JP2021066660A

JP2021066660A - Ｔｉｒａｐ阻害剤

Info

Publication number: JP2021066660A
Application number: JP2018022423A
Authority: JP
Inventors: 田沼　靖一; Yasukazu Tanuma; 靖一田沼
Original assignee: APION JAPAN KK
Current assignee: APION JAPAN KK
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2021-04-30
Also published as: WO2019156250A1

Abstract

【課題】本発明は、敗血症、関節リウマチ、インフルエンザ、糖尿病等の多様な疾患の発症に関与しているTIRAP/MyD88の相互作用を分子標的とした各種疾患の予防及び／又は治療用薬剤を提供することを目的とする。【解決手段】トリメブチン又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含有する、TIRAP/MyD88の相互作用に関連する疾患の予防及び／又は治療用薬剤。【選択図】なし

Description

本発明は、TIRAP(Toll/interleukin-1 receptor domain containing adaptor protein)を阻害する化合物を含有する医薬等に関する。より詳細には、TIRAP/MyD88(Myeloid differentiation primary response 88)との相互作用に関連する疾患の予防及び／又は治療薬等に関する。

外界からの侵襲に抵抗する能力、すなわち免疫は、自然免疫と獲得免疫に二分される。自然免疫において最も重要な役割を果たしていると考えられているのがTLR(Toll-like Receptor)である（非特許文献１）。特に、TLR4は関連分子のノックアウトマウスを用いた実験における高い治療効果から、現在治療が困難である敗血症の治療標的として有望視され（非特許文献２〜５）、種々の薬剤の開発がすすめられている。
TLRのシグナリングに関与する細胞内ドメインとしてTIRAP(Toll/interleukin-1 receptor domain containing adaptor protein)が知られ、その下流にあるアダプタータンパク質であるMyD88を介してシグナル伝達が行なわれる。MyD88はIL-1受容体結合キナーゼ（IRAK）をTLRに呼び寄せ、その結果、IRAKがリン酸化される。リン酸化によって活性化されたIRAKは、次にTRAF6と会合し、最終的にはMAPキナーゼ(JNK、p38MAPK)及びNF-κBの活性化に至る。
さらに、TIRAPは、TLRのシグナリングに関与するのみならず、RAGE（Receptor for advanced glycation-end products）のシグナリングにも関与することが知られている。従って、RAGEとそのリガンドとの相互作用もまた、TIRAP/MyD88を介したシグナル伝達経路に影響を及ぼす。
RAGEは、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞等の血管系細胞及びマクロファージ等の免疫系細胞に発現している一回膜貫通型タンパク質である（非特許文献６）。RAGEは、一次配列の相同性から免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、1つの可変領域ドメイン（Vドメイン）と2つの定常領域ドメイン（C1及びC2ドメイン）をもつ細胞外ドメインと、膜貫通領域、細胞内シグナル伝達領域からなる（非特許文献７）。リガンドとして、HMGB1（High mobility group box-1）、Advanced Glycation End-products (AGE)やS100B、amyloid-β(Aβ)が結合する（非特許文献６、８〜１０）。これらのリガンドがRAGEと結合すると多様なシグナル経路が活性化され、炎症や細胞増殖、アポトーシス、オートファジー、細胞移動に関与することが知られている（非特許文献１１）。

自然免疫反応が活性化された結果、サイトカインの産生と放出が引き起こされる。これは炎症の必要十分条件（発熱・発赤・腫脹・疼痛・機能障害の症候）であると考えられている（非特許文献１２）。サイトカインの過剰な産生は炎症性疾患を発症させ、重度の場合は致死的ショックや組織傷害をも引き起こしてしまうため、サイトカインの量は生体によって厳密に制御されている（非特許文献１３）。このことから、疾患の治療ターゲットとしてサイトカインを標的にしたものが近年功績を上げている。たとえば、関節リウマチや炎症性腸疾患に対する抗TNF抗体や抗IL-6抗体などである（非特許文献１４、１５）。しかしながら、特定のサイトカインが疾患の重症度と密接に関与している疾患に対しては有効であるが、様々なサイトカインが誘導される炎症性疾患に対して有効であるわけではなく、未だに有効な治療法を待つ炎症性疾患の患者は数多く存在している。

