CN114957277B - 一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物及其制备方法和应用；化合物为一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A简称即为PA，呈黄色粉末状；其制备方法为取针层孔菌属Phellinus真菌的子实体，用含水有机溶剂如甲醇或乙醇或丙酮回流提取或浸渍提取，经过大孔树脂柱层析，选择醇洗脱或水洗脱；其应用在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物给药方式为注射制剂、口服制剂或外用制剂，药物制剂形式为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。本发明实现了一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A在抗脑卒中及帕金森病药物上的应用，其效率高，针对性强，对神经元及脑组织具有很好的保护作用。

Description

一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物及其制备 方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物及其制备方法和应用，尤其是指一种菌类植物桑黄的提取物及其在预防及治疗脑卒中及神经退行性疾病中的应用。

背景技术

脑卒中是由于大脑血管破裂或者供血动脉闭塞，导致脑导致脑功能障碍的总称，脑卒中可划分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中约占80%以上，其危害性相对高于出血性脑卒中。脑卒中是我国居民第一位的死亡原因，成年人残疾的首位病因，是一个亟待解决的重大健康问题，目前，临床上治疗缺血性脑卒中的方法主要包括血管内血栓切除术和静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA），rtPA是美国FDA唯一批准用于治疗缺血性脑卒中的药物，然而，其治疗窗窄（必须在缺血性脑卒中发病的6小时内使用）以及可能导致进一步出血的缺点，极大限制了其在临床上的应用，虽然近年来缺血性脑损伤的机制研究及药物靶点研究上取得了一些进展，但临床上缺血性脑卒中的预防和治疗手段仍然十分有限，亟需发现更为有效治疗缺血性脑卒中的治疗靶点及防治药物。

脑卒中是一种急性的神经系统重大疾病，与之不同的是，神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病等则发病相对较缓，随着我国人口老年化问题的日趋严重，神经退行性疾病的发病率逐年升高，我国神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森症在65岁以上老年人中的发病率为0.6%左右，脑卒中的病因相对明确，由脑血管破裂或者供血动脉闭塞导致，而神经退行性疾病的病因及病理机制目前尚不明确，以帕金森病为例， 现有的主流观点认为帕金森病的主要病理特征是中脑黑质中多巴胺能神经元的逐步丢失，导致多巴胺与乙酰胆碱的平衡被打破，出现运动迟缓、静止性震颤、僵硬与共济失调等症状，基于这一假说，现有的治疗帕金森病的药物主要分为拟多巴胺类药与抗胆碱药，但这些药物并非对所有患者有效，且存在较为严重的不良反应，如左旋多巴是治疗帕金森病最经典的药物，但该药物使用3-5年后疗效已不显著，且会导致运动过多、开关现象及幻想幻视等精神症状。现有的治疗帕金森病的药物还包括多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶抑制剂、抗胆碱药物及金刚烷胺等，但同样存在着诸多不良反应，如剂末现象、异动症、冲动控制障碍、恶心及精神症状等，现有的帕金森病药物治疗手段的局限性迫使我们要去寻找新的化合物用于帕金森病的治疗。

菌类植物是天然药物的宝库，桑黄是多孔菌科（Polyporaceae）针层孔菌属（Phellinus）火木针层孔菌（P. igniarus）的子实体，桑黄药用历史悠久，可追溯至现存最早的中药学著作《神农本草经》。近年来，随着药物分离纯化及鉴定技术的发展，我们对桑黄菌中的活性成分进行分离鉴定时，分离出化合物phelligridimer A (PA)，有关phelligridimer A (PA)的首次分离及结构鉴定，参见文献：Phelligridimer A, a highlyoxygenated and unsaturated 26-membered macrocyclic metabolite withantioxidant activity from the fungus Phellinus igniarius。

有phelligridimer A (PA)在中枢神经系统疾病的作用，目前还未见报道，我们通过对化合物phelligridimer A (PA)的活性进行筛选，发现在体外氧糖剥夺/复氧(oxygenand glucose deprivation/ reoxygenation, OGD/R)模型中，phelligridimer A (PA)可对抗氧糖剥夺，增加HT-22神经元细胞的存活，进一步在脑缺血动物模型中，发现phelligridimer A (PA)具有减少脑梗死体积，改善动物临床评分的作用，提示phelligridimer A (PA)具有潜在的预防及治疗脑卒中的作用，同时，我们还利用1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP⁺)建立神经退行性疾病帕金森病的模型，发现PA能对抗神经细胞死亡，提示phelligridimer A (PA)在帕金森病的预防及治疗中具有潜在价值。

