CN104114699A - 具有提高的物理稳定性的人碳酸酐酶ii - Google Patents

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Abstract

描述了一种具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，其序列对应于经修饰的人碳酸酐酶II。该经分离多肽包括突变A23C、S99C、L202C、C205S以及V241C，并且该多肽具有与野生型碳酸酐酶II相比提高的物理稳定性。另外，该多肽包括在C23与C202之间和/或在C99与C241之间的二硫桥键。

Description

具有提高的物理稳定性的人碳酸酐酶II
技术领域
本发明涉及一种具有如由提高的热力学、热以及动力学稳定性所定义的如与野生型酶相比提高的物理稳定性的酶人碳酸酐酶II的工程改造变体。本发明还涉及一种提高碳酸酐酶的物理稳定性的方法。此外，本发明涉及所述酶在用于从介质提取CO2的任何技术应用中的用途。此外，本发明还涉及编码多肽以及经分离多肽的经分离多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸建构体和载体。
背景技术
碳酸酐酶(CA，EC4.2.2.1)是根据下式催化二氧化碳和水变成碳酸氢根和质子的可逆反应的一组酶：
碳酸酐酶广泛分布于自然界中，并且被分成五个不同类别：α、β、γ、δ以及ξ类[1]。α类碳酸酐酶可见于脊椎动物、细菌、藻类以及绿色植物中，而β类碳酸酐酶见于细菌、藻类以及叶绿体中。每一个δ和ξ类碳酸酐酶中的一者已从真核海洋硅藻中分离出来。到目前为止分离出来的唯一γ类碳酸酐酶(Cam)已从嗜热性古核生物甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)中分离出来[2]。然而，因为这五类已经由趋同进化而进化，因此它们彼此关于氨基酸序列、结构以及活性显著不同。
α类碳酸酐酶属于同源蛋白质超家族，即其基因是从共同的祖先基因进化而来。
最有效的碳酸酐酶是来自脊椎动物的α-碳酸酐酶，转化数(kcat)高达1.4·106s-1，这比自发反应快107倍。此外，例如对于人碳酸酐酶II的催化效率(kcat/Km)是1.5·108M-1s-1，这接近于扩散控制反应。因为酶的自然功能是例如促进从血液去除CO2(人碳酸酐酶II)，因此已提出可将碳酸酐酶用作被设计用于从不同气流捕获CO2的生物反应器中的生物催化剂。当前存在一个共识，大气中二氧化碳的浓度是加快全球变暖的主要贡献者，这一点也由政府间气候变化专门委员会(IPCC)总结出来[3]。因而，已提出并且测试了用于碳捕获和螯合(CCS)的若干化学方法。然而，这些方法中的大多数在极端压力或温度下操作，并且使用有害化合物并且在低效率下仍消耗大量能量。实际上，如果可以使用利用碳酸酐酶作为催化剂的基于酶的生物反应器，那么这就可以解决化学反应器的能量和环境问题。已在例如WO 2006/089423、第6,524,842号美国专利、WO 2004/007058、WO 2004/028667、U.S.2004/0029257、第7,132,090号美国专利、WO 2005/114417、第6,143,556号美国专利、WO 2004/104160、US 2005/214936以及US 7,892,814中提出若干这样的生物反应器和工艺。前述工艺通常通过使或者在溶液中游离或者固定化的碳酸酐酶与溶解在溶液中的CO2接触而操作。然而，因为例如溶液的温度、pH以及化学组成等操作条件可能取决于应用而大幅变化，因此如果必需的碳酸酐酶催化剂对于在这些操作条件下行使功能不够稳定或不具有足够长的寿命而在经济上可行，那么这些工艺都没有任何价值。
令人遗憾的是，因为没有生物体生活在捕获CO2的生物反应器中可能占优势的条件下，因此自然界尚未向我们提供具有所希望的稳定性或效率的碳酸酐酶。哺乳动物、植物以及原核碳酸酐酶已通过自然进化而被选择在相应生物体的生理条件下稳定。因而，α和β类碳酸酐酶通常仅在生理条件(即大致37℃或更低)下稳定。唯一的热稳定碳酸酐酶已发现于甲烷八叠球菌中，该甲烷八叠球菌在55℃下具有最佳生长并且在约70℃的热变性温度(解链点，Tm)下产生γ碳酸酐酶(Cam)。然而，此酶的催化转化比例如人碳酸酐酶II的催化转化慢约10倍(kcat约1.2·105s-1相比于1.4·106s-1)。此外，催化效率与人碳酸酐酶II的1.5·108M-1·s-1相比低约20倍(7.5·106M-1·s-1)[4,5]。来自甲烷八叠球菌的γ碳酸酐酶的使它较不被感兴趣作为生物反应器的催化剂的其他特征是它是同源三聚蛋白质，即从三个相同多肽链组成的酶。这些多肽中的每一者含有213个氨基酸并且所具有的分子量约为23kD，即总共639个氨基酸并且分子量为69.15kD。这可与HCA II相当，HCA II是具有259个氨基酸并且分子量为29.3kD的单体蛋白质[6]。因而，与Cam相比，HCA II的优点是它不会因为多肽的解离而失活。与来自甲烷八叠球菌的γ碳酸酐酶的使用相关联的另一个问题是要获得该酶的最具活性形式(Fe2+-Cam)，它需要厌氧地产生并且在纯化和使用期间被保护不受空气影响。如果不满足这些预置条件，那么活性位点中天然产生的Fe2+被氧化为Fe3+并且随后被Zn2+交换，这会使活性再降低3倍[6,7]。
转化速率和效率当然对于在任何CO2捕获工艺中使用碳酸酐酶的技术和经济可行性极为重要。因而，如果有可能使用人碳酸酐酶II，那么生物反应器将比使用例如来自甲烷八叠球菌的γ碳酸酐酶的对应反应器需要少10倍到20倍的酶(可替代地为对于相同量的酶小10倍到20倍)。
酶类是大分子蛋白质生物分子，能够充当高效、高性能生物催化剂，并且对于所有生物生命是必不可少的。它们是加速生命的化学反应而不在反应中消耗自身的物质。经分离酶类在用于处理生物基质的许多工业工艺中是重要的。因而，用于工业和环境应用的酶类具有大的并且不断提高的经济和生态价值。
酶类在工业工艺中的应用的一个瓶颈是为了具有活性，酶类和其他蛋白质必须保持高度有序并且折叠的结构。然而，仅当蛋白质在针对每一类型蛋白质具有特异性的某些限制内的主要条件(即pH、离子强度、温度等)下稳定时才能维持蛋白质的高度有序结构。就蛋白质在进化期间的自然选择而言，这一概念强调以下事实：蛋白质分子仅当它存在于类似于为它选择的条件下时(处于其所谓的天然状态)才使其结构有意义。蛋白质稳定性可基本上划分为化学稳定性和物理稳定性。化学稳定性涉及酶回应于不同化学更改(例如天门冬素(aspargine)到天冬氨酸的脱脒基作用和甲硫氨酸的氧化)的活性改变。活性改变可归因于酶促工艺中所涉及的氨基酸的改变或归因于化学修饰酶使其结构松散并且因此损失活性。物理稳定性涉及蛋白质发现并维持其结构(并且因此活性)的固有能力。物理稳定性能够以若干种方式加以测量，例如测量为热力学稳定性、热稳定性以及动力学稳定性，它们都随蛋白质内和蛋白质与其周围环境之间的交互作用的总和而变。
