JP5575923B2 - 抗凝固薬の解毒剤 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、医学の分野、特に抗凝固治療の分野に関するものである。
抗凝固薬は、血液凝固を防止する物質であって;すなわち抗凝固薬は血液が凝固するのを妨げる。抗凝固薬は、血栓性障害のための薬物療法としてのヒトの治療、例えば素因をもつ者における深部静脈血栓、肺塞栓、心筋梗塞および脳卒中の一次および二次予防に広く使用される。
一局面では、本発明は、抗凝固薬の活性を中和可能な抗体分子に関する。
[式中、
Aは、基Hetのベンゾ、ピリドまたはチエノ部分に結合されたカルボニルまたはスルホニル基を表し、
Bは、基Arに結合されたメチレン基が酸素もしくは硫黄原子によって、または−NR1−基によって置き換えられていてもよいエチレン基を表し、
ここで、R1は、水素原子またはC1−4−アルキル基を表し、
Eは、RbNH−C(=NH)−基を表し、
ここで、Rbは、水素原子、ヒドロキシ、C1−9−アルコキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニル−C1−3−アルコキシカルボニル、ベンゾイル、p−C1−3−アルキル−ベンゾイルまたはピリジノイル基を表し、一方で上記C1−9−アルコキシカルボニル基の2位のエトキシ部分は、C1−3−アルキルスルホニルまたは2−(C1−3−アルコキシ)−エチル基によって更に置換されていてもよく、
Arは、場合により塩素原子によって、またはメチル、エチルもしくはメトキシ基によって置換されている1,4−フェニレン基を表すか、あるいはArは2,5−チエニレン基を表し、
Hetは、1−(C1−3−アルキル)−2,5−ベンゾイミダゾリレン、1−シクロプロピル−2,5−ベンゾイミダゾリレン、2,5−ベンゾチアゾリレン、1−(C1−3−アルキル)−2,5−インドリレン、1−(C1−3−アルキル)−2,5−イミダゾ[4,5−b]ピリジニレン、3−(C1−3−アルキル)−2,7−イミダゾ[1,2−a]ピリジニレンまたは1−(C1−3−アルキル)−2,5−チエノ[2,3−d]イミダゾリレン基を表し、そして
Raは、R2NR3−基を表し、
ここで、R2は、カルボキシ、C1−6−アルキルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、C1−3−アルキルスルホニルアミノカルボニルもしくは1H−テトラゾール−5−イル基によって置換されていてもよいC1−4−アルキル基、
ヒドロキシ、ベンジルオキシ、カルボキシ−C1−3−アルキルアミノ、C1−3−アルコキシカルボニル−C1−3−アルキルアミノ、N−(C1−3−アルキル)−カルボキシ−C1−3−アルキルアミノもしくはN−(C1−3−アルキル)−C1−3−アルコキシカルボニル−C1−3−アルキルアミノ基によって置換されているC2−4−アルキル基であり、一方で上記基において隣接窒素原子に対してα−位にある炭素原子は、置換されていなくてもよく、
R3は、C3−7−シクロアルキル基、不飽和部分がR2NR3基の窒素原子に直接結合されていなくてもよいプロパルギル基、フッ素もしくは塩素原子によって、またはメチルもしくはメトキシ基によって場合により置換されているフェニル基、あるいはメチル基によって場合により置換されているピラゾリル、ピリダゾリルまたはピリジニル基を表すか、あるいは
R2およびR3は、それらの間の窒素原子と一緒になって、カルボキシまたはC1−4−アルコキシカルボニル基によって場合により置換されている5〜7員シクロアルキレンイミノ基を表し、フェニル環が更に縮合されていてもよい]
で示される二置換二環式複素環、その互変異性体、立体異性体および塩である。
(a) 2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾチアゾール−5−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−カルボキシエチル)−アミド、
(b) 2−[N−(4−アミジノフェニル)−N−メチル−アミノメチル]−ベンゾチアゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(c) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(d) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(3−ヒドロキシカルボニルプロピル)−アミド、
(e) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(ヒドロキシカルボニルメチル)−アミド、
(f) 1−メチル−2−[2−(2−アミジノチオフェン−5−イル)エチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(g) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(h) 1−メチル−2−[2−(4−アミジノフェニル)エチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(i) 1−メチル−2−[2−(4−アミジノフェニル)エチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(j) 1−メチル−2−[2−(4−アミジノフェニル)エチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−[2−(1H−テトラゾール−5−イル)エチル]−アミド、
(k) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−[2−(1H−テトラゾール−5−イル)エチル]−アミド、
