要求1所述的具热稳定性和高活性的碳酸酐酶，其特征在于，所述244位组氨酸由谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、酪氨酸或苏氨酸中的一种取代。
8.如权利要求1所述的具热稳定性和高活性的碳酸酐酶，其特征在于，所述245位的精氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、酪氨酸、苏氨酸或赖氨酸中的一种取代。
9.如权利要求1-8任一项所述的具热稳定性和高活性碳酸酐酶的应用，其特征在于，所述的碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应。
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