因此，在探索设计更稳定的蛋白质时，了解能够获得具有所希望的提高的稳定性的蛋白质的每一类型稳定性的这些差异和益处以及基本机制是重要的。
热力学稳定性是失活的去折叠(U)状态与其中酶具有活性的折叠状态(F)之间的自由能差(ΔG)的一种量度。如果蛋白质能自由地去折叠并且再折叠，那么可以确定热力学稳定性处于平衡条件。这一两状态模型可写为：
因而，在此情况下，稳定性简单地为U与F状态之间的自由能差(ΔG＝G去折叠-G折叠)，并且稳定性被定义为ΔGFU，其中
ΔGFU＝-RTlnK。
K表示去折叠与折叠状态之间的平衡常数(K＝[U]/[F])，并且因此，蛋白质在热力学上的稳定性越大，自由能差(ΔG)越大。这还能够通过绘制去折叠与天然状态之间的自由能差而以图形方式表示。(见图1)。
因而，简单地说，可以通过或者使去折叠状态(U的较高自由能)去稳定化或者使天然状态(F的较低自由能)稳定化以便最大化这两个状态之间的自由能差(ΔGFU)来提高热力学稳定性。要使折叠反应有效(即，青睐蛋白质的天然状态)，自由能的改变需要低于零(ΔG<0)。因为根据ΔG＝ΔH–TΔS，自由能差是由其焓(ΔH，交互作用)和熵(ΔS，无序)决定的，因此可通过加强折叠状态的交互作用，从而导致焓降低(例如氢键、离子键、蛋白质内部的更好填充等)来实现有利的ΔG。可以通过使去折叠状态去稳定化来实现有利的ΔG，即去折叠与折叠状态之间的较大自由能差。此外，对于可以认为是无规卷曲的去折叠状态，可通过限制去折叠状态的自由度从而导致去折叠状态的熵降低并且由此导致去折叠状态的自由能水平升高来实现有利的ΔG。
蛋白质的解链点(Tm)，即去折叠的中点温度，是蛋白质热稳定性的一种量度。在工业工艺中，常常希望使用具有高解链点的酶类，因为如果反应可在高温下发生，它在许多情况下是有利的(更高反应速率、更低粘度、更少微生物生长、更少结垢等)。出于此原因，在基于酶的工业工艺中具有潜在用途的蛋白质常常聚焦于具有高热稳定性(即高解链点)的蛋白质。
然而，认识到以下情况是重要的：在标准温度(25℃)下，热不稳定蛋白质的ΔGFU值不一定低于热稳定蛋白质，即高热稳定性并不在所有温度下都与高热力学稳定性相同[8]。因而，不可能通过简单地测定蛋白质在环境温度下的热力学稳定性来推断其解链点或反之亦然。解链温度(Tm)是U与F平衡并且同等地增加时的温度，并且通过ΔGFU(T)函数加以确定，并且将在变性压力(温度)过高以致ΔGFU＝0时发生。当ΔGFU标绘为温度的函数时，ΔGFU(T)函数显示一条偏斜的抛物线，该抛物线与x轴相交两次(即，热和冷变性两者均发生)(见图2)。
图2展示了可如何通过除了提高蛋白质在标准温度下的热力学稳定性(ΔGUF)之外的其他方式来从而提高假想蛋白质的热稳定性。
因而，热稳定性与热力学稳定性相关但并不等效于热力学稳定性。即，在环境温度下，蛋白质可具有相对低的热力学稳定性，并且仍证明具有相对高的解链点。
动力学稳定性是对蛋白质去折叠速率(kU)的一种量度。这对于蛋白质或使蛋白质不可逆地变性为去折叠状态的条件尤其重要。如果处于去折叠状态的蛋白质快速地经历某一永久性改变，例如蛋白水解降解或聚集(热变性蛋白质常常是这种情况)，那么蛋白质可以不可逆地变性。
在这些情况下，折叠与去折叠状态之间的自由能差并不重要。那只会影响平衡，并且这不是真正的平衡过程。实际上，对于动力学稳定性，重要的是折叠状态(F)与过渡状态(ts#)之间在去折叠路径上的自由能差，该自由能差决定去折叠活化能(EA,去折叠)。因此，EA,去折叠决定去折叠的速率常数(kU)并且由此决定去折叠状态的不可逆失活可发生的速率(见图3)。
因而，这与热力学稳定性(ΔGFU)或热稳定性(Tm)毫不相关，并且其他方式对于如与ΔGFU和Tm相比提高动力学稳定性是必要的。为了改变过渡状态的自由能，需要影响蛋白质的折叠/去折叠机制。简单地说，当一组蛋白质折叠时，它们将主要遵循产生具有最低可能能级的折叠中间体和过渡状态的最快路线。然而，如果这一路线不再可获得，那么它们将被迫经过具有更高能量的折叠中间体和过渡状态的可替代路线进行折叠。这将有效地导致使过渡状态处于更高自由能级的路线。在此情况下，因为折叠状态与之前具有相同能级(仍需要处于其高度有序天然折叠才能具有活性)，因此EA,去折叠的高度将增加并且因而提供对于去折叠的障碍，从而导致更慢的去折叠速率常数(kU)。
因而，要使蛋白质在任何应用中有价值，它需要在操作温度下具有大的负ΔGFU，以使得该蛋白质在远低于其解链点(Tm)下操作。同等重要的是，它需要高的动力学稳定性，以使得蛋白质维持在天然折叠状态，并且该蛋白质不会尝试使得它不可逆地失活的去折叠状态。因此，高动力学稳定性将促成蛋白质的缓慢去折叠和长寿命。这适用于所有条件并且将例如提高蛋白质在环境温度下的存放期，但去折叠活化能(EA,去折叠)还将为去折叠提供障碍(如果蛋白质在接近于或甚至高于其去折叠点(热或其他)下操作)并且因而还在诱导去折叠的条件下保持去折叠速率常数(kU)低并且寿命高。
存在众多方式来使蛋白质稳定[9]，通过不同方式或者通过使折叠状态稳定化或者通过使去折叠状态去稳定化。然而，使折叠状态稳定化的大多数方法依赖于加强仅在蛋白质折叠时才形成的局部交互作用，并且很少实质上影响折叠路线并从而影响动力学稳定性。此外，由于常常数百个氨基酸变化以及蛋白质内和蛋白质与周围环境之间的数千种交互作用，因此非常难以简单地检查结构并且指出改变什么来提高稳定性。这也是为何已开发如定向进化的组合方法的原因。因为这些方法“偶然地”产生数千种蛋白质变体，随后在不同条件下测试这些变体的活性，这就避开了详细了解蛋白质结构或理解蛋白质稳定性的需要。然而，对于非常熟悉蛋白质稳定性和稳定化的领域的人来说，有可能通过基于知识的蛋白质工程改造而设计出更稳定的蛋白质。通过基于知识的蛋白质工程改造而使特定蛋白质稳定的一种有吸引力的方式是将来自一种蛋白质同源物的已知稳定的结构基元移植到待稳定的蛋白质同源物，这在文献[10,11]中存在众多实例。如果两种蛋白质在沿着多肽链的显著数目个序列位置中具有相同氨基酸残基，那么就认为它们是同源的。然而，按照蛋白质化学中的教科书知识，三维结构比序列要保守得多，并且常常发现具有极低序列一致性的蛋白质仍具有类似功能和类似三维结构[12]。因而，这样的家族的成员也认为是同源的，即使多肽序列一致性在统计上不显著，而仅在结构上或功能上显著。此外，同源蛋白质始终含有核心区域(结构上保守的区域)，此处肽链的大体折叠极为类似。即，即使具有低序列一致性的关系较远的同源蛋白质的架构也具有类似结构。就是这些关系使得有可能在结构上同源的蛋白质之间转移稳定化氨基酸组合或基元(如果三维结构数据可获得)。结构数据可来源于X射线晶体学、核磁共振波谱学或建模。如果同源蛋白质的两个这样的结构重叠，一个具有所关注的稳定化交互作用(模板)并且另一个有待稳定(目标)，那么可以在目标结构中识别使待改变的氨基酸稳定的三维结构等效位置。