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本発明は、敗血症、関節リウマチ、インフルエンザ、糖尿病等の多様な疾患の発症に関与しているTIRAP/MyD88の相互作用を分子標的とした各種疾患の予防及び／又は治療用薬剤を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、慢性胃炎等の消化器疾患等による腹部疼痛や悪心・嘔吐、腹部膨満感等の症状を抑制する医薬品として上市されているトリメブチンにTIRAP/MyD88の相互作用を阻害する作用があることを見出した。さらに該化合物が、TIRAP/MyD88相互作用の阻害作用のみならず、HMGB1/RAGEの相互作用を阻害し得ること、その阻害作用によってTIRAP/MyD88相互作用を間接的に阻害し得ることを見出して本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］トリメブチン又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含有する、TIRAP/MyD88の相互作用に関連する疾患の予防及び／又は治療用薬剤。
［２］TIRAP/MyD88相互作用に関連する疾患が炎症性疾患である、上記［１］に記載の薬剤。
［３］TIRAP/MyD88相互作用に関連する疾患が敗血症である、上記［１］に記載の薬剤。
［４］トリメブチン又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含有する、TIRAP阻害剤。
［５］TIRAPの阻害が、HMGB1/RAGE相互作用の阻害による、上記［４］記載の阻害剤。
［６］TIRAPの阻害が、TIRAP/MyD88相互作用の阻害による、上記［４］記載の阻害剤。
［７］トリメブチン又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含有する、RAGE阻害剤。
［８］RAGEの阻害が、HMGB1/RAGE相互作用の阻害による、上記［７］記載の阻害剤。
［９］研究用試薬である、上記［４］〜［８］のいずれかに記載の阻害剤。

トリメブチンはTIRAP/MyD88相互作用を阻害する作用を有するので、該相互作用に関連する各種疾患、特にTIRAP/MyD88相互作用が発症原因となる疾患の予防及び／又は治療用薬剤として有用である。また、トリメブチンはHMGB1/RAGE相互作用を阻害する作用をも有するので、該相互作用に関連する各種疾患、特にHMGB1/RAGE相互作用が発症原因となる疾患の予防及び／又は治療用薬剤としても有用である。さらに、TIRAP/MyD88相互作用、HMGB1/RAGE相互作用の阻害剤等の研究用試薬としても有用である。

TIRAP/MyD88相互作用に対するトリメブチン（TLTM-001）の阻害効果を調べた結果を示す図である。(A)TIRAP/MyD88 Binding Assayの模式図である。（B）TIRAP/MyD88結合に及ぼすTLTM-001の阻害効果を示したグラフである。独立した3回の実験結果の平均値を標準誤差とともに示す。 HMGB1/RAGE結合に及ぼすトリメブチン（TLTM-001）の阻害効果を示したグラフである。独立した3回の実験結果の平均値を標準誤差とともに示す。トリメブチン（TLTM-001）によるHMGB1誘導性IL-6産生抑制効果及び細胞傷害性評価の結果を示す図である。(A)RAW264.7細胞をTLTM-001（0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM)）で2時間処理し、さらに18時間HMGB1（1 μg/mL）で刺激した。分泌されたIL-6をELISAにより測定した。独立した3回の実験結果の平均値を標準誤差とともに示す。(B) RAW264.7細胞をTLTM-001（0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM)）で24時間処理した。次いで、細胞生存率をWSTアッセイにより評価した。独立した3回の実験結果の平均値を標準誤差とともに示す。トリメブチン（TLTM-001）によるHMGB1誘導性サイトカイン、ケモカイン産生抑制効果を評価した結果を示す図である。(A)RAW264.7細胞をTLTM-001（30 μM)）で2時間処理し、さらに18時間HMGB1（1 μg/mL）で刺激した。分泌された各種サイトカインを、マウスサイトカイン抗体アレイを用いて測定した。（B）CCL2, CCL12, CCL22, CXCL10, GM-CSF, IL-1rα, IL-6, IL-27, Lipocalin-2及びPAI-1について強度をImage Lab (Bio-Rad)で解析した。トリメブチン（TLTM-001）によるRAGE細胞内シグナル伝達抑制効果を評価した結果を示す図である。（A）ERK1/2及びβ-アクチンに対して標準化したERK1/2のリン酸化を示す。（B）JNK及びβ-アクチンに対して標準化したJNKのリン酸化を示す。トリメブチン（TLTM-001）によるマウス骨髄マクロファージにおける抗炎症効果を評価した結果を示す図である。マウス由来の骨髄マクロファージをTLTM-001（30 μM)で２時間処理し、さらに18時間HMGB1（1 μg/mL）で刺激した。手順を（A）に示す。(B)分泌されたIL-6をELISAにより測定した。（C）分泌されたTNF-αをELISAにより測定した。独立した3回の実験結果の平均値を標準誤差とともに示す。トリメブチン（TLTM-001）によるTLR4及びTLR2を介する炎症反応抑制効果を評価した結果を示す図である。RAW264.7細胞をTLTM-001（0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM)）で2時間処理し、さらに18時間（A）LPS（0.1μg/ mL）又は（B）Pam3CSK4（0.2μg/mL）で刺激した。分泌されたIL-6をELISAにより測定した。独立した3回の実験結果の平均値を標準誤差とともに示す。トリメブチン（TLTM-001）によるTLR5を介する炎症反応抑制効果を評価した結果を示す図である。Caco-2細胞をTLTM-001（10 μM)又はTH-1020（10 μM)で2時間処理し、さらに24時間フラゲリン（0.2μg/mL）で刺激した。分泌されたIL-6をELISAにより測定した。独立した3回の実験結果の平均値を標準誤差とともに示す。敗血症モデルマウスにおけるトリメブチン（TLTM-001）の効果を調べた結果を示すグラフである。(A)評価方法を模式的に示した図である。(B)敗血症モデルマウスの生存率を調べた結果を示すグラフである。トリメブチンの作用機序を予測した模式図である。