目前，国内外还没有公开任何关于phelligridimer A (PA)及其在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病比如帕金森病中的应用的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供预防和治疗效率高，针对性强的一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物及其制备方法和应用，其中一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A对神经元及脑组织具有很好的保护作用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术措施为：

一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物，其中，所述的化合物为一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A，呈黄色粉末状。

所采用的技术措施还包括：

上述的一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A 分子结构式为：

其分子式为：C₅₂H₃₂O₂₀; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆): δ _H 4.35 (d, J = 6.6 Hz,H-7'), 5.91 (d, J = 6.6 Hz, H-8'), 6.33 (s, H-5'), 6.52 (s, H-5), 6.56 (s, H-13), 6.62 (d, J = 15.7 Hz, H-7), 6.77 (s, H-13', H-14'), 6.83 (s, H-10'),6.97(d, J = 15.7 Hz, H-8), 7.13 (s, H-10), 9.10 (s, 11-OH), 9.14 (s, 11'-OH),9.19 (s, 12'-OH), 9.51(s, 12-OH), 11.56(s, 4'-OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆):δ _C 51.5 (C-7'), 89.6 (C-8'), 95.1 (C-5), 99.3 (C-3), 101.7 (C-3'), 101.7 (C-5'), 112.2 (C-10), 113.6 (C-10'), 115.5 (C-13'), 116.8 (C-7), 118.0 (C-14'),118.5 (C-13), 125.2(C-14), 126.1(C-9), 129.7(C-9'), 133.9(C-8), 145.3(C-11),145.6(C-11'), 146.4(C-12'), 147.2(C-12), 157.8(C-2'), 159.6(C-6'), 162.8(C-6), 163.0(C-2), 165.0(C-4'), 170.5(C-4); HRESIMS m/z 975.1396 (calcd forC₅₂H₃₁O₂₀ 975.1414)。

本发明解决上述技术问题所采用的技术措施为：

一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物的制备方法，化合物为一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A，呈黄色粉末状；其制备方法包括；取针层孔菌属Phellinus真菌的子实体8 kg，用含水有机溶剂回流提取或浸渍提取，该有机溶剂为甲醇或乙醇或丙酮；浓缩提取液至干燥；用水分散浓缩物得到流浸膏；用乙酸乙酯萃取3-6次；浓缩乙酸乙酯部分得到提取物324 g；乙酸乙酯提取物经过大孔树脂柱层析，该大孔树脂柱层析为乙醇洗脱或水洗脱；取50%乙醇洗脱部位经过MCI CHP20P柱层析得到化合物phelligridimer A ，该MCI CHP20P柱层析为甲醇洗脱或水洗脱。

本发明解决上述技术问题所采用的技术措施为：

一种化合物在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病中的应用，其中，所述的化合物为一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A，呈黄色粉末状，应用于预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物中。

所采用的技术措施还包括：

上述的应用在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物中包含一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A的能接受盐。

上述的一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A 应用在制备改善脑卒中的急性脑损伤及神经退行性疾病的药物中。

上述的一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A单独应用在预防和治疗神经精神疾病的药物中或与其他化合物组合成复方应用在预防和治疗神经精神疾病的药物中。

上述的应用在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物给药方式为注射制剂、口服制剂或外用制剂。

上述的应用在预防或治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物制剂形式为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物及其制备方法和应用；化合物为一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A 简称即为PA，呈黄色粉末状；其制备方法为取针层孔菌属Phellinus真菌的子实体，用含水有机溶剂如甲醇或乙醇或丙酮回流提取或浸渍提取，经过大孔树脂柱层析，选择醇洗脱或水洗脱；其应用在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物给药方式为注射制剂、口服制剂或外用制剂，药物制剂形式为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。本发明实现了一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A在抗脑卒中及帕金森病药物上的应用，其效率高，针对性强，对神经元及脑组织具有很好的保护作用。

