CN112336729A

CN112336729A - 坎帕罗酮在制备预防或治疗淀粉样脑血管病药物中的应用

Info

Publication number: CN112336729A
Application number: CN202011371315.9A
Authority: CN
Inventors: 陈国俊; 宋力; 邓小娟; 朱炳林; 胡小童; 查静思; 周贵凤; 陈雪
Original assignee: First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-02-09

Abstract

本发明提供坎帕罗酮在制备预防或治疗淀粉样脑血管病药物中的应用，实验发现，坎帕罗酮可在细胞水平增加ADAM10的表达，但不促进其mRNA的表达。在进一步的动物实验APP/PS1小鼠模型中发现，坎帕罗酮显著减轻了脑血管淀粉样沉淀。本发明首次通过实验证明，坎帕罗酮可通过增加ADAM10的表达，将APP的淀粉样代谢途径转化为非淀粉样代谢途径，减少可聚集可沉淀的Aβ生成。研究还发现，坎帕罗酮衍生物Alsterpaullone(ALS)在SH‑SY5Y细胞促进了ADAM10的蛋白表达；而同为CDK抑制剂的AT7519在SHSY5Y细胞中不影响ADAM10的表达。这些研究对脑血管淀粉样变性的治疗及进一步的药物研发提供临床实验的指导意义。

Description

坎帕罗酮在制备预防或治疗淀粉样脑血管病药物中的应用

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年9月28日提交的中国专利申请2020110442206的优先权，所述申请的公开内容均援引入本文。

技术领域

本发明涉及坎帕罗酮的医药用途，具体涉及坎帕罗酮在制备预防或治疗淀粉样脑血管病药物中的应用。

背景技术

淀粉样脑血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)又称为脑嗜刚果红样血管病(cerebral congophilic angiopathy)、脑血管淀粉样变性(cerebrovascular；troyiofdosiS)，是老年人中常见的一种血管病变，主要累及脑皮质小动脉、中动脉、微动脉及毛细血管，表现为血管壁Aβ的进行性沉积(Biffi A,Greenberg SM(2011)Cerebralamyloid angiopathy:a systematic review.J Clin Neurol 7:1-9)。脑血管淀粉样变性被认为是老年人自发性颅内出血的重要原因。脑血管淀粉样变性主要有以下三种临床表现，可单独出现或合并出现：(1)反复或多发的颅内脑叶出血；(2)进行性加重的认知功能障碍；(3)刻板样短暂性神经功能缺损。脑血管淀粉样变最典型且致命的临床表现是在老年人群中的自发性脑出血，常发生于皮质与皮质下的交界处，可破入脑实质和蛛网膜下腔，根据出血的部位和范围，其症状可有很大变化，最常见的为头痛和癫痫部分性发作。脑血管淀粉样变相关颅内出血复发率高，且复发后的病死率很高。

目前，临床上针对脑血管淀粉样变性的相关治疗仍然停留在对症处理阶段。临床上治疗脑血管淀粉样变性的药物，如：免疫抑制剂，用于治疗较为罕见的炎症形式脑血管淀粉样变；对于更常见的脑血管淀粉样变，使用降压药物及抗血栓药物防止脑出血复发，而使用抗血栓药物可能会增加出血风险，这需要临床医生在个体化的基础上权衡使用抗凝剂和抗血小板药物治疗可能存在的潜在风险。所以有必要开发出新的治疗脑血管淀粉样变性的药物。

美国雅培制药公司在专利WO2008/064292A中公开了一种抗NOGO-66受体(NGR)的中和单克隆抗体，并公开了其在治疗脑血管淀粉样变性疾病中的用途。瑞士比奥根国际神经科学公司在专利WO2014/089500A公开了一种通过向受试者施用与BIIB037抗体结合于相同表位的抗Aβ抗体或其抗原结合片段来减少脑淀粉样蛋白斑块的方法。西班牙塞维利亚大学在专利WO2015/036646A中公开了一种用于治疗蛋白病或构象病的聚集蛋白和分子伴侣的组合物，并公开了其在治疗脑血管淀粉样变性疾病中的用途。尽管在过去的20多年里，全球各大制药公司及科研机构相继投入大量资金研发治疗脑血管淀粉样变性的药物，然而至今未成功开发出针对Aβ沉积这个环节进行病因治疗的药物。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供坎帕罗酮(Kenpaullone)及其衍生物Alsterpaullone(ALS)在制药领域的应用。

