JP5491474B2 - Jak/stat経路阻害剤およびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、米国仮特許出願第60/177,872号(2000年1月24日出願)の優先権を主張する。
本発明は分子生物学および整形外科の分野に属する。本発明は、JAK/STATにより媒介される疾患または障害(特に、JAK3により媒介される疾患または障害)を、JAK3阻害剤を使用して処置する新規な方法に関する。
退行性関節疾患の生物学
関節の軟骨は、滑膜性関節内の長骨の両端を覆って、身体の支持および動きに伴う通常の剪断力および圧縮力から、その下にある骨を保護している。軟骨は、細胞外マトリックスのコラーゲンから構成される。コラーゲンマトリックス内には、軟骨細胞(すなわち、分化した軟骨の細胞)および基質が含まれる。基質は、プロテオグリカンおよび水から構成される。コラーゲンは、引張り強度を付与するマトリックスを形成し、一方、プロテオグリカンは、圧縮に対する抵抗性をもたらす大きな集合体を形成する(Stockwell、1991)。プロテオグリカンは、強く負に帯電した大きな親水性分子であり、水を引き寄せている。関節機能の正常な圧力のもとでは、水は軟骨から滲出して、関節の表面を潤滑している。圧力が除かれると、その水は軟骨のプロテオグリカンによって吸収される。水の動きはまた、軟骨組織には血液が供給されていないので、軟骨細胞への栄養物の輸送および軟骨細胞からの老廃物の輸送をもたらす。軟骨の完全性を維持することは非常に重要である。異常な負荷は、増大または低下のいずれでも、軟骨の物理的完全性に作用し、細胞の代謝に影響し、そして生化学的な変化を誘導する、これらはすべて、軟骨の分解をもたらし、そして変形性関節症(OA)などの退行性関節疾患の発症をもたらし得る(Mow他、1992)。
OAなどの退行性関節疾患に対する治療薬を開発する現在の方法は、一般に、軟骨分解酵素阻害剤の合成、サイトカイン/細胞受容体レベルの調節およびタンパク質キナーゼの調節を含む。例えば、いくつかのタンパク質キナーゼC阻害剤が、特に、PKCにより媒介される炎症を緩和するために使用できることが一般に報告されている(NambiおよびPatil、1993;NambiおよびPatil、1997)。4−(2−アミノ−4−オキソ−2−イミダゾリン−5−イリデン)−2−ブロモ−4,5,6,7−テトラヒドロピロロ(2,3−c)アゼピン−8−オン(ヒメニアルジシン、以降、「H」)および4−(2−アミノ−4−オキソ−2−イミダゾリン−5−イリデン)−4,5,6,7−テトラヒドロピロロ(2,3−c)アゼピン−8−オン(デブロモヒメニアルジシン、以降、「DBH」)およびそれらの様々な生理学的に活性な塩を含むこれらの阻害剤のいくつかが、その後、培養中および関節軟骨の外稙片における軟骨細胞による、グリコサミノグリカンおよび細胞外マトリックスのIL−1により誘導される分解を阻害することが見出された(ChipmanおよびFaulkner、1997)。近年には、チロシンキナーゼ阻害剤のゲニステイン、ヘルビマイシンA、4,5−ジアニリノフタルイミド(DAPH)、チルホスチンAG82およびチルホスチンAG556もまた、インビトロで軟骨細胞による軟骨分解を低下または防止することが見出されている(Sharpe他、1997)。
軟骨分解酵素の調節に関しても、またはIL−1のシグナル伝達経路に関連してもいかなる点でもこれまで決して関連していない独立した独特なシグナル伝達経路がJAK/STAT経路である。非常に様々なポリペプチド性のサイトカイン、リンホカイン、および増殖因子により、(サイトカイン受容体を介して)JAKファミリーが活性化される(総説、Aringer他、1999)。受容体により活性化されたJAKの様々な結合は、次にSTAT(転写のシグナル伝達因子および活性化因子)タンパク質を活性化する(すなわち、チロシンをリン酸化する)。JAKsは、現在知られている5個のSTATタンパク質の主要な活性化因子であり得ると考えられている(Silvennoinen他、1997)。
JAK3は、JAKタンパク質チロシンキナーゼファミリーの最も新しいメンバーである。JAK3の3つのスプライス変化体が造血ガン細胞および上皮ガン細胞において報告されている。これらのJAK3スプライス変化体は、同一のアミノ末端領域を含むが、C末端は異なっている(Lai他、1995;GurniakおよびBerg、1996)。これらのスプライス変化体の機能的重要性は完全には理解されていない。JAK3のアミノ末端のJH7−6ドメイン(アミノ酸1〜192)は、それがIL−2Rサブユニットγcと相互作用するために必要かつ十分であることが示されている(Chen他、1997)。
