KR101632111B1

KR101632111B1 - 골다공증 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101632111B1
Application number: KR1020140097646A
Authority: KR
Inventors: 오재민; 이명수; 김주영
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2014-07-30
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2016-06-20
Also published as: KR20160015113A

Abstract

본 발명은 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 있어, WHI-131을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 NFATc1유전자 발현을 억제함으로써 파골세포 분화를 억제 및 RANKL에 의해서 유도되는 초기 신호전달 체계를 구성하는 유전자들의 인산화를 억제하는 효과가 있다.
또한, 생체내에서 LPS-유도 calvaria 골소실에 대한 치유효과 및 조골세포 분화 및 조골세포 유전자 마커의 mRNA발현을 촉진하는 효과가 있다.

Description

골다공증 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing and treating osteoporosis}

본 발명은 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 WHI-131((4-(4'-히드록시페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린))을 유효성분으로 함유하여 파골세포의 분화를 억제하며 조골세포 분화 및 조골세포 유전자 발현을 촉진하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

골다공증(骨多孔症)은 뼈 미세구조의 질적인 변화로 인해 뼈의 통합성과 강도가 약화되어 척추와 대퇴, 요골 등의 골절 위험도가 증가되는 대사성 질환이다.

최근 급속한 경제성장과 의학의 발전은 고령화 사회로의 진입을 가속시키고 있으며, 이에 따른 관련된 만성질환으로 고통 받는 노인 인구가 빠르게 증가하고 있다. 노인인구의 증가에 따라 더불어 나타나는 대표적인 질환이 골다공증이다. 퇴행성 골다공증은 주변에서 흔히 볼 수 있는 것으로, 미국의 경우 전체 인구의 10%가 골다공증에 의해 골격 부피가 줄어들어 있음이 보고되고 있고, 해마다 골다공증에 의한 골절환자의 발생률이 늘면서 연간 의료비도 계속 늘어나고 있는 추세이다. 동양 여성의 경우 골밀도가 서양 여성에 비해 낮고, 폐경기 여성의 절반 정도가 척추골절을 보이고 있고, 칼슘 섭취가 낮고, 육체적 활동이 서양여성에 비해 적은 것으로 미루어 보아 서양보다 더 큰 문제가 될 것으로 예상할 수 있다

뼈는 살아 있는 조직이기 때문에 오래된 뼈는 일정하게 파괴되고 다시 새로운 뼈를 만들어내는 재형성 과정을 거친다. 이러한 과정 중에서 파골세포는 오래되어 불필요하게 된 뼈 조직을 파괴하여 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지할 수 있도록 도와주고 조골세포는 파괴된 뼈를 다시 재생시키는 역할을 한다. 이 작용은 하루 24시간 계속 일어나며 1년에 성인의 뼈의 약 10 - 30%가 이런 식으로 다시 만들어진다. 그러므로 파골세포와 조골세포 간의 균형은 매우 중요하며, 이 균형은 여러 호르몬과 기타 몸의 화학 성분 등에 의해 조절된다. 폐경기 이후 여성이나 노인 남성의 경우 파골세포와 조골세포 간의 균형이 깨져 파골세포가 과다 증식해 뼈의 칼슘이 많이 빠져나가 골성분이 부족한 골다공증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 골다공증 예방과 치료를 위해서 파골세포에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.

세계보건기구(WHO)는 골다공증을 골강도의 약화로 골절의 위험성이 증가하게 되는 골격계질환으로 정의하고 있으며, 골강도는 골량과 골질에 의해 결정된다. 골량은 20대 중반 또는 30대 초반의 청장년 시기에 일생 중 최대 골량이 형성되고 그 이후 연령 증가에 따라 골 손실이 진행된다. 30대에서 50대까지는 대체로 골량이 유지되며, 이는 오래된 뼈는 제거되는 골흡수와 새로운 뼈를 형성하는 골형성이 항상성이 이루어지기 때문이다.