坎帕罗酮(Kenpaullone)是一种蛋白激酶抑制剂，能够抑制CDK2和GSK3/，并在肌萎缩侧索硬化症病人的细胞模型中具有神经保护作用(YangYM,Gupta SK,Kim KJ,PowersBE,CerqueiraA,Wainger BJ,Ngo HD,Rosowski KA,Schein PA,Ackeifi CA,ArvanitesAC,Davidow LS,WoolfCJ,Rubin LL(2013)A small molecule screen in stem-cell-derived motor neurons identifies a kinase inhibitor as a candidatetherapeutic for ALS.Cell stem cell 12:713-726.)。Kenpaullone还是KLF4(Kruppel-Like Factor 4)抑制剂，能抑制乳腺癌干细胞的转移(YuF,Li J,Chen H,Fu J,Ray S,Huang S,Zheng H,Ai W(2011)Kruppel-like factor 4(KLF4)is required formaintenance ofbreast cancer stem cells and for cell migration andinvasion.Oncogene 30:2161-2172.)；并减轻风湿性关节炎的炎症反应(Choi S,Lee K,Jung H,ParkN,Kang J,Nam KH,Kim EK,Ju JH,Kang KY(2018)Kruppel-Like Factor4Positively RegulatesAutoimmuneArthritis in Mouse Models andRheumatoidArthritis in Patients viaModulating Cell Survival and InflammationFactors of Fibroblast-Like Synoviocyte.Frontiers in immunology 9:1339.)。坎帕罗酮(Kenpaullone)分子式为C₁₆H₁₁BrN₂O。

Alsterpaullone(ALS)是kenpaullone的衍生物，是几种周期蛋白依赖性激酶(CDK)的ATP竞争抑制剂。Alsterpaullone被认为是第3组髓母细胞瘤的治疗药物。研究表明，Alsterpaullone调节细胞周期的进程，它可以通过干扰线粒体膜电位来激活caspase-9，从而阻止细胞周期并刺激癌细胞凋亡。Alsterpaullone分子式为：C₁₆H₁₁N₃O₃。

AT7519是一种不具备kenpaullone类似结构的小分子多细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。

坎帕罗酮(Kenpaullone)、Alsterpaullone(ALS)和AT7519结构如下：

Aβ是由淀粉样前体蛋白APP(amyloid precursor protein)降解而来。APP通过淀粉样途径代谢，即经分泌酶(BACE1)剪切，氮端形成胞外分泌片段β(sAPPβ)，碳端形成膜保留片段C99(β－CTF)，C99再经γ分泌酶剪切形成末端AICD和AD病理相关的Aβ。APP还可经另一条非淀粉样途径代谢，即经α分泌酶(ADAM10)剪切代谢。ADAM10属于I型跨膜蛋白酶家族，是在哺乳动物大脑中最为主要的α分泌酶。APP经ADAM10切割后形成胞外分泌段α(sAPPα)和碳端膜保留片段C83(α－CTF)，从而阻断了BACE1的作用，最后减少Aβ的聚集。

文献证明，ADAM10能够影响Aβ的沉积。如：ADAM10基因突变造成小鼠大脑Aβ聚集(Suh J,Choi SH,Romano DM,Gannon MA,Lesinski AN,Kim DY,Tanzi RE(2013)ADAM10missense mutations potentiateβ-amyloid accumulation by impairing prodomainchaperone function.Neuron 80:385-401.)；过表达ADAM10抑制了Aβ的沉积(Yan R,Vassar R(2014)Targeting the beta secretase BACE1 forAlzheimer's diseasetherapy.The Lancet Neurology 13:319-329.)；促进ADAM10表达的药物能够显著减少Aβ产生(Min Z,TangY,Hu XT,Zhu BL,Ma YL,Zha JS,Deng XJ,Yan Z,Chen GJ(2018)Cosmosiin Increases ADAM10 Expression via Mechanisms Involving 5'UTR and PI3KSignaling.Frontiers in molecular neuroscience 11:198.)。

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供坎帕罗酮(Kenpaullone)在制备预防或治疗淀粉样脑血管病药物中的应用。本发明提供坎帕罗酮衍生物Alsterpaullone(ALS)在制备预防或治疗淀粉样脑血管病药物中的应用。

本发明坎帕罗酮(Kenpaullone)及其衍生物Alsterpaullone(ALS)能够减轻并改善脑血管淀粉样沉淀；具体为坎帕罗酮(Kenpaullone)及其衍生物Alsterpaullone(ALS)通过增加ADAM10的表达来改善脑血管淀粉样沉淀；更具体的说，坎帕罗酮(Kenpaullone)及其衍生物Alsterpaullone(ALS)在细胞水平增加ADAM10的表达来改善脑血管淀粉样沉淀。所述应用为淀粉样变脑血管病相关脑出血(Cerebral Amyloid Angiopathy Hemorrhage，CAAH)。所述应用为淀粉样变所致自发性脑出血、头痛或癫痫部分性发作。

本发明提供坎帕罗酮(Kenpaullone)及其衍生物Alsterpaullone(ALS)在制备淀粉样蛋白Aβ抑制剂中的应用。所述坎帕罗酮(Kenpaullone)及其衍生物Alsterpaullone(ALS)能够抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平。进一步，坎帕罗酮(Kenpaullone)及其衍生物Alsterpaullone(ALS)通过增加ADAM10表达从而减少Aβ沉积。

本发明提供坎帕罗酮(Kenpaullone)及其衍生物Alsterpaullone(ALS)在制备ADAM10激动剂中的应用。坎帕罗酮(Kenpaullone)在细胞水平增加ADAM10的表达，但不促进其mRNA的表达。

本发明还提供了治疗患者的淀粉样变脑血管病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)化合物。本发明进一步提供了防止患者的淀粉样蛋白Aβ沉积发展成为淀粉样变脑血管病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)化合物。

本发明所使用的坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)原料纯度最好是99.0％以上，以重量百分数计。