以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
本発明はトリメブチン又はその医薬上許容され得る塩（以下、これらを総称して本発明の化合物とも称する）を有効成分として含有するTIRAP/MyD88の相互作用及び／又はHMGB1/RAGE相互作用に関連する疾患の予防及び／又は治療用薬剤（以下、本発明の薬剤とも称する）を提供する。

トリメブチンの医薬上許容され得る塩としては、例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ケイ皮酸、フマル酸、ホスホン酸、塩酸、硝酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、スルファミン酸、硫酸等の酸との酸付加塩；例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の金属塩；例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン等の有機塩基との塩等が挙げられる。

本発明化合物には立体異性体（例、鏡像異性体）が存在し得るが、全ての可能な立体異性体及びそれらの混合物も本願発明において用いることができる。これらの異性体は、自体公知の合成手法、分離手法（濃縮、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶等）によりそれぞれを単品として得ることができる。

本発明化合物は結晶であっても無晶形であってもよい。トリメブチンが結晶である場合、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても本願発明において用いることができる。結晶は、自体公知の結晶化法を適用して、結晶化することによって製造することができる。

本発明化合物は溶媒和物（例えば、水和物等）であっても、無溶媒和物であってもよく、いずれも本願発明において用いることができる。

本発明化合物は同位元素（例、^３Ｈ，^１４Ｃ，^３５Ｓ，^１２５Ｉ等）等で標識されていてもよい。

トリメブチンは、TIRAPとそのアダプタータンパク質であるMyD88との相互作用を阻害する作用を有する。さらにトリメブチンは、RAGEとそのリガンドであるHMGB1との会合を阻害する作用を有する。
本明細書中、「TIRAP/MyD88相互作用」とは、TIRAPとMyD88との会合及びそれによってもたらされる種々の細胞内事象を意味する。
TIRAPは、アダプタータンパク質であるMyD88と会合し、細胞内シグナル伝達経路を介して、転写因子であるIRFやNF-κBを活性化し、それぞれIFN-α、IFN-βまたは、IL-1、IL-6、IL-8などサイトカインを誘導し炎症を惹起する。従って、TIRAPとMyD88との相互作用を阻害する作用は、炎症性サイトカイン産生に対する阻害活性を測定することによって評価することができる。炎症性サイトカインとしては、IL-6、TNF-α、IL-1β等が挙げられるが、好ましくはIL-6である。
同様に、本明細書中、「RAGE/HMGB1相互作用」とは、RAGEとHMGB1との会合及びそれによってもたらされる種々の細胞内事象を意味する。
HMGB1は、組織・臓器の損傷時に死細胞（ネクローシス及びアポトーシス細胞）から放出され、マクロファージを活性化することで炎症反応を惹起することが知られている。また、マクロファージ自身からも分泌される。細胞外に放出されたHMGB1は、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞等の血管系細胞、マクロファージ等の免疫細胞及び神経細胞の細胞膜表面に発現しているRAGEに作用し下流のNF-κBを活性化し、炎症性サイトカインを過剰に放出することで炎症の増悪化や組織障害に働く。従って、HMGB1とRAGEとの相互作用を阻害する作用は、炎症性サイトカインの産生に対する阻害活性を測定することによって評価することができる。炎症性サイトカインとしては、IL-6、TNF-α、IL-1β等が挙げられるが、好ましくはIL-6である。

