JP5529534B2 - 4−ヒドロキシチオベンズアミド薬剤誘導体 - Google Patents
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Description
ニコチン、コリン様作用薬などの抗痴呆薬は、特に酸化ストレスの病態においては低い忍容性で特徴付けられる。
従って、先行技術の薬剤における欠点を示すことなく、酸化ストレスおよび/または内皮機能障害の病的状態にある患者に投与可能な、毒性が低くおよび/または高い効能を有する改善された治療効果を示す有効な薬剤が必要とされる。
驚くべきことに、本発明者らは、4−ヒドロキシチオベンズアミド(本願明細書において4−HTB若しくはTBZとも称する)が組織中の有効なH2S放出成分であり、薬剤と共有結合するか薬剤とともに塩を形成した場合、副作用が軽減された薬剤誘導体が形成されることを発見した。例えば、本発明の薬剤誘導体による胃腸系および/または心臓血管系副作用は有意に軽度である。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある(国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【特許文献01】 米国特許出願公開第2002/0165276号明細書
【特許文献02】 米国特許出願公開第2003/0119903号明細書
【特許文献03】 米国特許出願公開第2006/0270635号明細書
【特許文献04】 米国特許出願公開第2007/0197479号明細書
【特許文献05】 米国特許第4,301,163号明細書
【特許文献06】 米国特許第4,412,992号明細書
【特許文献07】 米国特許第4,440,763号明細書
【特許文献08】 米国特許第4,751,221号明細書
【特許文献09】 米国特許第5,013,727号明細書
【特許文献10】 米国特許第5,245,080号明細書
【特許文献11】 米国特許第5,541,170号明細書
【特許文献12】 米国特許第5,811,547号明細書
【特許文献13】 米国特許第6,197,341号明細書
【特許文献14】 米国特許第6,353,024号明細書
【特許文献15】 米国特許第6,458,776号明細書
【特許文献16】 米国特許第6,602,915号明細書
【特許文献17】 米国特許第6,986,901号明細書
【特許文献18】 米国特許第7,041,704号明細書
【特許文献19】 国際公開第98/48826号
【特許文献20】 国際公開第04/006902号
【特許文献21】 国際公開第06/125293号
【特許文献22】 国際公開第06/125295号
【特許文献23】 カナダ特許第2,204,747号明細書
【特許文献24】 欧州特許第1,645,288号明細書
【非特許文献】
A−Y−X (化学式I)
式中、Aは薬剤遊離基であり、Yは−C(O)−、−C(O)NH−、−C(O)OC(O)、−C(O)NHCH2C(O)−、O、S、N、
NSAID誘導体[2−(2,6−ジクロロ−フェニルアミノ)−フェニル]−酢酸 4−チオカルバモイル−フェニルエステルの合成を例に用いてスキーム1を以下に示す。このスキームでは、NSAIDに共有結合した硫化水素放出部分にローソン試薬を用いて硫黄基を加える。
蛍光指示薬を加えたMacherey−Nagelシリカゲル50プレート上で薄層クロマトグラフィを行い、プレートを紫外線(254nm)で視覚化した。カラムクロマトグラフィにはKieselgel 60を用いた。合成試薬はいずれもAldrich−Sigma Chemical Companyから購入し、精製せずに用いた。溶剤の純度は分析用試薬以上であり、供給されたままの状態で使用した。真空内での溶剤除去にはBuchi R−114 Rotavaporを用いた。構造をプロトン1H−NMRおよび13C−NMRにより分光学的に検証した。スペクトルはVarian Mercury Plus 400装置に記録した。化学シフトは内部基準としてMe4Siを参照した。Applied Biosystem API 2000 質量分析により前記合成産物の質量スペクトルを計測した。Buchi B−540で融点を測定した。最終化合物の純度をRP−HPLCで測定した。カラムをRheodyneモデル7725インジェクタ、Waters 600 HPLC システム、Waters 486調節可能吸光度検出器(215若しくは235nmに設定)、Water 746チャート式記録計に接続した。合成された化合物の元素分析の結果は満足すべきものであった。分析は元素記号のみによって示され、結果は理論値±0.4%以内である。
N,N−ジメチルホルムアミド50mL中に1(ジクロフェナク、890mg、3.0mmol)を加えた溶液中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール(445mg、3.3mmol)およびDCC(680mg、3.3mmol)を加え、0℃で1時間撹拌した。前記反応混合液に4−ヒドロキシベンズアミド(4、616mg、4.5mmol)を加え、0℃で1時間、室温で3時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下に蒸発させ、得られた油性残留物をクロロホルムに溶解した。有機層を塩水で洗浄し、無水MgSO4上で乾燥させ、濾過し、溶剤を蒸発させた。粗生成物5をシリカゲル・オープンカラムに加え、CH2Cl2/MeOH(9/1)で溶出し、そこから4−カルバモイルフェニル 2−(2−(2,6−ジクロロフェニルアミノ)フェニル)アセテート(5)を得た(212mg、収率17%)。
4−カルバモイルフェニル 2−(2−(2,6−ジクロロフェニルアミノ)フェニル)アセテート(5,480mg、11.4mmol)およびローソン試薬(460mg、1.14mmol)を無水ベンゼン20mLに溶解した。反応液を50℃まで温め、6時間にわたって撹拌した。減圧下に前記溶剤を除去し、粗残留物をシリカゲル・カラム(ジクロロメタン/メチルアルコール 9.5/0.5)で精製し、当該純粋化合物6(446mg、収率91%)を得た。
1H NMR(CDCl3):δ4.07(s、2H)、6.59(d、1H)、6.67(s、1H)、6.98(t、1H)、7.14(t、1H)、7.19(d、1H)、7.28(t、1H)、7.33(d、2H)、7.63(s、1H)、7.97(d、2H);
