DE60129926T2

DE60129926T2 - Inhibitoren des jak/stat-weges und deren verwendung zur behandlung von allgemeiner primärer osteoarthritis

Info

Publication number: DE60129926T2
Application number: DE60129926T
Authority: DE
Inventors: George Brookline VASIOS
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2021-01-23
Also published as: JP2012041354A; EP1250137A2; WO2001052892A2; IL150763A0; JP5491474B2; EP1250137B1; PT1782800E; WO2001052892A3; ES2452696T3; JP5512909B2; IL150763A; US20040209799A1; DE60129926D1; JP2004500376A; CA2397774A1; US20090280081A1; AU2968701A; ATE369844T1

Description

Querverweis auf verwandte Anmeldung
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der provisorischen US-Anmeldung Nr. 60/177,872, die am 24. Januar 2000 hinterlegt wurde.
Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich der Molekularbiologie und Orthopädie. Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf neue Behandlungen von Krankheiten oder Störungen, die durch JAK/STAT vermittelt werden, insbesondere der JAK3-vermittelten Erkrankung oder Störung primäre generalisierte Osteoarthritis, unter Verwendung von JAK3-Inhibitoren.
Hintergrund der Erfindung
Die Biologie der degenerativen Gelenkerkrankung
Gelenkknorpel bedeckt das Ende der langen Knochen (Röhrenknochen) innerhalb der synovialen Gelenke, um den darunter liegenden Knochen gegen normale Scher- und Kompressionskräfte, die beim Stützen und der Bewegung des Körpers auftreten, zu schützen. Knorpel besteht aus einer extrazellulären Kollagenmatrix. Enthalten innerhalb der Kollagenmatrix sind Chondrozyten (d.h., spezialisierte Knorpelzellen) und die Grundsubstanz. Die Grundsubstanz besteht aus Proteoglycanen und Wasser. Kollagen bildet die Matrix, welche Zugfestigkeit verleiht, während Proteoglycane große Aggregate bilden, die Beständigkeit gegen Komprimierung liefern (Stockwell, 1991). Proteoglycane sind große, stark negative, hydrophile Moleküle, welche Wasser anziehen. Unter dem normalen Druck der Gelenkfunktion wird Wasser aus dem Knorpelgewebe herausgedrückt, um die Gelenkoberfläche zu schmieren. Sobald der Druck nachlässt, wird das Wasser durch die Proteoglycane des Knorpels wieder aufgenommen. Die Wasserbewegung stellt außerdem den Transport von Nährstoffen und Abfallprodukten in die und aus den Chondrozyten bereit: Es gibt keine Blutversorgung zum Knorpelgewebe. Die Aufrechterhaltung der Knorpelintegrität ist äußerst wichtig. Eine vom Normalen abweichende Belastung, entweder übermäßig oder vermindert, beeinflusst die physikalische Integrität des Knorpels, hat Auswirkung auf den Zellmetabolismus und induziert biochemische Veränderungen, welche sämtlich zu Knorpelabbau und zur Entwicklung einer degenerativen Gelenkerkrankung, wie beispielsweise Osteoarthritis (OA), führen können (Mow et al., 1992).
Die Degenerative Gelenkerkrankung, wie beispielsweise OA, tritt bei Vertebraten häufig auf. Sie wird charakterisiert als progressive, irreversible Erkrankung (Mankin and Brandt, 1991) als Folge von Knorpelabbau. Obwohl der Name Osteoarthritis eine entzündliche Erkrankung oder Störung vermuten lässt, entsteht OA durch biochemische Prozesse innerhalb des Knorpels, welche zu Knorpelabbau führen. In dieser Hinsicht unterscheidet sich OA von rheumatoider Arthritis (RA) und seronegativen Spondyloarthropathien. Im Unterschied zu RA, bei der das Synovium die primäre Quelle degradativer (abbauender) Enzyme darstellt, sind bei der OA Chondrozyten die hauptsächliche Quelle von Enzymen, die für den Knorpelkatabolismus verantwortlich sind. Einzelne und vorübergehende inflammatorische (entzündliche) Antworten stellen jedoch oftmals eine separate sekundäre Komplikation dar, die mit dem Fortschreiten von OA assoziiert ist (Goldring, 1999).
Obwohl das (oder die) anfängliche(n) Ereignis(se) bei der Entwicklung von OA immer noch unbekannt ist (sind), beinhaltet die Pathogenese von OA vermutlich eine Interaktion von äußerlich wirkenden mechanischen Faktoren und des inneren Knorpelmetabolismus. Die letztendlichen Ursachen von OA können von physikalischem Trauma auf den Knorpel (sekundäre OA) bis zu metabolischen Veränderungen, welche sich auf die normalen Aufrechterhaltungsprozesse des Knorpels auswirken, bis zu schwächeren intermittierenden entzündlichen Reaktionen, bis zu genetischen Störungen reichen, durch die sämtlich autolytische Enzyme induziert werden können (Wilson, 1988, Goldring, 1999). Ungeachtet des initiierenden Ereignisses oder Traumas, welches das Einsetzen von OA triggern kann, ist das allgemein akzeptierte Modell, dass aktivierte Cytokine und/oder Rezeptoren zu einer Signaltransduktion zum Chondrozyten-Nukleus führen, wodurch Genexpression von Knorpel-abbauenden Enzymen und inflammatorischen Agenzien induziert wird.
Eine direkte Verletzung von Knorpel kann ebenso eine Schädigung der Chondrozyten verursachen. Chondrozyten können auf Schädigung durch Produktion degradativer Enzyme und durch Induktion unangemessener Reparaturprozesse antworten (Mow, et al., 1992). Die biochemischen Veränderungen bei OA haben Einfluss auf verschiedene Knorpelkomponenten, einschließlich Proteoglycan-Aggregate und Kollagene. Proteoglycan-Abbauprodukte wurden in der synovialen Flüssigkeit von OA-Patienten nachgewiesen (Lohmander et al., 1993). Der verminderte Proteoglycan-Gehalt in Verbindung mit abgebautem Kollagen führt zu dem funktionellen Verlust der normalen physiologischen Eigenschaften der Matrix.
Der enzymatische Abbau der Knorpelmatrix ist ein Schlüsselfaktor beim Einsetzen und Fortschreiten der degenerativen Gelenkerkrankung (Pelletier et al., 1992; Pelletier et al., 1993). Zu Knorpel-abbauenden Enzymen, die bekanntermaßen eine Hauptrolle bei der OA-Pathologie spielen, zählen Matrix-Metalloproteasen (MMPs), Aggrecanasen und Serin- und Thiol-Proteasen (Pelletier et al., 1997).
Zu Matrix-Metalloproteasen, die bei der OA eine Rolle spielen, zählen Kollagenasen, Stromelysine und Gelatinasen. Kollagenasen sind verantwortlich für den Abbau des Kollagen-Typ-II-Gerüsts im Knorpel. Kollagenase-1 (MMP-1) und Kollagenase-3 (MMP-13) wurden in situ in OA-Knorpel identifiziert. Die Niveaus von Kollagenase-1 und -3 korrelieren mit der histologischen Schwere des von OA betroffenen Knorpels (Reboul et al., 1996). Die Stromelysine und Gelatinasen (einschließlich Gelatinase-A und -B, ebenso als MMP-2 bzw. MMP-9 bezeichnet) sind Metalloproteoglycanasen, die ebenso bei OA eine Rolle spielen. Die Stromelysin-Niveaus korrelieren ebenso mit der histologischen Schwere der OA (Dean et al., 1989). Des Weiteren ist Stromelysin verwickelt in die Aktivierung von Prokollagenase, wodurch seine Gesamtwirkung in der OA-Pathologie vervielfältigt wird (Murphy et al., 1987). Für neutrophile Kollagenase (ebenso als Kollagenase-2 oder MMP-8 bekannt) wurde gezeigt, dass sie Aggrecan an einzelnen Stellen spaltet, einschließlich der Stelle der Aggrecanase-Spaltung, obwohl sie dies nicht bevorzugt genug tut, um als eigentliche Aggrecanase zu gelten (Arner et al., 1997). Von diesen Matrix-Metalloproteinasen wird angenommen, dass sie primär verantwortlich sind für die Schädigung von Proteoglycan, Kollagen-II- und Kollagen-IX-Komponenten des Knorpels, die bei der OA auftritt (Dean et al., 1989; Mort et al., 1993; Buttle et al., 1993).
Aggrecanasen stellen eine Familie von Enzymen dar, welche Aggrecan, die Hauptkomponente von Proteoglycan-Aggregaten im Knorpel, abbauen. Aggrecanasen werden definiert durch ihre charakteristische Spaltung von Aggrecan zwischen Glu373 und Ala374. Die Aggrecanasen wurden kürzlich als Unterfamilie der Disintegrin- und Metalloproteasen(ADAM)-Familie charakterisiert, welche mehrere Carboxy-Thromspondin-Motive enthalten, die für extrazelluläre Matrixbindung verantwortlich sind. Diese Disintegrin- und Metalloprotease-Verbindungen mit Thrombospondin-Motiv (ADAMTS), insbesondere ADAMTS-4, -11 und, möglicherweise, -1, weisen charakteristische spaltungsspezifische Aggrecanase-Aktivität auf (Abbaszade et al., 1999; Tortorella et al., 1999).
Stickstoffoxid (NO), ein anorganisches freies Radikal, wurde ebenso mit degenerativen Gelenkerkrankungen in Verbindung gebracht. NO wird enzymatisch aus 1-Arginin durch NO-Synthase (NOS) synthetisiert. Derzeit sind zwei Isoformen der NOS bekannt: konstitutive NOS (cNOS) und induzierbare NOS (iNOS). Eine klinische Messung von Nitrit- und Nitrat-Niveaus der synovialen Flüssigkeit von OA-Patienten zeigt NO-Produktion in osteoarthritischen Gelenken (Farrell et al., 1992). Außerdem wurde beschrieben, dass NOS-Inhibitoren einige arthritische Zustände in Ratten unterdrücken (McCartney-Francis et al., 1993).
Cyclooxygenase 2 (COX 2) spielt eine Hauptrolle bei der Synthese von Eicosanoiden, lokal wirkenden hormonähnlichen Molekülen, die in einer Vielzahl biologischer Prozesse, die mit Schmerz, Fieber und Entzündung in Verbindung stehen, eine Rolle spielen. Insbesondere ist COX 2 erforderlich für die Synthese von Prostaglandinen, Prostacyclinen und Thromboxanen aus Arachidonsäure. NF-κB (ein Heterodimer von p65 und p50) ist ein Transkriptionsfaktor, welcher die Transkription von COX 2 aktiviert. Da COX 2 bei der Synthese von Prostaglandinen erforderlich ist, wurde auf dieses Enzym und seinen Transkriptionsfaktor NK-κβ als Schlüsselkomponenten beim Einsetzen und Fortschreiten von OA abgezielt.
Die Rolle von Cytokinen, die den Metabolismus von Bindegewebe regulieren, und ihre begleitenden intrazellulären Signaltransduktionswege wurden intensiv im Hinblick auf Gewebeabbau in Verbindung mit Gelenkerkrankungen, wie beispielsweise rheumatioder Arthritis und Osteoarthritis, untersucht (siehe z.B. Goldring, 1999; Pelletier et al., 1993). Die Studien zeigten, dass inflammatorische Cytokine eine zentrale Rolle als biochemische Signale spielen, welche Chondrozyten dazu stimulieren, die verschiedenen oben erwähnten Knorpelabbauenden Verbindungen freizusetzen. Derzeit sind die Hauptcytokine, von denen angenommen wird, dass sie mit Knorpelabbau assoziiert sind, Interleukin-1 und -6 (IL-1 und IL-6) und der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α).
