KR20010052346A

KR20010052346A - 알로에 펙틴

Info

Publication number: KR20010052346A
Application number: KR1020007012701A
Authority: KR
Inventors: 니야웨이; 예이츠케네스엠; 자르직키리스자드
Original assignee: 터너 칼튼 이.; 캐링턴 라보라토리즈, 인코포레이티드
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2001-06-25
Also published as: AU3898999A; US5929051A; CA2331744C; WO1999058575A1; DE69927498D1; EP1607407A2; EP1086141A1; CA2331744A1; DE69927498T2; JP2002514663A; KR100587423B1; EP1607407A3; EP1086141B1

Abstract

알로에 베라의 겔 및 외피 세포벽으로부터 펙틴이 추출, 분리 및 동정된다. 두 부류의 알로에 펙틴, 즉 고분자량 (HMW) 펙틴 및 저분자량 (LMW) 펙틴이 수득된다. 알로에 펙틴은 저 메톡실 (LM) 함량을 가진다. 알로에 펙틴은 칼슘의 존재하에서 겔을 형성하며 이들, 특히 HMW 펙틴은 저온에서 1가 양이온계 겔을 형성하고 실온에 적용되면 용액으로 복원된다. HMW 알로에 펙틴-칼슘 겔은 조절된 방출을 위해 사용된다. 1가 양이온계 겔은 약물을 저장하기위한 매트릭스 및 항원과 항체의 침전반응을 위해 사용된다.

Description

알로에 펙틴 {Aloe pectins}

서론

본 발명은 펙틴에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 알로에 펙틴, 이의 분리방법 및 그의 용도에 관한 것이다.

본원에서는 다음의 약어가 사용된다:

Ab, 항체; AG, 아라비노갈락탄; APase, 알칼리성 포스파타제; CDTA, 트랜스-1,2-디아미노사클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산; Da, 달톤; DAc, 아세틸화도; DM, 메틸화도; EDTA, 에틸렌디아민테트라아세트산; Gal, 갈락토즈; Gal A, 갈락투론산; GalNAc, N-아세틸화 갈락토사민; Glc, 글루코즈; Glc A, 글루쿠론산; HM, 고 메톡실; HMW, 고분자량; HPSEC, 고성능 크기별 배제 크로마그래피; HR, 모 영역; HT, 가열; kDa, 킬로달톤; LM, 저 메톡실; LMW, 저분자량; Man, 만노즈; MWCO, 분자량 컷오프; PBS, 인산염 완충 염수(10 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.4); RG, 람노갈락투로난; RT, 실온; SEC, 크기별 배제 크로마토그래피; SF, 초임계 유액; SR, 평활영역; TMS, 트리메틸실릴; TN, 완충액 25 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.4.

펙틴은 식물 세포벽 성분이다. 세포벽은 중간 라멜라, 일차 세포벽 및 이차 세포벽이라는 세개의 층으로 분리된다. 중간 라멜라 층에 펙틴이 가장 풍부하다. 펙틴은 세포벽 성장동안에 생성되고 침적된다. 펙틴은 빠른 성장 및 고 수분 함량의 조건하에 있는 연질 식물조직에 특히 풍부하다. 세포벽에서 펙틴은 칼슘 착화합물로 존재한다. 칼슘 교차결합에 대한 근거는 킬레이트화제 세포벽으로부터 펙틴의 방출을 촉진한다는 사실에 의해 입증된다.

펙틴은 식물 세포벽과 연관된 복합 폴리사카라이드이다. 이는 결합된 α1-4 폴리갈락투론산 골격에 람노즈 잔기가 삽입되어 있고 아세틸, 메틸 및 페룰산 그룹과 같은 비당 성분 및 중성 당측쇄로 변형되어 이루어져 있다. 현재 이해되고 있는 바를 근거로 한 펙틴 또는 펙틴 물질의 일반 구조는 도 1에 나타낸 바와 같다. 전체 구조는 상부에 도시되어 있고 상세한 구조는 하부에 도시되어 있다. 아라비난 및 아라비노갈락탄 (I 형 및 II 형)을 포함한 중성 당 측쇄가 O-3 또는 O-4 위치에서 골격의 람노즈 잔기에 결합되어 있다. 람노즈 잔기는 골격에서 함께 뭉치는 경향을 띤다. 이렇게 측쇄가 결합된 영역을 모 영역(hairy region)이라 하고 나머지 골격 부분을 평활 영역이라 부른다. 람노즈 잔기는 골격에서 Gal A 잔기에 1-2 결합되어 있고 이 결합의 배위는 현재 α로 결정되어 있다.

전통적으로 펙틴은 식품 첨가제로서 사용된다. 그러나 이들의 용도는 의약 분야로도 또한 확대되고 있다. 펙틴은 오래동안 지사제로 사용되어 왔고 장의 기능을 개선시킬 수 있다. 지사 효과는 부분적으로 펙틴의 항균 활성에 의한 것으로 여겨진다.

펙틴은 또한 위궤양 및 소장결장염에 효과적이다. 펙틴은 또한 장에서 세포 증식에 영향을 미친다. 이들은 또한 혈중 콜레스테롤 강하 효과를 나타내고 동맥경화를 억제한다. 이러한 효과는 펙틴과 담즙산염 사이의 상호작용 결과이다. 또한 펙틴은 고콜레스테롤혈증 환자에서 피브린 네트워크에 영향을 끼치는 것으로 나타났다.

펙틴이 많은 이가 금속 이온과 상호작용한다는 능력에 의해 펙틴은 강력한 해독제로 나타난다. 펙틴은 소화관 및 호흡기관으로부터 납 및 수은을 제거하는데 효과적인 것으로 나타났다. 최근에 펙틴은 식도산 유입에 의해 일어난 가슴앓이를 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.

최근, 알칼리 분해에 의해 얻은 작은 분자 (약 10kDa)인 소위 변형된 감귤류 펙틴은 실험 동물에서 암 세포 전이를 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.

펙틴의 구조는 중성 당 측쇄 및 약간의 다른 비당 성분의 존재로 인해 아주 복잡하다. 반드시 두 분자는 서로 동일한 구조를 갖지 않는다. 펙틴을 "펙틴 물질"이라는 용어를 사용하여 기술하는 이유가 여기에 있다. 펙틴 물질은 흔히 펙틴, 펙틴산 및 이의 염, 및 특정 중성 폴리사카라이드 (아라비난, 아라비노갈락탄 및 갈락탄)을 포함하기 위해 사용된다. 펙틴산 또는 이의 염은 탈에스테르화된 펙틴이다.

람노즈, 갈락토즈, 아라비노즈 및 자일로즈가 펙틴의 가장 흔한 중성 당 성분이다. 약간 빈도가 적은 당은 글루코즈, 만노즈 및 퓨코즈이다. 자일로즈 잔기가운데 일부는 각각이 O-3 위치에 Gal A 잔기에 결합되어 있다. 세개 유형의 중성 당 측쇄가 펙틴에서 확인되었다. 아라비난은 α1-5 결합된 아라비노즈로 구성된다. 아라비노갈락탄 I은 β1-4 결합된 갈락토즈와 O-3에 결합된 짧은 아라비난 쇄로 구성되어 있다. 아라비노갈락탄 II에서 갈락토즈는 아라비노즈와 β1-3 및 6 결합되어 있다.