13C NMR(DMSO−d6):δ38.8、118.8、121.8、122.6、123.7、124.4、128.7、129.1、131.2、137.2、137.8、142.9、153.5、170.5、193.2、201.7
MS(El)、m/e 431(M+);
m.p.:170〜172℃。
ジメチルホルムアミド15mLに1(ルミラコキシブ、223mg、0.75mmol)を加えた溶液中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール(111mg、0.825mmol)およびDCC(170mg、0.825mmol)を加え、0℃で1時間撹拌した。前記反応混合液に4−ヒドロキシベンズアミド(4、154mg、1.125mmol)を加え、0℃で1時間、室温で3時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下に蒸発させ溶剤を除去した。こうして得られた油性残留物をクロロホルムに溶解し、有機層を塩水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、溶剤を蒸発させた。得られた粗生成物5をシリカゲル・オープンカラムに加え、CH2Cl2/MeOH(9/1)で溶出し、そこから4−カルバモイルフェニル−2−(2−(2−クロロー6−フルオロフェニルアミノ)−5−メチルフェニル)アセテート(5)を得た(111mg、収率35%)。
4−カルバモイルフェニル−2−(2−(2−クロロ−6−フルオロフェニルアミノ)−5−メチルフェニル)アセテート、5(110mg、0.27mmol)、およびローソン試薬(109mg、0.27mmol)を無水ベンゼン15mLに溶解した。反応液を60℃まで温め、3時間にわたって撹拌した。減圧下に前記溶剤を除去し、得られた粗残留物をシリカゲル・カラム(ジクロロメタン/メチルアルコール 9.5/0.5)で精製し、純粋化合物6を得た(59mg、収率51%)。
1H NMR(CDCl3):δ2.32(s、3H)、4.01(s、2H)、6.46(s、1H)、6.70(d、1H)、6.92(t、1H)、7.01(d、2H)、7.11(d、2H)、7.19(d、1H)、7.62(s、NH)、7.84(d、2H);
13C NMR(DMSO−d6):δ20.8、30.7、115.1、119.2,122.0、122.3、124.1、124.9、126.1、128.2、129.2,132.3、134.8、138.6、140.9、153.7、154.6、156.2、170.4、201.7
MS(El)、m/e 429(M+);
m.p.:120〜122℃。
ジメチルホルムアミド15mLに1(アセチルサリチル酸、500mg、2.77mmol)を加えた溶液中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール(412mg、3.05mmol)およびDCC(628mg、3.05mmol)を加え、0℃で1時間撹拌した。前記反応混合液に4−ヒドロキシベンズアミド(4、418mg、3.05mmol)を加え、0℃で1時間、室温で3時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下に蒸発させ溶剤を除去した。こうして得られた油性残留物をクロロホルムに溶解し、有機層を塩水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、溶剤を蒸発させた。粗生成物5をシリカゲル・オープンカラムに加え、CH2Cl2/MeOH(9/1)で溶出し、そこから4−カルバモイルフェニル 2−アセトキシ安息香酸(5)を得た(410mg、収率47%)。
4−カルバモイルフェニル 2−アセトキシ安息香酸、5(410mg、1.37mmol)およびローソン試薬(554mg、1.37mmol)を無水ベンゼン35mLに溶解した。反応液を60℃まで温め、3時間にわたって撹拌した。減圧下に溶剤を除去し、得られた粗残留物をシリカゲル・カラム(ジクロロメタン/メチルアルコール 9.5/0.5)で精製し、純粋化合物6 470mgを得た。得られた化合物を2溶剤システムによる分取RP−HPLCで精製した:A:0.1%TFA中に100%アセトニトリル、B:0.1%TFA(35分間に10%Aから60%Aの直線勾配、254nmでUV検出、流速30mL/分)に100%H2Oを加えることにより前記純粋化合物6(324mg、収率71%)が得られる。
1H NMR(CDCl3):δ2.30(s、3H)、7.17(d、1H)、7.21(d、2H)、7.40(t、1H)、7.66(t、1H)、7.94(d、2H)、8.2(d、1H)。
13C NMR(DMSO−d6):δ21.2、121.9、122.4、124.3、126.4、128.7、132.4、135.1、137.3、151.5、153.7、162.7、169.8、201.8
MS(El)、m/e 316(M+);
m.p.:154〜156℃。
ジメチルホルムアミド60mLに1(インドメタシン、3g、8.38mmol)を加えた溶液中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.25g、9.22mmol)およびDCC(1.9g、9.22mmol)を加え、0℃で1時間撹拌した。前記反応混合液に4−ヒドロキシベンズアミド(4、1.72g、12.6mmol)を加え、0℃で1時間、室温で2時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下に蒸発させ溶剤を除去した。こうして得られた油性残留物を酢酸エチルに溶解し、有機層を塩水、5%NaHCO3、10%クエン酸で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、溶剤を蒸発させた。得られた粗生成物5をシリカゲル・オープンカラムに加え、CH2Cl2/MeOH(9.5/0.5)で溶出し、そこから4−カルバモイルフェニル−2−[1−(4−クロロベンゾイル)−5−メトキシー2−メチル−インドール−3−イル]―酢酸(5)を得た(479mg、収率12%)。