淀粉样脑血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)是以淀粉样物质沉积在脑小动脉、较小的毛细血管及静脉为特征，主要累及颅内微血管的病变。CAA可以导致广泛性脑出血。具体说来，神经系统症状上会出现言语困难、阵挛或全身性抽搐，少数表现为偏瘫等症状。如果多发性脑出血情形严重，则会出现头痛，伴恶心呕吐或精神错乱；如出血局限，则多有明显的定位症状。发病前血压多正常，部分病人发病时血压有不同程度的升高。出血易流入邻近的蛛网膜下腔引起头痛、恶心、呕吐、颈项强直、克氏征阳性等脑膜刺激症状。因出血灶较浅表，一般不破入脑室系统，所以起病时大多无意识障。少数病人可因出血的凝块阻塞脑脊液通路或影响其再吸收，导致脑积水引起渐加重的意识障碍。如为多发性脑内出血，临床表现较凶险，多以昏迷、偏瘫、突发头痛起病，伴恶心、呕吐或精神错乱。脑组织和脑血管组织的病理学检查，可以有效帮助确认颅内血管淀粉样变脑出血的诊断，病理检验被认为是CAA诊断的唯一标准(祝怡然,淀粉样脑血管病相关脑出血与高血压脑出血外科治疗及临床研究分析,石河子大学硕士学位论文,2014年)。

本文使用的术语“治疗”包括限制、减缓、终止或逆转所存在的症状或病症的进展或严重程度。本文使用的术语“患者”是指人。本文使用的术语“有效量”是指本发明坎帕罗酮(Kenpaullone)及其衍生物Alsterpaullone(ALS)化合物或其可药用盐的数量或剂量，当给予患者单或多剂量时，这种数量或剂量能够为诊断或治疗中的患者提供预期效果。作为本领域技术人员，诊断医生通过利用已知的技术，并且观察在类似情况下所获得的结果，可以容易地确定有效量。在确定患者的有效量的过程中，诊断医生会考虑大量因素，包括但不限于∶患者的种类；年龄和常规健康情况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的复杂度或严重程度；个体患者的响应；给予的具体化合物；给药模式；给予的制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；使用的伴随药物；及其它相关的情况。

优选，将本发明的坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)化合物配制为药物组合物，通过能够使化合物生物可利用的任何途径给予，包括口服、透皮和肠胃外途径。最优选，口服或透皮给予这样的组合物，尤其优选口服。这样的药物组合物和其制备方法在本领域为大家所熟知，如片剂，滴丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂等；注射剂如注射用粉剂，注射用冻干粉等剂型，以上剂型均可以按照常规方法制得。上述剂型优选为口服胶囊剂、片剂和注射剂。

作为以本发明的化合物作为有效成分的制剂或药物组合物的形式，没有特别限定，可以列举例如片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、经口液剂、乳剂、酏剂、柠檬水剂、悬浊剂、糖浆剂、口腔用片剂、经口冻剂、吸入剂、栓剂、注射剂、软膏剂、眼软膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、贴剂、外用液剂等制剂。制剂化中可以使用通常使用的赋形剂、粘合剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭剂和根据需要的稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂等，配合通常作为药物制剂的原料使用的成分通过常规方法进行制剂化。例如，在制造经口制剂时，加入本发明的结晶或非结晶化合物和赋形剂并进一步根据需要加入粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭剂等作为添加剂，然后，通过常规方法制成散剂、细粒剂、颗粒剂、片剂、包衣片剂、胶囊剂等。作为添加剂，可以列举例如：大豆油、牛脂、合成甘油酯等动植物油；液体石蜡、角鲨烷、固体石蜡等烃；肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯等酯油；鲸蜡硬脂醇、山嵛醇等高级醇；有机硅树脂；硅油；聚氧乙烯脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物等表面活性剂；羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚丙烯酸、羧基乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、甲基纤维素等水溶性高分子；乙醇、异丙醇等低级醇；甘油、丙二醇、二丙二醇、山梨醇等多元醇；葡萄糖、蔗糖等糖；无水硅酸、硅酸铝镁、硅酸铝等无机粉体、纯化水等。作为赋形剂，可以使用例如乳糖、玉米淀粉、白糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、结晶纤维素、二氧化硅等，作为粘合剂，可以使用例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、甲基纤维素、乙基纤维素、阿拉伯胶、黄芪胶、明胶、结冷胶、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙二醇·聚氧乙烯·嵌段聚合物、葡甲胺等，作为崩解剂，可以使用例如淀粉、琼脂、明胶粉末、结晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、柠檬酸钙、糊精、果胶、羧甲基纤维素·钙等，作为润滑剂，可以使用例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅、硬化植物油等，作为着色剂，可以使用允许添加到医药品中的着色剂，作为矫味矫臭剂，可以使用可可粉、薄荷脑、芳香散、薄荷油、龙脑、桂皮粉末等。在制造片剂或颗粒剂时，可以包覆糖衣，此外可以根据需要进行适当包衣。另外，在制造糖浆剂、乳剂、酏剂、柠檬水剂、悬浊剂、注射用制剂等液剂时，可以在本发明的化合物进一步根据需要添加pH调节剂、溶解剂、乳化剂、分散剂、等渗剂等、助溶剂、稳定剂等作为添加剂并通过常规方法进行制剂化。制造外用剂时的方法没有限定，可以通过常规方法制造。即，作为制剂化时使用的基剂原料，可以使用医药品、医药部外品、化妆品等中通常使用的各种原料。作为使用的基剂原料，具体而言，可以列举例如动植物油、矿物油、酯油、蜡类、高级醇类、脂肪酸类、硅油、表面活性剂、磷脂类、醇类、多元醇类、水溶性高分子类、粘土矿物类、树脂、塑料、橡胶等非水溶性的天然或合成高分子化合物、纯化水等原料，进而，可以根据需要添加pH调节剂、抗氧化剂、螯合剂、防腐防霉剂、着色料、香料等，但本发明的外用剂的基剂原料不限于此。另外，还可以根据需要配合具有分化诱导作用的成分、血流促进剂、杀菌剂、消炎剂、细胞激活剂、维生素类、氨基酸、保湿剂、角质溶解剂等成分。另外，上述基剂原料的添加量为达到通常外用剂的制造时设定的浓度的量。