附图说明

图1为phelligridimer A 结构鉴定的氢谱图；

图2为 phelligridimer A结构鉴定的碳谱图；

图3为 phelligridimer A结构鉴定的高分辨质谱图；

图4为phelligridimer A对HT-22神经元的毒性；

图5为phelligridimer A 在氧糖剥夺/复氧诱导的脑缺血细胞模型中对HT-22细胞活力的影响；

图6为phelligridimer A 在氧糖剥夺/复氧诱导脑缺血细胞模型中对HT-22细胞凋亡的影响；

图7为phelligridimer A在大脑中动脉栓塞/再灌注诱导的大鼠脑缺血动物模型中对脑梗死及神经功能评分的影响；

图8为phelligridimer A 对SH-SY5Y细胞的毒性；

图9为phelligridimer A 在MPP⁺诱导的帕金森病体外细胞模型中对SH-SY5Y细胞活力的影响；

图10 为phelligridimer A在MPP⁺诱导的帕金森病体外细胞模型中对SH-SY5Y细胞死亡的影响；

图11为phelligridimer A 在MPP⁺诱导的帕金森病体外细胞模型中对小鼠中脑多巴胺能神经元细胞MN9D 细胞活力的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，实施例仅限于说明本发明以便于理解，而非对本发明的限定。

根据图1至图11所示：本发明解决上述技术问题所采用的技术措施为：

一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物，其中，所述的化合物为一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A，呈黄色粉末状。

所采用的技术措施还包括：

一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A 分子结构式为：

其分子式为：C₅₂H₃₂O₂₀; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆): δ _H 4.35 (d, J = 6.6 Hz,H-7'), 5.91 (d, J = 6.6 Hz, H-8'), 6.33 (s, H-5'), 6.52 (s, H-5), 6.56 (s, H-13), 6.62 (d, J = 15.7 Hz, H-7), 6.77 (s, H-13', H-14'), 6.83 (s, H-10'),6.97(d, J = 15.7 Hz, H-8), 7.13 (s, H-10), 9.10 (s, 11-OH), 9.14 (s, 11'-OH),9.19 (s, 12'-OH), 9.51(s, 12-OH), 11.56(s, 4'-OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆):δ _C 51.5 (C-7'), 89.6 (C-8'), 95.1 (C-5), 99.3 (C-3), 101.7 (C-3'), 101.7 (C-5'), 112.2 (C-10), 113.6 (C-10'), 115.5 (C-13'), 116.8 (C-7), 118.0 (C-14'),118.5 (C-13), 125.2(C-14), 126.1(C-9), 129.7(C-9'), 133.9(C-8), 145.3(C-11),145.6(C-11'), 146.4(C-12'), 147.2(C-12), 157.8(C-2'), 159.6(C-6'), 162.8(C-6), 163.0(C-2), 165.0(C-4'), 170.5(C-4); HRESIMS m/z 975.1396 (calcd forC₅₂H₃₁O₂₀ 975.1414)。

本发明解决上述技术问题所采用的技术措施为：

一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物的制备方法包括；取针层孔菌属Phellinus真菌的子实体8 kg，用含水有机溶剂回流提取或浸渍提取，该有机溶剂为甲醇或乙醇或丙酮；浓缩提取液至干燥；用水分散浓缩物得到流浸膏；用乙酸乙酯萃取3-6次；浓缩乙酸乙酯部分得到提取物324 g；乙酸乙酯提取物经过大孔树脂柱层析，该大孔树脂柱层析为乙醇洗脱或水洗脱；取50%乙醇洗脱部位经过MCI CHP20P柱层析得到化合物phelligridimer A ，该MCI CHP20P柱层析为甲醇洗脱或水洗脱。

本发明解决上述技术问题所采用的技术措施为：

一种化合物在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病中的应用，其中，所述的化合物为一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A，呈黄色粉末状，应用于预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物中。

所采用的技术措施还包括：

应用在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物中包含一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A的能接受盐。

一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A 应用在制备改善脑卒中的急性脑损伤及神经退行性疾病的药物中。

一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A单独应用在预防和治疗神经精神疾病的药物中或与其他化合物组合成复方应用在预防和治疗神经精神疾病的药物中。

应用在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物给药方式为注射制剂、口服制剂或外用制剂。

应用在预防或治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物制剂形式为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