4−カルバモイルフェニル−2−[1−(4−クロロベンゾイル)−5−メトキシー2−メチルーインドール−3−イル]−アセテート、5(340mg、0.71mmol)、ローソン試薬(287mg、0.71mmol)を無水ベンゼン15mLに溶解した。反応物を60℃まで温め、4時間にわたって撹拌した。減圧下に溶剤を除去し、得られた粗残留物をシリカゲル・カラム(ジクロロメタン/メチルアルコール 9.5/0.5)で精製し、粗化合物6 178mgを得た。得られた化合物を2溶剤システムによる分取RP−HPLCで精製した:A:0.1%TFA中に100%アセトニトリル、B:0.1%TFA(30分間に10%Aから80%Aの直線勾配、254nmでUV検出、流速30mL/分)中に100%H2Oを加えることにより純粋化合物6(56mg、収率16%)が得られる。
1H NMR(CDCl3):δ2.45(s、3H)、3.83(s、3H、OCH3)、3.91(s、2H)、6.70(d、1H)、6.88(d、1H)、7.04(s、1H)、7.11(d、2H)、7.47(d、2H)、7.67(d、2H)、7.88(d、2H)。
13C NMR(DMSO−d6):δ13.6、30.8、56.0、101.5、111.9、112.0、115.3、121.7、128.6、129.4、130.8、131.2、131.4、134.0、136.8、137.1、139.7、156.2、157.9、167.6、169.8、201.8
MS(El)、m/e 493(M+);
m.p.:224〜226℃。
ジメチルホルムアミド80mLに1(ナプロキセン、4g、17.4mmol)を加えた溶液中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール(2.59g、19.14mmol)およびDCC(2.59g、19.14mmol)を加え、0℃で1時間撹拌した。前記反応混合液に4−ヒドロキシベンズアミド(4、3.58g、26.1mmol)を加え、0℃で1時間、室温で2時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下に蒸発させ溶剤を除去した。こうして得られた油性残留物を酢酸エチルに溶解し、有機層を塩水、5%NaHCO3、10%クエン酸で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、溶剤を蒸発させた。粗生成物5をシリカゲル・オープンカラムに加え、CH2Cl2/MeOH(9.5/0.5)で溶出し、そこから4−カルバモイルフェニル 2−(2−メトキシナフタレンー6−イル)−プロパン酸(5)を得た(1.91g、収率32%)。
4−カルバモイルフェニル 2−(2−メトキシナフタレンー6−イル)−プロパン酸、5(1.80g、4.34mmol)およびローソン試薬(1.75g、4.34mmol)を無水ベンゼン130mLに溶解した。反応物を60℃まで温め、4時間にわたって撹拌した。減圧下に溶剤を除去し、得られた粗残留物をシリカゲル・カラム(ジクロロメタン/メチルアルコール 9.75:0.25)で精製し、純粋化合物6 2.9gを得た。得られた化合物をシリカゲル・オープンカラムで精製し、CH2Cl2/MeOH(9.5/0.5)で溶出し、純粋化合物6を得た(970mg、収率61%)。
1H NMR(DMSO−d6):δ1.59(d、3H)、3.86(s、3H、OCH3)、4.24(dd、1H)、7.06(d、2H)、7.18(d、1H)、7.31(s、1H)、7.50(d、1H)、7.84(s、1H)、7.85(d、1H)、7.86(s、1H)、7.89(d、2H)、9.47および9.84(s、2H、NH2)。
13C NMR(DMSO−d6):δ19.1、45.2、55.9、106.5、119.6、121.6、126.6、126.9、128.0、129.4、129.9、134.2、135.6、137.8、153.4、158.1、173.3、199.7。
MS(El)、m/e 366(M+);
m.p.:196〜198℃。
4−カルバモイルフェニル 2−(4−イソブチルフェニル)プロパン酸、3(2.48g、7.62mmol)およびローソン試薬(3.1g、7.62mmol)を無水ベンゼン130mLに溶解した。反応液を60℃まで温め、4時間にわたって撹拌した。減圧下に溶剤を除去した。得られた化合物をシリカゲル・オープンカラムで精製し、CH2Cl2/MeOH(9.5/0.5)で溶出し、純粋化合物4を得た(1.45g、収率55%)。
1H NMR(DMSO−d6):δ0.84(d、6H)、1.48(d、3H)、1.79〜1.82(m、1H)、2.42(d、2H)、4.05(dd、1H)、7.05(d、2H)、7.15(d、2H)、7.28(d、2H)、7.88(d、2H)、9.49および9.87(s、2H、NH2)。
13C NMR(DMSO−d6):δ19.2、22.9、30.3、44.9、121.6、127.9、129.5、130.0、137.8、138.0、140.8、153.3、173.3、199.6。
MS(El)、m/e 341(M+);
m.p.:121〜123℃。
ジメチルホルムアミド80mLに1(ケトプロフェン、3g、11.8mmol)を加えた溶液中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.76g、19.13mmol)およびDCC(2.68g、113mmol)を加え、0℃で1時間撹拌した。前記反応混合液に4−ヒドロキシベンズアミド(2、2.43g、17.7mmol)を加え、0℃で1時間、室温で2時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下に蒸発させ溶剤を除去した。こうして得られた油性残留物を酢酸エチルに溶解し、有機層を塩水、5%NaHCO3、10%クエン酸で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、溶剤を蒸発させた。粗生成物3をシリカゲル・オープンカラムに加え、CH2Cl2/MeOH(9.5/0.5)で溶出し、そこから4−カルバモイルフェニル 2−(4−オキソフェニル)−プロパン酸フェニル(3)を得た(1.84g、収率42%)。
4−カルバモイルフェニル 2−(4−オキソフェニル)−プロパン酸フェニル(3)(1.84g、4.93mmol)およびローソン試薬(2g、4.93mmol)を無水ベンゼン100mLに溶解した。反応液を60℃まで温め、4時間にわたって撹拌した。減圧下に溶剤を除去した。得られた化合物をシリカゲル・オープンカラムで精製し、CH2Cl2/MeOH(9.5/0.5)で溶出し、純粋化合物4を得た(0.45g、収率23%)。