(l) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−N−メチル−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(m) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−N−メチル−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(3−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(n) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−N−メチル−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(o) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−[(N−ヒドロキシカルボニルエチル−N−メチル)−2−アミノエチル]−アミド、
(p) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(3−フルオロフェニル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(q) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(4−フルオロフェニル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(r) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノ−2−メトキシ−フェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(s) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノ−2−メトキシ−フェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(t) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)アミノメチル]−インドール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−メトキシカルボニルエチル)−アミド、
(u) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)アミノメチル]−チエノ[2.3−d]イミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(v) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(w) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(x) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノ−2−メトキシ−フェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(y) 1−メチル−2−[N−[4−(N−n−ヘキシルオキシカルボニルアミジノ)フェニル]−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−エトキシカルボニルエチル)−アミド、
より選択される化合物、ならびにその互変異性体、立体異性体および塩である。
一局面では、本発明は、抗凝固薬の活性を中和可能な抗体分子に関する。
[式中、
Aは、基Hetのベンゾ、ピリドまたはチエノ部分に結合したカルボニルまたはスルホニル基を表し、
Bは、基Arに結合されたメチレン基が酸素もしくは硫黄原子によって、または−NR1−基によって置き換えられていてもよいエチレン基を表し、
ここで、R1は、水素原子またはC1−4−アルキル基を表し、
Eは、RbNH−C(=NH)−基を表し、
ここで、Rbは、水素原子、ヒドロキシ、C1−9−アルコキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニル−C1−3−アルコキシカルボニル、ベンゾイル、p−C1−3−アルキル−ベンゾイルまたはピリジノイル基を表し、一方で上記C1−9−アルコキシカルボニル基の2位のエトキシ部分は、C1−3−アルキルスルホニルまたは2−(C1−3−アルコキシ)−エチル基によって更に置換されていてもよく、
Arは、塩素原子によって、またはメチル、エチルもしくはメトキシ基によって場合により置換されている1,4−フェニレン基を表すか、もしくはそれは2,5−チエニレン基を表し、
Hetは、1−(C1−3−アルキル)−2,5−ベンゾイミダゾリレン、1−シクロプロピル−2,5−ベンゾイミダゾリレン、2,5−ベンゾチアゾリレン、1−(C1−3−アルキル)−2,5−インドリレン、1−(C1−3−アルキル)−2,5−イミダゾ[4,5−b]ピリジニレン、3−(C1−3−アルキル)−2,7−イミダゾ[1,2−a]ピリジニレンまたは1−(C1−3−アルキル)−2,5−チエノ[2,3−d]イミダゾリレン基を表し、そして
Raは、R2NR3−基を表し、
ここで、R2は、カルボキシ、C1−6−アルキルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、C1−3−アルキルスルホニルアミノカルボニルもしくは1H−テトラゾール−5−イル基によって置換されていてもよいC1−4−アルキル基、
ヒドロキシ、ベンジルオキシ、カルボキシ−C1−3−アルキルアミノ、C1−3−アルコキシカルボニル−C1−3−アルキルアミノ、N−(C1−3−アルキル)−カルボキシ−C1−3−アルキルアミノもしくはN−(C1−3−アルキル)−C1−3−アルコキシカルボニル−C1−3−アルキルアミノ基によって置換されているC2−4−アルキル基であり、一方で上記基において隣接窒素原子に対してα−位にある炭素原子は、置換されていなくてもよく、