Von IL-1 und TNF-α ist beschrieben, dass sie die Synthese (d.h. Genexpression) von Proteasen, einschließlich Metalloproteasen, erhöhen. Injektionen von IL-1 und TNF-α in Kombination rufen einen höheren Knorpelabbau hervor als jedes Cytokin allein (Henderson and Pettipher, 1989; Page-Thomas, 1991). Des Weiteren wurde berichtet, dass IL-1 autokrine Aktivität in Chondrozyten aufweist (Attur et al., 1998; Pelletier et al., 1993), wodurch ein positiver Feedback-Mechanismus erzeugt wird. IL-1 und TNF-α induzieren außerdem IL-6-Expression in synovialen Fibroblasten, was IL-6 als ein intermediäres Signal bei der Induktion anderer zellulärer (transkriptioneller) Antworten impliziert. Es wurde gezeigt, dass IL-6-Niveaus mit hohen Niveaus von TNF-α korrelieren und in den synovialen Flüssigkeiten aus OA-Gewebe erhöht sind. Von IL-1 wurde gezeigt, dass es eine Hauptrolle beim Knorpelabbau bei OA spielt (Pelletier et al., 1991; McDonnell et al., 1992). Es reguliert die Synthese und die Sekretion der Metalloproteinasen Stromelysin und interstitialer Kollagenase in dosisabhängiger Weise nach oben (Stephenson et al., 1987; Lefebvre, et al., 1990). Makrophagen-ähnliche synoviale Zellen werden von einigen als Hauptquelle von IL-1 und anderen Cytokinen, welche Chondrozyten zur Expression Knorpel-abbauender Enzyme anregen, betrachtet. Von den Chondrozyten selbst ist ebenso bekannt, dass sie IL-1 produzieren (Goldring, 1999).
Trotz der oben detailliert beschriebenen intensiven Forschungsanstrengungen bleibt die Manipulation des intrazellulären Chondrozyten-Signaltransduktionswegs zur Änderung des Verlaufs mechanischer und/oder durch Cytokine hervorgerufener Induktion von Knorpelabbauenden Enzymen schwierig. Die derzeitige Forschung richtet sich auf die Mitogenaktivierte Protein-Kinase(MAPK)-Familie, welche nicht nur durch ein unterschiedliches Spektrum von Stimuli aktiviert wird, sondern ebenso eine Anzahl von Transkriptionsfaktoren (insbesondere Aktivator-Protein-1 oder AP-1), von denen angenommen wird, dass sie für die Expression von MMP-Genen (z.B. Kollagenase-1 und -3) und verschiedenen inflammatorischen Cytokinen verantwortlich sind, reguliert (Rutter et al., 1997; Pendas et al., 1997; Lee et al., 1994). Durch Stress aktivierte Protein-Kinasen (SAPKs, ebenso als JNKs bezeichnet), extrazellulär regulierte Kinasen (ERKs) und p38-Kinasen wurden als wichtige Proteine in dem Signaltransduktionsweg, der zur Expression von Knorpel-abbauenden Enzymen führt, betrachtet.
AP-1 ist ein heterologer Proteinkomplex, welcher c-Jun- und c-Fos-Polypeptide umfasst. AP-1-Aktivierung spielt vermutlich ebenso eine wichtige Rolle bei progressiven degenerativen Knochen- und Knorpelerkrankungen (Firestein, 1996). Von AP-1 wird angenommen, dass es die Kollagenase-Gene und Stromelysin reguliert (Matrisian, 1994); IL-1 stellt einen der wirksamsten Induktoren von Kollagenase und AP-1 in Fibroblasten-ähnlichen RA-Synoviozyten dar (Zuoning et al., 1999).
Behandlung degenerativer Gelenkerkrankung
Derzeitige Ansätze zur Entwicklung von Therapeutika für degenerative Gelenkerkrankungen, wie beispielsweise OA, umfassen die Synthese von Inhibitoren von Knorpel-abbauenden Enzymen, die Regulation von Cytokin- und Zellrezeptor-Niveaus und die Regulation von Protein-Kinasen im Allgemeinen. Beispielsweise wurde beschrieben, dass einige Protein-Kinase-C-Inhibitoren verwendet werden können, um, inter alia, PKC-vermittelte Entzündung allgemein zu mildern (Nambi and Patil, 1993; Nambi and Patil, 1997). Später stellte sich heraus, dass bestimmte dieser Inhibitoren, einschließlich 4-(2-Amino-4-oxo-2-imidazolin-5-yliden)-2-bromo-4,5,6,7-tetrahydropyrrolo(2,3-c)azepin-8-on (Hymenialdisin; im Folgenden "H") und 4-(2-Amino-4-oxo-2-imidazolin-5-yliden)-4,5,6,7-tetrahydropyrrolo(2,3-c)azepin-8-on (Debromohymenialdisin; im Folgenden "DBH"), und verschiedene physiologisch aktive Salze davon den IL-1-induzierten Abbau von Glycosaminoglycan und extrazellulärer Matrix in Chondrozyten in Kultur und in Explantaten von Gelenkknorpel inhibieren (Chipman and Faulkner, 1997). Kürzlich stellte sich außerdem heraus, dass die Tyrosinkinase-Inhibitoren Genistein, Herbimycin A, 4,5-Dianilinophthalimid (DAPH), Tyrphostin AG 82 und Tyrphostin AG 556 ebenso Knorpelabbau durch Chondrozyten in vitro reduzieren oder verhindern (Sharpe et al., 1997).
WO 9711692 offenbart, dass Proteintyrosinkinase-Inhibitoren, wie beispielweise Tyrphostine, wirksam bei der Behandlung von Osteoarthritis sind.
US 5310759 offenbart die Verwendung eines zyklischen Adenosin-Monophosphat-Agonisten oder -Induktors, wie beispielweise 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) oder Forskolin, für die Behandlung degenerativer Gelenkerkrankungen, wie beispielsweise Osteoarthritis.
Dennoch bleiben viele der zellulären Mechanismen, welche spezifisch die Expression von Knorpel-abbauenden Enzymen regulieren, die in degenerative Gelenkerkrankungen verwickelt sind, unbekannt. Die Entdeckung eines spezifischen Signaltransduktionswegs, welcher Knorpel-abbauende Enzyme reguliert, entweder direkt oder durch die Aktivierung von Intermediaten, stellte einen enormen Fortschritt in dem Verständnis der Induktion und des Fortschreitens degenerativer Gelenkerkrankungen dar und lieferte neue Wege für die Entwicklung einer neuen Klasse effektiver Therapeutika zur Behandlung derartiger Erkrankungen.
Der Janus-Kinase(JAK)-Pfad
Einen separaten und eigenen Signaltransduktionsweg, welcher nie zuvor in irgendeiner Weise mit der Regulation von Knorpel-abbauenden Enzymen noch mit dem IL-1-Signaltransduktionsweg in Verbindung gebracht wurde, ist der JAK/STAT-Pfad. Eine große Anzahl von Polypeptid-Cytokinen, Lymphokinen und Wachstumsfaktoren aktivieren (über Cytokin-Rezeptoren) die JAK-Familie (Review von Aringer et al., 1999). Rezeptor-aktivierte JAK-Assoziationen aktivieren (d.h., Tyrosin-phosphorylieren) STAT-Proteine (Signaltransduktoren und Aktivatoren der Transkription). Von JAK wird angenommen, dass sie die hauptsächlichen Aktivatoren der fünf derzeit bekannten STAT-Proteine darstellen (Silvennoinen et al., 1997).
Das derzeitige Modell der STAT-Aktivierung ist, dass JAKs spezifische Tyrosinreste innerhalb des aktivierten Zellrezeptors phosphorylieren, wodurch Andockstellen für STATs geschaffen werden, welche an ihre Src-Homologie-2(SH2)-Domänen binden. JAKs katalysieren die STAT-Phosphorylierung, wodurch STAT-Dimerisierung aktiviert wird und die STATs vom Rezeptor abgelöst werden. Die STAT-Dimere verlagern sich dann in den Zellkern, wo sie als Transkriptionsfaktoren fungieren, die beispielweise an Interferon-DNA-Promotor-Regionen (IRE und GAS) binden (Darnell Jr. et al., 1994; Ihle, 1995; Ihle, 1994; Darnell, 1997).
Weiter stromaufwärts ist die JAK-Aktivierung direkt mit zellulären Cytokin-Transmembran-Rezeptoren verbunden, denen eine innere Kinaseaktivität fehlt. JAKs können an die cytoplasmatischen Motive dieser Rezeptoren binden. Die zellulären Rezeptoren wirken derart, dass sie JAKs als ihre Nicht-Rezeptor-Proteinkinase rekrutieren/aktivieren, um intrazelluläre Signalübertragung zu steuern (Aringer et al., 1999). Ein Modell schlägt vor, dass Ligandeninduzierte Rezeptor-Dimerisierung oder -Oligomerisierung die lokale Aggregation von JAK-Molekülen mit sich bringt und zu JAK-Aktivierung durch einen Kreuz-Phosphorylierungs-Mechanismus führt (Taniguchi, 1995).
Die Mitglieder der JAK-Familie, die derzeit aus JAK 1, JAK 2, TYK 2 und JAK 3 besteht, sind Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen. JAK-Proteine enthalten eine stark konservierte katalytische Domäne, die in anderen Tyrosinkinasen auftritt (Firmbach-Kraft, 1990; Hanks et al., 1991; Hunter, 1991; Wilks, 1989). Im Unterschied zu den meisten anderen Tyrosinkinasen sind JAKs jedoch im Cytoplasma lokalisiert und enthalten eine zweite Kinase-ähnliche Domäne unbekannter Funktion, jedoch keine SH2- oder SH3-Domänen, Signalpeptid-Sequenzen oder Transmembran-Domänen (Harpur et al., 1992; Wilks et al., 1991).
Von den JAK-Proteinen ist bekannt, dass sie in die Signalübertragung von einer Anzahl von Cytokinen verwickelt sind, die auf hämopoetische Zellen wirken. JAK-Signaltransduktion wird aktiviert durch: IFN-α, -β und -γ (Interferone); IL-2, -3, -4, -6, -7, -17 (Interleukine); GM-CSF (Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor); EPO (Erythropoietin); GH (Wachstumshormon); CNTF (ciliärer neurotrophischer Faktor); LIF (Leukämie-inhibierender Faktor); OSM (Oncostatin M) und PRL (Prolactin) (Argetsinger, 1993; Gauzzi et al., 1996; Helden and Purton (eds.) 1996; Ihle, 1996; Liu et al., 1997; Luttichen, 1994; Muller et al., 1993; Schindler and Darnell Jr., 1995; Stahl et al., 1994; Subramaniam et al., 1999; Velazquez et al., 1992; Watling et al., 1993; Witthuhn et al., 1993; Rui et al, 1994).
Es wurde eine absolute Korrelation zwischen JAK-Aktivierung und der Aktivierung verschiedener Cytokin-induzierter Downstream-Signalübertragungsereignisse gezeigt. Dazu zählen: Phosphoinositol-3-Kinase (PI-3K), Shc, Insulin-Rezeptor-Substrat-1 und -2 (IRS-1 und -2) sowie Vav-Phosphorylierung und Induktion von c-Myc-, c-Fos-, c-Jun-, Pim- und CIS-Genen (Silvennoinen et al., 1997).
Es stellte sich heraus, dass JAK/STAT-Proteine in vivo in embryonischem und postnatalem Gehirn vorliegen und moduliert werden, was auf eine Rolle während der Gehirnentwicklung hinweist (De-Fraja et al., 1998). Es zeigte sich, dass der JAK/STAT-Pfad eine wichtige Rolle bei Gehirntumoren spielt (z.B. Meningiomen). Ebenso stellte sich heraus, dass der JAK/STAT-Pfad als Signaltransduktionsweg bei der Pathogenese von diabetischer Nephropathie dient.
Janus-Kinase 3 (JAK 3)
JAK 3 ist das neueste Mitglied der JAK-Protein-Tyrosinkinase-Familie. Es wurden drei Splice-Varianten von JAK 3 in hämatopoetischen und ephithelialen Krebszellen beschrieben. Die JAK3-Splice-Varianten enthalten identische aminoterminale Regionen, unterscheiden sich jedoch am C-Terminus (Lai et al., 1995; Gurniak and Berg, 1996). Die funktionelle Signifikanz dieser Splice-Varinaten ist nicht vollständig verstanden. Es wurde gezeigt, dass die aminoterminalen JH-7-6-Domänen (Aminosäuren 1–192) von JAK3 notwendig und ausreichend für dessen Interaktion mit der IL-2R-Untereinheit γc sind (Chen et al., 1997).