골(bone)은 형성과 흡수가 지속적으로 일어나는 역동적인 조직으로 여러 가지 종류의 자극에 반응한다. 이런 골 대사는 조골세포(osteoblast)와 파골세포(osteoclast)의 활성정도에 따라 오래된 뼈가 파괴, 흡수되거나 새로운 뼈가 형성되는데, 정상적인 경우 이들 세포의 상호작용에 의해 골개조(bone remodeling)가 일어난다. 하지만, 이러한 골흡수와 골형성의 항상성은 여성의 경우 폐경 이후 급격한 골 손실이 더 일어나게 되어 균형이 깨지기 쉬우며, 노화로 골 형성 기능이 퇴화됨에 따라 골손실이 지속됨에 따라 골다공증이 일어나게 된다. 골다공증은 초기에 급격히 진행되는데 골흡수로 인해 골 손실이 일어나게 되지만, 골형성이 불충분하여 일어나기도 하므로 조골전구세포가 조골세포로 분화하는 능력에 의해서도 결정된다. 이에 조골세포의 분화를 촉진하거나 파골세포의 분화를 억제하여 골흡수를 감소시키는 것이 필요하다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 파골세포의 분화를 억제하며 조골세포 분화 및 조골세포 유전자 발현을 촉진하는 WHI-131을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 있어, WHI-131을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 농도 의존적으로 Trap 양성 파골세포의 형성이 억제되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. .

또한, 본 발명에서는 파골세포의 액틴링 형성과 골 흡수능을 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 파골세포 분화에 있어 핵심적인 기능을 하는 NFATc1의 mRNA와 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 RANKL에 의해서 유도되는 초기 신호전달 체계를 구성하는 유전자들의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 인산화가 억제되는 상기 초기 신호전달 체계를 구성하는 유전자는 AKT, IkB, GSK3b 및 STAT6인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 ALP 활성 증가를 통해 초기 조골세포 분화 및 광물화 증가를 통한 후기 조골세포 분화를 증진하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 WHI-131을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 역시 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 WHI-131을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 이용하여 골다공증의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 WHI-131을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물은 파골세포의 액틴링 형성과 골 흡수능을 억제하며, NFATc1유전자 발현을 억제함으로써 파골세포 분화를 억제 및 RANKL에 의해서 유도되는 초기 신호전달 체계를 구성하는 유전자들의 인산화를 억제하는 효과가 있다.

또한, 생체내에서 LPS-유도 calvaria 골소실에 대한 치유효과 및 조골세포 분화 및 조골세포 유전자 마커의 mRNA발현을 촉진하는 효과가 있다.

도 1은 WHI-131이 파골세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 마우스 골수유래대식세포 BMM에 M-CSF와 RANKL을 첨가하여 파골세포 분화를 유도하는 실험 조건에 WHI-131을 농도별로 처리하여 얻은 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 WHI-131의 농도에 따른 파골세포의 액틴링 형성과 골 흡수능에 대한 실험 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 WHI-131이 파골세포 분화에 있어 핵심적인 기능을 하는 NFATc1유전자의 발현에 미치는 영향을 mRNA와 단백질 발현을 통해 확인 해 본 결과를 나타내는 그림이다.
도 4는 p38, JNK, Akt 및 전사인자 NF-kB를 포함하는, RANKL-유도 조기 신호화 경로와 관련된 신호 단백질이 WHI-131에 의한 파골세포형성의 억제에 관련되는지 여부를 알아내기 위한 실험의 결과를 나타내는 그림이다.
도 5는 LPS-유도 마우스 calvaria 골소실 모델을 사용하여, 마우스에 LPS를 WHI-131과 함께 또는 WHI-131 없이 calvaria에 국소적으로 주사하여 파골세포의 형성 및 골소실을 관찰한 실험 결과를 나타내는 그림이다.
도 6은 1차 조골세포에 대한 WHI-131의 효과 검증 실험을 하였기위해서, 1차 조골세포를 이용한 7일간의 분화에서 초기 분화 마커인 ALP의 형성을 염색과 활성을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림(A,B) 및 조골세포 형성 동안 WHI-131에 의한 미네랄화 효과를 시험하기 위해 조골세포에서 배양 21일 후에 ARS 염색 분석을 수행한 결과를 나타낸 그림이다(A,C). 또한, 추가적으로 조골세포 분화와 관련된 유전자들의 발현에 미치는 WHI-131의 효과 검증 실험결과를 나타낸 그림이다(D-G).

이하, 본 발명의 도면을 참조하여 상세하게 설명하고자 한다.