R3は、C3−7−シクロアルキル基、不飽和部分がR2NR3基の窒素原子に直接結合されていなくてもよいプロパルギル基、フッ素もしくは塩素原子によって、またはメチルもしくはメトキシ基によって場合により置換されているフェニル基、あるいはメチル基によって場合により置換されているピラゾリル、ピリダゾリルまたはピリジニル基を表すか、あるいは
R2およびR3は、それらの間の窒素原子と一緒になって、カルボキシまたはC1−4−アルコキシカルボニル基によって場合により置換されている5〜7員シクロアルキレンイミノ基を表し、フェニル環が更に縮合されていてもよい]
で示される二置換二環式複素環、その互変異性体、立体異性体および塩である。式(I)で示される化合物、これらの化合物の調製および抗凝固薬としてのそれらの使用は、国際公開公報第98/37075号に記載されている。
(a) 2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾチアゾール−5−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−カルボキシエチル)−アミド、
(b) 2−[N−(4−アミジノフェニル)−N−メチル−アミノメチル]−ベンゾチアゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(c) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(d) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(3−ヒドロキシカルボニルプロピル)−アミド、
(e) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(ヒドロキシカルボニルメチル)−アミド、
(f) 1−メチル−2−[2−(2−アミジノチオフェン−5−イル)エチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(g) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(h) 1−メチル−2−[2−(4−アミジノフェニル)エチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(i) 1−メチル−2−[2−(4−アミジノフェニル)エチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(j) 1−メチル−2−[2−(4−アミジノフェニル)エチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−[2−(1H−テトラゾール−5−イル)エチル]−アミド、
(k) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−[2−(1H−テトラゾール−5−イル)エチル]−アミド、
(l) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−N−メチル−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(m) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−N−メチル−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(3−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(n) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−N−メチル−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(o) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−[(N−ヒドロキシカルボニルエチル−N−メチル)−2−アミノエチル]−アミド、
(p) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(3−フルオロフェニル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(q) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(4−フルオロフェニル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(r) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノ−2−メトキシ−フェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(s) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノ−2−メトキシ−フェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(t) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)アミノメチル]−インドール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−メトキシカルボニルエチル)−アミド、