本発明は、JAK/STATシグナル伝達経路(特に、JAK3)が退行性関節疾患の開始および進行に関与しているという発見に基づく。詳細には、JAK3阻害剤によって、OAの発症および進行に関与していることが知られている遺伝子のIL−1誘導による発現が阻止されることが示される。本明細書中にはまた、JAK3が軟骨細胞では少なくとも2つの形態で発現していることも最初に明らかにされる。DBHおよびHなどの分子が、動物モデルにおいてOAなどの軟骨分解性障害を処置することにおいて効果的であることが示される一方で、様々な軟骨分解因子および炎症媒介因子の発現を直接的および/または間接的に低下させるまたは抑制するJAK3特異的阻害剤として作用することを明らかにする証拠が示される。最後に、他のJAK3阻害剤もまた、DBHおよびHの様式と同一の様式で様々な軟骨分解性因子の発現を、直接的および/または間接的に、効果的に抑制し得ることを明らかにする証拠が示される。軟骨の変性におけるJAK/STAT経路のこの新規な役割の同定、およびそのような疾患の病状予防におけるJAK3阻害剤の特異的な機能の同定および決定は、退行性関節疾患の処置に対して効果的な種類の治療薬を開発する新しい方法をもたらす。本発明はまた、OA治療薬として以前に知られている分子に対する新しい使用法、すなわち、JAK/STATにより媒介される、OA以外の疾患または障害を処置することにおける使用法を明らかにする。
関連する態様において、本発明は、軟骨分解酵素の発現を調節するためのJAK/STAT阻害剤の使用に関する。
軟骨細胞におけるJAK/STATシグナル伝達に関する役割、および退行性関節疾患の開始および進行におけるその関与を記載する、最初の報告が本明細書中に開示される。詳しくは、本発明者らは、DBHおよびH(これらは現在、OAなどの退行性関節疾患の動物モデルにおける効果的な治療薬であることが知られている)が、実際に、軟骨細胞におけるJAK/STATシグナル伝達を乱すことによって、具体的には、JAK3阻害剤として作用することによって機能することを発見した。退行性関節疾患におけるJAK/STAT経路のこの新規な役割を確認するために、軟骨分解因子の調節を行うことが以前には知られていなかったさらなる既知のJAK3阻害剤もまた、DBHおよびHと同一な様式でそのような細胞プロセスを調節することを明らかにする証拠が示される。
本明細書中で使用される、JAK/STAT阻害剤の「薬学的に効果的な量」は、インビトロで処置された細胞またはインビボで処置された対象体のいずれかにおいて所望する生理学的な結果を達成するために効果的な量である。具体的には、薬学的に効果的な量は、問題の疾患状態に関連した臨床的に定義される病理学的プロセスの1つまたは複数をある期間にわたって阻害するために十分な量である。効果的な量は、選択された特定のJAK/STAT阻害剤に依存して変化し得、また処置される対象体に関連する様々な要因および状態ならびに障害の重篤度にも依存する。例えば、阻害剤がインビボで投与される場合、患者の年齢、体重および健康状態などの要因、ならびに臨床前の動物研究で得られた用量応答曲線および毒性データは特に考慮されるであろう。阻害剤をインビトロで細胞と接触させる場合、取り込み、半減期、用量、毒性などのようなパラメーターを評価するための様々な臨床前のインビトロ研究もまた設計される。所与の薬剤に対する薬学的に効果的な量を決定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
これらの発見の結果としてまた、JAK−3阻害剤(すなわち、DBHおよびH)の新しいクラスが同定される。したがって、本発明の別の態様において、薬学的に効果的な量のDBHまたはHを投与することによって、OAとは異なるJAK/STAT媒介による疾患または障害あるいはPKC媒介による炎症を処置するための方法が提供される。JAK/STAT媒介の疾患または障害は、疾患状態の臨床的に定義された症状または原因の1つまたは複数を媒介することにJAK/STATシグナル変換経路が関与している疾患または障害である。そのような疾患および障害の例には、T細胞により媒介される障害、例えば、HTLV−1、sdzory’s症候群、c−abl変換、ナチュラルキラー様T細胞リンパ腫(NK様腫瘍)および移植片対宿主病など;2型(サイトカイン過敏性)疾患または障害、例えば、リーシュマニア症、らい病、アレルギー、およびウイルス感染症など;マスト細胞により媒介される障害、例えば、アレルギー、枯草熱、喘息、じんま疹、およびアナフィラキシーなど;および、急性のリンパ性白血病およびリンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫および骨髄起源の白血病などの白血病およびリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