1H NMR(DMSO−d6):δ1.53(d、3H)、4.25(dd、1H)、7.08(d、2H)、7.54〜7.73(m、9H)、7.90(d、2H)、9.51および9.88(s、2H、NH2)。
13C NMR(DMSO−d6):δ19.2、44.9、121.6、129.3、129.5、129.8、130.3、132.6、133.5、137.6、137.9、138.1、141.2、153.3、154.5、156.1、163.8、172.9、199.6。
MS(El)、m/e 390(M+);
m.p.:114〜116℃。
ジメチルホルムアミド80mLに1(フルルビプロフェン、2g、8.2mmol)を加えた溶液中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.22g、9.02mmol)およびDCC(1.86g、9.02mmol)を加え、0℃で1時間撹拌した。前記反応混合液に4−ヒドロキシベンズアミド(2、1.7g、12.2mmol)を加え、0℃で1時間、室温で2時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下に蒸発させ溶剤を除去した。こうして得られた油性残留物を酢酸エチルに溶解し、有機層を塩水、5%NaHCO3、10%クエン酸で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、溶剤を蒸発させた。粗生成物3をシリカゲル・オープンカラムに加え、CH2Cl2/MeOH(9.5/0.5)で溶出し、そこから4−カルバモイルフェニル 2−(3−フルオロ、4−フェニル)プロパン酸フェニル(3)を得た(1.09g、収率37%)。
4−カルバモイルフェニル 2−(3−フルオロ,4−フェニル)プロパン酸フェニル、3(1.09g、3mmol)およびローソン試薬(1.21g、1.3mmol)を無水ベンゼン70mLに溶解した。反応液を60℃まで温め、4時間にわたって撹拌した。減圧下に溶剤を除去した。得られた化合物をシリカゲル・オープンカラムで精製し、CH2Cl2/MeOH(9.5/0.5)で溶出し、純粋化合物4を得た(0.35g、収率31%)。
1H NMR(DMSO−d6):δ1.55(d、3H)、4.21(dd、1H)、7.32〜7.55(m、8H)、7.90(d、2H)、9.51および9.88(s、2H、NH2)。
13C NMR(DMSO−d6):δ19.1、44.7、115.9、116.2、121.7、124.8、128.6、129.3、129.4、129.5、131.7、135.8、137.7、142.6、153.7、158.3、163.5、173.1、199.6。
MS(El)、m/e 380(M+);
m.p.:142〜144℃。
ジオキサン25mLおよび水12.5mLに4−または5−アミノサリチル酸(10.0mmol)を加えた溶液中に、トリエチルアミン(15.0mmol)およびジ−tert−ブチルージカルボネート(15.0mmol)を加え、0℃で1/2時間撹拌した。反応混合液を室温で24時間、機械的に撹拌した。前記溶剤の蒸発後、3M HCL(15mL)を前記残留物に滴下した。得られた沈殿物を濾過し、水で洗浄し、乾燥した。得られた残留物をシリカゲル・オープンカラムに加え、CH2Cl2/MeOH(9/1)で溶出し、そこから4−または5−tert−ブトキシカルボニルアミノー2−ヒドロキシ安息香酸(1)を得た(収率80%)。
化合物(1)(12.0mmol)、H2SO4濃縮物(6.0mmol)、およびDCM(100mL)をイソブチレン・ガス(5psi)の存在下に室温で6時間にわたって撹拌した。得られた溶液を冷たい10%NaHCO3(2x100mL)および塩水(100mL)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、蒸発させた。得られた残留物をMeOH/CCl4(1:1、400mL)に溶解し、水(300mL)で洗浄し、MeOH/水(1:1、2 x 200mL)で抽出した。前記抽出物を乾燥させ(Na2SO4)、白色固体(2)になるまで蒸発させ、白色固体をDCM/ヘキサンにより再結晶させた(収率83%)。
ジメチルホルムアミド50mLに4−または5−tert−ブトキシカルボニルアミノー2−ヒドロキシー安息香酸(2)(3.0mmol)を加えた溶液中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール(3.3mmol)およびDCC(3.3mmol)を加え、0℃で1時間撹拌した。前記反応混合液に4−ヒドロキシ−チオベンズアミド(3.0mmol)を加え、0℃で3時間、室温で72時間にわたり機械的に撹拌した。濾過後、濾液を減圧下に蒸発させ溶剤を除去した。こうして得られた油性残留物を酢酸エチルに溶解し、有機層を塩水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、溶剤を蒸発させた。得られた粗中間物(7)にTFAの40%CH2Cl2溶液による処理を加えた。2時間後、前記溶剤を除去し、粗残留物として化合物(8)を得た。得られた残留物をシリカゲル・オープンカラムに加え、CH2Cl2/MeOH(8/2)で溶出し、そこから化学式XXVIIの化合物である4−または5−アミノー2−ヒドロキシ−安息香酸 4−チオカルバモイルーフェニルエステル(8)を得た(収率48%)。
3,4,5−トリメトキシ安息香酸2−(ジメチルアミノ)−2−フェニルブチルエステル 4−チオカルバモイル安息香酸(トリメブチン・チオカルバモイル安息香酸)の作成
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6):δ0.60(t、3H)、1.45〜1.75(m、4H)、1.80〜1.90(m、2H)、2.28(s、6H)、2.90〜3.40(m、2H)、3.69(s、9H)、3.95(m、1H)、4.73(dd、2H)、7.01(s、2H)、7.22(t、1H)、7.35(t、2H)、7.46(d、2H)、7.93(dd、4H)、9.65(bs、1H、NH)、10.05(bs、1H、NH)。
13C−NMR(400MHz、DMSO−d6):δ9.07、28.9、56.5、60.8、64.5、65.7、107.1、125.3、127.4、128.1、128.6、129.5、129.7、132.3、141.8、142.5、148.5、153.4、154.8、165.9、169.4、172.5、188.6.