本発明化合物の有する優れたTIRAP阻害作用、具体的にはTIRAP/MyD88相互作用の阻害作用及びHMGB1/RAGE相互作用の阻害作用により、本発明化合物は、哺乳動物（例、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ等）に対し、TIRAP/MyD88相互作用がその発症や進行に関与する疾患（発症又は進行が促進される疾患）及びHMGB1/RAGE相互作用がその発症や進行に関与する疾患（発症又は進行が促進される疾患）の予防又は治療用薬剤として有用である。
TIRAP/MyD88相互作用がその発症や進行に関与する疾患としては、例えば、炎症性疾患（敗血症等の急性炎症や関節リウマチ、糖尿病等の慢性炎症を伴う各種疾患）やインフルエンザ等の感染症が挙げられる。また、HMGB1/RAGE相互作用がその発症や進行に関与する疾患として、敗血症、虚血再灌流障害、急性肺炎等の急性炎症や関節リウマチ、糖尿病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、多発性硬化症、がん等の慢性炎症を伴う各種疾患が挙げられる。

本発明化合物を有効成分として含有する薬剤中におけるトリメブチンの含有量は製剤全体に対して通常、約０．０１〜約９９．９重量％、好ましくは約０．１〜約５０重量％である。

本発明化合物の投与量は、年令、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
投与量は対象疾患、症状、投与対象、投与方法等によって異なるが、例えば、トリメブチンの量として、１日量約０．１〜５０ｍｇ／Ｋｇ（体重）程度、好ましくは約０．３〜３０ｍｇ／Ｋｇ（体重）程度、より好ましくは１〜２０ｍｇ／Ｋｇ（体重）、更に好ましくは約１〜１０ｍｇ／Ｋｇ（体重）程度を１回又は２ないし３回に分けて投与するのが好ましい。

本発明化合物は、対象となる疾患に応じて、他の薬剤と組み合せて用いることができる。これらの併用薬剤は低分子化合物であっても良く、また高分子の蛋白、ポリペプチド、抗体あるいはワクチン等でも良い。この場合、本発明化合物と併用薬剤の投与時期は限定されず、投与時に本発明化合物と併用薬剤とが組み合わされていればよい。

本発明化合物は、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の固形製剤；シロップ剤、注射剤等の液状製剤；貼付剤、軟膏剤、硬膏剤等の経皮吸収剤；吸入剤；坐剤として、適宜製剤化し、本発明の薬剤とすることができる。
本発明の薬剤は、経口又は非経口投与され、上記した化合物を１種単独で用いてもよく、又は２種以上を併用して用いてもよい。

薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用されている各種有機あるいは無機担体物質を用いることができる。具体的には、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等を配合することができる。又、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることもできる。

賦形剤の例としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、でんぷん、蔗糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム等が挙げられる。

滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、精製タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。

結合剤の例としては、結晶セルロース、白糖、マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

崩壊剤の例としては、でんぷん、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられる。

溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。

溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。

懸濁化剤の例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

等張化剤の好適な例として、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。

緩衝剤の好適な例として、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
無痛化剤の好適な例として、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。

防腐剤の好適な例として、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
抗酸化剤の好適な例として、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
着色剤の好適な例として、例えばタール色素、カラメル、三二酸化鉄、酸化チタン、リボフラビン類等が挙げられる。
甘味剤の好適な例として、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン、単シロップ等が挙げられる。

トリメブチン又はその医薬上許容され得る塩は、商業的に入手可能なものであるか、あるいは種々の公知（既報）の合成法を適用し、さらに所望に応じて適宜修飾して製造することができる。より簡便であり、且つ品質の安定性を考慮して、市販されているものを用いることができ、また用いることが好ましい。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