实施例1. phelligridimer A的提取、分离和鉴定

取针层孔菌属Phellinus真菌的子实体8 kg，用含水有机溶剂回流提取或浸渍提取，该有机溶剂为甲醇或乙醇或丙酮；浓缩提取液至干燥；用水分散浓缩物得到流浸膏；用乙酸乙酯萃取3-6次；浓缩乙酸乙酯部分得到提取物324 g；乙酸乙酯提取物经过大孔树脂柱层析，该大孔树脂柱层析为乙醇洗脱或水洗脱；取50%乙醇洗脱部位经过MCI CHP20P柱层析得到化合物phelligridimer A，该MCI CHP20P柱层析为甲醇洗脱或水洗脱。

phelligridimer A: 黄色粉末; 分子式为C₅₂H₃₂O₂₀; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆): δ _H 4.35 (d, J = 6.6 Hz, H-7'), 5.91 (d, J = 6.6 Hz, H-8'), 6.33 (s, H-5'), 6.52 (s, H-5), 6.56 (s, H-13), 6.62 (d, J = 15.7 Hz, H-7), 6.77 (s, H-13', H-14'), 6.83 (s, H-10'), 6.97(d, J = 15.7 Hz, H-8), 7.13 (s, H-10), 9.10(s, 11-OH), 9.14 (s, 11'-OH), 9.19 (s, 12'-OH), 9.51(s, 12-OH), 11.56(s, 4'-OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆): δ _C 51.5 (C-7'), 89.6 (C-8'), 95.1 (C-5), 99.3(C-3), 101.7 (C-3'), 101.7 (C-5'), 112.2 (C-10), 113.6 (C-10'), 115.5 (C-13'), 116.8 (C-7), 118.0 (C-14'), 118.5 (C-13), 125.2(C-14), 126.1(C-9),129.7(C-9'), 133.9(C-8), 145.3(C-11), 145.6(C-11'), 146.4(C-12'), 147.2(C-12), 157.8(C-2'), 159.6(C-6'), 162.8(C-6), 163.0(C-2), 165.0(C-4'), 170.5(C-4); HRESIMS m/z 975.1396 (calcd for C₅₂H₃₁O₂₀ 975.1414).

phelligridimer A结构鉴定的氢谱图见图1；phelligridimer A 结构鉴定的碳谱图见图2； phelligridimer A结构鉴定的高分辨质谱图见图3。

实施例2. phelligridimer A，即简称PA，在脑缺血细胞模型中对HT-22细胞的保护作用

一. 实验材料：

1.1细胞：

HT-22 细胞为小鼠海马神经元细胞系，购自德国 Merck 公司。

1.2实验试剂：

高糖DMEM购于美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为11965092；无糖DMEM购于美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为11966025；澳洲胎牛血清购于美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为A3161001C；磷酸盐缓冲液购自美国 ThermoFisher Scientific公司，货号为C10010500BT；Pierce™ Rapid Gold BCA蛋白定量试剂盒购于美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为A53225；蛋白酶抑制剂购于杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD1001；磷酸酶抑制剂购于杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD1002；三羟甲基氨基甲烷，即Tris，购于杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD2010；甘氨酸购于杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD2020；脱脂奶粉购于上海源叶生物科技有限公司，货号为S30865；吐温20购自杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD0020；氯化钠购于杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD3467；抗体稀释液购于苏州新赛美生物科技有限公司，货号为WB500D；5×loading buffer购自杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD002；RIPA高强度裂解液购自杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD009；Cell Counting Kit-8，即CCK8购自日本同仁化学公司，货号为CK04；Immobilon Western Chemiluminescent HRPSubstrate购自德国Merck公司，货号为WBKLS0100；Hoechst 33342/PI双染试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，货号为KGA212；β-tubulin 抗体购自杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD0064；山羊抗兔 IgG（H+L）-HRP二抗购自杭州弗德生物科技有限公司，货号为FDR007；山羊抗小鼠 IgG（H+L）-HRP二抗购自杭州弗德生物科技有限公司，货号为FDM007；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，即caspase3抗体购自美国 Cell SignalingTechnology 公司，货号为9662。

1.3实验设备：

超净台购自苏州净化设备有限公司；Synergy HT多功能酶标仪购自美国Agilent公司；缺氧小室，型号MIC-101, 购自美国Billups-Rothenberg公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳转印装置购自美国Bio-Rad公司；CO₂细胞培养箱，购自美国Thermo Fisher公司；低温高速离心机购自美国Thermo Fisher公司；倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司；十万分之一电子天平购自德国Sartorius公司；化学发光凝胶成像系统，型号 Tanon-5200，购自上海天能科技有限公司。

