KR102633492B1 - 해조류 유래 sps-cf를 유효성분으로 포함하는 임플란트 코팅제 조성물 - Google Patents
해조류 유래 sps-cf를 유효성분으로 포함하는 임플란트 코팅제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)를 유효성분으로 포함하는 임플란트 코팅제 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)를 유효성분으로 포함하는 임플란트 코팅제 조성물에 관한 것이다.
최근 저출산 및 평균수명 증가에 의해 국내사회는 고령화 시대에 접어들고 있고, 이로 인한 노인 복지 및 보건의료 수요도 함께 증가하고 있다. 특히, 고령화의 진행에 따라 노인성 질환의 치료에 대한 관심이 많이 증대되고 있다. 2014년 건강보험통계연보에 따르면, 65세 이상 노인이 의료기관에서 가장 많이 치료를 받은 외래 다발성 질병 중 1위는 본태성 고혈압으로 235만7천명, 2위는 치은염 및 치주질환으로 185만 5천명을 기록하고 있다. 2위로 집계된 치은염 및 치주질환은 심할 경우, 임플란트 시술로 치료를 권장하고 있으며, 2014년 보건복지부는 75세 이상 의료급여 수급자 대상에게 임플란트 시술 비용을 지원한다고 발표하였으나 2015년에는 70세 이상, 2016년에는 65세 이상으로 대상범위를 확대하여 의료보장을 강화함으로써 고가의 임플란트 시술 수요를 증가시켰다.
한편, 노인뿐만 아니라 65세 이하 청장년층에서도 변화된 식습관으로 인한 치주질환 증가, 미관상의 이유 등으로 임플란트 시술이 보편화되고 있으며 세계 치과용 임플란트의 연간 만명당 보급 현황에서 우리나라가 225개로 1위로 보고되면서 국내 임플란트 시장이 점차 확대될 것으로 예상되고 있다(Straumann Annual Report, 2012).
치과용 임플란트 (dental implant)는 기능적, 심미적인 측면에서 시술되고 있으며 잇몸뼈에 삽입되는 매식체만을 따로 임플란트라고 명칭하고 있다. 현재, 생체친화적이고 인체에 무해한 티타늄을 임플란트 재료로 사용하고 있지만, 치과관련 분쟁 중 임플란트 부작용 건수가 가장 많이 집계되었으며(한국소비자원, 2014), 임플란트 분쟁 피해 유형을 보면, 임플란트 주위염 발생과 매식체의 탈락 및 파손 등의 부작용이 절반 이상 관찰되었고, 부작용의 원인으로는 환자의 나이, 시술자의 숙련도, 시술 후 관리, 임플란트의 퀄리티 등으로 나타났고 있다. 최근 임플란트 분야는 이러한 임플란트의 부작용을 최소화하면서 치료기간을 단축하기 위해 임플란트 식립 후 조기 골 유착을 유도하는 것에 관심을 집중하고 있는 실정이다.
임플란트에서의 골유착은 살아있는 세포와 임플란트 사이의 직접적인 접촉을 의미한다. 기존의 티타늄 임플란트는 표면에 산화층을 형성하게 되어 뼈와 금속의 직접적인 접촉을 막고 금속의 부식방지 및 임플란트 주변세포에 대한 독성반응이 없다는 연구결과가 있다. 하지만 티타늄과 잇몸뼈의 직접적인 접촉은 골 유착이 50~60%에 불과하며 현재, 임플란트의 성공적인 골 유착 정도는 표면처리 가공에 따라 결정된다는 다수의 보고에 따라 다양한 임플란트 표면처리가 시도되고 있다. 또한 티탄늄 임플란트가 가지고 있는 부작용들을 해결하기 위해서 골유착에 효과적인 코팅제로의 개발이 필요한 실정이다. 임플란트 코팅제가 골유착을 위해 가져야 할 조건들로는 생체 적합성, 임플란트의 형태, 세포와의 접촉 표면, 수술부위의 뼈의 상태, 외과적 시술, 하중조건 등의 특징들을 가져야만 한다. 이때, 세포와의 접촉면에 대한 코팅은 임플란트의 생체 적합성과의 연관으로 관심이 집중되고 있고 있으며, 새로운 임플란트 코팅 소재를 찾기 위한 노력들이 이루어지고 있다.