有益效果：

不意图为任何理论所束缚，认为尽管全球各大制药公司及科研机构相继投入大量资金研发治疗脑血管淀粉样变性的药物，然而至今未成功开发出针对Aβ沉积这个环节进行病因治疗的脑血管淀粉样变性药物。

发明人经长期探索与实验，意外发现，坎帕罗酮(Kenpaullone)可在细胞水平增加ADAM10的表达，但不促进其mRNA的表达。在进一步的动物实验中发现，在APP/PS1小鼠模型中，坎帕罗酮(Kenpaullone)显著减轻了脑血管淀粉样沉淀。本发明首次通过实验证明，坎帕罗酮(Kenpaullone)可通过增加ADAM10的表达，将APP的淀粉样代谢途径转化为非淀粉样代谢途径，减少可聚集可沉淀的Aβ生成。研究还发现，坎帕罗酮衍生物Alsterpaullone(ALS)在SH-SY5Y细胞促进了ADAM10的蛋白表达；而同为CDK抑制剂的AT7519在SHSY5Y细胞中不影响ADAM10的表达。这些研究对脑血管淀粉样变性的治疗及进一步的药物研发提供了临床实验的指导意义。

附图说明

附图中的KEN表示本发明的坎帕罗酮(Kenpaullone)；

图1是Kenpaullone在多种细胞中促进ADAM10的蛋白表达结果图，其中(图1A)SH-SY5Y细胞、(图1B)HEK-293细胞、(图1C)HT22细胞在不同浓度(250nM、500nM、750nM、1uM、2uM)的kenpaullone作用下用western blot检测其ADAM10的蛋白表达，其ADAM10未成熟体与成熟体蛋白表达增加的统计结果(图1D、图1E、图1F)分别表明Kenpaullone在SH-SY5Y细胞、HEK-293细胞、HT22细胞促进了ADAM10的蛋白表达；(数据显示为均值±标准差，*P＜0.05；**P小于0.01)。

图2是Kenpaullone不促进ADAM10的mRNA的表达结果图，其中(图2A)500nM的kenpaullone处理SH-SY5Y细胞36小时后，其与对照组相比，mRNA的表达差异统计结果显示为无统计学差异；(图2B)500nM的kenpaullone处理SH-SY5Y细胞36小时后，收集细胞培养基用ELISA检测Aβ1-40与Aβ1-42，观察到细胞外的Aβ1-42显著降低；(图2C)SHSY5Y细胞在DMSO以及不同浓度的Kenpaullone处理下，用CCK8的方法检测细胞活性，发现其细胞活性不受明显影响；(数据显示为均值±标准差，*P＜0.05；**P小于0.01)。

图3是kenpaullone在ADAM10的转录后水平发挥调控结果图，其中(图3A)500nM的kenpaullone处理SH-SY5Y细胞36小时后，再分别用转录抑制ActD 0.1uM处理16小时，翻译抑制剂CHX1uM处理16小时后用western blot检测细胞的ADAM10的蛋白表达，统计图(图3D)表明，翻译抑制剂CHX减弱了kenpaullone对ADAM10的蛋白表达的促进作用；(图3B)500nM的kenpaullone处理SH-SY5Y细胞36小时后，再分别用CQ溶酶体抑制剂100uM处理6小时，MG132蛋白酶体抑制剂1uM处理6小时后用western blot检测细胞的ADAM10的蛋白表达，统计图(图3E)；(图3C)将ADAM10的含有5-UTR(5端非翻译片段)与不含有5-UTR的质粒转染HEK-293细胞48小时，同时用500nM的kenpaullone处理细胞36小时后用western blot检测细胞的ADAM10蛋白表达情况，统计图(图3F)；(数据显示为均值±标准差，*P＜0.05；**P小于0.01)。

图4是kenpaullone对ADAM10不同启动子区荧光素酶活性分析结果图，其中(图4B)将ADAM10启动子区(-64～414)截成不同片段后构建质粒；(图4A)将以上不同片段质粒转染HEK293细胞，500nM的kenpaullone处理36h，检测荧光素酶活性；pGL4.17为阴性对照；**P<0.01；结果提示：1-414nt的ADAM105UTR区核苷酸序列介导了Kenpaullone的作用。