二. 实验方法：

2.1 氧糖剥夺/复氧模型的建立：

氧糖剥夺/复氧模型，即oxygen-glucose deprivation/reperfusion模型，简称OGD/R模型，是缺血性脑损伤经典的细胞模型。其可模拟缺血性脑损伤过程中缺血再灌注损伤的病理变化。常见的造模仪器包括三气培养箱以及缺氧小室。相对于三气培养箱而言，缺氧小室具有简便、经济以及高效的特点。因此，我们使用缺氧小室构建OGD/R模型。具体方法如下所述：将细胞用PBS洗涤两次，并将培养基更换为预先除去氧气不含葡萄糖的DMEM。然后将细胞转移到缺氧小室中，往小室内通入95% N₂和5% CO₂的混合气体以排出小室内空气。期间，确保小室的进气口以及出气口均为打开状态，防止爆炸。排气结束后，将小室的进气口以及出气口均夹闭，并将小室转移到37 ℃恒温箱中。对照组在有氧环境中培养，培养基为正常高糖DMEM。在缺氧小室中培养相应的时间后，将细胞从小室中取出，培养基更换为高糖DMEM培养基。

2.2 细胞活力的测定：

我们使用CCK8法测定细胞活力。其原理是WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜，其在450 nm处具有最大吸光度，其在450 nm处的吸光度值可反应细胞活力的变化。具体操作如下：将HT-22细胞以70～80%的密度接种于孔板中，培养过夜贴壁。然后，细胞进行OGD造模，并将培养基更换为高糖DMEM。复氧24 h后，每孔加入10%总体积的CCK8，反应4 h后用多功能酶标仪检测在450 nm处的吸光度。

2.3 蛋白免疫印迹：

Western blotting实验按常规使用的方法进行。简言之，细胞经药物及OGD/R处理后，培养孔内加入RIPA裂解液，裂解液中预加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，在冰上裂解细胞。裂解后的蛋白质样品经高速离心去除不溶物后，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，再采用SDS上样缓冲液95-100 ºC变性10 min。再用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到PVDF膜上。转膜结束后，采用5% BSA对PVDF膜进行封闭处理，室温封闭2 h，再使用特异性抗体anti-cleaved casapse3, caspase3或anti-beta tubulin 4ºC孵育过夜，使用TBST吸膜3次，每次5 min，再在室温条件下孵育二抗2 h。最后使用ECL发光液试剂盒进行曝光测定cleaved caspase 3和beta tubulin的蛋白水平，。对获得的图片利用ImageJ软件对印迹进行量化。

2.4 统计学处理：

所有实验数据都用 Mean±SD表示，用SPSS 19.0软件分析，组间差异采用单因素方差分析，方差齐时应用Bonferroni 进行两两比较分析。用GraphPad Prism 7.0 绘制结果图。P < 0.05 表示有显著性差异。

三. 实验结果：

3.1 PA对神经细胞的毒性：

为考察PA对抗脑缺血损伤的保护作用，我们先考察了PA对神经细胞的毒性。我们用2.5～20 μM的PA处理HT-22神经元，24 h后使用CCK-8法检测细胞存活率的变化。如图 4所示，PA在2.5~20 μM的浓度范围内对HT-22细胞存活率无显著影响，P > 0.05。提示PA对正常神经细胞细胞不产生毒性。

3.2 PA对抗 OGD/R 诱导的 HT-22 神经元凋亡：

已获知PA对正常神经细胞没有毒性，我们继而考察了在OGD/R条件下对细胞的保护作用。预先使用2.5-10 μM 的PA孵育HT-22细胞1 h，然后OGD/R处理细胞6 h。复氧 24 h后，使用CCK-8法检测细胞活力的变化。如图5所示，我们发现当OGD/R 处理后，HT-22细胞活力显著降低，P < 0.01；而PA在2.5～10 μM的浓度范围内剂量依赖性地增加HT-22细胞的活力，在5 μM的浓度时，可见显著差异，P < 0.01, 见图5。同时，使用 Western blot实验考察细胞凋亡标志性蛋白caspase 3 蛋白表达的变化并通过灰度分析计算cleaved caspase3/caspase 3的变化。，如图6所示，我们发现OGD/R 处理后cleaved caspase 3水平显著增加，P < 0.01，提示氧糖剥夺后，神经细胞凋亡显著增加；而PA能够有效减少cleavedcaspase 3的表达，P < 0.01；即PA能够减少OGD/R诱导的caspase 3的剪切活化。以上结果表明，PA能够有效减少OGD/R 诱导的HT-22 细胞凋亡。