Gal A 잔기의 카르복실 그룹에서 메틸화가 일어난다. 메틸화도는 메탄올로 에스테르화된 카르복실 그룹 (Gal A 잔기)의 퍼센트(%)로 정의된다. 메틸화도("DM")가 50% 이상인 펙틴은 고 메톡실("HM") 펙틴이라 하고 DM이 50% 미만인 펙틴은 저 메톡실("LM") 펙틴이라 한다. 대부분의 천연 펙틴은 해바라기 펙틴과 같은 소수를 제외하고는 HM이다. 아세틸화도(DAc)는 하나의 아세틸 그룹으로 에스테르화된 Gal A 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 단지 히드록실 기만이 아세틸화되는 것으로 추정된다. 각각의 Gal A 잔기는 하나 이상의 히드록실 기를 갖고 있기 때문에 DAc는 100% 이상일 수 있다. DAc는 일반적으로 사탕무 펙틴과 같은 일부를 제외하고는 천연 펙틴에서 낮다.

펙틴은 약간의 비당 성분을 함유할 수 있다. 페룰산 에스테르가 사탕무 펙틴에서 발견되었다. 이들은 중성 당 측쇄의 아라비노즈 및 갈락토즈 잔기에 결합되어 있다.

펙틴은 수용해성이며 대부분의 유기 용매에서는 불용성이다. 아주 낮은 수준의 메틸-에스테르화를 갖는 펙틴 및 펙틴산만이 칼륨 및 나트륨 염으로서 용해성이다. 다른 중합체의 경우처럼 펙틴에 대한 포화 한계는 없지만 3 내지 4% 이상의 농도를 갖는 진정한 용액을 얻는 것은 어렵다. 상업적 펙틴은 7 내지 14 x 10⁴Da의 크기 범위를 갖는다. 감귤류 펙틴은 사과 펙틴보다 크다. 펙틴 용액의 점도는 일반적으로 낮으며 이에 따라 펙틴은 좀처럼 점증제로서 사용되지 않는다. 점도는 크기, pH 및 짝이온의 존재와 직접적으로 관련이 있다. 1가 양이온의 첨가는 점도를 감소시킨다.

펙틴은 수개의 이가 금속이온과 상호작용할 수 있다. 선택성의 순서는 Cu~Pb〉〉Zn〉Cd~Ni≥Ca이다. 이 활성은 펙틴이 해독효과를 나타내는 근거가 된다.

펙틴 골격에서 Gal A 잔기는 α1-4 결합되어 있다. D-Gal의 탄소 원자 1 및 4에 있는 두 히드록실 기는 축방향으로 위치하고 있다. 따라서 이러한 결합은 트랜스 1-4이다. 이러한 유형의 결합은 중합체의 쇄 견고성을 증가시켜 준다. 따라서 유연성 파라미터 B가 0.072 내지 0.017인 펙틴은 견고한 분자이다. 골격에 람노즈 잔기의 삽입은 골격 쇄에 T-모양의 비틀림을 일으키는 것으로 제시되어 왔다. 람노즈 함량의 증가는 보다 유연한 분자를 유도한다. 펙틴은 회전 결합부로서 작용하는 유연성 모 영역(람노즈가 풍부함) 및 길고 견고한 평활 영역을 지닌 지그재그 중합체로서 고려될 수 있다. 또한, DM이 쇄 유연성에 영향을 미친다. 용액중에서 펙틴 분자는 우방향 나선 구조를 취하는 것으로 밝혀져 왔다.

펙틴은 pH 3 내지 4에서 가장 안정하다. pH 3 이하에서는 메톡실 및 아세틸 그룹 및 중성 당 측쇄가 제거된다. 승온에서 이들 반응은 촉진되고 갈락투로난 골격에서 글리코시드 결합의 분해가 일어난다. 중성 및 알칼리성 조건하에서 메틸 에스테르 그룹은 비누화되고 폴리갈락투로난 골격은 메톡실화된 갈락투론 산 잔기의 비환원 말단에서 글리코시드 결합의 β-제거-분해를 통해 붕괴된다. 이들 반응은 또한 온도가 증가함에 따라 보다 빠르게 진행된다. 펙틴산 및 LM 펙틴은 메틸 에스테르 그룹이 전혀 없거나 단지 한정된 수로만 존재하기 때문에 중성 및 알칼리성 조건에 저항한다.

특정적으로 펙틴 분자를 변형시키고 분해시킬 수 있는 많은 효소가 있다. 이들 효소로는 엔도- 및 엑소-폴리갈락투로나제(EC3.2.1.15 및 EC 3.2.1.67), 펙테이트 라이아제(EC 4.2.2.10), 펙틴 메틸에스테라제(EC 3.1.1.11), 펙틴 아세틸에스테라제 및 람노갈락투로나제가 포함된다. 엔도-폴리갈락투로나제는 비-에스테르화된 α1-4 결합된 Gal A 잔기에 대해 특이적이며 네개의 인접한 비-에스테르화된 Gal A 잔기가 작동할 것을 요구한다. 이 효소는 식물, 진균 및 세균에 의해 생성될 수 있다.

HM 및 LM 펙틴은 모두 겔을 형성할 수 있으나 완전히 다른 메카니즘에 의해 생성한다. HM 펙틴은 저 pH에서 고 농도의 보조용질(자당)의 존재하에 겔을 형성한다. LM 펙틴은 칼슘의 존재하에서 겔을 형성한다. 또한, 사탕무 펙틴은 페룰 그룹의 교차결합을 통해 형성한다.

칼슘-LM 펙틴 겔 네트워크는 Ca²⁺이온에 의해 두개의 폴리갈락투론산이 교차결합되는 "에그-박스" 결합대가 형성됨으로써 만들어 진다. 사과 및 감귤류 펙틴의 경우, 람노즈가 삽입되어 있지 않은 폴리갈락투론산은 길이가 72 내지 100 잔기인 것으로 추정되어왔다. 이 지대는 골격에서 람노즈 잔기로 종결된다. 칼슘-LM 펙틴 겔은 열가역적이다. 따라서, 비등점에서 칼슘이 첨가될 수 있으며 겔 형성이 냉각이 발생한다. 0.5% 펙틴과 30 내지 60 mg/g Ca²⁺로 확고한 탄성 겔을 얻을 수 있다. 소량의 칼슘과 고 함량의 펙틴이 탄성 겔을 제공하는데 반하여 고 농도의 칼슘과 소량의 펙틴은 부서지는 겔을 초래한다.

1가 짝이온의 첨가는 칼슘-LM 펙틴 겔의 형성을 강화시켜 준다. 즉, 겔을 형성하는데는 칼슘이 보다 적게 요구된다.

시판되고 있는 펙틴은 주로 사과 찌꺼기 또는 오렌지 껍질을 뜨거운 산 조건으로 처리한 후 알콜 침전에 의해 추출된다. 천연 물질은 일차로 표백처리한 다음 세척하여 펙틴을 분해시킬 수 있는 내인성 효소를 불활성화한 후 색소를 제거한다. 효소 불활성을 위한 공통된 방법은 알콜 처리이다. 즉, 세포벽 섬유질을 소위 알콜 불용성 잔기("AIR") 또는 고체("AIS")로서 제조한다.