JAK/STAT阻害剤を対象体に投与する経路は限定されておらず、非経口的(皮下注射、静脈内注射、髄内注射、関節内注射、筋肉内注射、または腹腔内注射を含む)、直腸的、局所的、経皮的または経口的を含み得る。例えば、JAK/STAT阻害剤は、対象者の局所的に冒された領域(例えば、関節)内に関節内投与することができ、したがって、そのような領域における治療効果を最大限にし、その一方で、非罹患領域に対する作用を最小限にすることができる。阻害剤はまた、罹患領域の近くに局所投与することができる。あるいは、阻害剤は、例えば、カプセル剤、懸濁剤または錠剤で経口投与することができる。
OAなどの退行性軟骨の疾患または障害に関連した細胞病理学を研究するために、ヒト軟骨の細胞(ヒト軟骨細胞)培養物を調製した。
ヒト軟骨細胞におけるJAK3の発現を明らかにするために、JAK3特異的プライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を、単層で培養された正常な成人ヒト軟骨細胞から単離された総RNAに対して行った。
ヒト変形性関節症の軟骨に由来する関節軟骨細胞におけるJAK3の発現を、上記の実施例2の正常なヒト軟骨細胞において見出されるJAK3の発現と比較するために、JAK3特異的プライマーを使用するRT−PCRを、成人のヒト変形性関節症の軟骨から直接単離された総RNAに対して行った。
JAK3がヒト軟骨細胞で活発に発現していることをさらに明らかにするために、JAK3をヒト軟骨細胞のcDNAライブラリーから単離した。
凍結された軟骨細胞の細胞株HC30−0198(実施例1に記載されるように調製された正常なヒト関節軟骨細胞)を解凍して、単層で培養し(第2継代)、コンフルエンス後5日目まで培養した。試験培養物をリン酸塩緩衝化生理的食塩水(PBS)で洗浄し、その後、1)2ng/mlの組換えヒトインターロイキン−1β(rhIL−1β)(R&D Systems、Minneapolis、MN)を1%抗生物質溶液を含有する無血清DMEM中で24時間にわたって、または2)1%抗生物質溶液を含有する無血清DMEMのみ(コントロール)のいずれかを加えた。
OAなどの退行性関節疾患に対して効果的な治療薬であるDBHがJAK3を阻害するように機能することを明らかにするために、チロシンキナーゼの酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)を行った。
様々な細胞成分に対するDBH(およびその変化体)の特徴的な阻害をさらに調べるために、ポリ(Glu,Tyr)4:1のELISAを行った。ヒメニアルジシン(H)、DBH(海産海綿動物の抽出物として:ChipmanおよびFaulkner(1997)を参照のこと)、および合成DBHの3つの変化体(DBHの遊離塩基形態(DBH−2FB)、DBHのトリフルオロ酢酸塩形態(DBH−2S)、およびDBHのメタンスルホン酸塩形態(DBH1))をDMSOに溶解して、ZAP−70(70kDaのζ会合ポリペプチド)タンパク質チロシンキナーゼ、BTK(ブルートン型無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ)、JAK3(Janusキナーゼ3)タンパク質チロシンキナーゼ、LCK(リンパ様T細胞タンパク質チロシンキナーゼ)、およびIGFR(インスリン様増殖因子受容体)タンパク質チロシンキナーゼを阻害する効力について試験した。
これらの結果は、DBHおよびその様々な誘導体がJAK3に特異的な阻害剤であることを明らかにしている。
DBHによるJAK3阻害の下流の影響を調べるために、ノーザンブロットアッセイを行い、OAに関連した様々な分子の定常状態のmRNAレベルにおける変化を検出した。
単層培養物に由来する総RNAを、製造者が指示するプロトコールに従ってTRIzol試薬(GIBCO/BRL、Gaithersburg、MD)を使用して集めた。それぞれの試験サンプルから得られた総RNAの10μgを2.2Mホルムアルデヒド/1.2%アガロースゲルで分離し、そして製造者が支持するプロトコールに従ってTURBOBLOTTER(商標)システム(Schleicher&Schuell、Kneene、NH)を使用して穏和なアルカリ転写によってナイロン支持メンブラン(Schleicher&Schuell、Kneene、NH)に転写した。総RNAを、Stratalinker(登録商標)1800UV架橋装置(Stratagene、La Jolla、CA)を使用してメンブランに固定した。