본 발명은 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 있어, 하기의 화학식 1로 나타나는 WHI-131을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

WHI-131(4-(4'-히드록시페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린)은 세포 투과성이 있으며, JAK1, JAK2, 또는 기타 단백질 타이로신 키나아제의 효소 활성에 영향을주지 않고 선택적으로 78 M의 IC 50 값 JAK3의 티로신 키나아제 활성을 억제한다. 또한 신경 세포로 쥐의 골수 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포)를 유도하는 데 도움이되는 것과 비정상적 ROS 발현 및/또는 활성에 기초하는 폐암에서 ROS-억제 치료제로 알려져 있다.

본 발명에서 골다공증 예방 및 치료와 관련하여 발명자는 WHI-131이 조골세포의 분화를 촉진하거나 파골세포의 분화를 억제하여 골흡수를 감소시키는 효과가 있음을 밝혀 내었다.

WHI-131은 농도에 의존적으로 TRAP 양성 파골세포의 형성을 의미 있게 억제한다. 파골세포 분화에 있어 표지유전자로 알려진 TRAP과 OSCAR 의 mRNA발현을 현저히 억제하는 것을 확인 하였다.

또한, WHI-131은 파골세포의 액틴링 형성과 골 흡수능을 억제하였고, 파골세포 분화에 있어 핵심적인 기능을 하는 NFATc1유전자의 발현에 미치는 영향을 mRNA와 단백질 발현을 모두 유의하게 억제하는 것으로 나타났다.

또한, WHI-131은 RANKL에 의해서 유도되는 초기 신호전달 체계를 구성하는 유전자들의 인산화를 억제하며, ALP 활성 증가를 통해 초기 조골세포 분화 및 광물화 증가를 통한 후기 조골세포 분화를 증진시키는 것도 확인하였다.

본 발명의 골다공증 예방 및 치료용 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구,직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 WHI-131을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 역시 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 경피흡수제, 겔제, 로션제, 연고제, 크림제, 첩부제, 카타플라스마제, 페이스트제, 스프레이, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, “기능성식품(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 본 발명에서 용어, “건강식품(health food)"은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다. 상기 식품은 간 기능 개선 및 회복에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

이러한 기능성 식품의 구체적인 예로, 상기 조성물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다. 상기 조성물을 포함하는 건강기능성 식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 마아가린, 지방 지속성(fat continuous) 또는 물 지속성(water continuous) 또는 양쪽 지속성(bicontinuous) 스프레드, 지방 감소된 스프레드, 초콜렛, 초콜렛 코팅, 초콜렛 속(fillings) 또는 베이커리 속인 과자류, 아이스크림, 아이스크림 코팅, 아이스크림 함유물, 드레싱, 마요네즈, 치즈, 크림 대체물, 건조 스프, 드링크, 시리얼 바, 소스, 스낵바, 유제품, 임상 영양식품, 소아용 식품 등의 형태로 제조된 것을 사용할 수 있다.

다음에 소개되는 실시예들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 설명된 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.

재료 및 방법

1) 시료 및 실험재료

WHI-131은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 재조합 용해 인간 M-CSF(Recombinant soluble human)와 RANKL은 PeproTech Ltd. (London, UK)사의 제품을 사용하였다. 항-Akt, 항-phospho-Akt, 항-p38, 항-phospho-p38, 항-JNK, 항-phospho-JNK, 항-phospho-IkB, 항-GSK3b, 항-phospho-GSK3b, 항-phospho-PLCγ2, 항-STAT1, 항-phospho-STAT1 (Ser727), 항-STAT3, 항-phospho-STAT3 (Tyr705), 항-phospho-STAT3 (Ser727), 항-phospho-STAT5 (Tyr694) 및 항-phospho-STAT6 (Tyr641)은 Cell signaling Technology Inc. (Beverly, MA, USA)사에서 구입하였고, 항-c-Fos, 항-NFATc1, 항-IkB, 항-STAT3, 항-STAT5, 항-STAT6, 항-PLCγ2, 항-smad1/5/8 및 항-phospho-smad1/5/8에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)의 제품을 이용하였다. β-actin 항체와 TRAP kit는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)사의 제품을 이용하였다. XTT 어쎄이 킷은 Roche (Indianapolis, IN, USA)에서 구입하였다. 세포배양에 필요한 α-MEM, FBS 및 ㅎ하항생제(antibiotics; 페니실린/스트렙토마이신)는 Gibco-BRL (Grand Island, NT, USA)에서 구입하였다.