식물 세포벽으로부터 펙틴을 분리하기 위해 여러가지 추출조건이 사용되어 왔다. 여기에는 EDTA, CDTA, 나트륨 헥사메타포스페이트 및 암모늄 옥살레이트와 같은 킬레이트화제(pH 3 내지 6.5), 뜨거운 묽은 산(HCl, pH 1.5 내지 3), 및 차가운 묽은 염기(NaOH 및 Na₂CO, pH 10)의 사용이 포함된다. 추출은 흔히 수율을 높이기 위하여 승온(60 내지 100℃)에서 수행한다. 시판 감귤류 및 사과 펙틴은 뜨거운 묽은 산으로 추출한다. 펙틴은 3 미만의 pH에서 쉽게 분해되기 때문에, 추출 공정은 보통 사용된 온도에 따라 계속된다. 킬레이트화제가 사용된 3 내지 6.5의 pH는 이들의 최적 킬레이트화 효과에 필요한 pH보다 낮지만 β-제거를 통한 펙틴 분해를 최소화하기 위해 사용된다. 뜨거운 묽은 산 추출과 마찬가지로, 알칼리성 추출은 광범위한 분해를 초래할 수 있다. 이 추출은 β-제거를 통한 펙틴 분해를 최소화하기 위해 단지 0 내지 4℃에서 수행한다. 냉 알칼리성 추출은 세포벽에 강하게 결합되어 있는 펙틴을 제거하기 위해 일련의 추출과정에서 마지막 단계로서 흔히 사용된다.

펙틴 추출을 위해 효소가 또한 시험되어 왔다. 이러한 효소로는 아라비나제, 갈락타나제, 폴리갈락투로나제 및 람노갈락투로나제가 포함된다. 또한, 폴리갈락투로나제-생성 효모 세포가 펙틴 추출을 위해 직접 사용되었다.

상이한 조건하에서 추출된 펙틴의 특징은 다양할 수 있다. 승온에서 추출된 펙틴은 실온에서 추출된 것보다 작으며 중성 당이 보다 풍부하다. 좀더 작은 크기는 보다 격렬한 조건하에서의 분해 결과이다. 그러나, 수율은 승온에서 훨씬 높다. 킬레이트화제로 얻은 펙틴은 보통 보다 많은 Gal A 함량을 가진다. 냉 알칼리성 조건하에서 얻은 펙틴은 일반적으로 감소된 Gal A 함량을 가지며 중성 당 함량은 보다 많다.

공업적 펙틴 HM 또는 LM은 주로 사과 및 감귤류로부터 산 추출 및 알콜 침전에 의해 수득된다. LM 펙틴은 HM 펙틴으로부터 화학적 탈에스테르화에 의해 수득된다. 펙틴은 식품 첨가제로서 좋은 표준 자격을 지닌다. 이들은 미국에서 일반적으로 안전한 것으로 인정됨("GRAS")으로서 유럽에서는 매일 흡수 허용됨("ADI")으로 분류된다. 즉, 이의 사용은 특정 명세를 충족하기 위한 현 굳 매뉴팩처링 프랙티스("cGMP") 요건에 의해서만 제한된다. 이들 명세에는 65%(w/w)의 최소 Gal A 함량이 포함된다.

HM 펙틴은 다른 유형의 LM 펙틴, 즉 아미드화 펙틴으로 전환될 수 있다. 이것은 HM 펙틴을 알콜성 현탁액중 알칼리성 조건하에서 암모니아로 첨가함으로써 달성된다. 메틸 에스테르 그룹은 아미드 그룹으로 치환된다. 아미드화 펙틴은 공인 LM 펙틴에 비하여 칼슘의 존재하에서 보다 좋은 겔 형성 능력을 나타낸다.

많은 다른 식물이 또한 펙틴 생산에 대하여 시험되었다. 이들 중 사탕무 펄프 및 해바라기 헤드가 집중적으로 연구되었다. 이들 둘은 천연 물질로 풍부하다. 그러나, 사탕무 펙틴은 주로 이의 고 아세틸 그룹 함량 및 작은 분자 크기(약 5 x 10⁴Da) 때문에 빈약한 겔 형성능을 가진다. 해바라기 펙틴은 천연적으로 LM이며 킬레이트화제로 효율적으로 추출할 수 있다. 이들은 흔히 불량한 질의 천연물질 및 불량한 색깔 질(보통 갈색)의 펙틴 최종산물로 나타난다.

상이한 식물원으로부터의 펙틴은 다른 특징을 나타낸다. 일반적으로, 추가의 가공을 통해 얻은 것을 포함한 모든 상업적 펙틴은 최종 산물로서 특정 정도의 색상을 나타낸다. 색깔은 담황색/갈색(감귤류 펙틴)에서 암갈색(사과 및 해바라기 헤드 펙틴)에 이른다. 색상은 두 인자(천연 물질의 천연색 및 폴리페놀의 양)의 조합에 의해 발생한다. 화학적으로, 해바라기 헤드 펙틴은 아주 많은 Gal A 함량을 가지며 천연 LM 펙틴인데 반하여 사탕무 펙틴은 비교적 적은 Gal A 함량과 아주 많은 아세틸과 페룰산 그룹 함량을 가진다. 사과와 감귤류 펙틴의 구조는 서로 아주 유사하다.

펙틴 분석을 위해 일련의 기술이 설정되었다. Gal A 함량은 색깔 형성을 위해 m-하이드록실디페닐을 이용한 방법에 의해 측정된다. 이 검정은 이전의 검정보다 간단하고 중성 당으로부터 최소로 간섭을 받는다. 또한, Gal A 측정을 위한 다른 검정이 공개되어 왔다. 당 조성은 알디톨 아세테이트 또는 트리메틸실릴에테르 ("TMS") 유도체화를 사용하여 GLC 또는 GC-MS에 의해 분석된다. GLC 절차는 메틸 에스테르 함량을 측정하는데 가장 흔히 사용된다. 이 절차에는 염기(0.5N)에 의한 비누화 및 120℃하의 포로팍 큐(Poropak Q) 컬럼 또는 125℃하의 카르보왁스(Carbowax) 1500 컬럼에서 GLC에 의한 메탄올의 측정이 포함된다. 캐필러리 전기영동 방법이 또한 펙틴의 DE를 측정하기 위해 시험되었다. 빠르고 민감한 비색정량 검정이 아세틸 그룹을 측정하는데 사용된다.

크기 측정은 점도, HPSEC 및 겔 침투 크로마그래피를 포함한 여러가지 수단에 의해 달성된다. 최근에, 광분산이 보다 정교한 방법으로서 제시되어 왔다. 펙틴의 내인성 점도는 흔히 우벨로데 점도계를 사용하여 측정된다. 이는 펙틴 분자의 전해질 특성때문에 0.1 내지 0.15 M NaCl의 존재하에서 수행된다.

펙틴의 정제는 대체로 이온 교환 크로마토그래피 및 제이구리 침전에 의해 달성된다. 이온 교환 크로마토그래피의 경우, DEAE 세파로즈 CL-6B 매트릭스 및 아세테이트 완충액 (pH 4.8)이 가장 넓게 사용된다. 펙틴의 중성 당 함량은 이들 방법으로 정제한 후 결정된다.

발명의 요약

넓은 의미에서 본 발명의 한 가지 관점은 약 50몰% 미만의 메틸화도, 약 2 내지 약 15몰%의 람노즈 함량, 약 0.1 내지 약 5몰%의 3-O-메틸 람노즈 함량 및 칼슘 염 용액의 존재하에서 겔의 형성할 수 있는 특성중 하나 이상의 특성을 가진 알로에 펙틴에 관한 것이다. 알로에 펙틴은 알로에 잎으로부터 추출에 의해 분리된다. 추출은 과임계 유액, 수용성 유기용매, 산, 알칼리, 킬레이트화제, 세균, 효소 또는 이들의 조합에 의해 달성된다.