减小去折叠状态的自由度(即熵)并且因而使去折叠状态处于更高能级的一种方式是在蛋白质的多个部分之间引入共价键。这可通过将原始氨基酸改变为半胱氨酸而实现，半胱氨酸在两个氨基酸侧链的硫醇基团在空间中正确放置的情况下能够形成共价二硫桥键(S-S)。然而，要设计这样的桥键并不简单，因为蛋白质中的无应变-CH2-S-S-CH2-桥键的几何形状限于相当窄的构形约束，并且与几何约束偏离会将张力引入到折叠结构中。然而，由于这些几何约束，二硫桥键的识别特别遵从于同源性建模以识别要更改为半胱氨酸的氨基酸位置，以便在同源蛋白质中引入二硫桥键，在文献[13,14]中存在这些同源蛋白质的众多实例。
尽管这一方法因为野生型氨基酸的置换和二硫桥键的引入常常会导致有利交互作用的损失或折叠状态中的张力而具有有限的成功率，但它在折叠状态不受影响的情况下将导致较大的热力学稳定性(ΔGFU)(见图4)。
另外，如果所引入的二硫桥键将通常在折叠事件的早期阶段期间紧密接触的蛋白质的部分连在一起，那么它将不影响折叠路径，并且因而将仅提高热力学稳定性并且可能提高折叠速率(在折叠状态的能级不受影响的前提条件下)。然而，如果所引入的二硫桥键将在正常折叠期间并不在折叠事件早期交互作用的蛋白质的部分连在一起，那么这将导致蛋白质可能需要经过具有更高自由能的过渡状态的可替代路线进行折叠。在折叠状态的能级不受影响的前提条件下，这将导致去折叠活化能(EA,去折叠)将变得更高，并且因而去折叠速率将变得更慢，并且蛋白质的寿命将提高。如果可实现这种情况，那么能够建构具有高热力学稳定性(和可能提高的解链温度)和高动力学稳定性两者的理想蛋白质(见图5)。
除潜在地能够提高蛋白质的热力学和动力学稳定性两者之外，稳定化通过并入共价键(二硫桥键)来限制去折叠状态的自由度而具有熵起因。因而，通过引入二硫桥键的焓稳定化交互作用将不显示强温度依赖性，温度依赖性原本可能弱化或加强，例如氢键、盐桥键、离子键或疏水效应。此外，这还意味着稳定化还将更少地受到周围介质的其他特征的影响，例如极性和离子强度等，并且稳定性的相对提高还将在除了缓冲水溶液以外的介质中得以维持。
从上可假定，要更多地提高蛋白质的物理稳定性，可以简单地添加更多二硫桥键。然而，这出于若干原因不是不复杂的。首先，即使单个稳定化二硫键的引入也是具挑战性的，因为常常通过减小去折叠状态的熵而获得的能量差常常又在折叠状态的焓能量中失去了(由于失去的非共价交互作用或引入到结构中的张力)，使得工程改造蛋白质的ΔGFU相同于或甚至小于野生型蛋白质的ΔGFU(即热力学上去稳定化)。因而，引入两个或更多个二硫桥键可以提高或减小蛋白质的稳定性。其次，在存在两个二硫桥键的情况下，蛋白质的折叠路径可能被阻断，使得蛋白质不再能够折叠成其天然活性形式。第三，当将两个以上半胱氨酸引入到蛋白质中时，存在以下高风险：半胱氨酸使二硫键在合成或折叠期间具有错误配偶体。这将始终导致失活的蛋白质，因为它将不能够发现其折叠活性构形。这在于重组系统(例如细菌)中产生具有多个二硫键的异源(例如哺乳动物)蛋白质期间也是尤其重要的，因为在这样的系统中形成正确或天然的二硫键是极为低效的，常常导致功能性酶类的产生的低产率。
发明内容
因为不存在天然产生的满足用于在基于酶的生物反应器中捕获CO2所需要满足的要求的碳酸酐酶，因此在本领域中存在对于开发工程改造碳酸酐酶的需求，这些碳酸酐酶满足所期待的要求并且生产起来简单并且经济、在不同条件下具有高催化活性、具有高物理稳定性以及长寿命。
因此，本发明的目标是通过提供生产起来简单并且经济、在不同条件下具有高催化活性、高物理稳定性(如由热力学、热以及动力学稳定性决定)以及长寿命的碳酸酐酶来解决上文所描述的问题和缺点。
这根据本发明通过具有碳酸酐酶活性的经分离多肽来实现，该多肽的序列对应于经修饰的人碳酸酐酶II，其中该多肽包括突变A23C、S99C、L202C、C205S以及V241C，与野生型碳酸酐酶II相比具有提高的物理稳定性，并且进一步包括在C23与C202之间和/或在C99与C241之间的二硫桥键。
根据一个实施例，具有碳酸酐酶活性的该经分离多肽具有与野生型碳酸酐酶II相比提高了23.5kJ/mol的热力学稳定性。
根据另一个实施例，具有碳酸酐酶活性的该经分离多肽具有与野生型碳酸酐酶II相比提高了18.5℃的解链点。
在又一实施例中，具有碳酸酐酶活性的该经分离多肽具有与野生型碳酸酐酶II相比提高了25kJ/mol的去折叠活化能。
在一个实施例中，具有碳酸酐酶活性的该经分离多肽在水中在21℃下具有与野生型人碳酸酐酶II相比慢约22.000倍的去折叠速率。
根据一个实施例，具有碳酸酐酶活性的该经分离多肽在60℃下具有86天的半衰期，在65℃下具有8天的半衰期，并且在70℃下具有1.6天的半衰期。
根据另一个实施例，具有碳酸酐酶活性的该经分离多肽与野生型碳酸酐酶II相比在乙醇胺水溶液中维持其提高的物理稳定性，这些乙醇胺包括甲基二乙醇胺(MDEA)、单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)以及氨基乙氧基乙醇。
根据又一实施例，具有碳酸酐酶活性的该经分离多肽具有根据SEQ ID NO:8的序列。
本发明的目标进一步通过一种提高选自天然产生或经修饰α-碳酸酐酶超家族的碳酸酐酶(EC4.2.2.1)的物理稳定性的方法来实现，该方法包括将两个稳定二硫桥键的组合插入到SEQ ID NO:8中的C23、C99、C202以及C241的三维等效或序列同源位置，等效于人碳酸酐酶II中的位置A23、S99、L202以及V241。
本发明还涉及一种包括根据本发明的多肽的构建体，该构建体可操作地键联到指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
在一个实施例中，本发明涉及一种包括根据本发明的构建体的重组表达载体。
本发明的目标进一步通过一种包括根据本发明的构建体或根据本发明的重组表达载体的重组宿主细胞来实现。
本发明的目标进一步通过使用根据本发明的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽来从含有二氧化碳的介质中提取二氧化碳来实现。
根据另一个实施例，该含有二氧化碳的介质是气体。
在一个实施例中，该气体是烟气、沼气、排气，或天然气。
在另一个实施例中，该含有二氧化碳的介质是液体。
在又一实施例中，该含有二氧化碳的介质是多相混合物。
根据一个实施例，从含有二氧化碳的介质中提取二氧化碳发生在一个生物反应器中。
本发明进一步涉及一种制备经分离多肽SEQ ID NO:8的方法，该方法包括通过在pH7到10下，在氧化剂存在下，在25℃到60℃的高温下孵育该多肽而加速二硫桥键的形成。
另外，本发明涉及一种经分离多核苷酸，该多核苷酸具有编码根据本发明的多肽的序列。
根据一个实施例，该经分离多肽具有与伪野生型HCA II相比具有至少75％的剩余CO2水合活性。