图5是Kenpaullone在离体细胞中影响α及β终端片段(α/β-CTF)的表达结果图，其中(图5A)是对照组和加药处理组的α及β终端片段(α/β-CTF)的表达情况；(图5B)为统计结果；(数据显示为均值±标准差，*P＜0.05；**P小于0.01)。

图6是Kenpaullone在动物模型中改善脑血管淀粉样沉淀结果图，12月龄的APP/PS1小鼠经腹腔注射kenpaullone(5mg/kg/2d)2个月后，用免疫组化的方式检测其与对照组小鼠的老年斑在脑组织中的沉积(图6A、图6B、图6C、图6D)；(图6A)和(图6B)为AD模型鼠给予生理盐水组即对照组的脑血管图，可见脑血管周围间隙褐色的淀粉样蛋白沉积较多，血管壁增厚，管腔狭窄；(图6C)和(图6D)为AD模型鼠给予Kenpaullone处理后即实验组的脑血管图，可见其脑血管周围间隙的褐色淀粉样蛋白沉积有所改善，血管壁厚度正常。

图7是Kenpaullone在动物模型中改善脑血管淀粉样沉淀的统计图，12月龄的APP/PS1小鼠经腹腔注射kenpaullone(5mg/kg/2d)2个月后，用免疫组化的方式检测其与对照组小鼠的老年斑在脑组织中的沉积的统计图；(数据显示为均值±标准差，*P＜0.05；**P小于0.01)。

图8为AT7519和Alsterpaullone(ALS)处理下SH-SY5Y细胞中ADAM10蛋白表达结果图；其中(A)为AT7519在1、5、10、20uM浓度下对SH-SY5Y细胞处理24小时后，western blot检测ADAM10和CDK5的蛋白表达图，(C)为对应的统计图；(B)为kenpaullone结构类似试剂Alsterpaullone(ALS)在0.5、1、2、5、10uM的浓度下对SH-SY5Y细胞处理24小时后，westernblot检测ADAM10的蛋白表达图，(D)为对应的统计图；结果表明kenpaullone的结构类似试剂Alsterpaullone(ALS)在SH-SY5Y细胞促进了ADAM10的蛋白表达；而不具备kenpaullone类似结构的CDK抑制剂AT7519在SHSY5Y细胞中不影响ADAM10的表达(数据显示为均值±标准差，*P＜0.05；**P小于0.01)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所述原料及试剂均为市售产品。除特殊说明外，本发明所述百分比均为质量百分比。

实施例

1材料和方法

1.1传代细胞培养

1.1.1实验细胞

HEK293细胞中科院细胞库

HT22细胞中科院细胞库

SH-SY5Y细胞中科院细胞库

1.1.2主要仪器及试剂

1.1.3传代细胞培养基配制

10％FBS完全培养基(10％DMEM/DMEM-F12，4℃保存)

胎牛血清 5ml

双抗(青霉素、链霉素) 5ug/ml

培养基定容至 500ml

1.1.4传代细胞的复苏

从液氮容器中取出冻存管，浸入37℃水浴箱并不时摇动使其尽快融化。取出冻存管，在无菌的超净台里小心的打开盖子，用吸管轻轻的上下吹打几下吸出细胞悬液，加入到离心管中并加入10倍以上培养液，混匀。离心1000rm，5min。弃去上清液，为了使细胞打散和降低细胞损伤，先在离心管外面底部处轻轻拍打10下，然后加入含10％小牛血清培养液轻吹几下，重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种在培养瓶里，放37℃培养箱静置培养。

次日更换一次培养液，继续培养。

1.1.5传代细胞培养

(1)观察细胞融合率约为90％时进行传代。

(2)弃培养基，枪头沿皿的侧壁加2-3ml FBS free培养基清洗细胞，缓慢晃动培养皿，弃培养基。

(3)将1ml胰酶沿培养皿侧壁打入皿中，没过细胞即可，至培养皿于镜下观察形态，细胞膜成圆形，触角微缩即可。

(4)弃胰酶，加2ml 10％FBS培养基，吹打细胞约15次。

(5)室温1100rpm离心5min。

(6)离心完毕，弃上清，轻拍管壁沉淀数次。

(7)离心管中注入10％FBS培养液3mL，高压灭菌枪头轻吹重悬细胞。

(8)按1:4-6左右传代。

(9)上下左右晃动培养基静置过夜。

1.1.6传代细胞的冻存：

配制含10％DMSO小牛血清的冻存培养液。取对数生长期的细胞，移去上清液用胰蛋白酶消化细胞，1-3分钟，然后加入培养液终止消化反应。用移液枪轻轻吹打瓶壁和悬液使细胞均匀，然后将细胞悬液移至离心管中，离心1000rpm，5min。

弃去上清液，在离心管外面底部细胞处轻轻拍打几下，然后加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打让细胞均匀地装入冻存管中，细胞的最终密度为1×10^6/ml-5×10^6/ml。

在冻存管上标记细胞的名称，冻存时间及操作者，放入冻存盒中过夜，然后移入液氮容器中。

1.2传代细胞药物处理

1.2.1实验药物及试剂

DMSO sigma(美国)