본 발명에 따라, 알로에 베라의 겔 및 외피 세포벽 섬유질로부터 펙틴이 추출, 분리 및 동정된다. pH가 약 7 내지 약 8.5인 EDTA와 같은 킬레이트화제로 알로에 섬유질을 연속 처리하는 것이 가장 효율적인 추출방법이다. 정제된 알로에 펙틴은 알로에 펙틴을 이온 교환 수지로 좀더 처리함으로써 수득된다. 알로에 픽틴은 칼락투론산, 특이하게 고 수준의 람노즈 및 3-OMe-람노즈를 함유한다. 크기로 구분되는 두 부류의 알로에 펙틴이 수득된다. 실온 추출은 고분자량(HMW)의 펙틴을 형성하는 반면 가열에 의한 추출은 저분자량(LMW)의 펙틴을 생성한다. 알로에 펙틴은 천연적으로 낮은 메톡실(LM) 함량을 가진다. HMW 및 LMW 펙틴은 칼슘의 존재하에서 겔을 형성할 수 있다. 또한, 알로에 펙틴, 특히 HMW 펙틴은 저온에서 1가 양이온계 겔을 형성하며 실온에 적용되었을때 용액으로 전환한다. HMW 알로에 펙틴-칼슘 겔은 단백질, 항체 및 백신과 같은 약물의 조절된 방출을 위해 적합한 아주 효율적인 캡슐화제이다. 알로에 펙틴은 항원 및 항체 침전 반응을 위한 매트릭스를 형성한다. 또한, 알로에 펙틴은 약물을 위한 저장 매트릭스를 형성한다. 펄프로부터의 알로에 펙틴은 회백색 분말색을 나타내며 물에 용해되었을때 등명한 용액을 형성한다.

도 1은 펙틴 또는 펙틴 물질의 일반 구조를 보여준다. 여기서 "HR"은 모 영역을, "SR"은 평활 영역을, "AG"는 아라비노갈락탄을, "RG"는 람노갈락투로난을 나타낸다.

도 2는 알로에 베라 잎 구조의 횡단면을 보여준다.

도 3은 알로에 베라 펄프 엽육 세포의 구조 성분을 보여준다.

도 4는 킬레이트화제를 이용한 일련의 알로에 펙틴 추출(실온 및 고온에서)의 플로우 차트이다.

도 5는 조절된 방출을 위한 캡슐화제로서 알로에 펙틴의 사용을 보여준다. 펙틴 비드로부터 방출된 효소의 상대적 양이 기질 PNPP로 측정되었다:

(a) APase-Ab 결합 비드에 대한 수중의 자발적 방출이 APase-Ab 결합 비드로 제시되었고;

(b) 알로에 펙틴의 크기에 대한 수중의 자발적 방출이 10 mg/ml 알로에 펙틴으로 만든 APase-Ab 결합 비드로 제시되었으며;

(c) 방출을 유도함에 있어 pH 및 NaCl (150 mM)의 영향이 15 mg/ml 알로에 펙틴 (1.36x10⁶Da)으로 만든 APase 비드로 제시되었다. TN, 25 mM 트리스 및 150 mM NaCl, pH 7.4; 염수, 150 mM NaCl.

알로에 베라는 약용 식물로서 오랫동안 사용되어 왔다. 알로에 베라는 황폐한 조건에서 살도록 적응된 다육식물이다. 다육식물은 많은 물 저장 조직을 보유하는데 특징이 있다. 알로에 베라 잎은 두 부분 녹색 외피 및 등명한 펄프 (즉, 내부 겔 또는 내부 융대)로 구성된다. 후자는 물 저장 조직이고 의약 목적을 위해 가장 넓게 사용된다. 그의 등명하고 가냘픈 외관때문에 펄프는 주로 단일 균질체로 처리된 점액겔로서 흔히 언급된다.

알로에 베라로부터의 펙틴 또는 펙틴 물질 및 이들의 추출은 어떠한 상세한 방식으로도 전에 기술된 바 없다. Gal A가 풍부한 펙틴 물질이 주 펄프 폴리사카라이드 성분으로서 기술되어 왔다. 등명한 펄프의 알콜 침전물을 뜨거운 물로 추출한 후 85%의 Gal A 함량을 갖는 폴리사카라이드가 분리되었다. 중성 당 조성 분석 결과 갈락토즈, 람노즈, 아라비노즈 및 극소량의 만노즈, 글루코즈 및 자일로즈가 검출되었다. 이러한 발견은 대부분의 다른 연구가 알로에 베라 펄프의 주 폴리사카라이드 성분으로서 만노즈-풍부 폴리사카라이드를 동정한 사실에 비하여 알로에 베라 종 및 특정 국부 조건내에서 식물 변이의 결과로서 해석되었다. Gal A-풍부한 폴리사카라이드가 미리 끓는 메탄올로 처리된 잎 재료로부터 열수 및 암모늄 옥살레이트 추출을 통해 수득되었다. Gal A 함량은 페이퍼 및 가스-액체 크로마토그래피를 근거로 55%인 것으로 추정되었다. 이 폴리사카라이드는 펙티나제에 의해 분해되었으며 이에 따라 펙틴으로 동정되었고 차례로 알로에 베라의 주 폴리사카라이드인 것으로 주장되었다. 상기 어느 연구에서도 중성 당에 대한 관련 연구는 수행되지 않았으며 또한 그 분리된 폴리사카라이드의 다른 물리 화학적 특성 (예, 크기, DM, DAc 및 겔 형성)에 대한 어떠한 세부적인 성상도 없다.

본 발명의 한 가지 관점은 알로에 베라 잎의 등명한 펄프 또는 발라낸 내부 겔로부터 출발되었다. 알로에 잎의 다른 부분의 분리는 미국 특허 제4,735,935호, 제4,851,224호, 제4,917,890호, 제4,959,214호 및 제4,966,892호에 기술되어 있다. 이들 각 특허의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다. 등명한 겔은 극히 한정된 수의 퇴화된 세포소기관과 함께 큰 엽육(저수) 세포를 함유하며 녹색의 외피는 미토콘드리아 및 엽록체와 같은 세포소기관이 풍부한 훨씬 작은 세포를 함유한다. 균질화후 펄프는 두개의 주요 분획, 즉 가용성 분획과 불용성 분획으로 분리될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 가용성 분획은 β1-4 결합된 만노즈가 풍부한 것으로 나타났다. 불용성 분획은 (균질화후 저배율하의 현미경적 외견을 근거로 하여) 주로 등명한 세포벽 또는 세포벽 섬유질로 구성되어 있다. 알로에 베라 펄프 추출물중의 세포벽 성분은 이전에는 기술된 바 없다. 세포벽 섬유질은 고수준의 Gal A(34% w/w)를 함유하고 있는 반면 가용성 분획은 5% (w/w)의 Gal A를 함유하였다. 이러한 데이터는 그들 세포벽 섬유질에 잠재적으로 펙틴이 풍부한다는 것을 분명히 암시한다. 계속된 실험은 평균 70% (w/w) 이상의 Gal A 함량과 함께 다량의 펙틴 (50% w/w 이상)이 그들 펄프 세포벽 섬유질로부터 추출될 수 있음을 보여주었다. 대등하게 Gal A가 풍부한 다량의 펙틴이 또한 외피로부터 분리된 세포벽 섬유질로부터 추출될 수 있었다. 펄프 또는 외피 섬유질로부터의 그들 펙틴을 알로에 펙틴이라 명명하였다.