mp 66〜68℃(dec)。
前記化合物を、ここに掲げた参考文献(Fairfull、E.S.,Lowe J.L.,Peak D.A.J.Chem.Soc.1952,742)で既に報告されている方法に従って合成した。
4−シアノ安息香酸1(20.4mmol)3gをピリジン40mLに溶解し、トリエチルアミン(20.4mmol)2.1mLを加えた。乾燥硫化水素を前記溶液に4時間絶え間なく通した。次に前記混合液を水中に注ぎ、濾過により固形物を得た。石油エーテルからの再結晶により純粋化合物2 2.51gを得た(収率68%)。
MS(ESl)、m/e182.2(M+)。
1H NMR(DMSO−d6):δ7.92(dd、4H)、9.68(s、1H、NH)、10.12(s、1H、NH)、13.25(s、1H、OH)。
13C NMR(DMSO−d6):δ127.3、129.6、132.0、148.5、169.4、188.6
m.p.296〜298℃(dec.)。
MS(El)、m/e 638(M+);
1H NMR(DMSO)δ0.831(m、6H、2−Me)、1.075(m、9H、3−Me)、1.53(m、6H)、1.97(m、2H)、2.27(m、5H)、2.52(d、2H)、2.62(d、2H)、3.68(m、1H)、4.07(m、1H)、5.52(m、1H)、5.50(bt、1H)、5.77(dd、1H)、5.96(d、1H)、7.08(d、2H)、7.87(d、2H)、7.94(bs、2H)。
MS(El)、m/e 654(M+);
1H NMR(DMSO)δ0.831(m、6H、2−Me)、1.075(m、9H、3−Me)、1.53(m、6H)、1.97(m、2H)、2.27(m、5H)、2.52(d、2H)、2.62(d、2H)、3.68(m、1H)、4.07(m、1H)、5.52(m、1H)、5.50(bt、1H)、5.77(dd、1H)、5.96(d、1H)、7.11(d、2H)、7.9(d、2H)、9.48(s、1H)、9.86(s、1H)。
化合物の検査
以下の例では、マウスへの2,4,6−トリニトロベンゼン・スルホン酸(TNBS)大腸内投与により誘発された大腸炎の標準的実験動物モデルを用いた。このモデルの詳細な説明が発表されており(Santucciら(2003)Gastroenterology 124:1381〜94)、「参考文献」を参照のこと。つまり、6〜8週齢のBalb/cマウスの腸内に、TNBS1.5mgを30%エタノール0.1mLに溶いたものを投与した。前記マウスを様々な治療群に無作為化した(群当たりn=6)。1時間後から開始しその後12時間ごとに5日間、賦形剤(1%カルボキシメチルセルロース(CMC))、5−ASA(メサラミン)単独(100mg/kg)、4−ヒドロキシチオベンズアミド(図では4−HTBと呼称)(100mg/kg)、5−アミノ−2−(4−チオカルバモイル−フェノキシカルボニルオキシ)−安息香酸(100mg/kg)(以後、化合物XXVIIと呼称)、メサラミンと4−HTBを等量ずつ(それぞれ50mg/kg)の内いずれかをマウスに経口投与した。*賦形剤投与群に対し、p<0.05。各群は少なくともラット5匹で構成された。
次の例では、過敏性腸症候群の前臨床モデルである内臓痛知覚に関するラットモデルを用いた。ラット(雄性、Wistar系、200〜250g、イタリア、モンツァのCharles River社から購入)をプラスチックケージ内に入れ、12時間ごとの明暗サイクル(午前7時に点灯)を維持した。水道水および標準飼料を自由に得られるようにした。実験前の2〜3日間にわたり、1日当たり2〜3時間をプレキシガラス製ケージ内で過ごさせることによりラットを個々に訓練した。そうすることによってラットは移動制限環境に適応することができた。結腸直腸拡張(colorectal distension:CRD)の記録前12時間は食餌を与えないでおいた。実験は覚醒ラットを対象とし、各ラットに投与される薬剤内容が観察者に分からないようにして行った。
既に詳述されているように(Wallaceら、(1993)Am.J.Physiol.265:993〜998、「参考文献」を参照のこと)、白血球粘着が生体顕微鏡を用いて研究された。ラットをペントバルビタールナトリウム(60mg/kg i.p.)で麻酔し、電気メスにより腹部を切開した。呼吸を容易にするため気管切開を行った。ラットを仰臥位とし、腹部切開口を通して腸間膜の一部を体外に露出させた。前記腸間膜を、2cm2の組織片の透光を可能にする光学的に透明な観察台上に慎重にセットした。脱水を最小限とするため、露出組織ははすべて生理食塩水に浸したガーゼで覆った。観察台の温度を37℃に保ち、温めた重炭酸緩衝生理食塩水(pH7.4)で腸間膜を灌流した。生体顕微鏡(ニコン L25/0.35)およびアイピース(a x10)を用いて腸間膜の微小循環を観察した。直径が20〜40μmの後毛細血管細静脈を研究対象とした。顕微鏡に取付けられたビデオカメラ(パナソニック(商標) デジタル5000)が画像をモニター上に映し出し、画像は再生分析のためビデオカセットレコーダーにより記録された。腸間膜微小循環の画像を、アスピリン投与5分前(ベースライン)、アスピリン投与時(時間0〜5)、およびその後15分ごとに60分間記録した。 5分間にわたる血管のビデオ画像に基づき、白血球粘着を、血管壁に沿って30秒間以上静止したままの白血球の数(細静脈の長さ100μm当たり)として盲検的に計測した。アスピリン(または賦形剤)投与60分前に、各群(少なくともn=5)のラットに5−アミノー2−(4−チオカルバモイルーフェノキシカルボニルオキシ)−安息香酸(化合物XXVII)(100mg/kg)、メサラミン(50mg/kg)、賦形剤のいずれかを前投与した。これらの薬剤は胃内に投与した。一部の実験では、これら化合物の投与30分前に、ラットにグリベンクラミド(10mg/kg i.p.)または賦形剤を投与した。