Der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg und insbesondere die Rolle von JAK3 stellen einen signifikanten Punkt der therapeutischen Intervention für verschiedene Erkrankungen und Störungen dar. Das volle Ausmaß und die Funktion des JAK/STAT-Pfads bleiben jedoch unklar. Es ist erforderlich, den JAK/STAT-Pfad besser in seiner Gesamtheit zu verstehen; Methoden zur Regulation dieses Signaltransduktionswegs können wichtige neue Therapeutika zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen, die durch JAK/STAT vermittelt werden, liefern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg, insbesondere JAK 3, in das Einsetzen und Fortschreiten degenerativer Gelenkerkrankungen verwickelt ist. Insbesondere wird gezeigt, dass JAK3-Inihibtoren die IL-1-induzierte Expression von Genen, die bekanntermaßen in die Entwicklung und das Fortschreiten von OA verwickelt sind, blockiert. Ebenso wird hierin erstmals gezeigt, dass JAK 3 in Chondrozyten in wenigstens zwei Formen exprimiert wird. Es wird der Beweis geliefert, dass Moleküle, wie beispielweise DBH und H, von denen gezeigt wurde, dass sie bei der Behandlung von Knorpel-abbauenden Störungen, wie beispielsweise OA, in Tiermodellen wirksam sind, als JAK3-spezifische Inhibitoren operieren, welche direkt und/oder indirekt die Expression verschiedener Knorpel-abbauender und Entzündungs-vermittelnder Faktoren reduzieren oder unterdrücken. Schließlich wird der Beweis geliefert, dass andere JAK3-Inhibitoren ebenso wirksam direkt und/oder indirekt die Expression verschiedener Knorpel-abbauender Faktoren in einer zu der von DBH und H identischen Weise unterdrücken. Die Identifizierung dieser neuen Rolle des JAK/STAT-Pfads bei der Degeneration von Knorpel und der Identifizierung und Bestimmung der spezifischen Funktion von JAK3-Inhibitoren bei der Verhinderung der Pathologie derartiger Erkrankungen stellen neue Wege zur Entwicklung einer Klasse von Therapeutika bereit, die wirksam zur Behandlung degenerativer Gelenkerkrankungen sind.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Verwendung eines JAK3-Inhibitors gemäß Anspruch 1 zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung, welche Knorpelabbau beinhaltet, wobei es sich um primäre generalisierte Osteoarthritis handelt.
Die JAK/STAT-Inhibitoren können die Expression von Knorpel-abbauenden Enzymen oder pro-inflammatorischen Agenzien in einer Chondrozyte, einschließlich iNOS, COX-2 oder NF-κB, oder von pro-inflammatorischen Cytokinen in einer Chondrozyte, einschließlich IL-6, TNF-α und IL-1, regulieren.
Es werden Assays, welche JAK3-Interaktionen beinhalten, wie beispielsweise ein Assay zum Nachweis von Verbindungen, die geeignet sind zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung, welche Knorpelabbau beinhaltet, durch Detektion von Verbindungen, die JAK3 inhi bieren können, und Verbindungen, die unter Anwendung dieses Assays entdeckt wurden, offenbart.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 liefert einen Vergleich einer partiellen JAK3-cDNA-Sequenz, die aus einer RT-PCR-Analyse kultivierter humaner Chondrozyten erhalten wurde, mit der veröffentlichten humanen JAK3-cDNA (GenBank Accession #U09607).
2 liefert einen Vergleich der partiellen JAK3-cDNA-Sequenz, die aus einer RT-PCR-Analyse von mRNA erhalten wurde, die direkt von einer osteoarthritischen Probe gewonnen wurde.
3 liefert einen Vergleich der vröffentlichten humanen JAK3-cDNA (GenBank Accession #U09607) und der aus einer humanen Chondrozyten-cDNA-Bibliothek isolierten JAK3-cDNA.
4 veranschaulicht die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse von JAK3-mRNA in normalen humanen Gelenk-Chondrozyten.
5 veranschaulicht die DBH-Inhibition von JAK3, bestimmt durch ELISA-Analyse (Referenz).
6 liefert einen illustrativen Vergleich der JAK3-Inhibition durch H (979) und DBH (5025), bestimmt durch ELISA-Analyse (Referenz).
7 liefert einen illustrativen Vergleich der Substrat-Inhibition durch verschiedene Varianten von DBH, bestimmt durch ELISA-Analyse. 7A zeigt die Inhibitionskurven von zwei Salzformen (DBH-2S und DBH-1) und einer freien Basenform (DBH-2FB) von DBH. 7B veranschaulicht die Inhibition der freien Base DBH im Vergleich zu ZAP-70, LCK, BTK, IGF und JAK3 (Referenz).
8 (A&B) veranschaulicht die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse der DBH-Inhibition von mRNAs verschiedener Knorpel-abbauender Komponenten in humanen Gelenk-Chondrozyten (Referenz).
9 zeigt graphisch die Inihibition von IL-1-induzierter Aggrecanase-Aktivität durch verschiedene Varianten von DBH (Referenz).
10 veranschaulicht die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse der Inhibition von mRNA verschiedener Knorpel-abbauender Komponenten in humanen Gelenk-Chondrozyten durch den JAK3-spezifischen Inhibitor 4-(4'-Hydoxyphenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin (auf dem Gebiet als WHI-P131 bekannt und in der Figur als J1030 identifiziert).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Hierin sind erstmals Ergebnisse offenbart, die eine Rolle der JAK/STAT-Signaltransduktion in Chondrozyten und ihre Rolle beim Einsetzen und Fortschreiten degenerativer Gelenkerkrankungen beschreiben. Insbesondere stellte sich heraus, dass DBH und H, die derzeit in Tiermodellen als effektive Therapeutika degenerativer Gelenkerkrankungen, wie beispielsweise OA, bekannt sind, tatsächlich durch Unterbrechung der JAK/STAT-Signaltransduktion in Chondrozyten, insbesondere durch die Wirkung als JAK3-Inhibitoren, operieren. Um diese neue Rolle des JAK/STAT-Pfads bei degenerativen Gelenkerkrankungen zu bestätigen, wird der Beweis geliefert, dass ein weiterer bekannter JAK3-Inhibitor, von dem zuvor nicht bekannt war, dass er die Regulation Knorpel-abbauender Faktoren beeinflusst, ebenso solche zellulären Prozesse in einer zu DBH und H identischen Weise reguliert.
Als Ergebnis dieser Studien werden eine neue Klasse von Verbindungen, d.h., JAK/STAT-Inhibitoren, und bevorzugt JAK3-Inhibitoren, bei denen es sich nicht um DBH und H handelt, als geeignet zur Beeinflussung des Verlaufs von Krankheiten, bei denen Knorpel-Degeneration eine Rolle spielt, identifiziert. Somit ist in einer Ausführungsform die vorliegende Erfindung gerichtet auf die Verwendung einer Verbindung, welche JAK3 inhibiert, bei der es sich nicht um Hymenialdisin (H) oder Debromohymenialdisin (DBH) handelt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibition des Fortschreitens von primärer generalisierter Osteoarthritis (OA) oder der Wahrscheinlichkeit, primäre generalisierte Osteoarthritis (OA) zu entwickeln.
Ein "JAK/STAT-Inhibitor" bezieht sich auf jede Verbindung, welche die Menge und/oder Aktivität von JAK/STAT-Interaktionen herunterregulieren oder auf andere Weise vermindern oder unterdrücken kann. JAK-Inhibitoren regulieren die Quantität oder Aktivität von JAK-Molekülen herunter. STAT-Inhibitoren regulieren die Quantität oder Aktivität von STAT-Molekülen herunter. Die Inhibition dieser zellulären Komponenten kann durch eine Vielzahl von Mechanismen, die auf dem Gebiet bekannt sind, erreicht werden; dazu zählen die direkte Bindung an JAK (z.B. ein JAK-Inhibitorverbindung-Bindungskomplex oder ein Substrat-Mimetikum), direkte Bindung an STAT oder die Inhibition der Expression des Gens, welches die zellulären Komponenten kodiert. Der JAK/STAT-Inhibitor der vorliegenden Erfindung ist ein JAK3-Inhibitor, bei dem es sich nicht um Hymenialdisin (H) oder Debromohymenialdisin (DBH) handelt. Im Allgemeinen können JAK/STAT-Inhibitoren Proteine, Polypeptide, kleine Moleküle oder andere chemische Reste oder Nukleinsäuren sein.
Mutanten, Varianten, Derivate und Analoge der zuvor erwähnten Inhibitoren können ebenso geeignet sein. "Mutanten, Varianten, Derivate und Analoge", wie hierin verwendet, beziehen sich auf Moleküle mit ähnlicher Form oder Struktur zu der Ausgangsverbindung, welche ihre Fähigkeit, als JAK3-Inhibitoren zu wirken, beibehalten. Beispielsweise kann jeder der hierin offenbarten JAK3-Inhibitoren kristallisiert werden, und geeignete Analoge können auf der Grundlage der Koordinaten, die für die Form der aktiven Stelle(n) verantwortlich sind, zweckmäßig konstruiert werden. Alternativ kann der Durchschnittsfachmann ohne übermäßigen experimentellen Aufwand die funktionellen Gruppen eines bekannten Inhibitors modifizieren und die derartig modifizierten Moleküle bezüglich erhöhter Aktivität, Halbwertszeit, Bioverfügbarkeit oder anderer gewünschter Eigenschaften screenen. Wenn es sich bei dem JAK3-Inhibitor um ein Polypeptid handelt, können Fragmente und Modifikationen des Polypeptids hergestellt werden, um die Einfachheit der Abgabe, die Aktivität, die Halbwertszeit usw. zu erhöhen. Wiederum können derartige Modifikationen bei gegebener Fachkenntnis auf dem Gebiet der synthetischen und rekombinanten Polypeptidherstellung ohne übermäßigen experimentellen Aufwand erreicht werden.
Zu Beispielen für JAK/STAT-Inhibitoren, welche in den Verfahren dieser Erfindung geeignet sein können, zählen PIAS-Proteine, welche auf dem Niveau der STAT-Proteine binden und inhibieren (Chung et al., 1997); Mitglieder einer SH2-enthaltenden Proteinfamilie, welche an JAKs und/oder Rezeptoren binden können und die Signalübertragung ("Signaling") blockieren (siehe beispielweise Aman and Leonard, 1997; Nicholson and Hilton, 1998); Cytokininduzierbares Scr-Homologie-2-enthaltendes (CIS)-Protein, ein Inhibitor der STAT-Signalübertragung (Yoshimura et al., 1995); CIS-verwandte Proteine, welche die STAT-Signalübertragung inhibieren können oder direkt an Janus-Kinasen binden (Yoshimura et al., 1995; Matsumoto et al., 1997; Starr et al., 1997; Endo et al., 1997; Naka et al., 1997); ein Suppressor des Cytokin-Signaling-I-Proteins (SOCS-I, ebenso als JAB oder SSI-1 bezeichnet), welcher mit allen JAKs zu assoziieren scheint, um die Downstream-Aktivierung von STAT3 zu blockieren (Ohya et al., 1997); Tyrphostine, welche Derivate von Benzyliden-Malononitril sind und Tyrosin- und Erbstatin-Resten ähneln (Gazit et al., 1989); AG-490, ein Mitglied der Tyrophostin-Familie von Tyrosinkinase-Inhibitoren (Wang et al., 1999; auch Kirken et al., 1999); 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzoesäure und 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzamid, welche spezifisch JAK 3 inhibieren (Goodman et al., 1998); 4-(Phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin (Ausgangsverbindung WHI-258) und Derivate dieser Verbindung, welche strukturell von Dimethoxychinazolin-Verbindungen abgeleitet sind (Sudbeck et al., 1999); Verbindungen, welche eine 4'-OH-Gruppe enthalten, einschließlich 4-(4'-Hydroxyphenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin (WHI-P131), 4-(3'-Bromo-4'-hydroxyphenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin (WHI-P154) und 4-(3',5'-Dibromo-4'-hydroxylphenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin (WHI-P97); WHI-P180, eine weitere Dimethoxychinazolin-Verbindung (Chen et al., 1999); und cAMP-erhöhende Agenzien, wie beispielweise Forskolin, ein direkter Aktivator von Adenylatcyclase und Dibutyryl- cAMP, und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), ein Inhibitor von cAMP-Phosphodiesterase (Kolenko et al., 1999).