(u) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)アミノメチル]−チエノ[2.3−d]イミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(v) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−フェニル−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(w) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノフェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(x) 1−メチル−2−[N−(4−アミジノ−2−メトキシ−フェニル)−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−ヒドロキシカルボニルエチル)−アミド、
(y) 1−メチル−2−[N−[4−(N−n−ヘキシルオキシカルボニルアミジノ)フェニル]−アミノメチル]−ベンゾイミダゾール−5−イル−カルボン酸−N−(2−ピリジル)−N−(2−エトキシカルボニルエチル)−アミド、
より選択される化合物、その互変異性体、立体異性体および塩であり、それらの全ては、国際公開公報第98/37075号に記載されている。
を有するダビガトラン(CAS211914−51−1、N−[2−(4−アミジノフェニルアミノメチル)−1−メチル−1H−ベンゾイミダゾール−5−イルカルボニル]−N−(2−ピリジル)−β−アラニン)である。
で示されるプロドラッグとして適用される。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gin、his、lys、arg;
(5)鎖の配向に影響する残基:gly、pro;および
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
(a)発現制御配列と機能的に関連して該抗体分子をコードする一つ以上の核酸を含む宿主細胞を提供すること、
(b)該宿主細胞を培養すること、および
(c)細胞培養物から抗体分子を回収すること
を含む方法に関する。
I. ポリクローナル抗ダビガトラン抗体の製造
ポリクローナル抗ダビガトラン抗体の製造のために、2種の異なるハプテンおよびハプテンと担体タンパク質(BSA)の異なるモル投入量比で、3種の異なる免疫原を製造した。
ハプテンである、ハプテン1およびハプテン2を以下のように合成した:
ハプテン1 2−[(4−カルバムイミドイル−フェニルアミノ)−メチル]−1−メチル−1H−ベンゾイミダゾール−5−カルボン酸[2−(4−アミノ−ブチルカルバモイル)−エチル]−フェニル−アミド
4−メチルアミノ−3−ニトロ−安息香酸クロリド(23.3mmol)および3−フェニル−アミノ−プロピオン酸メチルエステル(23.3mmol)の無水テトラヒドロフラン(THF)80mL中の溶液に、トリエチルアミン(50.2mmol)を撹拌しながら室温で滴下により加えた。3時間後に反応混合物を蒸発乾固し、残りの固体を水で粉砕し、固体生成物を濾過により単離した。
収率:99%
C18H19N3O5(357.36)
TLC(シリカゲル;ジクロロメタン/エタノール 19:1):Rf=0.48
触媒としてPd(炭上に10%)を用いてエタノール中で室温で水素化することによって生成物1aのニトロ基を還元した。
収率:99%
C18H21N3O3(327.38)
TLC(シリカゲル;ジクロロメタン/エタノール 9:1):Rf=0.23
質量スペクトル(ESI):[M+H]+=328
生成物1b(23.2mmol)およびN−(4−シアノ−フェニル)−グリシン(23.2mmol)を無水THF中で室温にてCDI(23.2mmol)でカップリングさせた。反応の完了後に、その混合物を蒸発乾固させ、粗生成物をさらに精製せずに使用した。
収率:97%
C27H27N5O4(485.54)
質量スペクトル(ESI):[M+H]+=486
生成物1c(22.6mmol)の濃酢酸100mL中の溶液を1時間加熱還流した。次に、その溶液を蒸発乾固し、残った固体を水で粉砕し、撹拌しながらpHを約8〜9に調整した。酢酸エチルで抽出することによって粗生成物を単離し、シリカゲルを用いたクロマトグラフィー(溶離液:ジクロロメタン/エタノール 1:1)によって精製した。
収率:58%
C27H25N5O3(467.52)
TLC(シリカゲル;ジクロロメタン/エタノール 9:1):Rf=0.71
質量スペクトル(ESI):[M+H]+=468
生成物1d(13.0mmol)の100mLメタノール中の溶液に、水酸化ナトリウム(20.0mmol)を添加した。その混合物を40℃で2.5時間撹拌し、次に蒸発乾固した。残った固体を水100mLと一緒に撹拌し、そして濃酢酸でpHを約6に調整した。沈殿した生成物を濾過によって単離し、水で洗浄し、60℃で乾燥させた。
収率:88%
C26H23N5O3(453.49)
TLC(シリカゲル;ジクロロメタン/エタノール 9:1):Rf=0.33
質量スペクトル(ESI):[M+H]+=454
生成物1e(5.23mmol)、2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート(TBTU、5.23mmol)およびN−メチル−モルホリン(5.23mmol)のDMF 20mL中の溶液を室温で30分間撹拌した。次に、(4−アミノ−ブチル)−カルバミン酸tert−ブチルエステル(5.23mmol)を添加し、その混合物を室温で新たに24時間撹拌した。次に、その混合物を水(100mL)で希釈し、酢酸エチルで抽出することによって生成物を単離した。
収率:92%
C35H41N7O4(623.75)
TLC(シリカゲル;ジクロロメタン/エタノール 9:1):Rf=0.51
生成物1f(4.81mmol)をHClの飽和エタノール溶液(250mL)に溶解させ、その混合物を室温で一晩撹拌し、次に30℃で蒸発乾固した。残った原材料を無水エタノール200mLに溶解させ、次に炭酸アンモニウム(48.1mmol)を添加し、その混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒の蒸発後に、残った原材料をエタノール約5mLと一緒に摩砕し、不溶性物質を濾過によって分離し、溶媒を30℃で蒸発させた。次に、生成物を水30mLに溶解させ、溶液を約2gの炭と一緒に撹拌し、濾過し、蒸発乾固した。