实施例3. phelligridimer A，即简称PA，在脑缺血动物模型中对脑组织的保护作用

一. 实验材料：

1.1实验动物：

本实验使用的动物为体重260～300 g的成年雄性SD大鼠，购自南方医科大学动物中心。大鼠的饲养符合实验标准：大鼠饲养在温度为24±2ºC、湿度为50～70%、12 h光照/12h黑暗交替循环的环境中，其可自由获得水和饲料。所有动物实验均经南方医科大学实验动物伦理委员会批准，并按照美国国立卫生研究院1996年修订实验动物护理和使用指南的伦理准则进行。

1.2实验试剂：

2,3,5-氯化三苯基四氮唑，即TTC，购自德国Merck公司，货号为T8877；吐温 80，购自杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD3515；氯化钠购自杭州弗德生物科技有限公司，货号为FD3467；异氟烷购自深圳瑞沃德生命科技有限公司，货号为200052001。

1.3实验设备：

大鼠脑模具购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；小动物气体麻醉机购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；温控加热垫购自北京西浓科技有限公司；扫描仪购自日本Canon公司。

二. 实验方法：

2.1 大脑中动脉栓塞模型的建立：

大脑中动脉栓塞模型，即Middle cerebral artery occlusion模型, 简称MCAO模型，是经典的缺血性脑损伤的整体动物模型，可模拟脑缺血再灌注损伤这一病理过程。我们根据文献所报道的方式构建MCAO模型。具体方法如下：首先，根据随机对照原则，我们将SD大鼠随机分组。然后以异氟烷为麻醉剂，使用小动物气体麻醉机麻醉大鼠。通过使用带有肛门温度计探头的温控加热垫将大鼠体温维持在37±0.5ºC。在使用眼科镊小心地分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉后，将一根头部预包被有0.36 mm硅胶的栓线插入颈内动脉以阻塞大脑中动脉。当插入深度约为18～22 mm并感受到阻力时即可停止插入。MCAO造模2 h后，轻轻拔出栓线进行再灌注，即Middle cerebral artery occlusion/reperfusion, 简称MCAO/R。假手术组大鼠在没有插入栓线的情况下接受了相同的手术操作。为验证MCAO模型构建成功，我们使用激光散斑血流仪验证了大脑中动脉堵塞后大脑血流量的减少，以及拔出栓线再灌注后大脑血流的增加。

2.2 神经功能评分：

我们按照Longa-Z评分法判断MCAO造模后SD大鼠的神经功能情况，具体的评分标准如下：在MCAO造模24 h后评估神经功能缺损情况。“0分”代表无神经功能障碍症状； “1分”代表提起大鼠尾巴悬空时，对侧前肢不能自由伸展； “2分”代表行走时向对侧转圈； “3分”代表行走时向对侧倾倒； “4分”表示意识水平明显下降，无自主活动。MCAO剔除标准：在以下条件下将大鼠排除在分析之外：（1）神经学评分为0分，（2）发现蛛网膜下腔出血或（3）MACO造模后大鼠死亡。由于以上原因导致未达到各组预计样本时，采用随机原则进行补充。

2.3 TTC染色实验：

TTC染色实验是经典、公认的检测脑梗死的方法。TTC染色的原理如下：正常组织细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶可将TTC还原为红色甲臜，所以正常组织能被染成红色。而在梗死组织细胞已经死亡，缺乏琥珀酸脱氢酶。TTC不能被还原为红色甲臜，因而梗死组织呈现为白色。具体方法如下所述：缺血再灌注24 h后，使用异氟醚麻醉SD大鼠致死。然后快速断头，取出大脑，并将大脑在-30 ºC条件下快速冷冻约10 min，并使用脑模具将大脑其切成2 mm厚的冠状切片。将脑切片在 2% TTC溶液中37 ºC避光孵育30 min。最后，脑切片用4% PFA固定30 min，并有顺序地摆放于玻璃板上，用扫描仪进行扫描。通过ImageJ分析梗塞体积。为消除脑梗死时，梗死侧脑水肿对梗死百分比计算的影响，我们通过以下校正公式进行计算：梗死体积（%）=（对侧大脑体积 - 非梗死大脑体积）/ 对侧大脑体积 × 100%。

2.4统计学处理：

所有实验数据都用 Mean±SD表示，数据采用SPSS 19.0软件分析，组间差异采用单因素方差分析，方差齐时应用Bonferroni 进行两两比较分析。用GraphPad Prism 7.0绘制结果图。P < 0.05 表示有显著性差异。