在一个实施例中，该经分离多肽具有54千焦/摩尔的热力学稳定性。
在另一个实施例中，该经分离多肽在孵育15分钟之后具有77.5℃的解链点。
在又一实施例中，该经分离多肽在70℃下孵育15分钟之后具有100％的剩余CO2水合活性。
在另一个实施例中，该经分离多肽在70℃到95℃下孵育15分钟之后具有至少20％的剩余CO2水合活性。
根据另一个实施例，该经分离多肽在65℃下孵育2小时之后具有100％的剩余CO2水合活性。
根据又一实施例，该经分离多肽具有121千焦/摩尔的去折叠活化能。
在又一实施例中，该经分离多肽在21℃下在水中具有4.2×10-9min-1的去折叠速率。
根据又一实施例，该经分离多肽与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有至少95％的一致性。
根据另一个实施例，该经分离多肽与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有至少98％的一致性。
附图说明
图1是展示了蛋白质的去折叠状态(U)与天然折叠状态(F)之间的自由能差(ΔGFU1)的定义的曲线图。该曲线图进一步展示了可如何通过使折叠状态(ΔGFU2)稳定化而提高热力学稳定性。
图2展示了热力学稳定性与热稳定性之间的关系以及关于在单个温度下的热力学稳定性的知识并不给出关于蛋白质的解链温度(Tm)的任何信息。假想热不稳定蛋白质的ΔGFU(T)函数(──)与其解链温度(Tm)，以及Tm通过ΔGFU(T)函数的上移(─·─)、右移(---)以及平化(·····)的可能提高(根据参考文献8改编)。
图3是展示了由折叠状态(F)与过渡状态(ts#)之间在去折叠路径上的自由能差决定的蛋白质去折叠活化能(EA,去折叠)的定义的曲线图。
图4是展示了如何通过并入二硫桥键(US-S)来限制去折叠状态的自由度，从而使去折叠状态处于更高能级而提高蛋白质的热力学稳定性(ΔGFU)的曲线图。
图5是展示了对于二硫桥键插入在影响去折叠状态的自由度以及折叠路径两者并且由此影响过渡状态的位置处的蛋白质，热力学稳定性(ΔGFU,S-S)和去折叠活化能(EA,S-S)两者的所得提高的曲线图(.....)。与未修饰的参考野生型(wt)蛋白质(──)进行了比较。
图6是展示了对于SEQ ID NO:2(o)、4(■)、6(□)和孵育过夜的以及孵育2到5天(●)的SEQ ID NO:8，呈去折叠蛋白质的分率随Gu-HCl浓度而变的形式的酶变体在变性剂中对去折叠的抗性的曲线图。
图7A-C展示了SEQ ID NO:2(o)、4(■)、6(□)以及8(●)在60℃(图7A)、65℃(图7B)以及70℃(图7C)下的寿命。注意，SEQ ID NO 2仅在60℃下测量，因为它在此温度下已经即刻失活(图7A)，并且SEQ ID NO:4仅在60℃和65℃下测量(图7A和图7B)。在所有温度下具有可观寿命的唯一变体是SEQ ID NO:8的多肽。
具体实施方式
本发明的一个方面是提供一种酶，该酶具有足够高的物理稳定性以使被设计并且能够从含有CO2的介质中提取CO2的生物反应器切实可行并且在经济上可行。
本披露提供一种经工程改造的、高度有效人碳酸酐酶II变体，该变体具有提高的物理稳定性(如由热力学、热以及动力学稳定性所决定)以及延长的寿命。
根据本发明的稳定的人碳酸酐酶II具有提高了23.5kJ/mol的热力学稳定性。
本发明进一步提供一种经工程改造的人碳酸酐酶II，该酶热稳定并且能够在常温和高温下在长时间段内催化CO2的水合。本发明的热稳定性提供一种具有77.5℃的解链点并且在70℃下维持100％CO2水合活性达至少15分钟并且在95℃维持大于20％的残余CO2水合活性达至少15分钟的碳酸酐酶。
本发明还提供一种经工程改造的动力学稳定的人碳酸酐酶II，该酶具有比野生型酶提高了25kJ/mol的去折叠活化能(EA,去折叠)和在环境温度下比野生型酶慢约22000倍的去折叠速率(kU)。
本披露进一步提供一种经工程改造的人碳酸酐酶II，该酶在除了缓冲水溶液以外的溶液(例如乙醇胺溶液)中也相对于野生型酶维持其相对稳定化特性。
本发明还提供一种经济地并且有效地产生根据本发明的经工程改造的人碳酸酐酶II的方法。
本发明进一步提供编码野生型和根据本发明的经工程改造的人碳酸酐酶II的多核苷酸。
本发明涉及酶人碳酸酐酶II的一种经基因工程改造变体，该变体具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列，具有如由提高的热、热力学以及动力学稳定性所定义并且如与具有氨基酸序列SEQ ID NO:2、4和6的其亲本酶类相比实质上提高的物理稳定性。对应于SEQ ID NO:2、4、6和8的核苷酸序列分别示出于SEQ ID NO:1、3、5和7中。提高的物理稳定性提供允许酶以提高的寿命、在高温(即高于37℃)下并且在除了缓冲水溶液以外的介质中(例如，在甲基二乙醇胺溶液中)使用的酶特性。
此外，SEQ ID NO:2、4与6的组合导致允许它以一种经济上可行的方式产生的SEQ ID NO:8的特性。本发明的一个方面是稳定碳酸酐酶作为用于从含有CO2的气体、液体或多相混合物中捕获并螯合CO2的生物反应器中的催化剂的用途。当需要延长的寿命时和/或当含有CO2的介质的温度高于天然产生或可商购的碳酸酐酶的解链点时，本发明尤其重要。此外，本发明可用于CO2的螯合(水合)以及先前螯合的CO2的碳酸氢根的后续恢复(脱水)两者。
定义
“碳酸酐酶”与缩写“CA”可互换地使用以指代具有酶促E.C4.2.1.1活性并且能够催化二氧化碳和水到碳酸氢根和质子的相互转化。
“人碳酸酐酶II”与“HCA II”可互换地使用以指代人碳酸酐酶II的同功异型物2变体。
“野生型”或“天然产生”是指可在自然界中发现并且尚未通过人为操纵有意地修饰的多肽或多核苷酸序列形式。
“伪野生型人碳酸酐酶II”(“HCA IIpwt”)是指在特征上与在位置205中的天然产生的半胱氨酸通过基因操纵以代替密码而互换为氨基酸丝氨酸(C205S)的野生型人碳酸酐酶II不可区分的人碳酸酐酶II变体。人碳酸酐酶同功异型物序列的常规命名有时是指相对于人碳酸酐酶I中的位置的位置，并且编号因而可能在不同出版物之间不同。然而，除非另行说明，否则在本文中定义的所有位置都是指如在SEQ ID NO:1到8中所定义的序列和位置。
根据本发明的“经修饰”多肽涉及具有更多突变的多肽、多肽的截断变体，以及在多肽的N端或C端部分添加有一个或多个氨基酸的多肽。
实例
实例1
突变位置的选择