収率:90%
C30H36N8O2(540.67)
TLC(逆相RP−8;メタノール/5%NaCl水溶液 9:1):Rf=0.79
質量スペクトル(ESI):[M+H]+=541
[M+Cl]−=575/7
水酸化ナトリウム(50.0mmol)のエタノール500mLおよび水50mL中の溶液に、3−({2−[(4−シアノ−フェニルアミノ)−メチル]−1−メチル−1H−ベンゾイミダゾール−5−カルボニル}−ピリジン−2−イル−アミノ)−プロピオン酸エチルエステル(41.4mmol)を添加した。その混合物を室温で3時間撹拌し、次にエタノール約350mLを留出させ、水約100mLを添加し、pHを6に調整した。次にジエチルエーテル(50mL)を添加し、その混合物を一晩撹拌した。生成物を濾過により単離し、さらに精製せずに使用した。
収率:78%
C25H22N6O3(454.48)
生成物2a(2.20mmol)、2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU、2.20mmol)およびN−メチル−モルホリン(2.20mmol)の無水テトラヒドロフラン(100mL)中の溶液を室温で15分間撹拌した。次に(2−アミノ−エチル)−カルバミン酸tert−ブチルエステル(2.20mmol)を添加し、そしてその混合物を室温で新たに24時間撹拌した。次にその混合物を水40mLで希釈し、酢酸エチルで抽出することによって生成物を単離し、クロマトグラフィー(シリカゲル;ジクロロメタン/メタノール 15:1)によって精製した。
収率:61%
C32H36N8O4(596.68)
質量スペクトル(ESI):[M+H]+=597
[M+H]−=595
生成物2b(1.34mmol)をHClの飽和無水エタノール溶液(30mL)に添加した。その溶液を室温で5時間撹拌し、次に30℃で蒸発乾固した。エタノール(30mL)および炭酸アンモニウム(13.0mmol)を添加し、そしてその混合物を室温で一晩撹拌した。次に溶媒を蒸発させ、無機塩からの生成物を分離するために残った物質をジクロロメタン/メタノール(30:1)混合物約4mLで5回粉砕し、濾過し、蒸発させた。
収率:27%
C27H31N9O2(513.61)
質量スペクトル(ESI):[M+Cl]−=548/50
[M+HCl+Cl]−=584/6
[M+H]+=514
2.1 試薬合成用の化学物質
ウサギの免疫系を刺激してダビガトランに対するポリクローナル抗体を生成するために、カップリング試薬として1,4−ベンゾキノンまたは1,1’−カルボニル−ジ−(1,2,4−トリアゾール)を使用して、ハプテンであるハプテン1およびハプテン2を担体タンパク質であるウシ血清アルブミン(BSA)にカップリングさせることによって、3種の免疫原(ロット番号GL256、GL258、およびGL262)を合成した。
0.1M KH2PO4緩衝液8.5mL中の0.75μMol BSAの溶液(pH=4.5)に、0.416mMol 1,4−ベンゾキノン(エタノール1.5mL中)を添加し、そして室温、暗中で1.5時間インキュベーションした。その後0.15M NaClで平衡化したセファデックスG25カラムにその溶液を通過させ、過剰の1,4−ベンゾキノン(最終体積12.5mL)を除去した。
N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)6.3mL中の158μMolハプテン2の溶液を室温で調製した。158μMol 1,1’−カルボニル−ジ−(1,2,4−トリアゾール)を添加し、そしてまず10℃で4時間、そしてその後室温で30分間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィーで化学反応をチェックし、そしてそれは約20〜25%であった。次に、0.75μMol BSAを0.13M NaHCO3 2mLに溶解させ、撹拌しながらN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)1mLを滴下により加えた。pHを約8.3に調整した。その後、撹拌しながらハプテン溶液(6.3mL)および0.13M NaHCO3 4mLをBSA溶液に滴下により加え、pHを8.4に調整した。免疫原GL258についてハプテンと担体タンパク質のモル投入量比は210:1であった。
N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)8.75mL中の225μMolハプテン2の溶液を室温で調製した。225μMol 1,1’−カルボニル−ジ−(1,2,4−トリアゾール)を添加し、そして10℃で4時間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィーで化学反応をチェックし、それは約20〜25%であった。
4.1 GL261の合成
N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)1.5mL中の37.4μMolハプテン2の溶液を室温で調製した。37.5μMol 1,1’−カルボニル−ジ−(1,2,4−トリアゾール)を添加し、そしてまず10℃で4時間、そしてその後室温で30分間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィーで化学反応をチェックし、それは約20〜25%であった。
5.1 ウサギの免疫処置
12匹の雌チンチラウサギ(3月齢)を、100μg免疫原GL256、GL258およびGL262の、0.9% NaCl溶液0.5mLおよびフロイント完全アジュバント(CFA)0.5mLのエマルションで免疫化した。何回かの追加免疫処置を翌月に続けた。3回目の免疫処置については、フロイント不完全アジュバント(IFA)0.5mLを使用した。4箇所の皮下部位および4箇所の筋肉内部位に各免疫処置を行った。