三. 实验结果：

3.1 PA缓解 MCAO/R 导致 SD 大鼠脑梗死及运动功能障碍：

首先在 SD 大鼠上构建了缺血性脑损伤的经典动物模型MCAO/R模型。在 MCAO 造模 2 h 后拔出栓线，然后腹腔注射给予10 mg/kg的PA或溶剂。缺血再灌注损伤 24 h 后，对大鼠进行了神经功能评分及取脑组织进行TTC染色以评估SD大鼠脑梗死的情况。如图7A、B所示，与假手术组相比，MCAO/R组出现明显的脑梗死，P < 0.01；如图7C所示，模型组大鼠出现明显的神经功能缺失症状，P < 0.01；具体表现为对侧前肢不能自由伸展，行走时自发转圈或向对侧倾倒，甚至出现静止不动，意识丧失等症状。而给予PA可显著减少MCAO/R导致的脑梗死体积，P < 0.01, 如图7A、B所示；PA处理也改善了脑缺血后神经功能缺陷评分，P< 0.01, 如图7C所示。以上结果说明PA可缓解MCAO/R导致SD大鼠脑梗死及运动功能障碍。这一实验在整体动物模型中证实了PA具有对抗脑缺血-再灌注损伤的作用。

实施例4. phelligridimer A，即简称PA，在1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的帕金森病细胞模型中对多巴胺能神经元的保护作用

一、 实验材料：

1.材料及主要试剂：

1.1 实验选用的细胞及来源：

SH-SY5Y 细胞，即人神经母细胞瘤细胞，从中国科学院上海生命科学研究院细胞库获得。小鼠中脑多巴胺能神经元细胞MN9D细胞来自美国ATCC公司。

1.2实验所使用的药品和试剂：

1-甲基-4-苯基吡啶离子，即简称MPP⁺，购自美国Sigma-Aldrich公司，货号为#D048；DMEM/F12购自美国 Thermo Fisher Scientific公司，货号为C11330500BT；澳洲胎牛血清购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为A3161001C；磷酸盐缓冲液购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为C10010500BT；胰酶细胞消化液购自上海碧云天生物技术有限公司，货号为C0201；噻唑蓝，即MTT，购自美国 Sigma-Aldrich公司，货号为M2128；二甲基亚砜，即DMSO，购自美国 Sigma-Aldrich 公司，货号为D2650；Hoechst33342/PI双染试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，货号为KGA212。

1.3实验设备：

超净台购自苏州净化设备有限公司；Synergy HT多功能酶标仪购自美国Agilent公司；CO₂细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司；低温高速离心机购自美国ThermoFisher公司；倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司；十万分之一电子天平购自德国Sartorius公司。

二、实验方法：

2.1 MTT法检测细胞活力：

检测SH-SY5Y及MN9D细胞活力的方法相同，简述如下：取培养中细胞密度达到80-90%的T25培养瓶，倒去旧培养液后用PBS润洗两次，加入0.25%胰酶消化液在37 ºC下消化2min，加入细胞完全培养液终止消化后置离心机中1000 rpm离心5 min，弃上清液，重悬细胞后计数。取96孔板，每孔内加入 100 μL 细胞悬液，使得每孔内的细胞数为 2×10⁴个，置培养箱中继续培养12h，待细胞全部贴壁后，将细胞培养液更换为含有不同浓度药物的 DMEM/F12 培养基，培养基的总体积为 100μL，处理 48 h 后，每孔加入11 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，放在培养箱中避光静置，4 h后取出，吸净孔内液体，每孔再加入150 μL 的DMSO，然后使用橡皮圈将 96 孔板固定在震荡仪上，设定振荡时长为 10 min，然后使用多功能酶标仪测定波长为 570 nm 时的吸光度值，依照下述公式计算细胞活力：

细胞存活率（%）=（处理组的OD值）/（对照组的OD值）×100%。

2.2 Hoechst 33342/PI染色：

取培养中细胞密度达到80-90%的T25培养瓶，倒去旧培养液后用PBS润洗两次，加入0.25%胰酶消化液在37ºC下消化2 min，加入细胞完全培养液终止消化后置离心机中1000rpm离心5min，弃上清液，重悬细胞后计数。取24孔板，每孔内加入300 μL 细胞悬液，使得每孔内的细胞数为5×10⁴，置培养箱中继续培养12h，待细胞全部贴壁后，将细胞培养液更换为含有药物的DMEM/F12培养基，培养基的总体积为360 μL；1h后，加入40 μl浓度为5mM的MPP⁺溶液，使其终浓度为500 μM。处理24h后，小心吸去染液，并加入Hoechst 33342/PI染色液，然后，小心吸去染液，并将培养基更换为DMEM/F12。最后将24孔板放置在倒置荧光显微镜下进行观察并拍照。