2) 조골세포 분화

수컷 5주령 ICR 마우스의 골수기질세포(bone marrow stromal cells, BMSC)를 정제하여 실험에 이용하였다. 마우스의 골수세포를 6일간 부착 시킨 뒤, α-MEM 배지에 10% FBS와 1% 항생제(antibiotics; 페니실린/스트렙토마이신)를 첨가하여 배양하였고, 분화를 위해 10 mM -glycerol phosphate (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)와 50 ㎍/mL의 아스코빅산(ascorbic acid(Sigma Aldrich St. Louis, MO, USA))를 첨가하여 사용하였으며, 3일마다 배지를 교환하였다.

3) 파골세포 분화

수컷 5주령 ICR마우스를 100% CO₂가스를 이용하여 안락사 시킨 뒤 대퇴골과 경골을 분리하였다. 분리된 경골과 대퇴골의 양끝을 절단한 뒤 1 ml 주사기로 골수 강 내의 세포를 채취하고 red blood cell lysis buffer (RBCL)을 이용하여 적혈구를 용해시켜 제거하였다. 얻어진 골수세포를 10% FBS, M-CSF (30 ng/mL)가 포함된 α-MEM 배지에서 3일간 배양하였다. 배양 3일 후, 부착된 세포를 대식세포로 실험하였다. 파골세포로의 분화를 위해 대식세포에 M-CSF (30 ng/mL)와 RANKL (100 ng/mL)을 처리하고, WHI-131을 농도별로 처리하여 3일간 배양하였다. 3일 후, 배양한 세포를 TRAP용액으로 염색하고 염색된 세포를 파골세포로 판단하였다.

4) 독성검사

96well plate에 대식세포를 110⁴/well의 밀도로 200 uL씩 분주하고 WHI-131과 M-CSF (30 ng/mL)를 농도 별로 첨가하여 3일간 배양하였다. 배양 3일 후, XTT 용액 50 uL를 각각의 well에 첨가하고 4시간 배양하였고, 그 후 흡광도 측정기(Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5) Real-Time PCR 분석

배양된 세포에서 TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, UsA)용액으로 제조사의 매뉴얼에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 1 ㎍은 dNTP, oligo dT primer, buffer, dithiothreitol, Superscript II reverse transcriptase 와 RNase inhibitor를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 아래의 프라이머(primer를 이용하여 PCR 증폭을 시행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 10초 동안 그리고 60 ℃에서 20초 동안의 반응을 40 cycles를 반복하여 증폭시켰다.

c-Fos sense, 5-GGTGAAGACCGTGTCAGGAG-3' 및

c-Fos antisense, 5'-TATTCCGTTCCCTTCGGATT-3';

NFATc1 sense, 5'-GAGTACACCTTCCAGCACCTT-3' 및

NFATc1 antisense, 5'-TATGATGTCGGGGAAAGAGA-3';

TRAP sense, 5'-ACTTCCCCAGCCCTTACTACCG-3' 및

TRAP antisense, 5'-TCAGCACATAGCCCACACCG-3';

OSCAR sense, 5'-GGAATGGTCCTCATCTCCTT-3' 및

OSCAR antisense, 5'-TCCAGGCAGTCTCTTCAGTTT-3';

Cathepsin K sense, 5'-CCAGTGGGAGCTATGGAAGA-3' 및

Cathepsin K antisense, 5'-CTCCAGGTTATGGGCAGAGA-3';

DC-STAMP sense, 5'-GCAAGGACCCCAAGGAGTCG-3' 및

DC-STAMP antisence, 5-CAGTTGGCCCAGAAAGAGGG-3';

ALP sense, 5-GCTGATCATTCCCACGTTTT-3' 및

ALP antisense, 5'-ACCATATAGGATGGCCGTGA-3';

Runx2 sense, 5-TGCCTTCAGCACCCTATACC-3' 및

Runx2 antisense, 5'-AGGTTGGAGGCACACATAGG-3';

OCN sense, 5-CTTGGGTTCTGACTGGGTGT-3' 및

OCN antisense, 5'-ACCTTATTGCCCTCCTGCTT-3';