현재 임플란트 표면처리와 관련하여 지금 다수의 임플란트 제조회사들이 연구하고 있는 생리활성물질 분야는 단백질 또는 펩타이드류이며, 그 중 골형성단백질(BMP-2)이 가장 활발히 진행되고 있다. 최근 메가젠임플란트사에서 BMP-2가 코팅된 임플란트 개발에 성공하였다고 보도된 바 있으며, 이 외에도 골세포 성장 인자를 코팅한 임플란트 개발에 대한 연구와 골의 흡수를 통해 골다공을 유발하는 파골세포의 저해제 코팅을 한 임플란트 연구가 진행되고 있다. (산업통상자원부, 2014).
다당류 폴리머는 친수성 및 생체적합성 특징을 다양한 분야에 접목시켜 고부가가치 바이오 소재로서 급부상하고 있다. 특히 안정성이 높은 식물성 다당류는 천연 고분자로서 이미 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 응용되고 있다. 이들 다당류 중 해조류 유래 다당류 폴리머는 차세대 천연생물자원으로 주목 받고 있으며 최근 이들이 갖는 기능성 생리활성이 발견됨에 따라 응용분야는 더욱더 확대될 전망이다. 특히, 골 형성에 관련하여, 푸코이단은 골세포에서 BMP-2 생산을 증가시킴으로써 골 형성을 촉진한다는 보고(Kim, 2009; Kim, 2015)가 있으며, 황산다당류인 헤파린 또한 골세포의 BMP 활성을 촉진시켜 골 형성을 유도한다고 보고(Takada, 2003)된 바 있다. 그러나, 우리나라 주요 소비 해조류 중 하나인 매생이에서 추출한 다당류 폴리머의 물성규명, 골다공증개선 효능 규명과 나아가 이를 이용한 임플란트 코팅소재 개발에 대한 연구는 현재 전무하다.
본 발명은 발명은 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)를 유효성분으로 포함하는 임플란트 코팅제 조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)를 유효성분으로 포함하는 임플란트 코팅제 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 파골세포의 골 흡수 억제능을 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은 TRAF6, P-Src, Gelsolin 또는 Carbonic anhydraseⅡ의 단백질 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 파골세포의 엑틴 고리(actin ring) 형성을 감소시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 25℃에서 75 cP 내지 95 cP의 점도를 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은 pH 7에서 70 cP 내지 100 cP의 점도를 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은 pH 8에서 50 cP 내지 90 cP의 점도를 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은 1.0%의 농도에서 50 cP 내지 100 cP의 점도를 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물에 포함된 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)의 함량은 조성물 총 중량의 1 내지 3 중량%인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 임플란트 코팅용 조성물은 우리나라 주요 소비 해조류 중 하나인 매생이로부터 추출된 SPS-CF을 유효성분으로 포함하는 것으로서, 상기 SPS-CF의 수급이 용이하며 파골세포에 대한 골 흡수 억제 효능이 우수하므로 임플란트가 식립된 주변부의 골 형성이 크게 증가하는 장점이 있으며, 생체 친화성 및 생체적합성이 우수한 임플란트 코팅용 조성물을 제공하는데 효과가 있다.
도 1은 매생이로부터 고분자 다당류 폴리머를 추출 및 정제하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 다당류 폴리머(SPS-CF)의 화학적 구성을 나타낸 것이다.
도 3은 HPLC를 이용한 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 성분당 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 HPLC를 이용한 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 분자량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 대식세포 및 파골세포에 대한 세포독성 여부 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 파골세포 골흡수 억제에 대한 TRAP (+) staining과 activity 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 파골세포에 대한 Actin ring formation 저해효과 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 처리에 의한 파골세포 골흡수 단백질 TRAF 6, P-Src, Gelsolin 및 Carbonic anhydrase 의 발현 억제능 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 농도별 점도변화 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 염(NaCl), pH 농도별 점도변화 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 온도별 점도변화 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 당류 폴리머 (SPS-CF)의 유화활성 및 유화안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 임플란트 표면 코팅 결과를 SEM으로 촬영한 것으로서, (a)는 다당류 폴리머 (SPS-CF)를 처리하지 않은 임플란트의 SEM 촬영 사진(우측부터 30 배, 1,000배, 3,000배 확대)이고, (b)는 다당류 폴리머 (SPS-CF)를 처리한 임플란트의 SEM 촬영 사진(우측부터 1,000배, 3,000배 확대)을 나타낸 것이다.