经选择用于突变和半胱氨酸的引入的位置是基于HCA IIpwt的两个先前变体的发现。尽管不是物理稳定性的有效测量[15]，但对于一个变体(SEQ ID NO:4)，在提高化学变性剂(胍盐酸盐)的浓度时的变性中点提高了[16]。在另一个变体(SEQ ID NO:6)中，在环境温度(23℃)下的热力学稳定性提高了[17]。在HCA IIpwt的这两个单独地工程改造的二硫桥键变体中，在一个变体(SEQ IDNO:4)中，在位置99中的半胱氨酸与在位置241中的半胱氨酸形成二硫桥键，并且在另一个变体(SEQ ID NO:6)中，在位置23中的半胱氨酸与在位置202中的半胱氨酸形成二硫桥键。然而，关于这些变体的稳定性的所有其他重要参数都是未知的。因为不能从知晓用于一个组份(SEQ ID NO:2)的去折叠的中点浓度或另一组份(SEQ ID NO:6)在环境温度下的热力学稳定性来简单地推断以下信息，因此根据以下实例确定两个单独变体(SEQ ID NO:4和6)的热力学稳定性、解链点、在30％乙醇胺溶液中的稳定性、动力学稳定性、去折叠速率以及在高温下的寿命。从针对本文件中的实例6到10中的单独变体(SEQID NO:4和6)所获得的集合信息，应理解，两个变体单独地拥有有益于碳酸酐酶用于被设计成捕获CO2的工业工艺中的特性。因而，两个变体的组合可能试验性地导致若干必需特性被增强的酶变体。然而，如可从背景技术理解，这不能在没有组合变体以及其特征的必需设计的情况下实现。
此外，两个二硫桥键的组合还会非常好地导致蛋白质不可再折叠或半胱氨酸与错误配偶体形成二硫键，并且由此折叠到非天然状态。对于这些变体中的一者(SEQ ID NO:6)，在先前还发现需要异乎寻常的化学方法来在可接受的时间尺度下形成二硫桥键，这将阻碍酶的大规模生产[16]。要有效地大规模生产酶，先前提出的方法将难以实现酶的在经济上可行的工业生产工艺。因而，基于本文件中对两个单二硫键变体(disulfide variant)的实验发现，设计(实例2)、产生(实例3到5)并且关于例如活性、物理稳定性以及寿命等重要特性表征(实例6到11)新颖的双二硫键变体(SEQ ID NO:8)。
实例2
HCA II pwt 的定点突变诱发
所有变体都是通过相同方法产生的。作为进一步修饰的模板，使用编码HCA II的熟知变体的核苷酸(SEQ ID NO:1)，该变体仅在位置205处的多肽序列(SEQ ID NO:2)中的半胱氨酸被丝氨酸置换[18]。这一变体的使用防止错误二硫桥键形成于任何引入的新半胱氨酸与在位置205中的原本为单一的天然产生的半胱氨酸之间。HCA II的这一变体具有与野生型HCA II不可区分的其他特性，并且因此被识别为伪野生型人碳酸酐酶II(HCA IIpwt)。编码HCA IIpwt的核苷酸序列被克隆到质粒pACA(用于针对T7-RNA聚合酶的表达的载体)中。T7RNA聚合酶的产生又在lac启动子的控制下，因而可通过添加乳糖或例如IPTG等类似物而活化所克隆的HCA II蛋白质的产生。质粒维持在大肠杆菌的实验室表达菌株(BL21/DE3)中。质粒是通过使用凯杰(Qiagen)质粒制备试剂盒根据制造商的说明而制备。突变诱发寡核苷酸依据来自DNA技术AS(丹麦)的规格来加以设计和排序。含于经纯化质粒中的HCA IIpwt核苷酸序列此后使用前述DNA寡聚物和来自Stratagene的定点突变诱发试剂盒而经受定点突变诱发。在纯化经处理的质粒之后，发送质粒的等分试样用于测序(GATC公司，德国)以便验证正确的所希望的序列和突变。在验证之后，使用这些质粒使一组新的BL21/DE3细胞转型，这些细胞在20ml2×LB培养基中在A660下生长到约OD1的细胞密度。将这些细胞以500μL的等分试样转移到艾本德管(Eppendorf tube)并且与500μL50％甘油混合并且在液氮中冷冻。此后在-70℃储存大肠杆菌储备液。
实例3
蛋白质产生
所有变体都是通过相同方法产生的。将含有携带突变的HCA IIpwt的质粒并且在37℃下于LB培养基中生长的50mL经转型BL21/DE3的2×15mL过夜培养物转移并用以在振荡瓶中接种2×1.5L的LB培养基。允许这些细胞在37℃下在A660下生长到约OD0.8的细胞密度并且接着分别用IPTG和ZnSO4补充到1mM的最终浓度，并且使这些细胞静置过夜以产生蛋白质。培养液的细胞通过以3.000×g离心而沉降，并且丢弃上清液。将这些细胞再悬浮于40mLpH9.0的10mM tris-H2SO4中。此后使细胞悬浮液经受超声波处理以使细胞壁裂开并且释放细胞内含物。此后使细胞悬浮液以10.000×g离心30分钟，并且收集含有所产生的突变HCA IIpwt的上清液。用tris碱将上清液的pH调整到约pH9。将该上清液与约10mL的用于HCA II的亲和性凝胶(磺酰胺偶合到基质的BioRad CM琼脂糖)混合，并且允许静置30分钟，随后应用于色谱柱。在监测A280的情况下用pH9.0的若干床体积的10mM tris-H2SO4洗涤该凝胶。当不能再检测到A280的改变时，用pH7.0的10mM tris-H2SO4和0.5M叠氮化物洗提该蛋白质。收集洗出液并且转移到分子量截留为10kDa的透析管(密理博公司(Millipore))，并且接着用5×10L的透析缓冲剂(10mM tris-H2SO4，pH7.5)透析，每次改变缓冲剂之间为至少8小时。接着收集所透析的蛋白质溶液并且在分子截留为10kDa的离心管中浓缩。
使用消光系数ε280＝55400M-1cm-1通过A280测量确定蛋白质样本的浓度。通过将蛋白质样本(每孔10μg)过量加载到SDS-PAGE上来进一步分析蛋白质样本的纯度。在SDS-PAGE运行之后，用考马斯亮兰(commassie brilliant blue)对凝胶中的蛋白质进行染色。对于所产生的每一个蛋白质样本，发现没有其他蛋白质带可以在视觉上检测到。因而，因为认为蛋白质是纯的，因此HCA II的突变变体可以经受进一步分析。
实例4
游离半胱氨酸的检测
含有半胱氨酸的所有变体都是通过相同方法加以分析。通过7-氯-4-氮苯并呋咱(NBD-Cl)检测尚游离半胱氨酸，即尚未与其预期的配偶体形成胱氨酸残基并且因而尚未形成稳定二硫桥键的非生产性半胱氨酸。将蛋白质、pH7.5的tris-H2SO4以及胍盐酸盐(Gu-HCl)分别混合到17.1μM、0.1M以及5M的最终浓度。在添加十倍过量的NBD-Cl(171μM)之后，使用分光光度计(日立(Hitachi)U-2001)在420nm处扫描30分钟的时间来检测游离半胱氨酸。作为参考，运行HCA IIpwt样本(不具有半胱氨酸氨基酸残基)。如果存在游离半胱氨酸，那么NBD-Cl将与硫醇基团反应并且形成半胱氨酸-NBD部分，该部分吸收可见波长中的光(变为黄色)。在半胱氨酸-NBD部分的消光系数ε420＝13000M-1cm-1的情况下，每蛋白质一个游离半胱氨酸将在反应之后在所使用的蛋白质浓度下给出0.22的吸光度A420，并且四个游离半胱氨酸将因而给出0.88的吸光度A420。在反应之后在420nm处并不显示吸光度增加的唯一的二硫键变体是单二硫桥键变体SEQ ID NO:4，该变体因而不具有游离半胱氨酸和完全形成的单个二硫键。如先前发现的另一个单二硫键变体(SEQ ID NO:6)不能够自发地形成其二硫桥键[16,17]。更重要的是，随后发现，该新颖的双二硫键变体(SEQID NO:8)还具有约50％的游离半胱胺酸(4个半胱氨酸中有2个不形成二硫桥键)。这最可能指示已自发地形成一个二硫桥键，而另一个二硫桥键不在产生酶SEQ ID NO:8的期间形成。因而，需要开发形成缺少的二硫桥键的方法。