（材料と方法）
１．材料
１．１．試薬
(1) グリチルリチン(Wako, Cat#074-03481)
(2) Lipopolysaccharides (rough strains) from Salmonella minnesota Re 595 (Re mutant)(SIGMA, Cat# L 9764)
(3) Pam3CSK4(InvivoGen, Cat# tlrl-pms)
１．２．タンパク質
(1) Human Soluble Receptor for Advanced Glycosylation End Products (sRAGE)
Recombinant, Biotinylated(AVISCERA BIOSCIENCE, Cat# 00112-02-50B)
(2) Recombinant Human HMGB1/HMG-1(R&D SYSTEMS, Cat# 1690-HMB)
(3) Bovine NativeHMGB1 (Chondrex, Cat# 9050)
(4) Flagellin (high purity)(Enzo Life Sciences, Cat# ALX-522-058-C010)
(5) Recombinant Human MyD88 protein (Novus, Cat# NBP2-23255)
(6) TIRAP(1-221), His-tagged, Human, Recombinant (ATK, Cat# ATK-ATGP1675)
１．３．抗体
＜一次抗体＞
(1) Anti-HMGB1 Antibody -ChIP Grade(abcam, Cat# ab18256)
(2) p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody(Cell Signaling TECHNOLOGY, Cat# #9102)
(3) Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) (E10) Mouse mAb (Cell Signaling TECHNOLOGY, Cat# #9106)
(4) SAPK/JNK Antibody(Cell Signaling TECHNOLOGY, Cat# #9252)
(5) Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) Rabbit mAb (Cell Signaling TECHNOLOGY, Cat# #4668)
(6) Anti-β-Actin Antibody, Mouse Monoclonal Clone AC-15(SIGMA ALDRICH, Cat# A1978)
(7) MyD88 Polyclonal Antibody (Elabscience, Cat# E-AB-32136)
(8) TIRAP Polyclonal Antibody (Elabscience, Cat# E-AB-17096)
＜二次抗体＞
(1) Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked species specific whole antibody (from donkey) (GE Healthcare, Cat# NA934V)
(2) Anti-Mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked species specific whole antibody (from sheep) (GE Healthcare, Cat# NA931V)

２．方法
２．１．HMGB1/RAGE Binding Assay (ELISA)
ストレプトアビジンプレート(Biotech Trading PartnersCat# BTP-996B)にビオチン標識リコンビナントsRAGEを室温で1時間反応させ固相化した。TBS-T（0.05% (v/v) Tween 20 in TBS）でプレートを洗浄後、グリチルリチン（100 μM）及びトリメブチン(30 μM)をそれぞれ1時間前処理し、続いてヒトリコンビナントHMGB1で1時間処理した。TBS-Tでプレート洗浄後、抗HMGB1抗体を室温で1時間反応させた。TBS-Tでプレート洗浄後、HRP標識抗ラビットIgG抗体を室温で1時間反応させた。TBS-Tでプレート洗浄後、検出試薬（QuantaBlu^TM Fluorogenic Peroxidase Substrate Kits）(Thermo Fisher Scientific Cat# 15169)を室温で15分反応させ、励起波長: 325 nm、検出波長: 420 nmで蛍光強度を検出した。

２．２．TIRAP/MyD88 Binding Assay (ELISA)
96 well plate (Corning, Cat# 9018)にMyD88抗体を4℃で 18時間反応させ固相化した。TBS-Tでプレートを洗浄後、ヒトリコンビナントMyD88を室温で1時間反応させた。また、それと同時にヒトリコンビナントTIRAPと各濃度のトリメブチンを室温で1時間前処理した。TBS-Tでプレート洗浄後、前処理しておいたヒトリコンビナントTIRAPとトリメブチンをプレートで1時間反応させた。TBS-Tでプレート洗浄後、抗TIRAP抗体を室温で1時間反応させた。TBS-Tでプレートを洗浄後、HRP標識抗ラビットIgG抗体を室温で1時間反応させた。TBS-Tでプレート洗浄後、検出試薬（eBioscience^TM TMB Solution (1X) (Thermo Fisher Scientific, Cat# 00-4201-56))を室温で15分反応させ、測定波長：450 nmで吸光度を検出した。

２．３．細胞培養
マウスマクロファージ様細胞株RAW264.7細胞は、10%熱非働化ウシ胎仔血清(Biosera, Cat# FB-1061/500), 1%ペニシリン及びストレプトマイシン(Wako, Cat# 168-23191)を含有するD-MEM, High-glucose (Wako, Cat# 043-30085)を用いて37℃, 5% CO₂インキュベーター中で培養した。本条件下での倍化時間は11時間である。2日おきに継代培養を行い、維持した。
ヒト結腸癌由来細胞株Caco-2細胞は、10%熱非働化ウシ胎仔血清, 2 mmol/L L-グルタミン(Wako, Cat# 073-05391), 1 mmol/L ピルビン酸ナトリウム(Wako, Cat# 190-14881), 1%ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するE-MEM(Wako, Cat# 056-08385)を用いて37℃, 5% CO₂インキュベーター中で培養した。本条件下での倍化時間は36時間である。4〜5日おきに継代培養を行い、維持した。