도 2는 다당류 폴리머(SPS-CF)의 화학적 구성을 나타낸 것이다.
도 3은 HPLC를 이용한 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 성분당 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 HPLC를 이용한 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 분자량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 대식세포 및 파골세포에 대한 세포독성 여부 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 파골세포 골흡수 억제에 대한 TRAP (+) staining과 activity 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 파골세포에 대한 Actin ring formation 저해효과 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 처리에 의한 파골세포 골흡수 단백질 TRAF 6, P-Src, Gelsolin 및 Carbonic anhydrase 의 발현 억제능 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 농도별 점도변화 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 염(NaCl), pH 농도별 점도변화 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 온도별 점도변화 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 당류 폴리머 (SPS-CF)의 유화활성 및 유화안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 임플란트 표면 코팅 결과를 SEM으로 촬영한 것으로서, (a)는 다당류 폴리머 (SPS-CF)를 처리하지 않은 임플란트의 SEM 촬영 사진(우측부터 30 배, 1,000배, 3,000배 확대)이고, (b)는 다당류 폴리머 (SPS-CF)를 처리한 임플란트의 SEM 촬영 사진(우측부터 1,000배, 3,000배 확대)을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 종래 임플란트 코팅제의 임플란트 매식 후 골 결합의 속도 등과 같은 품질 향상 등의 문제점을 극복하기 위해 노력한 결과, 매생이로부터 분리된 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)의 물성 및 임플란트 코팅제로서의 가능성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 내 "임플란트 코팅용 조성물"은 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)을 유효성분으로 포함하는 것으로서, 파골세포에 대한 골 흡수 억제능이 우수한 바, 항 골다공증 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 조성물에 의해 코팅된 임플란트는 임플란트가 식립된 주변부의 골 형성이 크게 증가하는 이점이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)를 유효성분으로 포함하는 임플란트 코팅제 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)는 분자량이 약 385 kDa인 고분자 다당류로서, 대식세포에서 세포독성을 나타내지 않는 천연 고분자물질이다. 또한, 상기 SPS-CF는 람노오스(rhamnose), 자일로스(xylose) 및 만노오스(mannose)를 주성분으로 포함하고 있다.
더 나아가, 본 발명에 따른 임플란트 코팅제 조성물은 매생이 유래 다당류 SPS-CF는 매생이로부터 산 추출 후 에탄올 침전으로 얻어진 수용성 조출물을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 통해 분리, 정제된 것으로서, 상기 매생이로부터 얻어진 조출물은 당업계에서 통상적으로 사용하는 열수추출 후, 에탄올 침전법에 따라 수득될 수 있고, 극성 휘발성 용매, 예컨대, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 디메틸설폭사이드를 물과 1:1 내지 1:5의 비율로 섞어 침전시켜 수득되는 것이 바람직하고, 75% 에탄올 침전법으로 수득되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 파골세포의 골 흡수 억제능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 도 6에 나타난 바와 같이, SPS-CF의 농도 의존적으로 TRAP 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 상기 SPS-CF의 농도가 50㎍/㎖일 때, 대조군에 비하여 약 50%p 이상 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 조성물은 TRAF6(TNF receptor associated factor 6), P-Src(Phospho-Src), Gelsolin 또는 Carbonic anhydraseⅡ의 단백질 발현을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로, 도 8에 나타난 바와 같이, SPS-CF의 농도 의존적으로 파골세포 골흡수 단백질인 TRAF6, P-Src, Gelsolin 또는 Carbonic anhydraseⅡ의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 조성물은 파골세포의 액틴 고리(actin ring) 형성을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
파골세포는 분화과정을 거친 후, 파골세포에만 나타나는 특이적인 현상인 세포골격화 과정을 수행하는데, 파골세포는 뼈에 부착함과 동시에 세포외 공간과 뼈를 흡수하는 공간을 구분하기 위해, 파골세포의 actin이 하나의 큰 고리(ring)로 조직화된다. 즉, 파골세포에 있어서, 액틴 고리(actin ring)의 형성은 세포가 뼈를 흡수할 수 있는 능력에 대한 중요한 표지가 된다.
구체적으로, 도 7에 나타난 바와 같이, SPS-CF가 농도 의존적으로 액틴 고리(actin ring)의 크기 및 파골세포의 수를 감소시키는 것을 확인할 수 있다.