ウサギ1 #50
ウサギ2 #51
ウサギ3 #52
ウサギ4 #53
B群 − 免疫原GL258
ウサギ5 #54
ウサギ6 #55
ウサギ7 #56
ウサギ8 #57
C群 − 免疫原GL262
ウサギ9 #46
ウサギ10 #47
ウサギ11 #48
ウサギ12 #49
*ウサギ番号1〜12を5回目の免疫処置の10日後に完全に瀉血した。
キシラジン(Rompun(登録商標), Bayer, Leverkusen, Germany)および塩酸ケタミン(Ketavet(登録商標), Parke-Davis, Freiburg, Germany)での麻酔下で、頸動脈を介して瀉血を行った。
凝固したウサギ血液の遠心分離によって血清を調製した。硫酸アンモニウム沈殿およびセファデックスG25カラム内に通過させる脱塩によってタンパク質画分を得た。
最後の3個の欄:値はダビガトランに関するものである。
ウサギ番号5(#54)、採血番号2およびウサギ番号2、3および5採血番号3(最後の採血)の抗血清を硫酸アンモニウムで沈殿させた。沈殿を4500U/min、10℃で30分間遠心分離し、溶液から分離し、トリス緩衝液中に再溶解させた。この手順を繰り返した。プロテインAセファロースFFを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってさらなる精製を行った。カラム緩衝液は0.01Mトリス(pH=7.5)であり、そして0.1Mグリシン(pH=3.0)を溶離のために使用した。ウサギIgGを含有する画分を合わせた。タンパク質濃度は、280nmでのUV分光法によって決定した。
2系列の実験を行って、ダビガトラン抗凝固活性に対する抗体のin vitro作用を示した。4種のポリクローナル抗体を実験室に受け入れ、ヒト血漿でさらに試験した。これを機能的アッセイであるトロンビン凝固時間で試験した。
簡潔には、3.13%クエン酸ナトリウムへ全血を入れて、ヒト血漿を得る。次に、これを遠心分離して無血小板血漿を得て、そして別個のチューブに移し、アッセイの日に必要とされるまで凍結する。アッセイの日に血漿を37℃で解凍する。
1. モノクローナル抗ダビガトラン抗体およびFabの製造
ヘモシアニンおよび免疫グロブリンなどの担体タンパク質にコンジュゲーションしたハプテン1(実施例1.1参照)をマウスに免疫処置し、標準的な手順によりハイブリドーマを発生させた。培養上清から精製されたモノクローナル抗体は、ダビガトラン−タンパク質コンジュゲートに結合し、そしてこの結合を溶液中のダビガトランと1〜10nMの範囲の濃度の最大半値阻害で競合することができた。モノクローナル抗体のパパイン切断に続く、プロテインAによるFcドメインの除去によってFabを生成させた。
3種のモノクローナル抗体クローンの可変ドメイン配列を図5および6に示す。クローン13の可変ドメインのアミノ酸配列を図5(DBG 13 VH、重鎖、配列番号:16)および図6(DBG 13 VK、軽鎖、配列番号:17)に示す。クローン14の可変ドメインのアミノ酸配列を図5(DBG 14 VH、重鎖、配列番号:18)および図6(DBG 14 VK、軽鎖、配列番号:19)に示す。クローン22の可変ドメインのアミノ酸配列を図5(DBG 22 VH、重鎖、配列番号:20)および図6(DBG 22 VK、軽鎖、配列番号:21)に示す。
人間に投与後の潜在的免疫原性を減少させるために、マウスモノクローナル抗体を「ヒト化」した。マウス先導物のために、フレームワークの相同性、CDRの構造、保存されたカノニカル残基、保存された界面充填残基および他のパラメーターに基づきヒトフレームワーク配列を選択した。これらのフレームワーク位置におけるアミノ酸残基の特異的置換は、結合親和性および/または安定性を含めた抗体の性能の様々な局面を、ヒト生殖細胞系フレームワーク領域へのCDRまたはHVLの「直接スワップ」によって形成されたヒト化抗体において実証されたものよりも改善することができる。キメラ親Fabに比べて、より良いまたは同等の結合と改善された発現とを示したFabを、さらなる特徴づけのために選択した。ヒト化Fabの可変ドメインのアミノ酸配列を、図5(Eng VH 14、配列番号:22;ENG VH 15、配列番号:24;およびENG VH 31、配列番号:26)および図6(Eng VK 11、配列番号:23;ENG VK 17、配列番号:25;およびENG VK 18、配列番号:27)に示す。Eng VH 15およびEng VK 18を含むFab(軽鎖:配列番号:37;重鎖:配列番号:36)をCHO細胞に直接発現させ、カッパー選択およびプロテインG樹脂を使用して精製した。
インタクトな抗体のLys−C切断によって生成された18/15 Fabフラグメントを、実施例IIに概要されたトロンビン凝固時間アッセイにおいてそれがヒト血漿でのダビガトラン抗凝固活性を中和する能力について試験した。Fabは、ヒト血漿におけるトロンビン依存性凝固のダビガトラン介在性延長を2.6nMのIC50で用量依存的に完全にリバースした(図10)。直接発現されたFabフラグメントおよびインタクトな抗体のパパイン切断によって生成されたFabフラグメントもまた、それぞれ2.6および2.7nMのIC50でダビガトランの抗凝固活性を中和した。
ラット(雄性Wistar、約300g)を、ペントバルビタールでボーラス(60mg/kg i.p.)および維持麻酔のための連続注入(20mg/kg/hr i.p.)として麻酔し、内部体温を維持するために37℃の温熱パッド上に置いた。採血のために頸動脈を、物質投与のために右頸静脈を分離し、カニューレを挿入した。ダビガトランをボーラスとして開始し(0.3μM/kg)、続いて20分間かけて注入し(0.1μM/kg/hr)、定常状態の血漿レベルを達成した。20分後に、左頸静脈を介してFabを等モル濃度または等モル濃度の半分のいずれかで単回ボーラスとしてi.v.注射した。血液試料(3.13%クエン酸ナトリウム中に1/10希釈)をベースライン(−20、−2min)で、そしてFab注射後に様々な間隔で30分間採取する。