"DBH" und "H", wie hierin verwendet, beziehen sich auf Debromohymenialdisin bzw. Hymenialdisin sowie auf verschiedene Analoge und physiologisch aktive Salze davon; dazu zählen die freie Base DBH und Trifluoressigsäure- und Methansulfonsäure-Formen von DBH. Analoge von DBH und H umfassen Verbindungen, welche einen fünfgliedrigen, stickstoffhaltigen heterozyklischen Ring, gebunden an die Position vier des Pyrroloazepinrings, der in DBH vorkommt, enthalten. Zu Beispielen für Analoge zählen Hymenin und Axinohydantoin. Spezifisch enthalten die Analogen von DBH und H die Struktur:
worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe -H und einem Halogen, und X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
wie in Chipman and Faulkener ausgeführt (1997; wobei jede der obigen chemischen Strukturen der radikalischen Gruppe X eine Darstellung der chemischen Bindung an die vierte Position des Pyrroloazepinrings, der in DBH auftritt, umfasst).
Eine "pharmazeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, eines JAK/STAT-Inhibitors ist eine Menge, die wirksam das gewünschte physiologische Ergebnis erzielen kann, entweder in Zellen, die in vitro behandelt werden, oder in einem Individuum, das in vivo behandelt wird. Insbesondere ist eine pharmazeutisch wirksame Menge eine Menge, die ausreichend ist, um für einen gewissen Zeitraum einen oder mehrere der klinisch definierten pathologischen Prozesse, die mit dem betreffenden Krankheitszustand assoziiert ist, zu inhibieren. Die wirksame Menge kann in Abhängigkeit von dem spezifisch ausgewählten JAK/STAT-Inhibitor variieren und ist ebenso abhängig von einer Anzahl von Faktoren und Zuständen, die mit dem zu behandelnden Individuum und der Schwere der Störung verbunden sind. Wenn beispielsweise der Inhibitor in vivo verabreicht werden soll, zählen zu derartigen Faktoren, die berücksichtigt werden sollten, das Alter, das Gewicht und der Gesundheitszustand des Patienten sowie Dosis-Antwort-Kurven und Toxizitätsdaten, die in prä-klinischen Tiermodellen erhalten wurden. Wenn der Inhibitor mit den Zellen in vitro in Kontakt gebracht werden soll, würden ebenso eine Anzahl prä-klinischer In-vitro-Studien konstruiert werden, um Parameter, wie beispielweise Aufnahme, Halbwertszeit, Dosis, Toxizität usw., festzustellen. Die Bestimmung einer pharmazeutisch wirksamen Menge für ein gegebenes Agens liegt innerhalb des Vermögens eines Fachmanns auf dem Gebiet.
JAK/STAT-Inhibitoren, bei denen es sich nicht um DBH oder H handelt, regulieren die Expression eines Knorpel-abbauenden Enzyms in einer Zelle durch das In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge des Inhibitors. Zu Knorpel-abbauenden Enzymen zählen Matrix-Metalloproteasen, Aggrecanasen und Serin- und Thiol-Proteasen. Bevorzugte Matrix-Metalloproteasen umfassen Stromelysine (z.B. Stromelysin-1), Gelatinase A, Gelatinase B, Kollagenase 1, Kollagenase 3 und neutrophile Kollagenase. Zu bevorzugten Aggrecanasen zählen ADAMTS-1, ADAMTS-4 und ADAMTS-11. Die Zellen, die für eine derartige Behandlung empfänglich sind, umfassen jegliche Zellen, die derartige Knorpel-abbauende Enzyme exprimieren, einschließlich Chondrozyten und Synoviocyten.
Der hierin verwendete Ausdruck "regulierende Expression" und/oder Aktivität bezieht sich im Allgemeinen auf irgendeinen Prozess, der dazu dient, die Quantität oder Aktivität (Funktionalität) einer zellulären Komponente zu kontrollieren oder zu modulieren. Statische Regulation hält die Expression und/oder Aktivität auf einem gegebenen Niveau. Die Hochregulation bezieht sich auf einen relativen Anstieg der Expression und/oder Aktivität. Die Herunterregulation stellt eine relative Abnahme der Expression und/oder Aktivität dar. Die Regulation ist bevorzugt eine Herunterregulation einer zellulären Komponente. Herunterregulation, wie hierin verwendet, ist synonym mit Inhibition einer gegebenen zellulären Komponente.
Die JAK/STAT-Inhibitoren, bei denen es sich nicht um DBH oder H handelt, regulieren die Expression pro-inflammatorischer Agenzien in einer Chondrozyte, einschließlich iNOS, COX-2 oder NF-κB, durch das In-Kontakt-Bringen der Chondrozyte mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge des Inhibitors.
Eine pharmazeutisch wirksame Menge eines JAK/STAT-Inhibitors, bei dem es sich nicht um DBH oder H handelt, reguliert die Expression eines pro-inflammatorischen Cytokins in einer Chondrozyte, einschließlich IL-6, TNF-α und IL-1.
Ein derartiger JAK/STAT-Inhibitor kann die Expression von Knorpel-abbauenden Enzymen, pro-inflammatorischen Agenzien und pro-inflammatorischen Cytokinen in Synoviocyten regulieren.
Verabreichungswege eines JAK/STAT-Inhibitors gemäß Anspruch 1 an ein Individuum umfassen parenterale (einschließlich subkutane, intravenöse, intrameduläre, intraartikuläre, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion), rektale, topische, transdermale oder orale Verabreichung. Beispielsweise kann der JAK/STAT-Inhibitor intraartikulär in eine lokalisierte betroffene Region (z.B. Gelenk) des Individuums verabreicht werden, wodurch die therapeutische Wirkung in dieser Region maximiert wird, während die Wirkungen auf nicht betroffene Bereiche minimiert wird. Der Inhibitor kann ebenso topisch in der Nähe der betroffenen Region verabreicht werden. Alternativ kann der Inhibitor oral, beispielsweise in Kapseln, Suspensionen oder Tabletten, verabreicht werden.
Der JAK/STAT-Inhibitor kann einem Individuum in einer einzigen Dosis oder in wiederholten Verabreichungen und in irgendeiner der verschiedenen physiologisch akzeptablen Salzformen und/oder mit einem akzeptablen pharmazeutischen Träger als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Physiologisch akzeptable Salzformen und pharmazeutische Formulierungs-Standardtechniken sind einem Fachmann auf dem Gebiet bestens bekannt (siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.).
Da die vorliegende Offenbarung erstmals die funktionelle Rolle des JAK/STAT-Pfads in Chondrozyten beim Einsetzen und Fortschreiten von Knorpel-abbauenden Erkrankungen oder Störungen beschreibt, werden ein Assay zur Detektion neuer Verbindungen, die geeignet sind zur Behandlung solcher Erkrankungen oder Störungen, sowie geeignete Verbindungen, die durch diesen Assay identifiziert wurden, offenbart. Die Assays identifizieren Verbindungen, die geeignet sind zur Behandlung von Knorpel-abbauenden Erkrankungen oder Störungen und beinhalten das Screenen einer Kandidaten-Verbindung oder einer Bibliothek aus Kandidaten-Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit JAK3-Aktivität zu inhibieren. Auf dem Gebiet sind eine Reihe verschiedener Assay-Protokolle und Detektionstechniken bestens bekannt und können durch einen Fachmann leicht an diesen Zweck angepasst werden. Zu derartigen Assays zählen Hochdurchsatz-Assays, zelluläre In-vitro- und In-vivo-Assays und Gewebe-Assays.
Nach der detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird diese durch die folgenden Beispiele, welche lediglich illustrativen Zwecken dienen, leichter verständlich.
BEISPIEL 1: Herstellung humaner Gelenk-Chondrozyten-Kulturen
Um die zelluläre Pathologie, die mit degenerativen Knorpelerkrankungen oder Störungen, wie beispielsweise OA, verbunden sind, zu untersuchen, wurden humane Knorpelzellkulturen (humane Chondrozyten-Kulturen) hergestellt.
Normale humane Gelenkknorpelschnitte wurden aus dem Knie eines 30-jährigen kaukasischen Mannes innerhalb einer 48-stündigen Autopsie gewonnen (National Disease Research Interchange (NDRI), Philadelphia, PA). Die Gelenk-Chondrozyten wurden aus den zerkleinerten Knorpelschnitten durch enzymatischen Verdau freigesetzt (0,1% Chlostridiumhistolyticum-Kollagenase; Worthington, Freehold, NJ, in Dulbecco's "Modified Eagle Medium" (DMEM; GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD) bei 37°C über Nacht). Unvollständig verdautes Material wurde für weitere drei Stunden unter Verwendung von 0,25% Kollagenase und 0,05% Trypsin in DMEM verdaut.
Die Chondrozyten wurden auf Kunststoff einschichtig ausgesät und in Gegenwart von DMEM, 10% fötalem Kälberserum (FBS; HyClone, Logan, UT), 100 U/ml Penicillin (pen) und 100 μg/ml Streptomycin (strep) bei 37°C, 8% CO₂ bis zur Konfluenz kultiviert, wobei das Medium alle drei Tage gewechselt wurde. Bei Konfluenz wurden die Chondrozyten der ersten Passage durch Trypsinierung geerntet, als Zellstamm HC30-0198 bezeichnet und in Flüssigstickstoff in Gegenwart von DMEM, pen/strep, 40% FBS und 10% Dimethylsulfoxid zur späteren Verwendung gelagert.
BEISPIEL 2: JAK3-Expression in normalen humanen Gelenk-Chondrozyten
Um JAK3-Expression in humanen Chondrozyten zu zeigen, wurde eine Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung JAK3-spezifischer Primer mit Gesamt-RNA, die aus in Monoschichten kultivierten, normalen adulten humanen Chondrozyten isoliert wurden, durchgeführt.
Normale adulte humane Gelenk-Chondrozyten wurden aus Knorpelschnitten isoliert und wie im obigen Beispiel 1 beschrieben kultiviert. Der gefrorene Chondrozyten-Zellstamm HC30-0198 wurde aufgetaut, in einer Monoschicht (zweite Passage) wie oben beschrieben kultiviert und bis 5 Tage nach Konfluenz kultiviert.
Gesamt-RNA wurde aus den 5 Tage nach Konfluenz gewonnenen humanen Gelenk-Chondrozyten unter Verwendung des Qiagen Rneasy^®-Kits (QIAGEN, Valencia, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert.