3つの異なった条件の下に、H2S生成に関する5−アミノ−2−(4−チオカルバモイル−フェノキシカルボニルオキシ)−安息香酸(化合物XXVII)の試験を行った。1mM濃度のL−システイン、4−HBT(4−ヒドロキシチオベンズアミド)、および5−アミノ−2−(4−チオカルバモイルーフェノキシカルボニルオキシ)−安息香酸から1時間以内に生成されるH2Sの濃度を測定した。3つの条件下にH2S放出の試験を行った:(i)当該化合物が緩衝液中にある場合、(ii)当該化合物が肝臓ホモジネート中にある場合、および(iii)当該化合物がシスタチオニンγ−リアーゼ阻害剤(PAG=DL−プロパルギルグリシン;2mM)とともに肝臓ホモジネート内にある場合。結果を図6に示す。*賦形剤群からの放出に比べ、p<0.05。対応する「ホモジネート」群に対し、p>0.05。H2S産生に対する酵素容量を、既述(Khanら(1980)Microchem J.25:388〜395、「参考文献」参照)のものと同じリアクターを用いて測定した。分析用反応混合液2mLをリアクター中に加えた。混合液には1mM L−システイン(または化合物)、2mMピリドキサル 5’−リン酸、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH=7.4)が含まれていた。混合液中を窒素がガス吹込管経由で絶え間なく通過するようにした。管を氷浴から37℃の温浴に移すことにより反応を開始させた。(pH 12.8で2M KOH、1Mサリチル酸、0.22Mアスコルビン酸から成る)硫化物抗酸化緩衝(sulfide anti−oxidant buffer:SAOB)液4mLが入った2番目のリアクターでは、窒素流に硫酸が含まれていた[5]。37℃で90分間培養後、10%トリクロロ酢酸液1mLを混合液に加え反応を停止させた。混合液中の残留H2Sは、さらに60分間37℃で培養することにより、窒素流によって除去された。SAOB液中の硫化物濃度を硫化物に感受性のある電極(モデル9616S2−/Ag+、Orion Research、米国マサチューセッツ州Beverly)を用いて測定した。前記試験化合物の肝臓ホモジネート中での培養試験のため、切離したラットの肝臓100〜150mgを氷冷したT−PERタンパク・エキストラクター1mL中でホモジナイズした。ホモジネートされたものを前記反応混合液に加え、濃度10%(wt/vol)とした。前記酵素反応の前に2mM DL−プロパギルグリシンを肝臓ホモジネートとともに37℃で5分間培養した。Khan S.U.,Morris G.F.、およびHidiroglou M.(1980)Rapid estimation of sulfide in rumen and blood with a sulfide−specific ion electrode.Microchem J.25:388〜395、「参考文献」参照のこと。
1.化合物XXVIIはH2Sを任意に放出し(緩衝液中)、そのことは腸での局所効果にとって望ましい。4−HTBおよびL−システインを緩衝液だけで培養した場合のH2S放出は有意でなかった。
2.H2Sの放出は組織の存在下における方が多い;
3.化合物XXVIIからのH2Sの放出はH2Sの内因性合成に用いられる2つの主要酵素(シスタチオニンβ―シンターゼおよびシスタチオニンγ―リアーゼ)の活性とは独立に生じる。このことは、それら酵素の阻害薬(PAG;DL−プロパギルグリシン)が化合物XXVIIからのH2S生成に及ぼす作用の欠如によって立証される。その一方、L−システインからのH2S放出はPAGにより顕著に阻害される;
4.化合物XXVIIから産生されるH2Sの濃度は化合物1mMが使用された場合10〜20μMである。患者が本薬剤の通常量を服用後、大腸腔内で最高5mMの濃度のメサラミンが測定可能である(Dig.Dis.Sci.1989;34:573〜578)。H2Sの内因性濃度(endogenous concentration)は最高160μMである(Antioxid.Redox Signal.2003;5,493〜501)。化合物XXVIIは生理学的範囲内の濃度でH2Sを放出し、H2S関連毒性の危険性を最小限とする。
実施例13で説明のごとくに実験を行ったが、但しラット5匹からなる各群には賦形剤、マレイン酸トリメブチン(10mg/kg)、等モルのトリメブチン・チオカルバモイル安息香酸(化合物III)またはチオカルバモイル安息香酸単独のいずれかを投与した。
本発明のジクロフェナク誘導体である[2−(2,6−ジクロロ−フェニルアミノ)−フェニル]−酢酸 4−チオカルバモイル−フェニルエステル(ここでは別名化合物XVII)を、ラットにおける胃腸安全性について評価した。特に、胃損傷、胃PGE2合成、小腸潰瘍、およびヘマトクリットについて評価した。