２．４．マウス骨髄細胞の単離とマクロファージへの分化
骨髄細胞をマウスの大腿骨と脛骨から単離し、RPMI 1640培地(Wako, Cat# 189-02025)に入れた。細胞を70 mmのセルストレーナーで濾過し、1,300 rpmで5分間遠心した。上清を吸引除去して沈殿をタッピングで崩した後、分化誘導培地(10%熱非働化ウシ胎仔血清, 1%ペニシリン及びストレプトマイシン及び50 ng/mL M-CSF (Peprotech, Cat# 300-25)を含有するRPMI 1640培地)10 mLで懸濁し、細胞数をカウントした。次に、5×10⁵cells/mLになるように分化誘導培地で調製し、10 mLずつ10 cm ディッシュに播種し、37℃, 5% CO₂インキュベーター中で培養した。3日目に新しい分化誘導培地を半量交換し、さらにもう2日間培養した。骨髄細胞採取から5日目に、培養上清を吸引除去し、接着している細胞に新しい培地を5 mL添加してセルスクレーパーを用いて剥がし、15 mL遠心管に移して1,300 rpm で5分間遠心した。上清を吸引除去して、沈殿を分化誘導培地で懸濁して細胞数をカウントし、実験用のプレートに播種した。

２．５．抗炎症評価
RAW264.7細胞を、2×10⁴cells/wellで96ウェルプレートに、2.5×10⁵cells/dish/1.5mLの濃度で3.5 cm ディッシュに播種し、22時間培養した。マウス由来骨髄マクロファージを1.1×10⁵cells/well/mLで12ウェルプレートに播種し、44時間培養した。Caco-2細胞を1.1×10⁶cells/dish/3.5mLの濃度で播種し、24時間培養した。無血清培地(Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific, Cat# 31985070))に変更後、各細胞に薬剤処理を行い、2時間後に1 μg/mLのHMGB1、0.1 μg/mLのLPS、0.2 μg/mLのPam3CSK4、0.2 μg/mLのフラジェリンのいずれかで刺激し、18〜24時間後の培養上清、及び細胞を回収した。培養上清中のIL-6はMouse IL-6 Uncoated ELISA(Thermo Fisher Scientific, Cat# 88-7064)またはIL-6 Human Uncoated ELISA Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat#88-7066)で、TNF-αはTNF alpha Mouse Uncoated ELISA Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat# 88-7324)で、111種類のサイトカイン、ケモカインはProteome Profiler array Mouse XL Cytokine array kit (R&D, Cat# ARY028)で測定し、細胞のERK1/2, JNKのリン酸化レベルはウェスタンブロッティングにより評価した。

２．６．Cell Viability assay (WST-8 Assay)
RAW264.7細胞を、96ウェルプレートに10000 cells/wellの濃度で播種し、37℃, 5% CO₂の条件で24時間培養した後、薬剤処理を行った。薬剤処理後24時間で、WST-8試薬を添加して細胞生存率を測定した。

２．７．ウェスタンブロッティング
各サンプルをSDS-PAGEによって分離した後、Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore)に転写した。その後、メンブレンを、5%スキムミルクを含むTBS-T（0.1% (v/v) Tween 20 in TBS）中、室温で1時間インキュベートし、非特異的な結合をブロッキングした。メンブレンをTBS-Tで15分間1回、5分間3回洗浄し、5%スキムミルクを含むTBS-Tで希釈した一次抗体溶液中、18時間4℃でインキュベートした。一次抗体反応後のメンブレンをTBS-Tで15分間×1回、5分間×3回洗浄し、二次抗体反応溶液中で1時間、室温でインキュベートした。二次抗体反応後のメンブレンをTBSTで15分間×1回、5分間×3回洗浄し、検出試薬(Immobilon Western (Millipore)のHRP Substrate Peroxide Solution : HRP Substrate Lumminol Reagent = 1 : 1で混合)を用いて化学発光させ、ChemiDoc MP (Bio-Rad)で検出し、Image Lab software (Bio-Rad)を用いて解析した。

実施例１：トリメブチンによるTIRAP/MyD88相互作用に対する阻害効果
MyD88タンパク質とTIRAPタンパク質とを用いたELISA系を構築して、TIRAP/MyD88相互作用に対するトリメブチンの阻害効果を調べた。ネガティブコントロールとしては、溶媒（1%DMSO）投与群を用いた。
結果を図1に示す。トリメブチンが濃度依存的にTIRAP/MyD88相互作用を阻害することがわかる。