더 나아가, 상기 조성물은 25℃에서 75cP 내지 95cP의 점도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
조성물은 pH 7에서 70 cP 내지 100 cP의 점도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, pH 8에서 50 cP 내지 90 cP의 점도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 조성물은 1.0%의 농도에서 50 cP 내지 100 cP의 점도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 SPS-CF는 물리적 특징으로 점도 및 온도에 대한 안정성을 가짐으로써 임플란트 코팅용 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 임플란트 코팅제 조성물은 상기 조성물에 포함된 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)의 함량은 조성물 총 중량의 1 내지 3 중량%인 것일 수 있으며, 1 내지 2 중량%인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이 때, 상기 SPS-CF의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 임플란트가 식립된 주변부의 골 형성이 증가 효과가 미비하다는 문제점이 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예 1. 매생이 유래 다당류 폴리머의 추출
전라남도 완도 원산지의 매생이(Capsosiphon fulvescens) 13.09 g (dry weight)을 1L의 0.01N 염산(HCl) 용액에 담가 실온 상태로 24시간 산 가수분해시켰다. 가수분해된 추출물을 여성용 스타킹을 이용하여 여과한 후 1N 수산화 나트륨(NaOH)을 이용하여 중화시켰다.
이후, 에탄올을 첨가하여 75 % 농도의 에탄올 용액을 만들어 4 ℃에서 24시간 침전시킨 뒤, 4℃에서 30분 동안 6000rpm으로 원심분리를 통하여 침전물을 얻었다. 침전물을 증류수에 다시 용해시킨 뒤, 1N 염산을 이용하여 pH 2.0으로 적정한 후 염화칼슘(CaCl2)의 최종 농도가 2M이 되도록 처리하여 2시간 동안 교반시켰다. 교반 용액을 4℃에서 30분 동안 6000rpm으로 원심 분리하여 상등액을 채취하였고, 상등액에 에탄올을 처리하여 75% 농도의 에탄올 용액으로 만들고 4℃에서 24시간 침전시켰다. 침전물을 4℃에서 30분 동안 6000rpm으로 원심 분리하여 얻어내고 50mL의 증류수에 다시 용해시킨 후 MWCO(분획분자량) 14,000의 투석막을 이용하여 투석하였다. 투석한 시료를 동결 건조하여 조-다당류 0.8336 mg를 얻었고, 상기 조-다당류는 6.37%의 수율을 나타냈다.
이후, 상기 조-다당류를 50 mg/ 10mL로 증류수에 녹여 DEAE-cellulose column chromatography(3 x 22 cm)를 이용하여 분리한 후 얻어낸 fraction들을 페놀 황산을 이용해 당을 검출하였고 당이 검출된 분획들을 모아 MWCO(분획분자량) 14,000의 투석막을 이용하여 투석한 후 동결건조 하였다. 그 결과, SPS-CF 19.035mg을 얻었고, 상기 SPS-CF는 약 2.42 %의 수율을 나타냈다(도 1).
실시예 2. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 화학적 조성 분석
매생이 다당류 폴리머(SPS-CF)의 화학적 성분을 정량분석하기 위하여 총 당, 황산기, 유론산 및 단백질 정량을 수행하였다(도 2).
2-1. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 총 당 정량
총 당 정량은 포도당을 표준용액으로 사용하여 페놀-황산법으로 구하였다. 200L의 시료용액에 5 % 페놀(Phenol) 용액을 20 μL 첨가하였다. 이후 황산용액을 2 μL 첨가하여 교반한 후 실온에서 20분간 두었다. 이를 490nm에서 ELIZA reader를 이용하여 측정하였다.
2-2. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 황산기 정량
황산기 정량은 황산을 표준용액으로 사용하여 Bitter법을 이용해 구하였다. 1 mg/mL 및 10 mg/mL로 각각 제조된 다당류 폴리머 (SPS-CF)를 시험관에 5μL 넣고 0.02 N NaOH를 5μL 첨가한 뒤 알코올 램프로 약 10분간 가열시켰다. 완전히 건조된 시험관에 0.24mL의 증류수를 넣어준 후 이 중에서 0.1mL만을 15mL 코니칼튜브에 나누어 담고 5mL의 2N 아세트산, 1mL의 0.01M BaCl2, 4mL의 0.02M NaHCO3가 포함되고 에탄올로 150mL까지 fill up시킨 barium buffer를 0.6mL 첨가하여 섞어주었다.