Kenpaullone sigma(美国)

所有处理组中DMSO浓度均小于1:1000。

1.2.2细胞药物处理

HEK293细胞每孔2×10⁵个，12孔板铺板细胞数量为1×10⁵。待细胞融合率为60％-70％左右，加药处理24h，36h或48h。

HT22于加药前一天铺板，6孔板铺板为每孔2×10⁵个，12孔板铺板数量为1×10⁵。待融合率为60％-70％加药处理24h，36h或48h。

Y5Y细胞每孔4×10⁵个，12孔板铺板细胞数量为2×10⁵。待细胞融合率为80％-90％左右加药处理24h，36h或48h。

1.3CCK-8测定

1.3.1仪器及试剂

酶标仪中国HEALES公司

96孔板美国Corning公司

CCK-8 美国Genview公司

1.3.2实验步骤

(1)细胞铺板。

(2)第二天显微镜下观察96孔板细胞的状态。融合度为70％-80％时，弃原培养基，加药处理细胞。每孔加入100μL不同药物浓度或DMSO以及不含二者的培养基，放孵箱中36h。

(3)药物作用时间到达后，弃旧培养基，每孔加入100μL培养基及10μL CCK-8，37℃孵育1-4h。

(4)取出96孔板、开盖，设置酶标仪中450nm参数。每组OD值为3个复孔的OD值的平均值。

1.4ADAM10启动子截短片段荧光素酶活性分析

1.4.1主要仪器及试剂

1.4.2检测前细胞处理

(1)HEK293铺96孔板，每孔3000个及加入100uL 10％DMEM，37℃过夜。

(2)第二天待融合率为60％左右时，按照Lip 2000操作手册转染96孔板。

(3)转染24h，加药处理。把药物溶于培养液中，200ul/每孔，继续培养。

(4)

萤光素酶检测。

1.4.3报告基因荧光素酶活性检测

(1)药物处理24h后，Luciferase Assay Substrate化学发光剂(避光)按照与培养基1：1浓度加入每孔。

(2)96孔板中每孔加入100uL的

试剂和100uL的

试剂。

(3)避光常温放置30-60分钟后，用

检测仪测荧光素酶活性。

(4)数据计算：取3个复孔均值。同时参考阳性对照、阴性对照结果。独立重复三次实验。

1.5qPCR

1.5.1仪器及试剂

1.5.2RNA提取

(1)实验前物品准备。

(2)1mLRNAiso Plus/每孔(6孔板)。

(3)每管分别加入200uL氯仿,剧烈震荡。

(4)离心后将最上层吸入EP管内，加入500ul异丙醇，静置10min之后将其置于4℃离心机中12000g离心10min。

(5)离心后留底部沉淀，弃上清，并加入1mL 75％乙醇。将其置于4℃离心机中7500g离心5min。

(6)弃上清，室温静置5-10min。加20-50ul DEPC(视沉淀量及所需浓度调整)。

(7)EP管55-60℃水浴10-15min。

(8)取1ul测量RNA浓度及纯度，剩余RNA储存-80℃。

1.5.3RNA质量鉴定

(1)取RNA5 ul做琼脂糖凝胶电泳。

(2)若28S处条带的亮度为18S条带亮度的2倍，则表示RNA质量合格。

(3)OD260/OD280在1.7-2.1之间为纯度合格。

1.5.4RT-PCR

(1)根据所测RNA浓度计算所需RNA量，按以下体系加至200uL EP管中(冰上进行)。

(2)PCR仪行RT-PCR反应。结束得到cDNA行荧光定量PCR。剩余保存于-20℃。

反应程序：

25℃ 10min

42℃ 30min

85℃ 5min

1.5.5实时定量PCR(qPCR)

(1)使用

Premix Ex Taq^TM II试剂操作步骤设置参数

(2)反应程序：

(3)qPCR引物见如下：

(4)实验结果用2-△△CT法计算。

1.6蛋白印迹(WB)

1.6.1仪器与试剂

1.6.2主要仪器与试剂

(1)WB电泳液 Tris base 3.03g+甘氨酸 18.8g+SDS 1g

(Milli-Q超纯水定容到1000ml)

(2)TBST洗膜液 Nacl 8.76g+Tris base 2.44g+Tween20500 ul

(Milli-Q超纯水定容到1000ml)

(3)WB转膜液 Tris base 3.025g+甘氨酸 15.0g+甲醇200ml

(Milli-Q超纯水定容到1000ml)

(4)WB封闭液：脱脂奶粉5g+TBST 100ml

(5)8％分离胶及4％浓缩胶(1.5mm)

1.6.3蛋白的提取

细胞在处理相应后，用冰的PBS洗两遍，于冰上加入适当体积的细胞裂解液，用细胞刮将细胞刮下来，然后用移液枪将其加入事先标记好的1.5ml的离心管中，煮沸5min。然后用细胞超声粉碎机将细胞打碎，4℃低温离心10min。-80℃低温保存待用。