Claims (32)
- ダビガトランに対して結合特異性を有する、配列番号:1および配列番号:2から成る群より選択されるCDR1、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、および配列番号:8から成る群より選択されるCDR2、ならびに配列番号:9および配列番号:10から成る群より選択されるCDR3を有する重鎖可変ドメインと、配列番号:11、配列番号:12、および配列番号:13から成る群より選択されるCDR1、配列番号:14で示されるCDR2、ならびに配列番号:15で示されるCDR3を有する軽鎖可変ドメインとを含む、ダビガトランの活性を中和可能な抗体分子。
- ダビガトランおよびダビガトランの1−O−アシルグルクロニドの活性を中和可能である、請求項1記載の抗体分子。
- 配列番号:1で示されるCDR1、配列番号:6、配列番号:7、および配列番号:8から成る群より選択されるCDR2、ならびに配列番号:10で示されるCDR3を有する重鎖可変ドメインと、配列番号:13で示されるCDR1、配列番号:14で示されるCDR2、ならびに配列番号:15で示されるCDR3を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項2記載の抗体分子。
- 配列番号:16、18、20、22、24、および26から成る群より選択される重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号:17、19、21、23、25、および27から成る群より選択される軽鎖可変ドメインを含む、請求項3記載の抗体分子。
- 配列番号:16で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号:17で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号:18で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号:19で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号:20で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号:21で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号:22で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号:23で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号:24で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号:25で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号:24で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号:27で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号:26で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号:27で示される軽鎖可変ドメインを含む、請求項4の抗体分子。
- ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、特にFab、Fab’、もしくはF(ab’)2フラグメント、単鎖抗体、特に単鎖可変フラグメント(scFv)、小モジュラー免疫医薬(SMIP)、ドメイン抗体、ナノボディ、ダイアボディ、または設計されたアンキリン反復タンパク(Designed Ankyrin Repeat Protein)(DARPin)である、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体分子。
- Fab、Fab’、もしくはF(ab’) 2 フラグメント、または単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項6記載の抗体分子。
- 重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、および配列番号:31から成る群より選択されるリンカーペプチドを介して相互に結合されている、scFvである、請求項6又は7記載の抗体分子。
- 配列番号:32または配列番号:33で示されるアミノ酸配列を含む、請求項8記載の抗体分子。
- 配列番号:34または配列番号:40で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:35で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、または配列番号:42で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:43で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項7記載の抗体分子。
- 配列番号:36、配列番号:38、または配列番号:41で示されるアミノ酸配列を含むFdフラグメントおよび配列番号:37または配列番号:39で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有するFab分子である、請求項6又は7の抗体分子。
- 医薬に使用するための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体分子。
- 抗凝固治療の副作用の治療もしくは予防に使用するための、および/または抗凝固薬の過剰投与をリバースするための、請求項1〜12のいずれか一項記載の抗体分子。
- 副作用が出血事象である、請求項13記載の抗体分子。