이후, 5 mL Rhodizonate 와 100mg ascorbic acid가 증류수 20 mL에 포함된 용액에 80mL의 에탄올을 더하여 제조된 Rhodizonate reagant 0.3mL를 넣고 충분히 섞어주었다. 상기 용액을 10분간 실온에서 반응시킨 뒤, 520nm에서 Spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.
2-3. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 유론산 정량
유론산 정량은 D-galcturonic acid를 표준용액으로 Loui 방법을 이용하여 측정하였다. 250μL 의 1% 다당류 폴리머(SPS-CF)를 4℃로 유지된 10 mL의 증류수에 0.9 g의 sodium tetraborate decahydrate를 녹인 후 4℃로 유지된 98% 황산 90 mL을 첨가한 용액 1.5mL을 첨가하여 100℃에서 10분간 가열하였다.
이후, ICE에 용액을 담그어 식히고 100mL의 에탄올에 100mg의 카바졸 (cabazole)을 용해시킨 용액을 50μL 첨가한 후, 다시 100℃에서 15분간 가열하였다. 상기 용액을 식힌 후, 525nm에서 흡광도를 측정하였다.
2-4. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 단백질 정량
단백질 정량은 표준용액으로 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA)을 사용하여 Bradford법으로 측정하였다. 다당류 폴리머(SPS-CF)를 1mg/mL로 제조하였다.
이후, 상기 다당류 폴리머 10μL를 채취하여 96 well-plate에 담고 200μL의 Bradford reagent를 첨가하여 혼합하였다.
이후, 595 nm에서 ELIZA reader를 이용하여 측정하였다.
실시예 3. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 중성당 정성 및 정량 분석
다당류 폴리머(SPS-CF)의 중성당 정성 및 정량 분석을 하기 위해 1% 용액으로 증류수에 녹인 후, 2M TFA(trifluoroacetic acid)로 100℃에서 4시간 동안 반응 하여 산 가수분해한 후 Speed Vac.을 이용하여 시료를 건조시켰다.
건조된 시료 준비된 시료를 HPLC water에 1% 농도로 녹인 후 0.22μm Spin-X 튜브로 여과하였다.
이후, Bio-LC (LC 20 Chromatography Enclosure, Dionex, Co., USA)를 이용하여 HPAEC-PAD(high-pH anion exchange chromatography with pulsed amerometric detection)로 분석하였다. 표준 중성당으로는 sigma(USA)사로부터 구입한 fucose, rhamnose, arabinose, galactose, glucose, mannose, xylose를 사용하였다. 컬럼은 CarboPac PA-1 (4 x 250 mm, Dionex, Thermo Scientific, USA)을 사용하고 분석조건은 0.7 mL/min의 속도로 증류수와 200mM의 NaOH로 농도구배를 가하면서 용출시켰다. 정성 분석은 각 peak의 retention time(min) 값을 비교하였고, 정량은 Chormeleon software(Thermo Scientific, USA)를 이용하여 Peak 면적을 비교하여 분석하였다.
중성당 분석 결과, 다당류 폴리머(SPS-CF)는 xylose, rhamnose 그리고 mannose를 주성분으로 하는 당으로 확인되었으며, 이들의 mole 비율은 각각 4.24, 2.04, 10.42 mole %의 비율을 나타내는 것으로 확인되었다(도 3).
실시예 4. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 분자량 측정
다당류 폴리머(SPS-CF)의 상대분자량을 측정하기 위하여 size-exclusion HPLC(Waters Alliance HPLC 2695, USA)를 사용하였다. 컬럼은 Shodex OHpack column (SB-showdex 806HQ)을 사용하였고, 시료는 HPLC water에 1 %로 제조된 매생이 다당류를 0.22μm Spin-X로 여과하여 사용하였다. 시료를 Column에 10μL 주입하여 Flow rate는 0.7 mL/min로 검출하였고, Pullulan과 Blue dextran을 상대분자량 표준물질로 이용하였다.
그 결과, 다당류 폴리머(SPS-CF)는 약 385kDa의 고분자 다당류인 것을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 5. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 항 골다공증 효과 분석
실시예 1에서 추출된 매생이 유래 다당류 폴리머의 항 골다공증 효과를 분석하였다.
5-1. 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 세포독성
다당류 폴리머(SPS-CF)의 RAW264.7 및 파골세포에 대한 세포독성(cytotoxicity) 여부를 알아보기 위해 MTT assay로 세포 생존률을 측정하였다.