实例5
SEQ ID NO:6和8的二硫桥键的形成
归因于还原形式对在胍盐酸盐中去折叠的低抗性(0.7M Gu-HCl的Cm,FU)[17]，通过如先前在文献[16]中描述的化学方法形成SEQ ID NO:6的二硫桥键，产生两个半胱氨酸都在正确的二硫桥键中反应并且保留天然和活性构形的蛋白质。然而，双二硫桥键变体SEQ ID NO:8仅形成两个二硫桥键中的一个。最可能是已形成SEQ ID NO:4的二硫桥键而尚未形成SEQ ID NO:6的二硫桥键，这类似于单独的二硫桥键变体的行为。尽管如此，不管已形成两个二硫桥键中的哪一个，每一个二硫桥键将单独地促成蛋白质的更高热稳定性(见实例9)。因而，替代使用先前描述的化学方法来提高结构灵活性以促进半胱氨酸发现彼此，可以通过允许反应在高温下发生而实现第二个二硫桥键在SEQ ID NO:8中的形成。
因此，针对SEQ ID NO:8的双二硫桥键变体开发出了用以形成SEQ ID NO:6的二硫桥键的化学方法的可替代方案。因为形成有二硫桥键的最不稳定的变体(SEQ ID NO:4)的解链点提高了7.5℃并且不受在温度<55℃下的孵育的影响(见实例9)，因此可以有效地在50℃下孵育SEQ ID NO:8的双二硫键变体以诱导从SEQ ID NO:6供给的第二个二硫桥键的形成。出于验证这一方法的目的，设计实验测定。制备含有在50mM pH8.5的tris-H2SO4(补充有100倍浓度的经氧化二硫苏糖醇(DTT))中的85.5μM蛋白质(仅形成一个二硫桥键的SEQ ID NO:8)的两个储备溶液。一个溶液在室温下孵育，而另一个溶液在经过加热的橱柜中在50℃下孵育。在某些时间点，取出这些储备溶液的等分试样并且如实例4中所描述测量游离半胱氨酸。发现通过在50℃下孵育样本，这一方法在24小时内得到SEQ ID NO:8的100％二硫桥键形成。此时，在室温下孵育的样本仅形成约20％的二硫桥键。通过SDS-PAGE进一步分析这些样本，该分析显示在热工艺期间尚未形成二聚体，指示已形成正确的二硫桥键。就酶SEQ ID NO:8的可应用性而言，这是一个非常重要的结果，因为它使得变体的大规模生产变得可行。与先前描述的化学方法相比，这部分是因为需要更少量的昂贵化学品，因为在这个工艺中不需要添加Gu-HCl。
此外，已完成的酶产物不需要从变性剂Gu-HCl中清洁的下游处理。此外，与SEQ ID NO:8的反应速率和所描述的“热”方法比化学方法快(对于100％二硫桥键形成为24小时)，因为它在高温下进行。这可与使用先前描述的化学方法在SEQ ID NO:6中形成二硫桥键的速率(对于100％二硫桥键形成为100小时)相当。
实例6
抵抗通过在水溶液中和在30％甲基二乙醇胺中的变性剂去折叠的稳定性
在缓冲溶液(pH7.5的0.1M tris-H2SO4)中的增加量的变性剂Gu-HCl(0到6M)中，在室温下孵育所描述的SEQ ID NO:2、4、6和8的HCA II变体中的每一者的0.85μM溶液的等分试样过夜(约18小时)。对于甲基二乙醇胺(MDEA)测量，该溶液还含有最终浓度为30％的MDEA。在光谱荧光计(乔平·伊冯(Jobin-Yvon)Fluoromax4)中记录在所选择的所有Gu-HCl浓度下的每一个变体的荧光光谱。激发波长为295nm，并且记录每一个样本在310到400nm之间的三个累积发射光谱。从这些光谱，确定波长位移。将数据归一化，并且确定随Gu-HCl浓度而变的分率改变。由此确定每一个变体在两种介质中在什么Gu-HCl浓度下出现去折叠中点(Cm,FU)(表1)。对于在缓冲水溶液中孵育的样本，HCA IIpwt(SEQ ID NO:2)和两个单二硫桥键变体(SEQ ID NO:4和6)的值达到先前发现的值(分别为1.0、1.40和1.85M Gu-HCl的Cm,FU)。出乎意料地，随后产生的新颖SEQ ID NO:8变体达到2.6MGu-HCl的表观极高的Cm,FU，这高于每一个单独的稳定二硫桥键的总和(1.0+0.4+0.85＝2.25MGuHCl)。这可能意味着两件事情中的一个。或者是稳定性中存在某一协同效应，从而使得SEQ ID NO:8的双二硫桥键酶实际上比两个贡献性单二硫桥键变体的稳定化总和更稳定地抵抗Gu-HCl变性。可替代地，SEQ ID NO:8的动力学稳定性提高了，使得去折叠的速率变慢，并且因而SEQ ID NO:8的蛋白质样本在18小时内未达到平衡。因此，将相同样本再孵育24小时(总共42小时)，随后再次收集数据。对于SEQ ID NO:8，发现曲线已偏移到更低浓度并且停止在2.25M Gu-HCl的Cm,FU。因而，尽管SEQ ID NO:8酶没有如初始结果所指示的那般抵抗变性剂，但如通过Cm,FU确定并且与SEQ ID NO:2、4和6相比，这仍是稳定性上相当大的提高。此外，这还证明SEQ ID NO:4与6的二硫桥键变体的组合是可实现的，因为蛋白质仍可折叠并且稳定性达到每一个单独的稳定二硫桥键的总和(2.25M GuHCl)，并且因而不会由于组合两者而失去关于对变性剂的抗性的稳定作用。
针对SEQ ID NO:8发现的缓慢平衡是据我们所知先前尚未针对HCA II的任何先前变体表现出的行为。该行为意味着SEQ ID NO:8的双二硫键变体具有对去折叠的高动力学障碍。这将由此导致SEQ ID NO:8的去折叠速率慢于SEQID NO:4和6的单独的二硫桥键变体中的每一者，并且因而折叠与去折叠状态之间的平衡比每一个单独的二硫桥键变体(SEQ ID NO:4和6)要花费更长时间来达到。
表1.
提高Gu-HCl浓度时的去折叠中点浓度
在30％MDEA中抵抗变性剂的稳定性遵循相同趋势，即SEQ ID NO:2具有最低Cm,FU，随后分别为SEQ ID NO:4、6和8(见表1)。因而，这一结果证实尽管MDEA通常使蛋白质去稳定化，但在Gu-HCl中的抵抗变性的稳定性的由于引入二硫桥键的相对提高几乎不受周围介质的特性的影响，如先前所描述。因此，还是在30％MDEA中，根据SEQ ID NO:8的蛋白质所具有的稳定性大大高于HCA IIpwt变体(SEQ ID NO:2)所具有的的稳定性。因而，SEQ ID NO:6和8的蛋白质变体即使在30％MDEA中也比SEQ ID NO:2即使在缓冲水溶液中更稳定。
实例7
在水溶液中的热力学稳定性
使用在实例6中获得的针对每一种酶变体的在过渡区中的平衡常数数据(K)来根据关系ΔG＝-RTln(K)通过线性外推法[19]计算对应的酶变体在纯缓冲水溶液中的热力学稳定性。
表2.