세포벽 섬유질이 펄프 또는 외피의 균질화 후 원심분리 또는 여과에 의해 분리되고 물에서 세척한 것을 제외하고는 어떠한 처리도 하지 않고 펙틴 추출을 위해 직접 사용되었다. 알로에 펙틴은 이들 섬유질로부터 상기된 방법, 즉 약 pH 1.5의 뜨거운 산, 약 pH 10의 냉 알칼리 (NaOH 또는 Na₂CO₃) 및 pH 4.0 내지 6.5의 킬레이트화제 (EDTA, 나트륨 헥사메타포스페이트)를 사용하여 추출할 수 있었다. 이러한 추출 과정의 특이성은 이전의 모든 연구에서 킬레이트화제가 β-제거를 통한 분해를 최소화하기위해 6.5이하의 pH에서 항상 사용되 왔기때문에 보다 높은 pH(7-8.5)를 사용한 것이었다. 이와 같이 보다 높은 pH를 사용한 이유는 알로에 펙틴이 천연적으로 알칼리 조건하에 β-제거에 내성을 나타내는 펙틴의 형태인 LM(하기 참조)이고 EDTA가 7이상의 pH에서 가장 효율적으로 작용하는데 있다.

이단계 연속 추출 과정은 섬유질의 사용을 최대화하였고 크기로 구분된 두 유형의 펙틴, 즉 HMW 및 LMW을 산출하였다. 섬유질은 일차로 RT에서 추출된 다음 HT(80℃까지)하에서 또 추출되었다. RT 추출은 1.1 x 10⁶Da의 평균 MW를 갖는 HMW 펙틴을 산출하고 HT 추출은 1.9 x 10⁵Da의 평균 MW를 갖는 LMW 펙틴을 산출하였다. MW는 내인성 점도와 직접적으로 상호관련이 있다. HMW 펙틴은 550 ml/g이상으로 978 ml/g 보다 큰 내인성 점도를 나타내었다. HMW 알로에 펙틴의 MW 및 내인성 점도는 상업적 펙틴의 점도보다 훨씬 더 높았다.

알로에 펙틴은 당 조성에서 약간 톡특한 특징을 나타냈다. 이들은 고수준의 람노즈를 함유한다. 알로에 펙틴중의 람노즈 함량은 다른 펙틴, 주로 감귤류, 사과, 사탕무 및 해바라기에서 보다 2배 이상이었다. 람노즈는 펙틴 골격에서 핵심 당이며 이의 함량은 그 분자의 유연성에 영향을 미친다. 알로에 펙틴은 또한 어떠한 다른 펙틴에도 기술되어 있지 않은 희귀한 당인 3-OMe-람노즈를 보유하였다. 알로에 펙틴은 일반적으로 30% 미만, 흔히 10% 미만의 DM을 가진 천연적 LM인 것으로 밝혀졌다. 이들은 칼슘의 존재하에서 겔을 형성할 수 있었다. 톡특하게, 알로에 펙틴, 특히 HMW 펙틴은 극히 낮은 펙틴 농도 (1 mg/ml)하에 저온(4℃)에서 1가 양이온 (NaCl)-기본 가역적 겔을 형성할 수 있다. 그러한 저온 겔화는 어떠한 다른 펙틴에 대해서도 기술된 바 없다.

알로에 베라로부터의 녹색 외피는 일반적으로 펄프-기본 산물의 생성동안에 폐기물로서 제거된다. 이들 외피와 이들에 붙어 남아 있는 소량의 펄프는 전체 잎의 약 60% (w/w, 습식)를 차지한다. 이들 외피로부터 제조된 세포벽 섬유질은 펄프로부터의 것과 유사한 알로에 펙틴 수율을 산출하는 것으로 밝혀졌다. 외피로부터의 알로에 펙틴은 동등하게 Gal A가 풍부하고 펄프로부터의 것과 동일한 특성 (즉, 천연적으로 LM이고, MW 및 내인성 점도 (HMW 경우)가 높고 저온(4℃)에서 1가 양이온계 겔을 형성할 뿐만 아니라 칼슘 겔을 형성할 수 있음)을 보유하였다.

펄프 섬유질로부터의 알로에 펙틴은 최종 산물로서 회색분말이고 감귤류, 사과, 사탕무 및 해바라기로부터의 현 상업적 및 실험적 펙틴의 황갈색 분말 및 흐린 용액에 비하여 등명한 용액을 산출한다. 외피 섬유질로부터의 펙틴은 담녹색-갈색 분말이고 흐린 용액을 산출하나 최상의 감귤류 펙틴보다는 흐리지 않다. 외피 섬유질로부터의 알로에 펙틴의 분말색 및 용액 등명도는 실질적으로 추가의 알콜 세척으로 개선될 수 있다.

전체적으로, 알로에 펙틴은 톡특한 펙틴이며 다음과 같은 특징중 하나 이상에 의해 감귤류, 사과, 사탕무 및 해바라기로부터의 펙틴과는 구분될 수 있다:

1) 고분자량 (〉1x10⁶Da) 및 고 내인성 점도 (〉550 ml/g)

2) 고 람노즈 함량

3) 3-OMe-람노즈 보유함

4) 천연적으로 LM임

5) 칼슘 겔 형성할 수 있음

6) 저온(4℃)에서 1가 양이온계 겔 형성할 수 있음

7) 회색분말 및 등명한 용액(펄프로부터의 알로에 펙틴)

재료 및 방법

재료

알로에 베라(알로에 바버덴시스 밀러) 식물은 로우 가게를 통해 에이취 앤드 피 세일즈 인코포레이티드(캘리포니아 비스타)로부터 입수하였다. 벌크 아세틸화 만난(BAM)은 캐링톤 레보라토리즈 인코포레이티드의 알로에 베라 펄프 추출물이다. 여러 상업적 펙틴 및 폴리갈락투론산이 사용되었다. 이들로서는 시그마 케미칼 컴퍼니로부터의 HM 감귤류 (92%의 DM을 가진 P-9561 및 64%의 DM을 가진 P-9436), LM 감귤류 (28%의 DM을 가진 P-9311) 및 폴리갈락투론산 (P-1879), 스펙트럼 케미칼 컴퍼니로부터의 HM 감귤류 (67%의 DM을 가진 PE100), 및 허브스트레이스-폭스 케이지로부터의 HM 감귤류 (CU401) 및 사과 (AU201)가 포함된다. 다음의 시약이 시그마 케미칼 컴퍼니로부터 입수되었다: 이나트륨 EDTA, 사나트륨 EDTA, 엔도-폴리갈락투로나제, 알칼리성 포스파타제, 알칼리성 포스파타제-항체 (IgG) 결합체, 폴린-시오칼튜 시약, 이미다졸 및 사용된 모든 중성 및 산성 당. 알칼리성 포스포타제 기질 pNPP는 피어스로부터 입수되었다. 나트륨 헥사메타포스페이트는 플루카 케미 에이지로부터 입수되었다.

일반적으로, BAM은 알로에 베라로부터 다음과 같이 제조될 수 있다:

1. 알로에 잎을 세척하고, 얇게 썰어 발라내어 잎 외피를 제거한다. 녹색 외피가 제거되는 한편 깨끗한 (실질적으로 안트라퀴논이 없음) 내부 겔은 유지된다.