1.6.4蛋白的定量

将BSA配制成浓度1mg/ml的蛋白标准溶液，-20℃保存；根据标本的总数量，将BCA试剂A：试剂B按50:1的比例配制适量BCA工作液，室温保存备用；分别将0、1、2、4、8、12、16、20μl的蛋白标准溶液(1mg/ml)依次加入至96孔板中，加PBS将每孔补足到20μl；分别将2μl的待测蛋白样品依次加入96孔板的样品孔中，每个样本3次重复，加PBS将每孔补足20μl；每孔分别加入200μl的BCA工作液，37℃放置30min；酶标仪测定波长为A562时各孔的比色值，根据比色值与BSA蛋白标准品的浓度绘制标准曲线，并根据其公式计算出各蛋白样品的浓度，然后计算出WB样品的上样量。

1.6.5Western blotting

1)配胶：将玻璃板洗净晾干，配制8％分离胶和4％浓缩胶，室温静置约30min，使其凝固待用。

2)上样电泳：固定好胶板后，在电泳槽中加入事先配好的电泳液1000ml，拔出梳子，将3ul蛋白预染Marker和10ul蛋白样品量分别加入相应泳道。先用80V约20min使其到达下层胶，然后120V约60min，使溴酚蓝到达分离胶底部。

3)转膜：将据分子量大小裁剪的PVDF膜浸泡在甲醇中约15s使其激活。从电泳槽中取出胶板，倒出电泳液，加入1000ml转膜液，根据Marker大小将目的蛋白切开，按照(-)黑板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白板(+)的顺序夹好，将夹子放入转膜槽中，按400mA恒流转膜30min。

4)封闭：转膜结束后，将膜置于丽春红溶液中浸泡3-5min，观察转膜情况。根据Marker裁剪出目的蛋白大小的条带并编号，用TBST洗3次，然后室温用5％脱脂奶粉封闭1h。

5)孵一抗：封闭结束后的膜用TBST洗3次后，将其放入事先配好的相应的一抗稀释液中，4℃缓慢摇动孵育过夜。

6)孵二抗：次日将膜用TBST液清洗3次后，放入用封闭液按1:5000稀释二抗中，室温缓慢摇动孵育1h。

7)显影：将膜用TBST洗3次，ECL化学发光液A和B按1:1比例混匀，均匀滴加到膜上，Fusion成像系统扫描分析。

8)统计：用quantity one软件分析各个条带的分度值，并整理记录便于统计。

1.7免疫组化

1.7.1主要试剂、器材

1.7.2免疫组化的方法

(1)用4％多聚甲醛固定脑组织，石蜡包埋切片，贴片。

(2)PBS洗3次，每次5min，0.3％H2O2-甲醇室温孵育30min。

(3)PBS洗3次，每次5min，加入0.5％TritonX100处理30min以增加膜的通透性。

(4)PBS洗3次，每次5min，山羊血清37℃孵育20min。

(5)弃掉血清，加入鼠源性Aβ抗体(1：200)，4℃孵育过夜。

(6)PBS洗3次，每次5min，加入HRP偶联二抗1:500,37℃孵育1h。

(7)PBS洗3次，每次5min，加入DAB显色液，普通光学显微镜下观察显色。

(8)梯度酒精脱水后，中性树胶封片。光学显微镜下，采集图片并分析。

1.8实验数据统计与分析

所有数据来源于三次独立的重复实验，以X±s表示，用GraphPad软件，进行数据统计。两个独立样本间的比较,用独立样本t检验，两个以上样本间的比较，采用one-wayANOVAwith Dunnett’s multiple comparison test检验。P<0.05为差异具有统计学意义。使用GraphPad Prism 5及CorelDRAW X4软件绘图。

2结果

一、Kenpaullone在多种细胞促进ADAM10的蛋白表达，但不促进其mRNA的表达

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人胚肾细胞HEK293、小鼠海马神经元细胞HT22接种于6孔板，待细胞融合率为60％-70％左右时加药处理24h，加药浓度为0nM、250nM、500nM、750nM、1uM、2uM。本实验验证500nM浓度安全且稳定有效，后续实验均选择500nM作为药物处理浓度。为了验证转录和蛋白水平的表达，进行qPCR及western blot实验，结果如图1所示。从图1中可看出，kenpaullone 500nM对SH-SY5Y、HEK293、HT22细胞ADAM10的蛋白水平的表达有促进作用，western blot检测其ADAM10蛋白较对照组增加约2倍。

500nM的kenpaullone处理SH-SY5Y细胞36小时后，其与对照组相比mRNA的表达差异统计图显示，kenpaullone不影响ADAM10的mRNA的表达。500nM的kenpaullone处理SH-SY5Y细胞36小时后，收集细胞培养基用ELISA检测Aβ1-40与Aβ1-42，观察到细胞外的Aβ1-42显著降低。不同浓度的kenpaullone(250nM、500nM、750nM、1uM、2uM)处理SH-SY5Y细胞36小时，结果显示，不影响细胞的生长活性(图2)。