JAK3特異的阻害剤としてのDBHの細胞作用を明らかにするために、DBHおよびその変化体の阻害を、IL−1α誘導される35S標識プロテオグリカンのウシ軟骨細胞における放出によって測定した(培養された初代ウシ軟骨細胞および軟骨外稙片におけるIL−1α誘導されるプロテオグリカンの放出は、アグリカナーゼとして知られている酵素によってアグリカンが切断されるためであることが十分に明らかにされている)。
1.バックグラウンド割合c
=培地中に放出された非IL−1誘導による放射能量を表す総放射能(培地+細胞層)の割合
=[「IL−1αなし、DBHなしのコントロール」の培地中の総CPM/(「IL−1αなし、DBHなしのコントロール」の培地中の総CPM+「IL−1αなし、DBHなしのコントロール」の細胞層における総CPM)]
2.培地中へのIL−1αによる35S標識プロテオグリカンの%放出
a)バックグラウンド=非IL−1誘導の放出による試験サンプルの培地中のカウント
=バックグラウンド割合c[試験サンプル培地中の総CPM+試験サンプル細胞層における総CPM]
b)IL−1αにより放出されたCPM=培地中の総CPM−バックグラウンド
c)IL−1αによる%放出=[IL−1αにより放出されたCPM/(IL−1αにより放出されたCPM+細胞層における総CPM)]100%
3.DBH存在下でのIL−1αによる%放出={(DBH培地サンプルにおける総CPM−バックグラウンド)/[(DBH培地サンプルにおける総CPM−バックグラウンド)+DBH細胞層サンプルにおける総CPM]}100%
4.DBHによる%阻害=[1−(DBH存在下でのIL−1αによる%放出/IL−1αによる%放出]100%
合成DBHの3つの形態(すなわち、DBH1、DBH−2S、またはDBH−FB)はIL−1α誘導による35S標識プロテオグリカンの放出の阻害を様々な程度で示した(それぞれ、約50%、約40%、および100%)(図10)。再度ではあるが、DBHの遊離塩基形態は、阻害剤として、DBHのそれ以外の2つの形態の結果を劇的に上回る結果をもたらした。
DBHおよびその関連する化合物が、JAK3に特異的な阻害剤として機能することによって効果的なOA治療薬として機能することを明らかにするために、そして一般にはOA関連化合物の阻害剤として、したがって新規な種類のOA治療薬としてのJAK3阻害剤の有効性を確認するために、よく知られているJAK3特異的阻害剤である4−(4’−ヒドロキシフェニル)−アミノ−6,7−ジメトキシキナゾリン(これはまたこの分野ではWHI−P131として呼ばれれている)による様々なOA関連mRNAの阻害を評価した。
Old,R.W.&S.B.Primrose、Principles of Gene Manipulation:An Introduction To Genetic Engineering(第3版、1985年)、Blackwell Scientific Publications、Boston。Studies in Microbiology;第2巻:409頁(ISBN0−632−01318−4)。
Claims (6)
- 軟骨の分解を伴う疾患または障害を処置するために有用な化合物を検出するためのアッセイであって、
(a)JAK3を候補化合物と接触させること、および
(b)JAK3活性の低下を検出すること
を含む方法。 - 候補化合物を細胞または組織と接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 候補化合物を軟骨細胞と接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- JAK3を候補化合物のライブラリーと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 軟骨の分解を伴う疾患または障害を処置するために有用な、JAK3を阻害する化合物を検出するためのアッセイであって、
(a)軟骨細胞を候補化合物と接触させること、および
(b)JAK3活性の低下を検出すること
を含む方法。 - 前記軟骨細胞を候補化合物のライブラリーと接触させることを含む、請求項3または5に記載の方法。
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