JAK3-Primer wurden anhand der veröffentlichten humanen JAK3-Gen- und cDNA-Sequenzen konstruiert (GenBank Accession Nos. U70065 bzw. U09607). Drei JAK3-Gen- spezifische DNA-Primer zielten auf die Exons 18 und 19 des humanen JAK3-Gens ab (Tabelle I). Tabelle I. Humane JAK3-DNA-Primer

Primer	Region/Strang	Sequenz
JAK3-1	Exon 18 (Sense)	5' GGT CAT GGA GTA CCT GCC 3'
JAK3-2	Exon 19 (Antisense)	5' GTT GTC CGA GAG GGA TTC GG 3'
JAK3-3	Exon 19 (Antisense)	5' GCG GAC CAC GTA GTA GTC 3'

Der erste Strang der cDNA wurde unter Verwendung des JK3-2-Primers, von Gesamt-RNA und Ready-To-Go^®You-Prime First-Strand-Beads und -Verfahren (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) hergestellt.
Das cDNA-Produkt (8 μl) wurde in einer 100-μl-Reaktion unter Verwendung von 10 μl 10 × PCR-Puffer, 2,4 μl 25 mM MgCl₂, 0,5 μl Taq-Polymerase Hot Start, (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 73 μl Wasser und jeweils 3 μl 10 μM JK3-1- und JK3-3-Primer amplifiziert. Das Hot-Start-PCR-Protokoll bestand aus einer anfänglichen Denaturierung für 5 Minuten bei 94°C (gefolgt von der Zugabe der Taq-Polymerase), und anschließender Denaturierung für 30 Sekunden bei 94°C, Hybridisierung ("Annealing") für 30 Sekunden bei 56°C und einer Extension (Verlängerung) für 30 Sekunden bei 72°C. Denaturierung, Hybridisierung und Extension wurden über 40 Zyklen durchgeführt; anschließend erfolgte eine letzte Extension für 5 Minuten bei 72°C.
Durch die RT-PCR wurde ein DNA-Produkt von 254 Basenpaaren erzeugt, welches durch Elektrophorese in einem 2%igen SeaKem^®-GTG^®-Agarose-Gel (FMC BioProducts, Rockland, ME) unter Verwendung des QIAquick^TM-Gel-Extraktions-Kits (QIAGEN, Valencia, CA) aufgereinigt wurde.
Das RT-PCR-Produkt wurde unter Verwendung des JK3-3-Primers und von AmpliCycle^®-Sequenzierungsreagenzien und -Protokoll (Perkin Elmer, Foster City, CA) sequenziert. Aus der Zyklus-Sequenzierungsreaktion eines Strangs des RT-PCR-Produkts wurde eine DNA-Sequenz von 109 Nukleotiden erhalten, wobei 106 Nukleotide eine 100%ige Identität zu der humanen JAK3-cDNA-Sequenz der GenBank zeigten (Accession No. U09607) (1). Die drei Nukleotid-Abweichungen wurden auf die suboptimale Qualität des durch RT-PCR erzeugten Sequenzierungs-Templates und das DNA-Sequenzierungsgel zurückgeführt.
BEISPIEL 3: JAK3-Expression in Gelenk-Chondrozyten aus humanem osteoarthritischem Knorpel
Um die JAK3-Expression in Chondrozyten aus humanem osteoarthritischem Knorpel mit der zu vergleichen, die in normalen humanen Chondrozyten aus dem obigen Beispiel 2 vorliegt, wurde RT-PCR unter Verwendung JAK3-spezifischer Primer mit Gesamt-RNA, die direkt aus adultem humanem osteoarthritischem Knorpel isoliert worden war, durchgeführt.
Schnitte eines osteoarthritischen Gelenkknorpels aus dem rechten Knie einer 47-jährigen kaukasischen Frau, bei der ein Austausch des gesamten Knies durchgeführt worden war, wurden von der NDRI erhalten. Der Knorpel wurde unmittelbar nach dem Gewinnen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Insgesamt 2 bis 4 Gramm eines intakten Knorpels wurden in Gegenwart von flüssigem Stickstoff unter Verwendung einer SPEX-Mühle (SPEX CertiPrep, Inc., Metuchen, NJ) zu Pulver pulverisiert. Aus dem pulverisierten Knorpel wurde unter Anwendung des von Reno et al. (1997) beschriebenen TRIspin-Verfahrens Gesamt-RNA isoliert.
Unter Verwendung der Primer JK-1, JK-2 und JK-3 wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mit der Gesamt-RNA-Probe RT-PCR durchgeführt. Durch die RT-PCR wurde ein DNA-Produkt von 254 Basenpaaren erzeugt, welches anschließend aus einem 2%igen SeaKam^®-GTG^®-Agarose-Gel (FMC BioProducts, Rockland, ME) unter Verwendung des QIAquick-Gel-Extraktions-Kits (QIAGEN, Valencia, CA) aufgereinigt wurde.
Das RT-PCR-Produkt wurde unter Verwendung des JK3-3-Primers und des ABI-Prism-Dye-Terminator-Cycle-Sequencing-Ready-Reaction-Kits (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers sequenziert. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung eines ABI PRISM^®-377-DNA-Sequencers (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) bestimmt. Es wurde eine Sequenz von 214 Basenpaaren bestimmt.
Von den 214 sequenzierten Nukleotiden zeigten 197 Nukleotide eine 100%ige Identität zu der humanen JAK3-cDNA-Sequenz der GenBank (Accession Number U09607) (2). Die Abweichungen bei den verbleibenden 17 Nukleotiden wurden der suboptimalen Qualität des Sequenzierungs-Templates zugeschrieben.
BEISPIEL 4: Isolierung von JAK3-cDNA aus einer humanen Chondrozyten-cDNA-Bibliothek
Um weiter zu zeigen, dass JAK3 aktiv in humanen Chondrozyten exprimiert wird, wurde JAK3 aus einer humanen Chondrozyten-cDNA-Bibliothek isoliert.
Unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Techniken wurde Gesamt-RNA, die aus in Alginat kultivierten humanen Gelenk-Chondrozyten insoliert worden war, verwendet, um eine cDNA-Bibliothek zu erzeugen (die Konstruktion der cDNA-Bibliothek wurde kommerziell von Stratagene, La Jolla, CA, durchgeführt). Die cDNA-Bibliothek wurde gemäß gut etablierten Protokollen titriert und gescreent (Sambrook et al., 1989, und die empfohlenen Protokolle von Stratagene, La Jolla, CA).
Eine JAK3-DNA-Sonde wurde verwendet, um die Chondrozyten-cDNA-Bibliothek zu screenen. Die Prähybridisierung und die Hybrisidierung der Filter der cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung einer 1 × Prähybridisierungs-/Hybridisierungs-Lösung (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) bei 65°C durchgeführt. Nach 15-stündiger Hybridisierung mit der JAK3-DNA-Sonde wurde der Blot zweimal nacheinander in 2 × SSC/0,1% SDS (15 Minuten/Waschung bei Raumtemperatur) und zweimal in 1 × SSC/0,1% SDS gewaschen (30 Minuten/Waschung bei 65°C). Der Blot wurde an der Luft getrocknet und die radioaktiven Signale unter Verwendung eines autoradiografischen Kodak X-Omat^TM AR(XAR)-Films (Eastman Kodak, Rochester, NY) sichtbar gemacht.
Diejenigen Plaques, die auf doppelten Filtern positiv waren, wurden gepickt, in 1 ml sterilem SM-Puffer (0,05 M Tris pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,008 M MgSO₄, 0,01% Gelatine) platziert, gevortext und bei 4°C über Nacht inkubiert. Es wurden vierzehn positive Plaques aus dem ersten Screening unter Verwendung von 10 μl einer 1 × 10^–2-Verdünnung in 200 μl des Bakterienstammes XL-1 Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, CA) ausplattiert und mit einer JAK3-DNA-Sonde wie oben gecreent. Die positiven Plaques aus dem zweiten Screening wurden gepickt und in SM-Puffer, wie oben beschrieben, platziert.
Zwei positive Phagen-Klone aus dem zweiten Screening wurden für eine DNA-Sequenzanalyse ausgewählt, basierend auf: i) der Bestätigung der JAK3-Identität unter Verwendung der Primer JK3-1 und JK3-3 in einer PCR-Reaktion, wie in Beispiel 2 beschrieben, und ii) der Identifizierung der Größe des klonierten cDNA-Inserts unter Verwendung der PCR-Primer T7 und T3 (Stratagene, La Jolla, CA). Das Hot-Start-PCR-Protokoll bestand aus einer anfänglichen Denaturierung für 5 Minuten bei 93°C (gefolgt von der Zugabe der Taq-Polymerase), anschließender Denaturierung für 1 Minute bei 93°C, Hybridisierung für 1 Minute bei 55°C, Extension für 45 Sekunden bei 75°C. Denaturierung, Hybridisierung und Extension wurden über 40 Zyklen durchgeführt; anschließend erfolgte eine letzte Extension für 7 Minuten bei 75°C. Die Größe der PCR-Produkte wurde in einem 1%igen SeaKam^®-GTG^®-Agarose-Gel (FMC BioProducts, Rockland, ME) visualisiert.
Nach der Identifizierung des PCR-Produkts der beiden Lambda-ZAP^®-II-Phagen-Klone, welche die größten cDNA-Inserts für JAK3 enthielten, wurden die JAK3-cDNA-Inserts unter Verwendung des ExAssist^TM-Interference-Resistant-Helfer-Phagens (Stratagene, La Jolla, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers jeweils in einen SOLR-E.-coli-Stamm subkloniert. Es wurden einige bakterielle Kolonien isoliert, und aus diesen Klonen wurde die Plasmid-DNA unter Verwendung eines QIAprep-Spin-Miniprep-Kits (Qiagen, Valencia, CA) aufgereinigt.