2.3统计学处理：

所有实验数据都用 Mean±SD表示，用SPSS 19.0软件分析，组间差异采用单因素方差分析，方差齐时应用Bonferroni 进行两两比较分析。用GraphPad Prism 7.0 绘制结果图。P < 0.05 表示有显著性差异。

三、实验结果：

3.1 PA对SH-SY5Y细胞的毒性作用：

将SH-SY5Y细胞暴露于2.5～20 μM的PA中，48 h 后使用MTT法检测细胞存活率的变化。结果如图8所示，PA在2.5～20 μM的浓度范围内对SH-SY5Y细胞没有明显的毒性作用，P > 0.05。SH-SY5Y细胞是常见的原来替代多巴胺能神经元的细胞系，这一结果提示PA对多巴胺能神经元没有毒性。

3.2 PA可对抗MPP⁺引起的SH-SY5Y细胞损伤：

MPP⁺诱导的细胞损伤模型是经典的模拟帕金森病的体外细胞模型。在获得PA对神经细胞没有毒性后，我们继而采用MPP⁺建立PD体外细胞模型，来考察PA的保护作用。该模型为经典的公认的PD体外模型。预先使用5～20 μM 的PA孵育SH-SY5Y细胞1 h，然后予500 μM的MPP⁺处理细胞48 h，通过 MTT 法检测细胞存活率的变化。如图9所示，我们发现500 μM的MPP⁺处理48 h后，细胞活力明显降低，P < 0.01；PA在5～20 μM 的浓度范围内剂量依赖性地提高细胞的存活率，在15 μM剂量时，可显著增加细胞的存活率，P < 0.01。我们同时采用Hoechst 33342/PI染色考察细胞死亡情况。PI，即碘化丙啶，是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，PI阳性的细胞为凋亡细胞。如图10A所示，我们发现：MPP⁺处理导致SH-SY5Y细胞死亡数目显著增加，而PA能有效减少MPP⁺ 诱导的SH-SY5Y细胞死亡。以PI阳性细胞数进行定量分析，结果如图10B所示，我们也发现PA处理细胞后，PI⁺细胞比例显著下降，P < 0.01。这表明，PA能有效对抗MPP⁺引起的SH-SY5Y细胞损伤。

3.3 PA可对抗MPP⁺引起的MN9D细胞的损伤：

上述实验在SH-SY5Y细胞中证实了PA具有对抗MPP⁺诱导的细胞损伤的作用。为进一步证实PA对多巴胺能神经元的保护作用，我们在小鼠中脑多巴胺能神经元MN9D细胞中再次进行证明。如图11所示，我们发现MPP⁺可显著诱导MN9D细胞的损伤，表现为细胞活力的下降，P < 0.001。而给予2.5～20 μM的PA处理，则可以剂量依赖性地对抗MPP⁺的作用，增加细胞活力。在2.5 μM时，PA即可显著对抗MPP⁺诱导的细胞损伤，P < 0.01；在20 μM时几乎完全逆转了MPP⁺对细胞的损伤作用，P < 0.01，结果见图11。这些结果表明：PA在MPP⁺诱导的PD模型中对多巴胺能神经元具有显著的保护作用。

一种预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病的化合物及其制备方法和应用，所述的化合物为一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A，能作为预防及治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物，其对神经元及脑组织能起到很好的保护作用。

本发明在预防和治疗脑卒中及神经退行性疾病中的应用具有准确可靠、经济节约的优点，采用含有一种菌类植物桑黄的提取物PA的血管神经精神类药物，能够快速、可靠地为脑卒中及神经退行性疾病药物提供借鉴。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的普通技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种如下式所示的化合物或其药学上可接受的盐或包含其的组合物在制备治疗脑卒中及神经退行性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的化合物为一种菌类植物桑黄的提取物phelligridimer A，所述化合物phelligridimer A的结构如下：

所述化合物phelligridimer A能有效对抗MPP+引起的SH-SY5Y细胞损伤；所述化合物phelligridimer A在MPP+诱导的PD模型中对多巴胺能神经元具有显著的保护作用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述药物的给药方式为注射、口服或外用。

3.根据权利要求1所述的应用，所述药物的制剂形式为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

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