OPN sense, 5-TCTGATGAGACCGTCACTGC-3' 및

OPN antisense, 5'-CCTCAGTCCATAAGCCAAGC-3';

GAPDH sense, 5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3' 및

GAPDH antisense, 5'-AGTGGGAGTTGCTGTTGAAGT-3'

6) Western blot 분석

배양된 세포는 lysis buffer (50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, protease inhibitors)를 이용하여 용해하고 원심분리하여 순수한 단백질을 얻었다. 단백질은 DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules,CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10% SDS-polyacrylamide gel에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막(Amersham Biosciences)으로 옮기고 PVDF 막은 5% non-fat dry milk를 처리하여 비 특이 단백질이 붙는 것을 방지하였다. 그리고 1차 항체 및 2차 항체를 처리했다. TBS-T 완충용액으로 PVDF막을 세척하여 enhanced chemiluminescence를 이용해 단백질 발현을 관찰했다.

7) 액틴링 형성 분석

마우스 골수유래대식세포를 M-CSF (30ng/mL), RANKL (100ng/mL) 그리고 WHI-131을 첨가하여 3일 동안 배양한 후 3.7% 포름알데히트로 20분간 세포를 고정한 뒤 0.1% Triton X-100 으로 10분간 반응한 뒤 rhodamin-conjugated phalloidin을 10분간 반응한 뒤 F-엑틴의 형광 이미지를 Leica 형광 현미경으로 관찰 및 획득하였다.

8) 골흡수능 분석

골수세포 (BMCs)와 초대 조골세포(primary osteoblast cells)를 콜라겐 젤로 도포한 배양접시에 10^-8 M 1,25-dihydroxyvitamin D3 (Sigma)와 10^-6 M prostanglandin E2 (PGE2) (Sigma)을 첨가하여 7일 동안 배양하여 성숙한 파골세포를 형성시킨다. 이렇게 형성된 파골세포를 0.1% collagenase (Gibco-BRL)를 사용하여 37 ℃에서 10분간 반응하여 떼어낸 뒤 상아절편 또는 하이트록시아파타이트 코팅 플레이트 (Corning, NY, USA)에 옮겨 WHI-131 투여 후 배양한다. 24시간 내지는 48시간 후에 세포를 제거하고 파골세포에 의해 형성 된 골흡수 영역 및 골흡수능을 분석하였다.

9) siRNA와 레트로 바이러스 정제 및 감염법

레트로 바이러스 정제를 위해 pMX와 c-Fos, NFATc1, costantively active (CA)-AKT 그리고 CA-Ikkβ가 포함 된 벡터를 X-tremeGENE9 (Roche, Nutley, NJ, USA)를 이용해 plat E cell에 transfection하였다. 48시간 배양 후 polybrene (10ng/mL)를 첨가한 상등액을 골수유래대식세포에 감염 시킨 후 6시간 배양한 뒤 M-CSF (30ng/mL), RNAKL (100ng/mL) 그리고 WHI-131을 처리하여 3일간 배양하였다. JAK3 siRNA를 마우스 골수유래대식세포에 도입하기 위해 JAK3 siRNA (Invitrogen, San Diego, CA, USA)를 lipofectamin3000 (Invitrogen)을 이용해 transfection하였다. M-CSF (30ng/mL)와 RNAKL (100ng/mL)을 처리하여 JAK3 유전자의 mRNA 발현을 확인하기 위해 24 시간을 배양하거나, 파골세포 분화를 위해 3일간 배양하여 각 실험에 사용하였다.

10) [Ca2+]i 측정

골수유래대식세포를을 M-CSF (30ng/mL) 처리하여 cover slips (22X22, 6X10⁴ cells/slip)에 분주하여 24시간 동안 배양한 뒤, WHI-131 (5 ㎍/mL)과 RANKL (100ng/mL)를 추가고 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 세포에 5mM Fura-2/AM을 처리하고 실온에서 50분 동안 반응한 뒤 bath 용액으로 세척하였다. Fura-2/AM 형광의 강도를 측정하기 위해 세포를 340nm와 380 nm에서 순차적으로 반응하고, 형광을 510nm (ratio=F340/F380)에서 발산시켜 charge-coupled device camera.를 이용하여 영상을 획득하였다. 영상은 MetaFluor software (Universal Imaging)을 이용하여 분석하였다.