Eine DNA-Sequenzanalyse jeweils eines DNA-Strangs der beiden Subklone zeigte, dass die ungefähr 2000 Nukleotide lange Sequenz, die von jedem Subklon erhalten worden war, identisch zu der veröffentlichten JAK3-cDNA-Sequenz war (Gen Bank Accession #U09607). Die von einem der Subklone bestimmte DNA-Sequenz ist in 3 dargestellt.
Die Ergebnisse der Beispiele 2, 3 und 4 bestätigen erstmalig die Expression von JAK3 in kultivierten Gelenk-Chondrozyten aus normalem humanem Knorpel sowie in humanem osteoarthritischem Knorpel.
BEISPIEL 5: Northern-Blot-Analyse der JAK3-Expression in humanen Gelenk-Chondrozyten
Der gefrorene Chondrozyten-Zellstamm HC30-0198 (normale humane Gelenk-Chondrozyten, wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt) wurde aufgetaut, in Monoschicht kultiviert (zweite Passage) und bis 5 Tage nach Konfluenz kultiviert. Die Kulturen wurden in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gespült und danach entweder: 1) rekombinantes humanes Interleukin-1β(rhIL-1β) (R&D Systems, Minneapolis, MN) mit 2 ng/ml für 24 Stunden in serumfreiem DMEM, enthaltend 1% antibiotische Lösung, oder 2) serumfreies DMEM, enthaltend lediglich 1% antibiotische Lösung (Kontrolle), zugegeben.
Nach 24-stündiger Kultur wurde die Gesamt-RNA aus der Monoschicht-Kultur unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) gemäß dem Protokoll des Herstellers gewonnen. 10 μg der Gesamt-RNA aus jeder der obigen Proben wurde in einem 2,2 M Formaldehyd/1,2%igen Agarose-Gel aufgetrennt und durch schwachen alkalischen Transfer unter Verwendung des TURBOBLOTTER^TM (Schleicher & Schuell, Keene, NH)-Systems gemäß dem Protokoll des Herstellers auf eine Nylon-Trägermembran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) überführt. Die RNA auf dem Northern-Blot wurde unter Verwendung eines Stratalinker^®-1800-UV-Crosslinkers (Stratagene, La Jolla, CA) auf der Membran fixiert.
Durch RT-PCR wurde eine 109 Basenpaare lange humane cDNA für JAK3 erzeugt (siehe obiges Beispiel 2). Die cDNA wurde mit [α³²P] dCTP (New England Nuclear, Boston, MA) unter Verwendung von Ready-To-Go-DNA-Labeling-Beads (-dCTP; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert, unter Verwendung von CHROMA. SPIN^TM + TE-30-Säulen (Clontech, Palo Alto, CA) gereinigt und als Sonde für eine Northern-Blot-Analyse verwendet.
Die Prähybridisierung und Hybridisierung des Northern-Blots wurde bei 42°C unter Verwendung einer 1:1-Verdünnung einer 2 × Prähybridisierungs-/Hybridisierung-Lösung (GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD) und Formamid durchgeführt. Nach 15-stündiger Hybridisierung unter Verwendung der JAK3-DNA-Sonde wurde der Blot zweimal nacheinander in 2 × SSC/0,1% SDS (15 Minuten/Waschung bei Raumtemperatur) und zweimal in 0,5 × SSC/0,1% SDS gewaschen (30 Minuten/Waschung bei 65°C). Der Blot wurde an der Luft getrocknet und das radioaktive Signal unter Verwendung eines Fujifilm-BAS-1500-Phosphorrimagers (Fuji Medical Systems, USA, Stamford, CT) sichtbar gemacht.
Das Phosphorimage der Northern-Blot-Analyse ist in 4 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass JAK3-mRNA in kultivierten normalen adulten humanen Gelenk-Chondrozyten exprimiert wird, und dass rhIL-1β das Niveau von JAK3-mRNA, welches in nicht mit rhIL-1β-stimulierten normalen adulten humanen Gelenk-Chondrozyten gefunden wird, weder erhöht noch herabsetzt. Außerdem wird durch den Northern-Blot deutlich, dass zwei Arten von JAK3 mit unterschiedlichem Molekulargewicht von humanen Gelenk-Chondrozyten in Monoschichtkultur exprimiert werden, die eine Länge von ungefähr 4,2 kb und 2,2 kb aufweisen. Die vorherrschende Form der von kultivierten normalen adulten humanen Gelenk-Chondrozyten exprimierten JAK3-mRNA ist die 2,2 kb große Form. Die größere (4,2 kb) Form stimmt in der Größe mit der Form überein, die in normalen humanen Blutzellen einer Lymphoidlinie auftritt, und stellt eine kleine Fraktion der in Chondrozyten exprimierten Gesamt-JAK3-mRNA dar.
BEISPIEL 6: DBH-Inhibition von JAK3 (Referenz)
Um zu zeigen, dass DBH, ein wirksames Therapeutikum für degenerative Gelenkerkrankung, wie beispielsweise OA, JAK3 inhibiert, wurde ein Tyrosinkinase-Enzym-gekoppelter Immunabsorptions-Assay (ELISA) durchgeführt.
Nunc-Immunoplate-Maxisorp-Flachboden-Capture-Platten (Nalge Nunc International, Rochester, NY) wurden mit 80 μl/Loch Anti-Phosphotyrosin-PY54-MAb-Antikörper (Transduction Labs, Lexington, KY), verdünnt auf 2 μg/ml in Beschichtungspuffer (10 mM Phosphat, pH 7,2 + 0,02% NaN₃), beschichtet und über Nacht bei 4°C adsorbiert. Die Platten wurden gewaschen (alle Waschungen wurden 4 × mit TEST: 25 mM Tris/HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl + 0,05% Tween-20 durchgeführt), und 200 μl/Loch Blocking-Puffer (TEST + 1% BSA) zugegeben. Die Platten wurden verschlossen und bei 37°C für 60 Minuten oder über Nacht bei 4°C inkubiert und wiederum gewaschen.
Die Kinase-Reaktionen wurden in 50-μl-Volumen mit biotinyliertem Peptidsubstrat in einer Rundbodenplatte (Corning, Corning, NY) durchgeführt. Die Kinase-Reaktionsmischungen enthielten: 20 μl 50 μM GAS1-biotinyliertes Peptid (LCBiotin-EGPWLEEEEEAYGWMDF-Amid), 0–1250 μM ATP in Kinase-Puffer, 10 μl 50 mM MgCl₂ in 2 × Kinase-Puffer (50 mM Imidazol/HCl, 2 mM DTT, 0,2 mM EDTA, 0,030% Brij-35, pH 6,8), 10 μl 0–50 μM DBH in Wasser, enthaltend 0,2% Pluronic-104 und 3% Dimethylsulfoxid (DMSO), und 10 μl JAK3-Enzym, verdünnt in Kinase-Puffer. Eine Phosphopeptid-Standardkurve (1–10 nM) unter Verwendung von Kinase-Puffer als Verdünnungsmittel wurde ebenso getestet.
Die Kinase-Reaktionen wurden über 30 Minuten bei 37°C durchgeführt und dann durch Zugabe von 15 μl/Loch 0,125 M EDTA, pH 6,8, gestoppt. Aliquots von 50 μl/Loch der gestoppten Lösungen wurden auf eine Antikörper-beschichtete Capture-Platte überführt, verschlossen und bei 37°C für 60 Minuten inkubiert. Die Platte wurde gewaschen und 80 μl/Loch SA-HRP-Reagenz (Genzyme, Cambridge, MA), 1/5 verdünnt in Genzyme-Verdünnungspuffer, zugegeben. Die Platte wurde verschlossen und wiederum bei 37°C für 60 Minuten inkubiert. Die Platte wurde gewaschen, und es wurden 100 μl/Loch Tetramethylbenzidin(TMB)-Substratlösung (Kirkgaard & Perry Laboratories, Gaitherburg, MD), prä-äquilibriert auf Raumtemperatur, zugegeben; das Ganze wurde für ungefähr 5 Minuten umgesetzt. Die Reaktion wurde mit 100 μl/Loch einer 1 N H₂SO₄-Lösung gestoppt. Die Proben wurden bei A₄₅₀–A₆₂₀ gelesen.
Die Ergebnisse des Experiments (dargestellt in 6) zeigen, dass DBH ein starker Inhibitor von JAK3 ist, wobei die aufgezeichnete Inhibitionskonstante (K_i) 286 ± 16 nM beträgt.
BEISPIEL 7: DBH (und Varianten davon) inhibieren spezifisch JAK3 (Referenz)
Um die Inhibitionseigenschaften von DBH (und dessen Varianten) auf verschiedene zelluläre Komponenten weiter zu untersuchen, wurde ein Poly (Glu, Tyr) 4:1-ELISA durchgeführt. Hymenialdisin (H), DBH (als marine Schwammextrakte; siehe Chipman and Faulkner, 1997) und drei Varianten von synthetischem DBH; die freie Basenform von DBH (DBH-2FB), eine Trifluoressigsäure-Salzform von DBH (DBH-2S) und eine Methansulfonsäure-Salzform von DBH (DBH1) wurden in DMSO solubilisiert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, ZAP-70(ς-assoziiertes Polypeptid von 70 kDa)-Protein-Tyrosinkinase, BTK (Bruton's Gammaglobulinämie-Tyrosinkinase), JAK3(Janus-Kinase 3)-Protein-Tyrosinkinase, LCK (Lymphoid-T-Zell-Protein-Tyrosinkinase) und IGFR(Rezeptor des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors)-Protein-Tyrosinkinase zu inhibieren.