2. 발라낸 물질을 균질화하고 (크레파로) 피셔 모델 75 (일리노이 시카고 소재의 FMC)로 여러차례 여과하여 대부분의 펄프를 제거한다.

3. 등명한 점성 겔을 묽은 염산으로 처리하여 약 3.2의 pH로 산성화한다.

4. 산성화된 겔은 주변온도에서 4회 용량의 95% 에탄올로 추출한다. 부유한 물질은 제거한 다음 알콜/물 혼합물을 사이펀으로 빨아내는 한편 원심분리로 고체 침전물을 수거한다. 유기산, 올리고삭카라이드, 모노삭카라이드, 안트라퀴논 및 무기염과 같은 대부분의 알콜/물 가용성 물질은 알콜 추출 과정에 의해 제거된다.

5. 이어서, 고체 알로에 베라 추출물을 새로운 알콜로 세척하고, 원심분리, 동결건조 및 분쇄시켜 백색분말을 수득한다.

이 생성물은 습기로부터 보호만 된다면 동결건조 형태로서 수년간 실온에서 안정하다. 실질적으로 안트라퀴논이 없는 알로에 겔의 제조방법, 실질적으로 안트라퀴논이 없는 알로에 쥬스의 제조방법, 알로에 잎으로부터 활성적인 화학물질을 추출하는 방법, BAM의 제조방법 및 알로에 잎으로부터 실질적으로 분해되지 않는 동결건조되고 배열된 직쇄 만노즈 폴리머를 추출하는 방법이 캐링톤의 미국 특허 제4,735,935호, 제4,851,224호, 제4,917,890호, 제4,957,907호, 제4,959,214호 및 제4,966,892호에 기술되어 있다. 이들 각 특허의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다. 알로에 산물의 용도는 캐리톤의 미국 특허 제5,106,616호, 제5,118,673호, 제5,308,838호, 제5,409,703호, 제5,441,943호 및 제5,443,830호에 기술되어 있다. 이들 각 특허의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다.

실시예 1

잎 단면의 광학 현미경 및 전자 현미경 검경

신선한 알로에 베라 잎을 외과수술용 칼로 2 내지 3 ㎜ 두께의 조각으로 절단하였다. 이 절편을 광학 현미경(Olympus BH02)하에서 직접 관찰하였다. 조직 분석을 위하여 신선한 알로에 베라 잎을 PBS 중의 10% 포르말린 중에 고정시키고 톨루이딘 블루로 절편을 염색하였다.

전자 현미경 검경을 위한 조직 고정 및 염색의 프로토콜은 문헌[Trachtenberg, Annuals of Botany, 1984, 53, pp.227-236]에 기재된 것에 따라 실시하였다. 간략히 설명하면, 새로운 펄프 조직 블록을 0.2M 카코딜레이트-HCl 완충액(pH 7.2) 중의 4% 글루타르알데히드 중에서 실온하에 2 시간 동안 고정시킨 다음, 상기 완충액 중의 2% 사산화오스뮴 중에서 2시간 동안 고정시켰다. 이 조직을 탈수시키고, 수지에 침지시킨 후 절편화하였다. 이 조직 절편을 우라닐 아세테이트로 염색한 뒤, Zeiss 10C 전자 현미경을 사용하여 조사하였다. 잎 절편의 광학 현미경 검경 결과, 펄프(3)는 육각형 형태를 나타내는 큰 투명 엽육 세포로 구성되어 있음을 알 수 있었다(도 2). 이 세포의 크기는 매우 크고, 보통 넓이가 300 ㎛ 이상이었다. 이 세포들의 벽은 맑고 투명하였다. 외피(1) 중의 세포는 펄프 중의 세포(3)와 비교하였을 때 훨씬 작았다(도 2). 전자 현미경 검경은 세포벽(6) 외에도, 극히 한정된 수의 퇴행성 세포 소기관(8)과 함께 펄프 중의 유일한 세포막인 액체 겔(7)을 나타내었다(도 3). 녹색 외피와 관다발(2)중에서는 핵과 엽록체 및 기타 세포 소기관, 예컨대 미토콘드리아 만이 관찰되었다(도 2).

실시예 2

세포벽 섬유질의 광학현미경 검경

BAM 2㎎/㎖을 물에 용해시켰다. 이 용액을 실온에서 3 시간 동안 또는 4℃에서 하룻밤동안 교반하였다. 그 다음, 저속(1000rpm 또는 180g)으로 15분 동안 원심분리하였다(Beckman TJ-6). 펠릿을 수거하여 물로 1회 세척하고 건조하였다(Centrivap, Labconco). 건조후 펠릿의 중량을 측정하였다. 이 펠릿중 소량을 광학 현미경(Olympus BH-2)으로 조사하였다. 펄프 추출물 유래의 불용성 펠릿 물질은 저배율(4x)에서 섬유질로 관찰되었고, 고배율에서는 전술한 투명 펄프 세포벽과 외관이 동일한 맑은 투명 시이트로 관찰되었다. 약간의 균질화시, 이 섬유질 중 일부는 엽육 세포의 본래 구조적 특징을 그대로 유지하였다. 이러한 관찰 역시 불용성 섬유질이 펄프 엽육 세포벽에서 유래하는 것임을 시사한다.

실시예 3

알로에 펙틴의 추출

세포벽 섬유질의 제조. 알콜 처리 및 비알콜 처리된 2종류의 세포벽 섬유질을 사용하였다. 알콜 처리된 섬유질은 BAM으로부터 원심분리를 통해 분리하였다. BAM 2㎎/㎖을 물에 용해시켰다. 그 다음, 이 용액을 180g에서 10분동안 원심분리하였다. 세포벽으로 구성된 펠릿을 수거하고, 물로 3회 세척한 다음 건조하였다. BAM은 알콜 침전시킨 것이기 때문에, 이 섬유질은 다른 식물 조직에서 펙틴을 추출할 때 일반적으로 제조되는 알콜 불용성 잔류물 또는 고체(AIS)와 유사하다.

비알콜 처리된 섬유질은 미정제 펄프와 외피 섬유질을 포함한다. 미정제 펄프 섬유질은 BAM 및 다른 펄프계 산물의 생성 동안 조여과를 통해 보유되는 것이었다. 이 섬유질은 크기가 보다 크고 알콜 처리되지 않은 것임을 제외하고는 BAM에서 발견되는 것과 동일하였다. 이 섬유질을 손실이 최소이도록 18번 체(개공 1㎜)로 수거하고 물로 3회 세척하였다. 전체 잎의 약 60% 습윤 중량에 해당하는 녹색 외피는 일반적으로 제조업자들에 의해서는 폐기물로서 분류되는 것이다. 이 외피에는 적당량의 녹색 외피 뿐만 아니라 필렛팅 후에도 잔존하는 일부 펄프를 포함하였다. 균질화 후 펄프로부터 섬유질을 분리하는 것과 유사한 방식으로 외피로부터 섬유질을 분리하였다. 이 섬유질을 물로 3회 이상 충분히 세척한 다음, 건조하고 펙틴 추출에 이용하기 전까지 실온에서 보관하였다.