11) LPS-유도된 마우스 두개골 골소실 모델 및 치료

ICR 마우스를 5마리씩 3개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 세 개의 실험군은 포스페이트-완충 식염수(PBS) 처리 그룹(대조군), LPS 처리 그룹 그리고 LPS 및 WHI-131 동시 처리군으로 나누었다. LPS 주사는 (500 ㎍/마우스)를 마우스 두개골 눈 위쪽 부위에 DMSO 또는 WHI-131(10 ㎍/kg)과 함께 주사하였고, LPS는 투여 0, 5일 째 총 2회 실시 하였고, WHI-131은 매일 투여하였다. 실험은 9일째 종료하여 마우스를 경추 탈골법에 의해 희생시킨 후 고해상도 마이크로컴퓨터 단층촬영(μ-CT) 분석을 수행하였다. 분석 후 마우스의 calvaria을 분리하여 TRAP 염색을 실시하여 개체의 이미지를 획득하였다.

결과

결과 1

WHI-131은 파골세포 분화를 억제함

WHI-131이 파골세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 마우스 골수유래대식세포에 M-CSF(macrophage-colony stimulation factor)와 RANKL(receptor activator of nuclear factor-kB ligand)을 첨가하여 파골세포 분화를 유도하는 실험 조건에 WHI-131을 농도별로 처리하여 그 효과를 확인하였다.

그 결과 M-CSF와 RANKL만을 처리한 대조군에 비해 WHI-131을 같이 처리한 경우, 농도 의존적으로 TRAP 양성 파골세포의 형성이 의미 있게 억제되었고(도. 1A-C), 5개 이상의 핵을 가지고 있는 형태의 다핵성 파골세포의 수도 WHI-131에 의해 의미있게 감소됨을 확인할 수 있었다(도. 1C). 또한 WHI-131에 의한 세포독성에 영향이 있는지 규명하기 위해 XTT검사를 실시하였다. 그 결과 파골세포 억제 효과가 WHI-131의 세포에 대한 독성에 의한 것이 아님을 확인할 수 있었다(도. 1D). 파골세포 분화에 있어 표지유전자로 알려진 TRAP과 OSCAR 의 mRNA발현도 대조군에 비해 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도. 1E,F). 마우스의 BMM에서 유도된 파골세포 분화의 억제효과와 더불어 인간골수세포(HBMC)에서 M-CSF와 RANKL-유도에 의한 파골세포 분화에 있어서도 역시 대조군에 비해 WHI-131를 첨가한 군에서 유의하게 억제함을 확인하였다(도. 1H).

한편, WHI-131은 통상적으로 JAK3 유전자 특이적 억제제로 역할 할 수 있다. 그래서 JAK3 siRNA를 이용하여 JAK3유전자의 기능이 억제되었을 때 파골세포 분화에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다. 그 결과, 골수세포 유래의 M-CSF, RANKL-유도의 파골세포 분화에 있어 JAK3 siRNA에 의한 유전자의 발현이 억제되었을 때의 파골세포 분화는 흥미롭게도 그 분화가 현저히 촉진되는 WHI-131과 상반되는 경향을 보였다. 이로써 M-CSF, RANKL로 유도되는 파골세포 분화에 관한 본 실험에서는 WHI-131이 JAK3 특이적 저해제로서 파골세포 분화에 미치는 영향보다는 WHI-131 자체 약물이 파골세포 분화에 미치는 영향에 대해 초점을 두고 다음 실험을 진행하였다.

결과 2

WHI-131은 파골세포의 액틴링 형성과 골 흡수능을 억제함

파골세포 분화가 진행되면서 형성되는 성숙한 파골세포는 골흡수를 도모함으로써 뼈의 항상성을 유지하는데, 그러한 기능을 형성, 유지하는데는 구조적으로 견고한 액틴링을 형성함으로써 비로소 정상적인 골 흡수능이 촉진되게 된다. M-CSF와 RANKL에 의한 파골세포 분화로 대조군에서는 견고하고 뚜렷한 액틴링이 파골세포 가장자리 부분에 형성된 것과 대조적으로 WHI-131에 의해서 농도 의존적으로 파골세포 분화가 억제되는 동시에 액틴링 형성에 결함이 있는 것을 확인할 수 있었다(도. 2A). 골흡수능을 확인하는 실험에서도 역시 하이드록시아파타이트 코팅 플레이트와 상아절편에서의 골흡수능을 본 결과, 모두 대조군와 유의하게 WHI-131에 의해서 골흡수능이 억제됨을 확인하였다(도. 2B-E).