- 抗凝固治療の副作用、または抗凝固治療での過剰投与事象の治療または予防のための医薬組成物であって、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体分子の有効量を含む医薬組成物。
- 請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体分子を製造する方法であって、
(a)発現制御配列と機能的に関連して、該抗体分子をコードする一つ以上の核酸を含む宿主細胞を提供すること、
(b)該宿主細胞を培養すること、および
(c)細胞培養物から該抗体分子を回収すること
を含む方法。 - 請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体分子またはその抗体分子を含む医薬組成物を含むキット。
- (a)請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体分子またはその抗体分子を含む医薬組成物;
(b)容器;および
(c)ラベル
を含むキット。 - 請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体分子、およびダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩を含むキット。
- ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の形態が、固体、液体またはゲルの形態である、請求項19記載のキット。
- ダビガトランエテキシラートの薬学的に許容されうる塩がメシラート塩である、請求項19記載のキット。
- 用量単位あたりのダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の強度が、1日1回または1日2回のいずれかで75mg〜300mgの間である、請求項19または21記載のキット。
- (a)請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体分子、またはその抗体分子を含む医薬組成物;
(b)ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の医薬組成物;
(c)容器;および
(d)ラベル
を含むキット。 - ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の形態が、固体、液体またはゲルの形態である、請求項23記載のキット。
- ダビガトランエテキシラートの薬学的に許容されうる塩がメシラート塩である、請求項23記載のキット。
- 用量単位あたりのダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の強度が、1日1回または1日2回のいずれかで75mg〜300mgの間である、請求項23または25記載のキット。
- (a)ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩を含む第1の医薬組成物;
(b)請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体分子を含む第2の医薬組成物;
(c)患者に該第1および第2の医薬組成物を別々に投与するための説明書
を含み、該第1および第2の医薬組成物が、別々の容器に入っており、そして該第2の医薬組成物が、ダビガトランまたはダビガトランの1−O−アシルグルクロニドの中和または部分中和を必要とする患者に投与されるキット。 - ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩で処置されている患者におけるダビガトランまたはダビガトランの1−O−アシルグルクロニドを中和または部分中和するための、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体分子。
- 患者におけるダビガトランまたはダビガトランの1−O−アシルグルクロニドを中和または部分中和するため:
(a)患者がダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩で処置されていたこと、および該患者によって取り込まれた量を確認すること;
(b)ダビガトランまたはダビガトランの1−O−アシルグルクロニドが、凝固または血液凝固の試験またはアッセイの結果の正確な読み出しを妨害するであろう該試験またはアッセイを行う前に、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体でダビガトランまたは1−O−アシルグルクロニドを中和すること;
(c)ダビガトランまたはダビガトランの1−O−アシルグルクロニドも存在しないときの血餅形成レベルを決定するために、該患者から採取された試料の凝固または血液凝固の試験またはアッセイを行うこと;ならびに
(d)患者における血餅形成と分解の間に適切なバランスを達成するために、該患者に投与されるダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の量を調整すること
を含む方法に使用される、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体分子。 - ダビガトランまたはダビガトランの1−O−アシルグルクロニドに対する抗体の量が、0.1〜100の間のモル比である、請求項28または29記載の抗体分子。
- ダビガトランまたはダビガトランの1−O−アシルグルクロニドに対する抗体の量が、0.1〜10の間のモル比である、請求項30記載の抗体分子。
- 試験またはアッセイの結果の正確な読み出しが、フィブリノーゲンレベル、または活性化プロテインC抵抗性の正確な読み出しである、請求項29記載の抗体分子。
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