추출. 킬레이트화제 EDTA를 사용하여 세포벽 섬유질로부터 알로에 펙틴을 추출하였다. 섬유질 0.2 내지 2%(w/v)를 물에 현탁시켰다. EDTA 스톡 용액은 0.5M의 농도와 pH 7.0 또는 8.0으로 제조한 뒤, 섬유질 현탁액에 첨가하였다. 사용된 EDTA의 최종 농도는 25mM이었다. 섬유질 현탁액의 최종 pH는 NaOH를 사용하여 소정의 pH로 조정하였다. 추출은 실온에서 또는 가열하에, 또는 연속 방식, 즉 RT 추출 후 HT 추출하에 교반하면서 실시하였다. HT는 최대 80℃까지 실시한 다음, 분리 단계 전에 정지하였다. 연속 추출에서는, RT 추출 후 남은 섬유질을 세척하지 않고 동량의 물에 재현탁시키고, RT 추출에서와 동일한 농도로 새 EDTA를 첨가하였다(도 4). 추출 후, 남은 섬유질을 원심분리로 제거하거나 18번 체로 여과한 다음 가아제 스폰지 여과하여 제거하였다. 가아제 스폰지(4x4, 8겹)는 3 조각을 함께 사용하여 디스크 필터 프레임에 장착하였다. 이 스폰지는 사용하기전 물로 세척하였다. 가아제 스폰지 여과는 체 여과후 남은 작은 섬유질들을 제거하는데 매우 효과적이었다. 필요한 경우, 추출물을 스폰지 필터를 통해 2회 통과시켰다. 여과액은 거의 투명하였다. 연속 추출로부터 얻은 생성물의 정량 분석을 위해, RT에서 1차 추출한 후에는 항상 원심분리하여 섬유질을 제거하였다. 이 투명 상청액 또는 여과액에 알콜(에탄올)을 최종 농도가 75%(w/v)가 되게 첨가하였다. 침전물을 원심분리(500g,15분) 또는 18번 체를 사용하여 수거하고 75% 알콜로 2회 세척하였다. 이 알콜 세척 단계는 잔류 EDTA를 제거하는데 필수적이다. 그 다음, 침전물을 압착하여 알콜을 제거하고, 건조한 뒤, 사용할 때까지 RT에서 보관하였다.

킬레이트화제 EDTA를 이용한 알로에 펙틴의 추출은 매우 효과적인 것으로 확인되었고, 그 수율은 50%(w/w) 정도로 높게 나타났다. 얻어진 펙틴은 평균 갈락트우론산 함량이 70%(w/w) 이상이었다(표 1). pH는 EDTA 추출시 펙틴 수율에 주요 영향을 미치는 것으로 관찰되었다(표 2). 5㎎/㎖의 수중 섬유질 현탁액은 pH가 약 3.7(3 내지 4)이었다. pH 8.0의 EDTA 스톡 용액을 최종 농도가 25mM가 되게 첨가한 후에는 섬유질 현탁액의 pH가 7.7(7.5 내지 8.0)이었다. pH 7.0의 EDTA 스톡 용액을 최종 농도가 25 mM가 되게 사용한 경우에는 pH 6.4(6.3 내지 6.5)가 얻어졌다. pH 5.0은 펙틴 추출의 일반적 조건인 pH 5.0의 아세트산나트륨 완충액을 최종 농도가 20mM이 되게 사용하여 얻어졌다. pH 5.0 내지 7.7에서 RT 추출한 후의 수율에는 큰 차이가 없는 것으로 관찰되었다(표 2). 하지만, pH의 주요 효과는 HT 추출시 관찰되었다. 새 섬유질을 HT 추출하는 동안 pH 5.0 또는 pH 6.4를 사용하였을 때 보다 pH 7.7에서는 수율이 〉20% 증가하였다(표 2). 또한, 1차 RT 추출후 남은 섬유질을 새로운 pH 8.0 EDTA를 첨가하여 HT에 추출하는 경우, pH 7.0 EDTA를 사용하는 경우보다 수율이 거의 2배 증가하는 것으로 관찰되었다(표 2). RT 추출 완료시 섬유질 현탁액의 pH 값은 크게 변하지 않았다(표 3). 하지만, 물에 재현탁하고 새 EDTA를 첨가한 후, 현탁액의 pH(~8.5)는 EDTA 스톡 용액(pH 8.0)의 pH보다 훨씬 높았다(표 3). 또한, HT 추출하에 새 섬유질을 사용하여, pH 8.5 추출이 pH 5.0에서의 추출보다는 2배 이상, pH 7.7에서의 추출보다는 ~40% 높은 수율을 제공한다는 것을 확인하였다(표 4). 하지만, pH를 9.0으로 증가시킨 경우에는 pH 8.5와 비교하였을 때 수율의 더 큰 증가(〈10%)를 나타내지 않았다. 또한, 후속 실험을 통해 pH 8.5에서의 RT 추출에 의해 수율이 크게 증가(20%)한다는 것을 확인하였다(표 4).

RT는 추출 동안 HT 보다 효율적이지 못하였다. RT 추출의 시간을 연장시키기만 한다면 두 조건 사이의 수율은 유사하였다. RT 추출에 의한 그 수율은 최대 ~4시간까지 소요되었다. 추출 시간을 더욱 연장시켜도 수율은 더 이상 크게 증가하지 않았다. HT하의 제2 추출의 수율은 제1 RT 추출의 길이에 따라 변화하였는데, 즉 HT하의 수율은 RT 추출이 단지 1 시간 동안만 수행된 경우에는 높을 것이고, RT 추출이 4 시간 이상동안 수행된 경우에는 더 낮을 것이다(표 2).

동일 조건하에서의 반복 추출은 점진적으로 수율의 저하를 나타내었다. 각 추출시마다 수율이 약 1/2씩 감소하였다. 따라서, 남은 섬유질은 이전 추출시 부피의 1/2에 현탁시킬 수 있다.

EDTA 및 섬유질 농도 역시 추출 효율에 영향을 미쳤다. 2 ㎎/㎖ 섬유질 현탁액에 대하여 25mM EDTA를 사용한 경우, HT하의 1회 추출 후 50 내지 60% 사이의 수율이 얻어졌다. 이와 동일한 EDTA 농도를 5 ㎎/㎖ 섬유질 현탁액에 사용한 경우에는, 수율이 약 30%로 감소하였다. 도 4에 도시된 바와 같이 연속 RT 추출 및 HT 추출을 실시한 경우에는, 쉽게 40 내지 50%의 총 수율이 얻어졌다. 알콜 처리 섬유질 및 비알콜 처리 섬유질 사이의 수율의 차이는 크게 없었다.

알로에 베라 추출을 위하여 다른 킬레이트화제도 사용해보았다. 암모늄 옥살레이트는 독성제로 보고 있기 때문에 사용하지 않았다. 나트륨 헥사메타포스페이트를 사용하여 상당한 수율을 얻었다. 하지만, 이 제제는 알콜 용액 중에서 침전물을 형성하기 때문에 제거하기가 어려웠고, 산(HCl 또는 HNO₃) 침전 단계는 알콜 세척 이전에 필요하였다.