Maxisorb-Mikrotiterplatten (Nalge Nune International, Rochester, NY) wurden mit 1 mg/ml Poly (Glu, Tyr) 4:1 (Sigma, St. Luois, MO), solubilisiert in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), 0,02% Natriumazid, beschichtet. Am Tag des Assays wurden die Mikrotiterplatten 4 × mit TBS-Tween (25 nM Tris pH 8,0, 1,50 mM NaCl, 0,05% Tween 20) unter Verwendung eines Skatron-Plattenwaschers (Skatron Instruments, Sterling, VA) gewaschen. 200 μl steriler Blockierungs-Puffer (3% BSA in PBS, 0,02% Natriumazid) wurden zu jedem Loch gegeben; die Mikrotiterplatten wurden bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Der Blockierungs-Puffer wurde entfernt, die Platten wurden gewaschen und verschiedene Konzentrationen des Inhibitors in einem 20-μl-Volumen zu den Löchern gegeben. Dann wurden 60 μl der geeigneten Substratmischung zugegeben. Die Substratmischungen wurden wie in Tabelle 2 wiedergegeben hergestellt. Tabelle 2: Poly (Glu, Try) 4:1 ELISA-Substratlösung

	4 × Assay-Puffer*	ATP	MnCl₂	MgCl₂	H₂O
ZAP-70	2 ml	1 ml 500 μM	1 ml 100 mM	-	2 ml
BTK	2 ml	1 ml 500 μM	1 ml 100 mM	1 ml 10 mM	1 ml
JAK3	2 ml	1 ml 500 μM	-	1 ml 100 mM	2 ml
LCK	2 ml	1 ml 500 μM	1 ml 100 mM	1 ml 100 mM	1 ml
IGFR	2 ml	1 ml 500 μM	1 ml 100 mM	1 ml 50 mM	1 ml

* (4 × Assay-Puffer: 100 mM Imidazol pH 6,8, 0,4 mM EDTA, 4 mM DTT, 0,06% Brij-35)