RAW264.7 세포에 RANKL 50ng/㎖을 처리하여 파골세포로 분화시키면서 매생이 다당류(SPS-CF)를 농도(0, 10, 30, 50 ㎍/㎖)별로 처리한 후, 세포 수를 측정하였다. 대조군으로서, 파골세포로 분화하기 전인 RAW264.7 세포에 대해서도 동일한 농도의 매생이 다당류를 처리하여 세포독성을 확인하였다(도 5).
5-2. 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 파골세포 분화 억제 효능
다당류 폴리머(SPS-CF)의 파골세포 골흡수 억제능을 조사하기 위해 TRAP (+) activity측정과 TRAP(+) staining을 시행하여 RAW264.7 세포의 파골세포 골흡수 정도를 측정하였다.
TRAP staining은 파골세포의 골흡수 척도를 측정하는 염색법이며, TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase)는 파골세포에서 특이적으로 만들어지는 골 흡수 marker로 산성 리소좀 효소로서 산성환경에서 알칼리성 인산효소와 유사한 역할을 수행하는 여러 단백질들을 칭한다.
RAW264.7 파골세포를 분화시키면서 다당류 폴리머(SPS-CF)를 농도(0, 10, 30, 50㎍/㎖)별로 처리한 후 생성된 파골세포의 분화정도를 TRAP staining 시약으로 염색한 결과를 대조군 100 %로 하여 비교하였다(도 6).
5-3. 다당류 폴리머 (SPS-CF)의 파골세포 분화 단백질 발현 억제
파골세포의 분화과정 중 다당류 폴리머(SPS-CF)에 의해 발현되는 단백질의 변화를 알아보기 위해 RAW264.7 파골세포에 다당류 폴리머(SPS-CF)를 농도(0, 10, 30, 50㎍/㎖)별로 처리한 군과 분화를 시키지 않은 RAW264.7 세포(대조군)와의 단백질량을 비교하였다.
배양한 세포의 단백질을 추출한 후 파골세포의 분화 중 발현 marker로 알려진 TRAF6, P-Src, Gelsolin 및 Carbonic anhydrase Ⅱ 단백질의 발현 변화를 Western blot을 통해 확인하였다. 또한 Actin ring stiaining을 통해 파골세포의 분화시 생성되는 Actin ring의 크기 감소 및 파골세포 수의 감소를 확인하였다. Actin ring staining에는 Rhodamin phalloidin을 이용해 염색하였으며 형광현미경으로 관찰하였다(도 7 및 도 8).
그 결과, 상기 다당류 폴리머(SPS-CF)는 농도 의존적으로 TRAF6, P-Src, Gelsolin 및 Carbonic anhydrase Ⅱ 단백질의 발현억제를 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 점성 분석
6-1. 0.1M NaCl 조건에서 다당류 폴리머(SPS-CF)의 농도에 의한 점도변화
실시예 1에서 분리된 다당류 폴리머(SPS-CF)를 0.1M NaCl 용액에 일정 농도(0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1%)로 용해시킨 후, 회전점도계(Broocfield LVDVI+, Brookfield Engineering Ltd., U.S.A.)등을 사용하여 25.00±0.02℃에서 점도를 측정하였다(도 9(a)).
그 결과, 상기 다당류 폴리머(SPS-CF)의 농도가 증가할수록, 점도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
6-2. 농도에 의한 점도변화
실시예 1에서 분리된 다당류 폴리머(SPS-CF)를 증류수에 농도별(0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1%)로 용해시킨 후, 회전점도계(Broocfield LVDVI+, Brookfield Engineering Ltd., U.S.A.)등을 사용하여 25℃에서 각 농도의 점도변화를 측정하였다(도 9(b)).
그 결과, 상기 다당류 폴리머(SPS-CF)의 농도가 증가할수록, 점도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
6-3. 염농도에 의한 점도변화
실시예 1에서 분리된 다당류 폴리머(SPS-CF)를 1% 농도로 증류수에 용해시킨 후, NaCl 용액을 농도별(0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0%)로 혼합하여 회전점도계(Broocfield LVDVI+, Brookfield Engineering Ltd., U.S.A.)등을 사용하여 점도변화를 측정하였다(도 10(a)).