결과 3

WHI-131은 NFATc1 유전자 발현 억제함으로써 파골세포 분화를 억제함

WHI-131이 파골세포 분화에 있어 핵심적인 기능을 하는 NFATc1유전자의 발현에 미치는 영향을 mRNA와 단백질 발현을 통해 확인 해 본 결과, WHI-131이 c-Fos와 NFATc1의 mRNA와 단백질 발현을 모두 유의하게 억제하는 것으로 나타났고(도. 3A-C), WHI-131에 의하여 억제되었던 파골세포 분화양상이 c-Fos와 NFATc1 레트로 바이러스를 이용한 각 유전자의 도입으로 인해 일부 회복되는 것으로 보아 (도. 3D-G) WHI-131에 의한 파골세포 분화 억제 작용 기전이 c-Fos와 NFATc1의 유전자의 발현을 억제하는 것과 관련이 있음을 다시 한 번 확인하였다. 파골세포 분화가 진행됨에 따라 나타나는 파골세포 지표 유전자들의 발현변화를 mRNA 수준에서 살펴 본 결과, RANKL에 의해서 증가되었던 DC-STAMP, OC-STAMP, ATP6v0d2 그리고 CtsK 등의 파골세포 분화 지표 유전자들이 WHI-131에 의해서 그 발현이 현저히 감소하는 것으로 나타났다(도. 3H-K).

결과 4

WHI-131은 RANKL에 의해서 유도되는 초기 신호전달 체계를 구성하는 유전자들의 인산화 억제함

p38, JNK, Akt 및 전사인자 NF-kB를 포함하는, RANKL-유도 조기 신호화 경로와 관련된 신호 분자가 WHI-131에 의한 파골세포형성의 억제에 관련되는지 여부를 알아내기 위하여 조사하였다. BMM에서 RANKL-유도 반응에 의해 5분에서 인산화가 촉진되던 것이 WHI-131에 의해 p38, JNK, ERK, STAT1 (Ser), STAT3(Tyr) 그리고 STAT3 (Ser)인산화는 변화 없었으나, AKT, IkB degradation, GSK3b 그리고 STAT6의 인산화를 억제하는 것으로 보여 WHI-131의 파골세포 분화 억제 기전은 AKT, IkB degradation, GSK3b 그리고 STAT6의 인산화를 억제하는 것과 연계되었음을 확인하였다(도. 4A,B). 더불어 CA-AKT와 CA-Ikkβ레트로 바이러스 시스템을 이용한 유전자의 도입에 의해 상실되었던 유전자의 기능이 일부 회복되는 것으로 보여 이것 역시 WHI-131에 의한 파골세포 분화는 AKT와 Ikkβ인산화 억제기전과 연계되었음을 확인하였다(도. 4C,D). 파골세포 분화에 핵심 유전자 기능을 하는 NFATc1 발현에 영향을 주는 요인으로 생체내에 존재하는 칼슘이온 농도가 NFATc1 발현에 중요한 역할을 하는데, 이는 PLCγ2의 인산화가 촉진됨으로 인해 NFATc1 전사가 증가되는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서도 RANKL에 의해 PLCγ2의 인산화가 증가되었던 것이 WHI-131에 의해 그 인산화가 현저히 억제되었고, 세포내 칼슘 파동에 영향을 주는 것으로 나타나 이러한 억제 기전들이 총체적으로 NFATc1의 전사를 음성적으로 조절함으로써 일어나는 일임을 확인할 수 있었다(도. 4F,F).