生体内におけるCOX−2の阻害を、既述モデル(Wallaceら、Limited anti−inflammatory efficacy of cyclo−oxygenase−2 inhibition in carrageenan−airpouch inflammation. Br J Pharmacol 1999:126:1200〜1204、「参考文献」参照)の修正版を用いて測定した。つまり、数日間にわたって繰り返し空気を注入することにより皮下「嚢」を作成した。作成後、1%ザイモサン1mLを注入することにより嚢の炎症を誘発できる。これにより嚢内のプロスタグランジンE2(PGE2)が顕著に増加し、これはほぼ例外なくCOX−2に由来することが示されている。カラギーナン注入の30分前に各群(それぞれラット5匹からなる)に賦形剤(1%カルボキシメチルセルロース)、ジクロフェナク(3mg/kg)、[2−(2,6−ジクロローフェニルアミノ)−フェニル]−酢酸 4−チオカルバモイルーフェニルエステル(化合物XVII)(4.1mg/kg)のいずれかを経口投与した。ラット5匹からなるもう一つの群には賦形剤を投与したが、ザイモサンではなく0.9%滅菌生理食塩水を嚢に注入した。
多くの化合物の抗炎症作用(COX−2およびCOX−1阻害)および胃安全性を、上記アッセイを用いて比較した。結果の概要を表1に示す。いずれの親NSAIDも顕著な胃損傷を引起した。しかし、本発明のTBZ誘導体の場合、前記親化合物に比べ胃安全性は改善されていた。さらに表1から、TBZ誘導体は前記親化合物に比べ、COX−1および/またはCOX−2阻害能を維持するか実質的に上昇させたことが認められる。
既述のように(Wallaceら、Gastroenterology 1998)、カラギーナン後足浮腫モデルを用いて[1−(2,6−ジクロロ−フェニルアミノ)−フェニル]−酢酸 4−チオカルバモイル−フェニルエステル(化合物XVII)およびジクロフェナクの抗炎症作用を評価した。雄性Wistar系ラット(175〜200g)に、1%ラムダカラギーナン100μLを足底部に注射する30分前に前記試験化合物を経口投与した。足容積を、Ugo Basile社のhydroplethysmometerを用い、カラギーナン注射前および注射後1時間ごと5時間にわたって測定した。それぞれラット5匹からなる各群にジクロフェナク1、3、10mg/kgのいずれか、または化合物XVIIをジクロフェナク3mg/kgと等モルの用量で投与した。
血管内皮への白血球粘着は炎症反応における早期イベントであり、血栓形成に寄与する。硫化水素供与体はアスピリンまたは炎症促進性トリペプチドfMLPによって誘発された白血球粘着を低下させることが示されている(Zanardoら、FASEB J 2006;20:2118〜2120)。本発明による数種のNSAID誘導体が白血球粘着に及ぼす作用につき、Zanardoらが詳しく説明したように(FASEB J 2006;20:2118〜2120)、ラットを対象に生体顕微鏡を用いて評価した。
COX−2に選択的に作用するものを含めNSAIDsは前から存在する胃潰瘍の治癒を阻害することが多い(Stadlerら、Diclofenac delays healing of gastroduodenal mucosal lesions.Double−bling,placebo−controlled endoscopic study in healthy volunteers.Digestive Diseases and Sciences 1991;36:594〜600)。本発明の2つの化合物(化合物XVIIおよび化合物XX)が潰瘍治癒に及ぼす作用をそれぞれジクロフェナクおよびナプロキセンと比較するため、胃への潰瘍誘発後、ラットにこれらの薬剤を投与した。Elliotらが説明したように、漿膜に酢酸を塗布することによって胃潰瘍を誘発した(A nitric oxide−releasing nonsteroidal anti−inflammatory drug accelerates gastric ulcer healing in rats.Gastroenterology 1995;109:524〜530)。3日後から、それぞれラット5匹からなる各群に、賦形剤、ジクロフェナク(30μM/kg)、化合物XVII(30μM/kg)、ナプロキセン(60μM/kg)、化合物XX(60μM/kg)のいずれかを1日2回経口投与した。4日間そのような治療を行った後、ラットを安楽死させ、胃を切除し、写真に撮った。ラットに施された治療内容を知らない者が潰瘍面積(mm2)を測定した。胃潰瘍誘発から3日後(すなわち薬剤投与開始前)に安楽死させたラット5匹のサブグループにおいて、潰瘍の平均表面積は24±2mm2であった。図17に示したように、賦形剤、ジクロフェナク、ナプロキセンを投与したラットはいずれも同程度の治癒を示した。しかし、化合物XVIIまたは化合物XXを投与したラットの治癒状況は有意に良好であった(*それぞれジクロフェナクおよびナプロキセンに比べ、p<0.05)。賦形剤群に比べTBZ単独投与では胃潰瘍の治癒は有意に影響されなかった。
COX−2に選択性を示すものを含めたNSAIDsは、前から存在する高血圧を悪化させ、一部の降圧剤の有効性を妨げる可能性がある(Whelton,A.Nephrotoxicity of nonsteroidal anti−inflammatory drugs:physiologic foundations and clinical implications. Am.J.Med.1999;106(5B):13S−24S)。本発明のナプロキセン誘導体である化合物XXが血圧に及ぼす作用をナプロキセン単独と比較するため、最初に高血圧を誘発した上でラットにこれらの薬剤を腹腔内投与した。Ribeiroら(Chronic inhibition of nitric oxide synthesis:A new model or arterial hypertension.Hypertension 1992;20:298〜303)が以前に説明したように、前記実験の7日前にラットにNω−ニトロ−L−アルギニン・メチルエステル(400mg/L)を加えた飲用水を与えた。ラット(群当たり5〜8匹)をハロタンで麻酔し、血圧測定のため頸動脈にカニューレを挿入した。血圧はチャート式記録計で連続的に記録した。安定血圧を最低15分間測定後、ナプロキセンまたは化合物XXのいずれか60μM/kgを腹腔内にボーラス投与した。投与後60分間にわたって血圧変化を記録した。平均基礎血圧は150±6mm Hgであった。図18は、ナプロキセンが収縮期血圧を大幅に上昇させたことを示している。一方、化合物XXは賦形剤投与群と比較し収縮期血圧を上昇させず、血圧変化はジクロフェナクおよびナプロキセン誘発によるものに比べて有意に少なかった。