그 결과, NaCl의 농도가 0.5M일 경우, 상기 다당류 폴리머(SPS-CF)의 점도가 약 18cP로 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
6-4. pH에 의한 점도변화
실시예 1에서 분리된 다당류 폴리머(SPS-CF)를 1% 농도로 증류수에 용해시킨 후, 용액을 pH 농도별(pH2~ pH11)로 혼합하여 회전점도계(Broocfield LVDVI+, Brookfield Engineering Ltd., U.S.A.)등을 사용하여 점도변화를 측정하였다(도 10(b))
그 결과, pH 7 및 8에서 상기 다당류 폴리머(SPS-CF)의 점도가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
6-5. 열처리에 의한 점도변화
실시예 1에서 분리된 다당류 폴리머(SPS-CF)를 1% 농도로 증류수에 용해시킨 후, 40℃, 60℃, 80℃, 100℃에서 30분간 열처리하고 25℃로 15분간 냉각시켜 회전점도계(Broocfield LVDVI+, Brookfield Engineering Ltd., U.S.A.)등을 사용하여 열처리에 의한 점도변화를 측정하였다(도 11).
그 결과, 25℃ 내지 80℃의 온도 범위에서 점도가 90cP 이상인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 다당류 폴리머(SPS-CF)는 온도변화에 안정적임을 알 수 있다.
실시예 7. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 유화활성 및 유화 안정성 분석
7-1. 유화활성 분석
측정용액 2 mL를 pH7의 0.2 M phosphate buffer 완충액 2 mL와 혼합한 후 각각의 기질을 1mL 넣고 1분간 강하게 교반하여 유화시켰다. 이후, 10분간 방치하여 540nm에서의 현탁도를 spectrophotometer를 사용하여 유화 활성을 측정하였다(도 12 (a)).
7-2. 유화안정성 분석
측정용액을 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 유화시켰다.
이후, 실온에서 방치하면서 매 10분마다 60분간 540nm에서의 현탁도를 측정하여 Log값으로 환산하였다(도 12 (b)).
그 결과, 실리콘 오일의 경우, 다른 용매에 비해 상대적으로 유화활성이 높은 반면, 유화안정성은 낮은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 다당류 폴리머(SPS-CF)의 임플란트 코팅 및 표면 처리능 분석
다당류 폴리머(SPS-CF)의 임플란트 코팅은 1%의 SPS-CF 100mL 에 Dipping & Drying Method를 이용하여 코팅을 진행하였다.
1시간 가량 1% SPS-CF 용액에 담그어 임플란트에 코팅을 하였으며 65℃에서 30분간 건조하여 물질의 고정을 유도하였다.
이후, 표면 처리능 분석은 Scanning electron microscope(HITACHI, Japan)으로 30배, 1,000배, 3,000배, 20,000배에서 촬영하여 다당류 폴리머의 코팅 유무를 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (9)
- 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)를 유효성분으로 포함하는 임플란트 코팅제 조성물로서,
상기 SPS-CF는 람노오스(rhamnose), 자일로스(xylose) 및 만노오스(mannose)를 각각 4.24, 2.04, 10.42 몰 %의 비율로 포함하는 것이며,
다당류 폴리머(SPS-CF)는 농도 10 ㎍/㎖의 농도인 것인, 임플란트 코팅제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 파골세포의 골 흡수 억제능을 갖는 것을 특징으로 하는
임플란트 코팅제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 TRAF6(TNF receptor associated factor 6), P-Src(Phospho-Src), 겔솔린(Gelsolin) 또는 탄산무수화효소Ⅱ(Carbonic anhydraseⅡ)의 단백질 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는
임플란트 코팅제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 파골세포의 엑틴 고리(actin ring) 형성을 감소시키는 것을 특징으로 하는
임플란트 코팅제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 25℃에서 75 cP 내지 95 cP의 점도를 갖는 것을 특징으로 하는
임플란트 코팅제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 pH 7에서 70 cP 내지 100 cP의 점도를 갖는 것을 특징으로 하는
임플란트 코팅제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 pH 8에서 50 cP 내지 90 cP의 점도를 갖는 것을 특징으로 하는
임플란트 코팅제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 1.0%의 농도에서 50 cP 내지 100 cP의 점도를 갖는 것을 특징으로 하는
임플란트 코팅제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물에 포함된 매생이 유래 다당류 SPS-CF(sulphated polysaccharides-Capsosiphon fulvescens)의 함량은 조성물 총 중량의 1 내지 3 중량%인 것을 특징으로 하는
임플란트 코팅제 조성물.
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