実施例２：トリメブチンによるHMGB1/RAGE相互作用に対する阻害効果
リコンビナントsRAGEとリコンビナントHMGB1を用いたELISA系を構築し、HMGB1/RAGE相互作用に対するトリメブチンによる阻害効果を調べた。また、ポジティブコントロールとして、HMGB1/RAGE相互作用を阻害すると報告されているグリチルリチン（Mollica L.et al., Chem Biol. 2007 Apr;14(4):431-41、Okuma Y.et al., Neuropharmacology. 2014 Oct;85:18-26）を用いた。その結果、グリチルリチンと比較して、著しく高い阻害効果がトリメブチンに認められた。トリメブチンはIC₅₀＝約8.9μMでHMGB1/RAGE相互作用を阻害した（図2）。

実施例３：トリメブチンによるHMGB1誘導性IL-6産生抑制効果及び細胞傷害性評価
実施例２において、トリメブチンがHMGB1/RAGE相互作用を強力に阻害することがわかったので、代表的な免疫細胞であるマウスマクロファージ様細胞RAW264.7細胞を用いて、HMGB1誘導性の炎症反応抑制効果の検証を行った。そこでまず、代表的な炎症性サイトカインであり、敗血症の重症度の指標にも用いられているIL-6の産生抑制効果の検証を行った。その結果、トリメブチンはHMGB1誘導性のIL-6産生をEC₅₀＝約300nMで阻害した（図3(A)）。
HMGB1やAβ等のRAGEリガンドは、RAGEと結合すると炎症反応以外にアポトーシスを惹起させることも報告されている。そのため、トリメブチン処理でみられたIL-6放出量の減少が、IL-6産生抑制効果によるものではなく、アポトーシスを誘導することによって細胞数が減少し、その結果IL-6放出量が減少しているという可能性が考えられた。そこで、トリメブチンが細胞生存率を減少させるか否かを、WST assayによって評価した。その結果、抗炎症効果を示している濃度域(≦30 μM)において、トリメブチンは細胞生存率に影響を与えないことが判明した（図3(B)）。

実施例４：トリメブチンによるHMGB1誘導性サイトカイン、ケモカイン産生抑制効果の評価
HMGB1がRAGEに結合することで、様々なサイトカイン、ケモカインが産生誘導され、炎症反応を誘導することが知られている。そのため、トリメブチンによって抑制されたHMGB1誘導性のIL-6産生が、IL-6特異的なものではなく、HMGB1/RAGE相互作用を阻害することによって他のサイトカイン、ケモカインも同様に抑制するか否か検証した。
培養上清中の111種類のサイトカイン、ケモカインを同時に測定できるProteome Profiler array Mouse XL Cytokine array kit (R&D)を用いて検証を行った。その結果、トリメブチンはHMGB1誘導性のCCL2, CCL12, CCL22, CXCL10, GM-CSF, IL-1rα, IL-6, IL-27, Lipocalin-2, PAI-1の産生を抑制することが明らかとなった（図4(A)、図4(B)）。
以上の結果から、トリメブチンはHMGB1/RAGE相互作用を阻害することによって様々なサイトカイン、ケモカインの産生を抑制し、抗炎症効果を示すことが明らかとなった。

実施例５：トリメブチンによるRAGE細胞内シグナル伝達抑制効果の評価
トリメブチンがHMGB1/RAGE相互作用を阻害することで、細胞外へのサイトカインやケモカインの産生を抑制することが明らかとなったため、次に細胞内のRAGE下流シグナル伝達を抑制しているか否か検証した。RAGEにHMGB1が結合することで、MAPKやNF-κBが活性化されることが報告されている。
そこで、RAW264.7細胞をHMGB1で刺激した際のERK1/2、JNKの活性化(リン酸化レベル)をウェスタンブロッティング法によって評価した。その結果、トリメブチンはHMGB1誘導性のERK1/2及びJNKのリン酸化を抑制することが明らかとなった（図5(A)、図5(B)）。
以上の結果より、トリメブチンはHMGB1/RAGE相互作用を阻害することでRAGE細胞内シグナル伝達を抑制することが示唆された。

実施例６：トリメブチンによるマウス骨髄マクロファージにおける抗炎症効果の評価
培養細胞であるRAW264.7細胞において、トリメブチンはHMGB1/RAGE相互作用を阻害することでHMGB1誘導性の炎症反応を抑制することが明らかとなった。次に、より生体内に近い条件下での抗炎症効果を評価するために、マウス由来の骨髄マクロファージを用いてトリメブチンによるHMGB1誘導性サイトカイン産生抑制効果の検証を行った。その結果、トリメブチンは正常細胞であるマウス骨髄マクロファージにおいても同様に抗炎症効果を示すことが明らかとなった（図6(A)、図6(B)）。