在环境温度(21℃)下在缓冲水溶液中的热力学稳定性。
清楚地，SEQ ID NO:8对Gu-HCl变性的提高的抗性(如由Cm,FU值判定)是显著地提高的热力学稳定性的效应。此外，SEQ ID NO:8的热力学稳定性的提高稍微大于SEQ ID NO:4与6的提高的稳定性的总和(8.5+12.5<23.5)，指示小的协同效应。
实例8
碳酸酐酶的活性测定
使用活性测定以便测量回应于条件(变性剂和温度)改变的酶活性改变以揭示解链温度(Tm)、去折叠速率、动力学稳定性以及在高温下的寿命。活性测定对于相对于伪野生型酶建立SEQ ID NO:4、6和8的蛋白质变体的绝对活性也是重要的，因为所希望的是也在工程改造变体中的尽可能高的催化活性和效率。
比色CO2水合活性测定的若干变体先前已在文献[20,21,22]中加以描述，这些变体都是基于导致从二氧化碳和水产生碳酸氢根和质子的酶促反应。因而，碳酸酐酶的酶促活性将比自发反应给出pH的更快减小，并且可以加以监测(如果反应在含有pH指示剂溴百里酚蓝(bromothymol blue，BTB)的缓冲剂中进行)。
在使用前，通过气体扩散器用CO2对冰冷却的去离子水进行鼓泡持续至少1小时来制备用CO2饱和的水性储备溶液。为监测每毫克酶的CO2水合活性，使含有20mg/L BTB的pH8.2的2ml 25mM佛罗拿(veronal)-H2SO4与1ml去离子水和30μL蛋白质(8.5μM)在放置于电磁搅拌器上面的冰浴中的小烧杯中混合。所有溶液在使用之前保持在冰上。通过将2ml CO2饱和溶液添加到搅拌过的缓冲溶液来开始反应。在添加CO2饱和溶液的同时，启动秒表，并且通过与参考样本的颜色比较来确定达到pH6.5的时间，该参考样本含有2ml 0.2M磷酸钠缓冲剂(pH6.5)、2ml 25mM佛罗拿-H2SO4(pH8.2)(含有20mg/L的BTB和1ml去离子水)。针对催化反应(tc)和无催化空白反应(tb)测量达到pH6.5的时间，并且使用以下方程式确定每毫克酶的活性单位(A.U.)：
在所有CO2水合实验中，活性测定中的酶量都是7.5μg。发现三个二硫键变体(SEQ ID NO:4、6和8)在测量条件(0℃)下的CO2水合活性分别为HCAIIpwt变体的活性的105％、82％与75％。因而，所有二硫桥键变体关于CO2水合保持高活性。
实例9
热稳定性测定
对于每一种酶变体(SEQ ID NO:2、4、6和随后产生的SEQ ID NO:8)，制备8.5μM酶在10mM tris-H2SO4(pH7.0)中的储备溶液。将70μL酶溶液的等分试样放置在薄壁PCR管中。为了防止酶溶液中的酶浓度在孵育之后归因于PCR管中的液体的蒸发和冷凝而增加，使用具有受热顶部的PCR热循环仪(GeneAmp PCR系统9600，应用生物系统公司(Applied Biosystems))。对于每一种酶变体和目标温度，将样本放置在经编程而恒定地斜升到设定温度(55℃到95℃)的热循环仪中并且孵育15分钟或2小时。在孵育之后，允许样本冷却到室温10分钟，随后根据实例8测量残余酶促活性。一式两份地执行所有实验。热处理15分钟与2小时之后的所得残余活性分别呈现在表3与表4中。清楚地，所有工程改造变体都具有比伪野生型酶(SEQ ID NO:2)高的热稳定性。此外，具有最高热稳定性的变体是所建构的双二硫桥键变体(SEQ ID NO:8)。为计算每一种变体的大致的Tm(即剩余50％残余活性时的温度)，将来自15分钟孵育的数据拟合到S形函数(Table-Curve，Jandel Scientific)并且呈现在表5中。
然而，重要的是要注意，所获得的Tm值只是表观解链点。尽管如此，如与HCA IIpwt(SEQ ID NO:2)相比的经修饰变体(SEQ ID NO:4、6和8)的Tm的提高(ΔTm)仍表示准确值。其原因是酶类的热变性并不是平衡过程，而是不可逆失活的实例，其中酶类在接近于或高于其对应的解链点的温度下去折叠之后聚集。因而，在活性测定中实际上监测的是尚未在对应的温度下去折叠并且聚集的酶分子的群体有多大。因此，在热稳定性的此情况下，动力学稳定性与热力学稳定性对于决定高温下的行为同样重要。因而，相比于其他变体，SEQID NO:8具有两个显著特征。首先，它具有约为77.5℃的格外高的解链点，这与伪野生型变体相比提高了18.5℃并且甚至高于来自甲烷八叠球菌的γ碳酸酐酶的约70℃。其次，酶SEQ ID NO:8在远远超出其解链点77.5℃的温度下具有高于20％的表观残余活性。这几乎确定无疑地是显著高的动力学稳定性的结果，从而导致甚至不用在95℃下孵育15分钟就足以完全使所有酶分子失活。清楚地，如果酶将用于例如温度相控方法(其中温度在低温与高温之间连续地更改)中，那么这是有价值的特征，因为SEQ ID NO:8的高动力学稳定性允许酶在远远超出其解链温度下存活短的温度突然增加。
表3
15分钟孵育之后剩余CO2水合活性百分比
表4
2小时孵育之后剩余CO2水合活性百分比
表5
酶变体的解链点和解链点的提高
Tm ΔTm
酶变体
SEQ ID NO: 2 59 -
SEQ ID NO: 4 66.5 7.5
SEQ ID NO: 6 71.5 12.5
SEQ ID NO: 8 77.5 18.5
实例10
工程改造HCA II变体的动力学稳定性
为了确定对应的酶变体的去折叠速率(kU)和去折叠活化能(EA,去折叠)，使用了化学变性。为进行去折叠测定，使每一种酶变体经受浓度不断增加的Gu-HCl，从高于其对应的去折叠中点浓度(Cm,FU，见表1，实例6)0.2到0.3M的浓度开始，步阶为0.1M。举例来说，具有1.0M Gu-HCl的Cm,FU的HCA IIpwt在1.2、1.3、1.4和1.5M Gu-HCl的Gu-HCl浓度中变性。针对每一种酶变体，制备达到最终测定浓度的Gu-HCl储备溶液，并且制备0.5mg/ml的蛋白质储备溶液。将2.5μl的酶与47.5μl的Gu-HCl混合以达到目标Gu-HCl浓度以及0.025mg/ml(8.5μM)的蛋白质浓度。在室温(21℃)下，从储备溶液制备每一种蛋白质变体和每一种Gu-HCl浓度样本，以监测10秒和30秒以及1分钟、2分钟、5分钟、30分钟、45分钟和60分钟之后的残余活性。如实例8中所描述(利用30μl的样本)进行活性测量，其差异在于缓冲BTB溶液补充有0.5mM的金属螯合剂EDTA以防止酶类在测定中再折叠。再折叠原本可能由于蛋白质和变性剂(Gu-HCl)两者都在活性测定中被稀释而发生。EDTA与Zn2+结合，该Zn2+是从去折叠酶类释放并且存在于溶液中，并且对于活性HCA II是必需的。因而，将EDTA添加到测定中“冻结”样本的状态，使得可测量残余CO2水合活性。
当针对每一种Gu-HCl浓度将残余活性标绘为时间的函数时，可通过将数据拟合到单个指数项而根据y＝a×e-kx计算在那一种特别的Gu-HCl浓度下的去折叠速率(kU)。为计算在水溶液中的去折叠速率常数，对照Gu-HCl浓度标绘对应的酶变体的所测量速率常数的自然对数，并且将经线性化的数据外推到0M Gu-HCl(给出在0M Gu-HCl下的ln kU)。可使用阿伦尼乌斯方程(Arrheniusequation)ΔG#＝RT[in(kB/h)-in(kU/T)]计算活化自由能(ΔG#)(在此情况下为用于去折叠的活化自由能(EA,去折叠))，其中R是气体常数8.314J·mol-1·K-1，kB/h是常数2.08358·1010，T是以开尔文计的绝对温度，并且kU是去折叠的速率常数。动力学稳定性的测量结果呈现于表6中。
表6
酶变体在21℃下的去折叠动力学数据
对于所有稳定的二硫桥键变体(SEQ ID NO:4、6和8)，存在去折叠速率(kU(H2O))的明显减小，该去折叠速率在所建构的SEQ ID NO:8的极慢去折叠中达到顶点，该所建构的SEQ ID NO:8在21℃下在水性介质中比HCA IIpwt变体(SEQ ID NO:2)的去折叠慢22.000倍。
重要的是酶SEQ ID NO:8表现地像HCA II的全新变体。发现SEQ ID NO:4带来动力学稳定性的高提高(12kJ/mol的ΔEA,去折叠)以及热力学稳定性的较低提高(8.5kJ/mol的ΔΔGFU)，并且因而表现地像具有工程改造二硫桥键的酶(具有更改的折叠路径并且由此具有在更高能级下的过渡状态)。与SEQ ID NO:4相反，发现酶SEQ ID NO:6具有动力学稳定性的较低提高(7kJ/mol的ΔEA, 去折叠)但具有高热力学稳定化(12.5kJ/mol的ΔΔGFU)。因而，这一变体具有置于甚至更高自由能级上的去折叠状态。另一方面，其折叠路径仅稍微更改，并且因此过渡状态具有比酶SEQ ID NO:2仅略高的能级。然而，对于酶SEQ IDNO:8，存在极高动力学稳定化(25kJ/mol的ΔEA,去折叠)和热力学稳定性的极高提高(23.5kJ/mol的ΔΔGFU)两者。对于热力学稳定性，提高接近但不同于SEQID NO:4与6的提高的稳定性的总和。然而，动力学稳定性的极大提高是源于在酶中成功引入两个二硫桥键(在迫使蛋白质经过未经勘察的路径折叠的位置处，该路径不同于酶SEQ ID NO:2、4和6)而同时保持折叠能力和酶促活性的不可预测效应。