二、kenpaullone在ADAM10的转录后水平发挥调控作用

用浓度为500nM的kenpaullone处理SH-SY5Y细胞36小时后，再分别用转录抑制剂ActD 0.1uM处理16小时，翻译抑制剂CHX 1uM处理16小时后用western blot检测细胞的ADAM10的蛋白表达；用浓度为500nM的kenpaullone处理SH-SY5Y细胞36小时后，再分别用CQ溶酶体抑制剂100uM处理6小时，MG132蛋白酶体抑制剂1uM处理6小时后用western blot检测细胞的ADAM10的蛋白表达；将ADAM10含有5-UTR(5端非翻译片段)与不含有5-UTR的质粒转染HEK-293细胞48小时，同时用500nM的kenpaullone处理细胞36小时后用western blot检测细胞的ADAM10蛋白表达情况。结果显示，kenpaullone在ADAM10的转录后水平发挥调控作用(图3)。

因为qPCR及western blot实验已证实kenpaullone可促进ADAM10的蛋白表达，为进一步探究kenpaullone对ADAM10启动子的作用及相关机制，利用前期构建的ADAM10核心启动子区不同长度的片段进行荧光素酶活性分析。将5个不同片段的质粒、阴性对照质粒pGL4.17转染SHSY5Y细胞，质粒量为100ng,于转染12h后加入kenpaullone 500nM作用细胞。结果显示，kenpaullone对转染了pGL4.17-ADAM10-E/E1/E2的SHSY5Y细胞，具有荧光素酶活性增强的作用，其中，ADAM10-E1片段的趋势最明显(图4)，较阴性对照组上升约2倍。但从图4中可看出ADAM105UTR的1-414片段均有可能发挥作用。

三、Kenpaullone在离体细胞中影响α及β终端片段(α/β-CTF)的表达

用浓度为500nM的kenpaullone处理HEK293-APP细胞36小时后，进行western blot实验，结果显示kenpaullone 500nM增加HEK293-APP细胞中β终端片段(β-CTF)的表达(图5)。

四、Kenpaullone可以改善脑血管淀粉样沉淀

发明人进一步进行了动物实验，选取同质的12月龄的14只WT和13只APP/PS1小鼠，在WT组中，以其中7只作为处理组以kenpaullone 5mg/kg腹腔注射，7只为对照组注射等计量的生理盐水；在APP/PS1组中，其中7只作为处理组以kenpaullone5mg/kg腹腔注射，6只为对照组注射等计量的生理盐水，隔天一次，连续2月，然后用免疫组化的方式检测小鼠的Aβ在脑组织中的沉积，检测使用的抗体为6E10(1：200稀释)。免疫组化结果表明，与对照组相比，kenpaullone减少Aβ在小鼠血管组织中的沉积(图6)，其统计结果如图7所示。

参照上述实施例，发明人考察了CDK抑制剂Alsterpaullone(ALS)和AT7519对ADAM10的表达情况，其中kenpaullone的衍生物Alsterpaullone(ALS)和另一种CDK抑制剂AT7519均购自美国MedChemExpress公司。

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y接种于6孔板，待细胞融合率为60％-70％左右时加药处理24h，AT7519的加药浓度为1uM、5uM、10uM、20uM，Alsterpaullone(ALS)的加药浓度为0.5uM、1uM、2uM、5uM、10uM。药物处理后进行western blot实验以验证蛋白水平的表达，结果如图8所示。从图8B和图8D中可看出，Alsterpaullone(ALS)在1uM、2uM、5uM、10uM的浓度下对SH-SY5Y的ADAM10的蛋白水平的表达有促进作用，在5uM时促进作用最明显，其ADAM10蛋白较对照组增加约1.7倍。而不具备kenpaullone类似结构AT7519在各个浓度对ADAM10的表达无促进作用(图8A、图8C)。结果：Kenpaullone衍生物Alsterpaullone(ALS)在SHSY5Y细胞促进了ADAM10的蛋白表达。

Claims

1.坎帕罗酮在制备预防或治疗淀粉样脑血管病药物中的应用；

所述坎帕罗酮(Kenpaullone)分子式为C₁₆H₁₁BrN₂O，化学结构式为：

2.坎帕罗酮衍生物Alsterpaullone(ALS)在制备预防或治疗淀粉样脑血管病药物中的应用；所述Alsterpaullone(ALS)分子式为C₁₆H₁₁N₃O₃，化学结构式为：

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)通过增加ADAM10的表达来改善脑血管淀粉样沉淀；优选的，所述应用为淀粉样变脑血管病相关脑出血。

4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述应用为淀粉样变所致自发性脑出血、头痛或癫痫部分性发作。

5.坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)在制备淀粉样蛋白Aβ抑制剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)能够抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于：坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)通过增加ADAM10表达从而减少Aβ沉积。

8.坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)在制备ADAM10激动剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：坎帕罗酮(Kenpaullone)在细胞水平增加ADAM10的表达，但不促进其mRNA的表达。

10.如权利要求1-9任一项所述的应用，其特征在于：将坎帕罗酮(Kenpaullone)或其衍生物Alsterpaullone(ALS)化合物配制为药物组合物，通过能够使化合物生物可利用的任何途径给予，包括口服、透皮和肠胃外途径；所述药物组合物选自片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、经口液剂、乳剂、酏剂、柠檬水剂、悬浊剂、糖浆剂、口腔用片剂、经口冻剂、吸入剂、栓剂、注射剂、软膏剂、眼软膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、贴剂、外用液剂。