Nach Zugabe der Substratmischung wurden 20 μl der Testprotein-Tyrosinkinase (in 1 × Assay-Puffer) zugegeben. Die Kinase-Reaktionen wurden 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend im Skatron-Plattenwascher gewaschen. Zu jedem Loch wurden 100 μl biotinylierter monoklonaler PT-66-Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Sigma, St. Luois, MO) (1:4.000 verdünnt in 0,5% BSA, steril filtriertes TBS) gegeben und für weitere 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und es wurden 100 μl Streptavidin-HRP-Konjugat (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA), 1:32.000 verdünnt in 0,5% BSA/steril filtriertem TBS, zu jedem Loch gegeben und noch einmal für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und es wurden 100 μl Tetramethylbenzidin(TMB)-Substratlösung (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) für 15 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben; anschließend wurden 100 μl Stopp-Reagenz (1 M Phosphorsäure) zugegeben. Die Proben wurden dann bei 450 nm in einer Plattenlesevorrichtung gelesen.
Vier Gruppen des marinen Extrakts H (bezeichnet als 979-1, 979-4, 979-5, 979-6) und zwei Gruppen des marinen Extraks DBH (bezeichnet als 5025-11 und 5025-12) zeigten spezifische, niedrig mikromolare Inhibition von JAK3, wobei die ec-50-Werte (wirksame Konzentration für 50%ige Inhibition) im Bereich von 2,6 μM–10,7 μM (Gruppen 979) und 23,4 μM–34,4 μM (Gruppen 5025) lagen (7). Die Inhibition von ZAP-70, LCK, BTK und IGFR war schwach, wobei die ec-50-Werte im Bereich von einigen Hundert Mikromolar lagen oder keine Inhibition vorlag (Daten nicht gezeigt).
Die drei getesteten Formen des synthetischen DBH zeigten ebenso Inhibition von JAK3, wobei die ec-50-Werte im Bereich von 11,60 μM–53,99 μM lagen (8a). DBH-2FB zeigte die stärkste Inhibition von JAK3 im Vergleich zu den zwei Salzformen von DBH (d.h., 11,60 μM). DBH-2FB zeigte sich ebenso als selektiver Inhibitor von JAK3, wobei die ec-50-Werte für ZAP-70, LCK, BTK und IGFR oberhalb von 1971 μM lagen oder keine Inhibition auftrat (8B).
Diese Ergebnisse zeigen, dass DBH und seine verschiedenen Derivate spezifische JAK3-Inhibitoren sind.
BEISPIEL 8: Herunterregulation von OA-assoziierten mRNAs durch DBH (und dessen Varianten) (Referenz)
Um die Stromabwärts(Downstream)-Wirkungen der JAK3-Inhibition durch DBH zu untersuchen, wurden Northern-Blot-Assays durchgeführt, um Veränderungen der Steady-State-mRNA-Niveaus verschiedener OA-assoziierter Moleküle nachzuweisen.
Der gefrorene humane Gelenk-Chondrozyten-Zellstamm HC30-0198 (beschrieben in Beispiel 1) wurde aufgetaut und in Monoschicht in T150-Gewebekulturflaschen (Corning Costar, Cambridge, MA), wie oben beschrieben, bis 1–5 Tage nach Konfluenz kultiviert. Die Testkulturen wurden in PBS gespült und für 2 Stunden mit 10 ml serumfreiem DMEM, enthaltend 5 μM DBH (synthetisch), in seiner freien Basenform oder Trifluoressigsäure-Salzform präinkubiert. Dann wurden zusätzlich 10 ml serumfreies DMEM, enthaltend 5 μM DBH, 4 ng/ml rekombinantes humanes Interleukin-1β (rhIL-1β; Endkonzentration 2 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) und 2% antibiotische Lösung (Endkonzentration 1%), für 24 Stunden zugegeben.
Es wurden zwei Kontroll-Kulturen parallel durchgeführt: eine ohne DBH (rhIL-1β allein) und eine weitere ohne DBH oder rhIL-1β.
Unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD) wurde Gesamt-RNA aus der Monoschicht-Kultur gemäß dem Protokoll des Herstellers gewonnen. 10 μg der Gesamt-RNA aus jeder der obigen Testproben wurde in einem 2,2 M Formaldehyd/1,2%gen Agarose-Gel aufgetrennt und durch schwachen alkalischen Transfer unter Verwendung des TURBOLOTTER^TM-Systems (Schleicher & Schuell, Keene, NH) gemäß dem Protokoll des Herstellers auf eine Nylon-Trägermembran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) überführt. Die Gesamt-RNA wurde auf der Membran unter Verwendung eines Stratalinker^®-1800-UV-Crosslinkers (Stratagene, La Jolla, CA) fixiert.
Humane DNA-Sonden für Stromelysin-1 (MMP3), Kollagenase 1 (MMP1), Cyclooxygenase II (COX2), NF-κB (p65), den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) wurden mit [α³²P] dCTP (New England Nuclear, Boston, MA) unter Verwendung von Ready-To-Go-DNA-Labeling-Beads (-dCTP) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert. Die radioaktiven Sonden wurden von nicht eingebautem [α³²P] dCTP unter Verwendung von CHROMA-SPIN^TM + TE-30-Säulen (Clontech, Palo Alto, CA) getrennt und die gereinigten Sonden für die Northern-Blot-Hybridisierungsexperimente verwendet.
Die Prähybridisierung und Hybridisierung der Northern-Blots mit den radioaktiven Sonden wurde unter Verwendung von ExpressHyb^TM-Hybridisierungslösung (Clontech, Palo Alto, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Der Blot wurde zweimal nacheinander in 2 × SSC/0,05% SDS (15 Minuten/Waschung bei Raumtemperatur) und zweimal in 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen (30 Minuten/Waschung bei 65°C). Der Blot wurde an der Luft getrocknet und das radioaktive Signal unter Verwendung eines Fujifilm-BAS-1500-Phosphorimagers (Fuji, Stanford, CT) visualisiert.
Die Normalisierung der RNA-Beladung wurde durch Ethidiumbromid-Anfärbung des Northern-Blots durchgeführt. 5 μl einer 10-mg/ml-Ethidiumbromid-Lösung (Sigma, St. Louis, MO) wurden zu 50 ml einer 1 × MOPS-Lösung (MESA-Puffer: Sigma, St. Louis, MO) gegeben und 7 Minuten bei Raumtemperatur angefärbt. Der Blot wurde 30 Minuten lang (3 mal) mit 1 × MOPS-Puffer gewaschen. Das Ethidumbromid-Färbungsmuster wurde auf einer Fujifilm-LAW-1000-Intelligent-Dark-Box (Fuji Medical System, USA, Stamford, CT) sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse der Northern-Blot-Experimente (in den 9A und 9B dargestellt) zeigen, dass 5 μM des JAK3-Inhibitors DBH in verschiedenem Ausmaß die IL-1β-induzierte Hochregulation von mRNAs inhibieren kann, von denen bekannt ist oder angenommen wird, dass sie mit der Pathologie von (Osteo)arthritis in Verbindung stehen: Stromelysin (MMP3), Kollagenase 1 (MMP1), Cyclooxygenase II (COX2), NF-κB (p65), Tumornekrosefaktor α (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6).
Interessant ist die unerwartete Beobachtung, dass bei einigen mRNAs die freie Basenform von DBH rhIL-1β-induzierte mRNAs in größerem Ausmaß inhibiert als die Trifluoressigsäure-Salzform von DBH (9A). Diese Beobachtung stimmt mit den in dem Tyrosinkinase-Assay von Beispiel 7 erhaltenen Daten überein.
BEISPIEL 9: DBH-Inhibition von IL-1α-induzierter Aggrecanase-Aktivität in bovinen Chondrozyten (Referenz)
Um die zellulären Wirkungen von DBH als JAK3-spezifischer Inhibitor zu zeigen, wurde die Inhibition von DBH und seinen Varianten durch IL-1α-induzierte Freisetzung von ³⁵S-markiertem Proteoglykan in bovinen Chondrozyten bestimmt. (Es ist bestens bekannt, dass IL-1α-induzierte Proteoglykan-Freisetzung in kultivierten primären bovinen Chondrozyten und Knorpelexplantaten auf eine Spaltung von Aggrecan durch das als Aggrecanase bekannte Enzym zurückzuführen ist.)
Primäre bovine Gelenk-Chondrozyten wurden aus zerkleinertem Gelenkknorpel aus Kniegelenken vom Kalb unter Anwendung einer 30-minütigen Behandlung (bei 37°C) mit 1 mg/ml Hyaluronidase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und einer anschließenden 30- minütigen Behandlung (bei 37°C) mit 2 mg/ml Kollagenase P (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 2,5 mg/ml Trypsin (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) isoliert. Die Enzymlösungen wurden in serumfreiem 1:1 Delbecco's modifiziertem essenziellem Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) hergestellt und mit einem 0,22-μm-Millex^®-GV-Filter (Millipore S. A., Molsheim, France) steril filtriert. Ein dritter Verdau (0,5 mg/ml Kollagenase P bei 37°C) wurde übernacht in einem Bellco-Rührkolben durchgeführt.
Die bovinen Chondrozyten wurden durch Zugabe eines gleichen Volumens an DMEM/F12, supplementiert mit 10% fötalem Kälerserum (FBS) zur Neutralisierung der Enzyme, gewonnen, durch einen 70-μm-Nylon-Falcon^®-Zellfilter (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) filtriert und bei 1000 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Die Chondrozyten wurden in Costar^®-24-Loch-Gewebekultur-Platten (Corning, Corning, NY) mit 8 × 10⁴ Zellen/Loch unter Verwendung von 0,5 ml 1:1 DMEM/F12, 10% FBS, 1% antibiotische Lösung (Penicillin, Streptomycin, Fungizon) (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) ausgesät und bei 37°C, 8% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden für 28 Tage kultiviert, wobei an jedem dritten Tag erneut DMEM/F12 plus 10% FBS, 1% antibiotische Lösung, zugeführt wurde.
Die metabolische Markierung der Proteoglycane wurde an Tag 22 mit 10 μCi ³⁵Sulfat (Amersham, Arlington Heights, IL) in serumfreiem DMEM/F12, 1% antibiotische Lösung für 48 Stunden durchgeführt. Das serumfreie ³⁵Sulfat wurde an Tag 24 entfernt; die Chondrozyten wurden mit PBS gewaschen und es wurde wieder DMEM/F12 plus 10% Serum, 1% antibiotische Lösung, zugeführt. Die Chondrozyten wurden für weitere 2 Tage kultiviert, wobei an Tag 26 wieder DMEM/F12 plus 10% Serum, 1% antibiotische Lösung, zugeführt wurde, und an Tag 27 mit PBS gewaschen.
Nach dem Waschen mit PBS wurden die Chondrozyten mit 0,5 ml serumfreinem DMEM/F12, 1% antibiotische Lösung, enthaltend entweder: 1) keine weiteren Zusatzstoffe oder 2) 5 μM DBH (entweder als DBH1, DBH-2S oder DBH-FB) behandelt. Nach 2 Stunden wurde (mit Ausnahme der "Nicht-rhIL-1α"-Kontrolle) rhIL-1α bis zu einer Endkonzentration von 1 ng/ml zu den Kulturen gegeben.
An Tag 28 wurden 0,5 ml Medium entnommen und in einem Szintillations-Minigefäß platziert. Es wurden 4 ml der Szintillations-Flüssigkeit zugegeben, und die Radioaktivität in dem Medium wurde durch Szintillations-Zählung quantifiziert. Die Zellschicht wurde in PBS gespült und mit 0,5 ml 1 × Trypsin-EDTA geerntet und durch Szintillations-Zählung wie oben quantifiziert. Alle Proben wurden dreifach kultiviert.
Die Daten wurden folgendermaßen bestimmt und ausgedrückt:

1. Hintergrundfraktion_c = Anteil der Gesamt-Radioaktivität (Medium + Zellschicht), welche die Menge an nicht-IL-1-induzierter Radioaktivität, die in das Medium freigesetzt wird, darstellt. = [Gesamt-CPMs im Medium der "Nicht-IL-1α, Nicht-DBH-Kontrolle"/(Gesamt-CPMs im Medium der "Nicht-IL-1α, Nicht-DBH-Kontrolle" + Gesamt-CPMs in der Zellschicht der "Nicht-IL-1α, Nicht-DBH-Kontrolle")]
2. Prozentuale Freisetzung von ³⁵S-markiertem Proteoglycan in das Medium durch IL-1α a) Hintergrund = Counts in dem Medium der Testprobe auf Grund nicht-IL-1-induzierter Freisetzung = Hintergrundfraktion_c [Gesamt-CPM im Testprobenmedium + Gesamt-CPM in der Testprobenzellschicht] b) Durch IL-1α freigesetztes CPM = Gesamt CPM im Medium – Hintergrund c) Prozentuale Freisetzung durch IL-1α = [Durch IL-1α freigesetztes CPM/(durch IL-1α freigesetztes CPM + Gesamt-CPM in der Zellschicht)] 100%
3. Prozentuale Freisetzung durch IL-1α in Gegenwart von DBH = {(Gesamt-CPM in der DBH-Mediumprobe – Hintergrund]/[(Gesamt-CPM in der DBH-Mediumprobe – Hintergrund) + Gesamt-CPM in der DBH-Zellschicht-Probe]} 100%
4. Prozentuale Inhibition durch DBH = [1-(% Freisetzung durch IL-1α in Gegenwart von DBH/% Freisetzung durch IL-1α] 100%

Die drei Formen des synthetischen DBH (d.h., DBH1, DBH-2S oder DBH-FB) zeigten verschiedene Inhibitionsgrade der IL-1α-induzierten Freisetzung von ³⁵S-markiertem Proteoglycan: ~50%, ~40% bzw. 100% (10). Wiederum lagen die durch die freie Basenform von DBH als Inhibitor erhaltenen Ergebnisse dramatisch über denen der anderen beiden DBH-Formen.
BEISPIEL 10: Herunterregulation von OA-assoziierten mRNAs durch die Verbindung WHI-P131
Um zu zeigen, dass DBH und dessen verwandte Verbindungen als wirksames OA-Therapeutikum durch Wirkung als JAK3-spezifischer Inhibitor operieren, und um die Wirksamkeit von JAK3-Inhibitoren allgemein als Inhibitoren OA-assoziierter Verbindungen und somit als neue Klasse von OA-Therapeutika zu bestätigen, wurde die Inhibition verschiedener OA-assoziierter mRNAs durch den bekannten JAK3-spezifischen Inhibitor 4-(4'-Hydroxyphenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin (ebenso als WHI-P131 bezeichnet) bewertet.
Normale humane Gelenk-Chondrozyten wurden aus Knorpelschnitten isoliert und wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert. Es wurden mRNA-Inhibitions-Experimente identisch zu den in Beispiel 8 beschriebenen Protokollen durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der JAK3-spezifische Inhibitor WHI-P131 (4-(4'-Hydroxyphenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, bezogen von A. G. Scientific, San Diego, CA), anstelle von DBH verwendet wurde. Es wurden zwei Konzentrationen von WHI-P131, solubilisiert in DMSO, getestet: 33,6 μM und 168 μM.
Die Ergebnisse des Northern-Blot-Experiments (in 11 dargestellt) zeigen, dass die Behandlung des JAK3-spezifischen Inhibitors WHI-P131 sowohl mit 33,6 μM als auch mit 168 μM die IL-1β-induzierte Hochregulation von mRNAs, von denen bekannt ist oder angenommen wird, dass sie mit der Pathologie von (Osteo)arthritis in Verbindung stehen, inhibiert: d.h., Stromelysin-1 (MMP3), Kollagenase 1 (MMP1), Cyclooxygenase II (COX2) und NF-κB (p65).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Techniken, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie bestens bekannt und in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind:

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Claims

Verwendung einer Verbindung, die JAK-3 inhibiert, die nicht Hymenialdisin (H) oder Debromohymenialdisin (DBH) ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung des Fortschreitens oder der Wahrscheinlichkeit, primäre generalisierte Osteoarthritis zu entwickeln.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung, die JAK-3 inhibiert, 4-(4'-Hydroxyphenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin (WHI-P131) ist.