实例11
通过酯酶活性测量测定的在高温下的寿命
SEQ ID NO:8的双二硫桥键变体的提高的热、热力学以及动力学稳定性应致使该变体在高温下具有高寿命。出于实际原因，通过酶的酯酶活性来监测其寿命。在具有螺帽和密封件以防止蒸发的管中在pH7.0的10mM tris-H2SO4中制备2.5mg/ml每一种酶变体的储备溶液。将这些储备溶液放置在处于所希望的温度(60℃、65℃或70℃)的经过加热的橱柜中，并且在不同时间点取出等分试样用于测量残余酯酶活性。通过将6μL蛋白质样本添加到比色皿中的1.44mL反应缓冲剂(50mM tris-H2SO4，pH8.5，离子强度用Na2SO4调整为0.1M)来测定酯酶活性。用反应剂(在冰冷的丙酮中的60μL 30mM对硝基苯基醋酸(pNPA))补充该样本，并且简单地混合，随后在分光光度计中在348nm下测量酯酶活性。对催化反应的吸光度的提高监测60秒，并且接着减去空白反应(未添加酶)的吸光度的提高。根据先前描述的方法[23]计算表观二阶速率常数(k′)。
作为时间零参考，测定每一种酶储备溶液在热处理之前的酯酶活性。发现三种二硫键变体(SEQ ID NO:4、6和8)在测量条件(约21℃)下的酯酶活性与HCA IIpwt变体的活性相比分别为99％、86％与78％。因而，所有二硫桥键变体还关于酯酶活性保持高活性，并且程度与CO2水合活性(实例8)大致相同。对照时间标绘每一种变体在每一个温度下的残余活性，并拟合到单个指数项(y＝a·e-kx)以获得每一种酶变体在三个温度下的去折叠速率常数。因为失活是一阶速率过程，因此可通过t1/2＝ln2/k计算每一种酶变体在每一个温度下的半衰期(t1/2)。寿命实验的结果呈现于表7到9以及图7中。
表7.
15分钟孵育之后残余酯酶活性百分比
表8.
2小时孵育之后残余酯酶活性百分比
表9.
酶变体在60℃到70℃下的失活速率常数(kU)、失活半衰期(t1/2)以及t1/10。
工程改造成SEQ ID NO:8的双二硫桥键变体的提高的物理稳定性导致比其他变体慢得多的失活速率，并且因而导致在升高的温度下的长得多的寿命。在60℃下，活性失活的半衰期对于SEQ ID NO:8的双二硫桥键变体为86天，这与在相同温度下即刻去折叠并且失活的HCA IIpwt(SEQ ID NO:2)相当。此外，SEQ ID NO:8的活性下降到1/10的时间在60℃下为约285天。即，如果两个不同反应器分别使用相同量的SEQ ID NO:8的工程改造HCA II与具有1/10活性的酶(例如，Cam)，那么具有SEQ ID NO:8的反应器即使是下降到Cam反应器的低开始值也将需要285天。因而，不仅物理稳定性本身，而且蛋白质的活性以及效率，对于酶的实用性是重要的。即使在70℃下(其中所有其他变体快速地去折叠并且失活)，酶SEQ ID NO:8仍具有可观的缓慢失活以及半衰期为1.6天的提高的寿命。以长寿命耐受60℃到70℃范围内的温度的能力是SEQ ID NO:8的一个极其重要的特征。在例如现代焚化厂处，烟气净化由过多的步骤组成，以致烟气在到达烟囱之前被冷却到约60℃到70℃[24]。因而，待用于焚化厂处的CO2捕获生物反应器中的任何酶应优选地在60℃到70℃的温度范围内还为稳定的并且具有活性，酶SEQ ID NO:8因而满足这一要求。此外，SEQ ID NO:8的二硫桥键的组合已工程改造为属于结构上保守的α-碳酸酐酶超家族的酶(HCA IIpwt)。为发现结构上相关的蛋白质，对照保守域数据库(CDD)[25]执行HCA II的三维结构(PDB ID2cba)的数据库检索，该数据库包括保守蛋白质域与分子建模数据库(MMDB)中的已知3维蛋白质结构的比对。该检索导致来自α-碳酸酐酶超家族的4977个具有相关保守域的蛋白质序列以及438个相关解决结构。因而，可识别HCA IIpwt的SEQ ID NO:8变体中的位置C23到C202与C99到C241之间的二硫桥键的结构基元的组合，并且最可能还通过如前所述的同源性建模移植到α-碳酸酐酶超家族的其他成员。实际上，SEQ ID NO:6的显著提高的稳定性最初是通过HCA II与来自淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)的关系较远的同源α-碳酸酐酶(NGCA，38.5％序列一致性，该α碳酸酐酶具有天然产生的二硫桥键)之间的同源性建模而实现。通过同源性建模，发现NGCA中二硫桥键的位置(序列位置C28和C181)在HCA II中在位置A23和L202处具有其三维结构等效位置。因而，通过对照关系较远的同源酶的同源性建模，几何学上正确的二硫桥键可以从NGCA移植到HCA II中的正确位置[17]。
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25)美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)，URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Claims (16)

1.具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，其序列对应于经修饰的人碳酸酐酶II，其中该多肽包括突变A23C、S99C、L202C、C205S以及V241C，具有与野生型碳酸酐酶II相比提高的物理稳定性，并且进一步包括在C23与C202之间和/或在C99与C241之间的二硫桥键。
2.根据权利要求1所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有与野生型碳酸酐酶II相比提高了23.5kJ/mol的一种热力学稳定性。
3.根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有与野生型碳酸酐酶II相比提高了18.5℃的一个解链点。
4.根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有与野生型碳酸酐酶II相比提高了25kJ/mol的一种去折叠活化能。
5.根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有在水中在21℃下与野生型人碳酸酐酶II相比慢约22.000倍的一个去折叠速率。
6.根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有在60℃下86天，在65℃下8天，并且在70℃下1.6天的一个半衰期。
7.根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，其中该经分离多肽在乙醇胺水溶液中维持其与野生型碳酸酐酶II相比提高的物理稳定性，这些乙醇胺包括甲基二乙醇胺(MDEA)、单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)以及氨基乙氧基乙醇。
8.根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，其中该序列是SEQ ID NO:8。
9.提高选自天然产生或经修饰α-碳酸酐酶超家族的碳酸酐酶(EC4.2.2.1)的物理稳定性的方法，包括将两个稳定二硫桥键的一个组合插入到SEQ ID NO:8中的C23、C99、C202以及C241的三维等效或序列同源位置，等效于野生型人碳酸酐酶II中的位置A23、S99、L202以及V241。
10.构建体，包括编码根据权利要求1到8中任一项所述的一种多肽的一种多核苷酸，该构建体可操作地键联到指导该多肽在一个表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
11.重组表达载体，包括根据权利要求10所述的构建体。
12.重组宿主细胞，包括如权利要求10所述的构建体或如权利要求11所述的重组表达载体。
13.根据权利要求1到8中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽的用途，用于从一种含有二氧化碳的介质中提取二氧化碳。
14.根据权利要求13所述的用途，其中该具有碳酸酐酶活性的经分离多肽被用于一个生物反应器中。
15.制备SEQ ID NO:8的经分离多肽的方法，包括通过在25℃到60℃的高温下，在一种氧化剂的存在下，在7到10的一个pH下，孵育该多肽来加速二硫桥键的形成。
16.经分离多核苷酸，具有一个编码如权利要求1到8中任一项所定义的多肽的序列。
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