実施例７：トリメブチンによるTLR4、TLR2を介する炎症反応抑制効果の評価
トリメブチンがTLR4によって誘導されるIL-6産生を抑制するか否か検証した。その結果、トリメブチンは、TLR4の特異的リガンドであるLPS刺激によるIL-6産生も抑制した。この際、EC₅₀＝約600nMであった（図7(A)）。続いて、この作用がTLRの中でTLR4に特異的なものかを検証するために、細胞内においてはTLR4と全く同じ分子を介して炎症反応を誘導するTLR2においても抗炎症効果の検証を行った。その結果、トリメブチンはTLR2の特異的リガンドであるPam3CSK4刺激によるIL-6産生も抑制した。この際、EC₅₀＝約6.96 μMであった（図7(B)）。
以上の結果より、トリメブチンはTLRを介する炎症反応も抑制することが示された。また、LPS刺激によるIL-6産生抑制効果と比較して、Pam3CSK4刺激によるIL-6産生抑制効果が弱いことがわかった。

実施例８：トリメブチンによるTLR5を介する炎症反応抑制効果の評価
実施例７よりトリメブチンによるTLRシグナル伝達抑制効果はTIRAPに対する作用に基づくことが示唆された。このことを確認する為、細胞内においてTLR4及びTLR2と同様にMyD88を中心とするMyD依存的経路によって炎症反応を誘導するが、TIRAPが介在していないTLR5の誘導する炎症反応に関する検証を行った。TLR5が発現しているヒト結腸癌由来細胞株Caco-2細胞にTLR5の特異的リガンドであるフラジェリンを作用させた際のトリメブチンによるIL-6産生抑制効果の検証を行った。この際、ポジティブコントロールとして既存のTLR5阻害剤であるTH1020（Yan L. et al., ChemMedChem. 2016 Apr 19;11(8):822-55）を使用した。その結果、トリメブチンはTLR5を介する炎症反応は抑制しないことが明らかとなった（図8）。
以上の結果から、トリメブチンはTLRシグナル伝達においてはTIRAPに作用することで抗炎症効果を発揮することが明らかとなった。そのため、トリメブチンはTLRの中でTLR4及びTLR2に選択的に抗炎症効果を示すことが明らかとなった。

実施例９：敗血症モデルマウスに及ぼす効果
盲腸結紮穿刺法(CLP)により作成した敗血症モデルマウスをトリメブチンで処理し、生存率から本発明化合物の効果を検討した。具体的な手順を図9(A)に示す。
結果を図9(B)に示す。本発明化合物を投与したマウスにおいて生存率が有意に改善された。このことは本発明化合物が敗血症の治療薬として有効であることを示している。

トリメブチンは、TIRAP/MyD88相互作用を直接阻害するだけでなく、HMGB1/RAGE相互作用の阻害を介してTIRAPに作用することで、相乗的に抗炎症効果を発揮することが期待できる（図10）。炎症の後期メディエーターであるHMGB1に誘導される炎症を抑制することが有用であると考えられる一方で、TIRAPを阻害するという作用機序によるTLRシグナル伝達抑制は、これまでに開発されてきたTLR阻害剤とは異なる作用機序であり、有用性が高いと考えられる。

本発明化合物はTIRAP/MyD88相互作用及びHMGB1/RAGE相互作用を阻害する作用を有するので、TIRAP/MyD88相互作用及びHMGB1/RAGE相互作用に関連する疾患、特にこれらの相互作用が発症原因となる疾患の予防及び／又は治療に有用である。また、本発明化合物はTRRAP/MyD88相互作用及びHMGB1/RAGE相互作用を阻害する作用を有するので、TIRAP阻害剤、RAGE阻害剤等の研究用試薬としても有用である。

Claims

トリメブチン又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含有する、TIRAP/MyD88の相互作用に関連する疾患の予防及び／又は治療用薬剤。
TIRAP/MyD88相互作用に関連する疾患が炎症性疾患である、請求項１に記載の薬剤。
TIRAP/MyD88相互作用に関連する疾患が敗血症である、請求項１に記載の薬剤。
トリメブチン又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含有する、TIRAP阻害剤。
TIRAPの阻害が、HMGB1/RAGE相互作用の阻害による、請求項４記載の阻害剤。
TIRAPの阻害が、TIRAP/MyD88相互作用の阻害による、請求項４記載の阻害剤。
トリメブチン又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含有する、RAGE阻害剤。
RAGEの阻害が、HMGB1/RAGE相互作用の阻害による、請求項７記載の阻害剤。
研究用試薬である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の阻害剤。