[2−(2,6−ジクロロ−フェニルアミノ)−フェニル]―酢酸 4−チオカルバモイルーフェニルエステル(化合物XVII)およびTBZ誘発による生体外H2S放出を比較するため、単離した肝臓100〜150mgを氷冷したT−PERタンパク質抽出試薬1mL中でホモジナイズした。分析反応混合液2mLをシールされた3−ネック・リアクター中の氷冷した0.1N NaOH 250μLに加えた。混合液には100mMリン酸カリウム緩衝液(pH=7.4)にPEGを加えた中に1mMの化合物XVIIまたは1mMのTBZが溶解されていた。培養は10%(w/v)肝臓ホモジネートおよび2mMピリドキサル5‘−リン酸を加えた場合とそうでない場合にわけて行った。窒素が混合液をガス吹込管経由で絶え間なく通過した。リアクターを37℃に保ち、10%トリクロロ酢酸溶液1mLを加えることによってH2S抽出を開始した。 (pH 12.8で2M KOH、1Mサリチル酸、0.22Mアスコルビン酸から成る)硫化物抗酸化緩衝(sulfide anti−oxidant buffer:SAOB)液2mL中の冷却コネクタおよび泡立てによる別のリアクターでは、窒素流に硫酸が含まれていた。30分後にSAOB溶液を除去し、硫化物濃度を硫化物感受性の電極(モデル9616S2−/Ag+電極、Orion Research、米国マサチューセッツ州Beverly)で測定し、H2Sとして示した(Ubuka、2002;Khanら、1980)。ガラス管を氷浴から37℃の温浴に移すことにより反応を開始させた。既述のように、窒素流がSAOB 2mLを含んだ2番目のリアクター中の硫酸を運んだ。37℃で90分間培養後、50%トリクロロ酢酸液1mLを混合液に加え反応を停止させた。混合液中の残留H2Sは、さらに30分間37℃で培養することにより、窒素流によって除去された。SAOB溶液中の塩化物濃度を既述の硫化物感受性電極によって測定した(Ubuka、2002;Khanら、1980)。
既に詳述されているように(Ma L、Elliott SN、Cirino G、Buret A、Ignarro LJ、Wallace JL.Platelets modulate gastric ulcer healing through release of endostatin and VEGF.Proc Natl Acad Sci USA 98:6470〜6475、「参考文献」参照)、多血小板血漿(PRP)を作成した。PRP中の血小板濃度をTyrode緩衝液(pH7.4)で希釈し1x 108/mLに調整した。血小板400μLをガラスキュベットに入れ、Chronolog社血小板測定装置に挿入した。キュベットにアデノシン2リン酸(ADP)を加えた時の凝集反応を5分間にわたってモニターした。まずADPに対する濃度反応曲線を作成し、次に最大凝集の70〜80%を生じるADP濃度を用いてその後の試験を行った。PRPの懸濁液を、様々な濃度(3〜30μM)のシンバスタチンまたは化合物 I、または賦形剤(メタノール)とともに37℃で10分間前培養を行った。次にADPに対する凝集反応を評価した。各薬剤の各濃度に対し、実験を4〜6回繰り返した。
前記のように、多血小板血漿(PRP)を作成した。非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤IBMX(イソブチル−1−メチルキサンチン;0.5mM)が入ったガラス管にPRP 400μLを加えた。2分後、賦形剤(メタノール)または各種濃度(3〜100μM)のシンバスタチンまたは化合物Iをガラス管に加えた。陽性対照として、血小板の一部に既知のアデニル酸シクラーゼ刺激薬であるフォルスコリン(10μM)を加えた。10分後、PRPサンプルを9,000gで2分間遠心分離にかけ、上澄液を廃棄した。得られた沈殿物を緩衝液中に再懸濁し、超音波で2分間分解し、特異的酵素免疫測定法を用いてcAMP濃度を測定した(Cayman Chemical Co.,米国ミシガン州Ann Arbor)。各薬剤の各濃度に対し、実験を4〜6回繰り返した。
Claims (4)
- 請求項1または2記載の化合物において、前記抗高脂血症薬はロバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン・ナトリウム、シンバスタチンから成る群から選択されるものである、化合物。
- 請求項3記載の化合物において、前記化合物はコハク酸2−{2−[8−(2,2−ジメチル−ブチリルオキシ)−2,6−ジメチル−1,2,6,7,8,8a−ヘキサヒドロ−ナフタレン−1−イル]−エチル}−6−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−4−イル エステル 4−チオカルバモイルーフェニルエステルである、化合物。
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