결과 5

WHI-131은 생체내에서 LPS-유도 calvaria 골소실에 대한 치유 효과가 있음

본 실험에서는 파골세포 분화에 대한 WHI-131의 시험관내 효과가 생체 내에서도 확인될 수 있는지 여부가 calvaria에 국소적인 투여를 통해 이루어졌다. 이 실험을 위해 LPS-유도 마우스 calvaria 골소실 모델을 사용하였다. 마우스에 LPS를 WHI-131과 함께 또는 WHI-131 없이 calvaria에 국소적으로 주사하였다. LPS 주사된 마우스는 calvaria에 심각한 염증과 파골세포 형성 및 골소실이 관찰되었고, LPS-유도 calvaria 골소실은 WHI-131와 LPS를 병행 투여 한 마우스의 calvaria 골소실 및 염증, 파골세포 형성이 현저히 감소하였음을 TRAP 염색과 μ-CT를 통해 관찰하였다(도. 5A,B). 이로써 WHI-131은 생체내에서 파골세포 형성 및 골의 재흡수에 대한 억제 효과를 가진다는 결론을 내릴 수 있었다.

결과 6

WHI-131은 조골세포 분화 및 조골세포 유전자 마커의 mRNA 발현 촉진함

뼈의 항상성은 파골세포에 의한 골의 재흡수와 조골세포에 의한 골의 형성의 균형에 의해 이루어진다. 이 때문에 1차 조골세포에 대한 WHI-131의 효과 검증 실험을 하였다. 1차 조골세포를 이용한 7일간의 분화에서 초기 분화 마커인 ALP의 형성을 염색과 활성을 통해 확인하였다. WHI-131에 의해 ALP의 발현 및 활성이 5 ㎍/mL 농도에서 상당한 증가를 보였다(도. 6A,B). 이는 WHI-131이 ALP 활성 증가를 통해 초기 조골세포 분화를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 조골세포 분화는 후기 단계에서 세포외 바탕질(ECM)의 광물화를 형성한다. 조골세포 형성 동안 WHI-131에 의한 광물화 효과를 시험하기 위해 조골세포에서 배양 21일 후에 ARS 염색 분석을 수행하였다. WHI-131에 의해 바탕질 광물화를 위한 ECM 칼슘 침착이 대조군에 비해 5 ㎍/mL 농도에서 상당한 증가를 보였다(도. 6A,C). 이들 결과는 WHI-131이 ALP 활성 증가를 통해 초기 조골세포 분화 및 미네랄화 증가를 통한 후기 조골세포 분화를 증진시킨다는 결론을 내랄 수 있었다. 또한 추가적으로 조골세포 분화와 관련된 유전자들의 발현에 미치는 WHI-131의 효과 검증 실험을 하였다. Runx2, ALP, OPN의 발현 수준은 WHI-131을 처리하진 않은 대조군과 비교하여 그 발현이 증가하였지만, OCN의 발현은 대조군과 차이를 보이지 않았다(도. 6D-G). 다음으로 조골세포 내의 신호 전달에 있어 WHI-131의 영향을 보는 실험을 하였다. 그 결과 조골세포 신호 전달 체계에 있어 WHI-131은 AKT, p38, Smad1/5/8 그리고 STAT6의 인산화를 증가시키는 것으로 보여졌고, STAT3(Ser)의 인산화에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 이로써 WHI-131은 초기 조골세포의 분화에 AKT, p38, Smad1/5/8 그리고 STAT6의 인산화를 증가시키고, Runx2, ALP, OPN의 발현 수준을 올림으로써 조골세포 분화 촉진을 도모한다는 결론을 내릴 수 있었다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

골다공증 치료용 약학적 조성물에 있어, 하기의 화학식 1로 나타나는 WHI-131을 유효성분으로 포함하는 골다공증 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 농도 의존적으로 트랩(Trap) 양성 파골세포의 형성이 억제되는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 파골세포의 액틴링 형성과 골 흡수능을 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 파골세포 분화에 있어 핵심적인 기능을 하는 NFATc1의 mRNA와 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 RANKL에 의해서 유도되는 초기 신호전달 체계를 구성하는 유전자들의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 약학적 조성물.
제 5항에 있어서,
인산화가 억제되는 상기 초기 신호전달 체계를 구성하는 유전자는 AKT, IkB, GSK3b 및 STAT6인 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 ALP 활성 증가를 통해 초기 조골세포 분화 및 광물화 증가를 통한 후기 조골세포 분화를 증진하는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 골다공증 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 골다공증 치료용 약학적 조성물.
골다공증 예방용 건강기능식품에 있어, 청구항 1의 상기 화학식 1로 나타나는 WHI-131을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방용 건강기능식품.