또한, 알로에 펙틴 추출을 위한 다른 조건에 대해서도 조사하였다. 고온 희석산 및 저온 알칼리 용액이 펙틴 추출의 2가지 다른 일반 조건이다. 이 조건들은 모두 분해를 충분히 유발할 수 있다. 감귤류 및 사과 유래의 시판 펙틴은 고온 희석산 조건하에 추출하였다. 알로에 펙틴에 대해서도 이러한 조건을 사용하여, 섬유질 현탁액의 pH를 HCl로 1.5로 조정한 다음 최대 80℃ 까지 가열하였다. 얻어지는 수율은 EDTA 추출을 사용하는 경우와 비교하였을 때 보다 훨씬 낮았다(표 5). 단지 물에서의 HT에 의한 추출은 사실상 알콜 침전성 물질을 얻지 못한다. 리나울트와 티바울트[Renault and Thibault, Carbohydrate Research, 1993, 244, pp.99-114]는 HT(80℃)을 이용한 PBS(pH 6.5) 중에서의 사과 및 사탕수수 섬유질의 추출이 EDTA 추출의 경우와 유사하게 높은 수율을 생성한다고 보고한 바 있다. 이러한 조건을 사용하였을 때, 알로에 베라 펄프 섬유질에서는 낮은 수율만이 얻어졌다(표 5). 저 알칼리 추출은 50 mM NaOH 또는 50 mM Na₂CO₃를 사용하여 4℃에서 실시하였다. 현탁액 중의 pH는 50 mM NaOH를 사용하는 경우 11.5이고, 50 mM Na₂CO₃를 이용하는 경우 10.5이었다. 4℃에서 1 시간 후, 50mM Na₂CO₃에 의해 얻어지는 수율은 매우 낮았다. 50 mM NaOH를 사용한 경우에는 알콜 침전성 물질은 얻지 못하였다. RT에서 1시간 동안 추출을 실시한 경우에, NaOH 또는 Na₂CO₃에 의해 얻어지는 수율은 전혀 없었는데, 이는 이러한 조건하에서 펙틴이 빠르게 분해한다는 것을 암시한다.

종합해보면, 이상의 결과들은 pH 7.0 내지 8.5의 EDTA를 사용한 추출법이 알로에 펙틴을 얻을 수 있는 가장 효과적인 추출법이라는 것을 시사하였다. 도 4에 개략된 연속 RT 내지 HT 추출 도식을 이용하는 경우, HMW 및 LMW 펙틴 모두의 생성과 함께 고수율(40 내지 50%, w/w)을 얻을 수 있다. 이 추출 절차의 특징은 사용된 높은 pH(7.0 내지 8.5)이다. 이와 같은 높은 pH를 사용하는 이유는 알로에 펙틴이 본래 알칼리 조건하에 β-제거에 보다 내성적인 LM(하기 기재)이고, 7.0 이상의 pH에서 가장 효과적으로 작용하기 때문이다. 또한, EDTA는 7.0 이상의 pH에서 용해성이 커서, 알콜 침전 및 세척 단계 동안 더 쉽게 제거될 수 있다.

녹색 외피 섬유질은 pH 8.0 EDTA로 추출하였을 때 펄프 섬유질과 비교하여 유사한 수율의 펙틴을 생성하였다(표 6). 이 외피 펙틴은 GalA와 마찬가지로 고농도이었다(표 1). 외피에서 얻어지는 섬유질의 양은 펄프(잎의 단위당)에서 얻어지는 섬유질 양의 10배 이상이었다(표 6). 이러한 결과는 외피가 펄프에 비해 훨씬 적은 수의 세포로 구성되어 있다는 사실과 일치하는 것이다(도 2 및 도 3). 종합해보면, 이 결과들은 현재 일부 제조업자에 의해서는 폐기물로서 버려지고 있는 잎의 외피 부분으로부터 매우 다량의 알로에 펙틴을 얻을 수 있음을 시사한다.

LM/HMW 알로에 펙틴을 거의 실온에서 EDTA로 추출하는 경우, 작업가능한 pH 범위는 약 5 내지 약 8.5, 바람직하게는 약 8 내지 8.5인 것으로 나타났다. LM/LMW 알로에 펙틴을 고온(예컨대, 약 80℃)에서 EDTA로 추출하는 경우, 작업가능한 pH 범위는 약 5 내지 약 8.5, 바람직하게는 약 8.0인 것으로 나타났다. 고온에서 다른 원료로부터 HM 펙틴을 EDTA 추출하는 경우 pH가 6.5 이상이면, 생성물을 분해시킬 수 있다. EDTA 또는 기타 다른 킬레이트화제를 사용하여 다른 식물 원료로부터 펙틴을 추출하는데 있어, 보고된 pH 범위는 4 내지 6.5 이다.

실시예 4

이온 교환 크로마토그래피에 의한 펙틴 정제

이온 교환 크로마토그래피는 파마시아 바이오테크 AKTA 탐침 크로마토그래피 시스템을 사용하여 실시하였다. 컬럼으로는, 5㎖ 카트리지가 연속으로 결합된 3 Pharmacia Hi-trap Q를 사용하였다. 알로에 펙틴을 1㎎/㎖ 농도로 물에 용해시키고, 유속이 1㎖/min인 컬럼 상에 장입하였다. 물 15㎖로 세척한 후, 결합된 물질을 NaCl의 선형 구배(0 내지 1.0M)를 사용하여 용출시켰다. 컬럼 용출제는 215nm, 254nm 및 280nm에서의 UV 흡광도로 모니터하였다. 펙틴을 함유하는 분획은 저속 원심분리로 침전물을 만들어 수거하고 모은 뒤 물에 재용해시켰다. 그 다음, Sephadex G-25 컬럼을 통해 통과시켜 탈염시켰다. 펙틴 함유 분획을 수거하고, 건조한 뒤, 실온에서 저장하였다.

알로에 펙틴의 갈락투론산 함량

세포벽 섬유질의 기원^*	EDTA 추출 조건⁺	UA 함량(%, w/w)	DM^#(%,mol/mol)	페놀(%,w/w)
펄프,BAM20926(AP B1)	약알칼리, HT	64	-	-
펄프,BAM20926(AP B8)	산성, HT	89	-	-
펄프,BAM20926(AP B8-2)	약알칼리, HT	85	-	-

펄프,BAM10679(AP B9)	산성, HT	84	-	-
펄프,BAM10679(AP B9-2)	약알칼리, HT	86	-	-
펄프,BAM10679(AP B10)	산성, HT	69	-	-
펄프,BAM10679(AP B14)	산성, HT	87	-	-
펄프,BAM10679(AP B15)	약알칼리, RT	81	35	0.064
펄프,BAM10679(AP B15-2)	약알칼리, HT	79	40	0.036
펄프,BAM10679(AP 10679)	약알칼리, HT	77	9.4	0.05

펄프, 미정제(AP B16)	약알칼리, RT	93	1.1	〈0.03
펄프, 미정제(AP B16-2)	약알칼리, HT	92	17.5	〈0.03
펄프, 미정제(AP 97-1)	약알칼리(RT ＆ HT)	91	4.4	〈0.03

외피, 미정제(AP 외피B1)	약알칼리, RT	81	4	0.045
외피, 미정제(AP 외피B1-2)	약알칼리, HT	84	9.5	0.041
외피, 미정제(AP 외피B2)	약알칼리, RT	75	-	0.219
^*BAM(벌크 아세틸화 만난) 다음의 수는 BAM 롯트 번호이고, 알로에 펙틴 일련 번호는 괄호안에 기재한 것이며, -2는 RT 추출 후 HT 추출에 의해 얻어지는 펙틴을 의미한다.⁺약알칼리, pH 7.0 내지 8.5; 산성, pH 5.0; RT, 실온; HT, 가열^#DM, 메틸화도

각종 추출 조건하에 얻어지는 알로에 펙틴 수율(%, w/w)

	추출 온도⁺	추출 조건^*
	추출 온도⁺	pH 7.0 EDTA 및 20mM pH 5.0 NaOAc(pH 5.0)	pH 7.0 EDTA(pH 6.4)	pH 8.0 EDTA(pH 7.7)
실험1	HT	22	26	32.3

실험2	RT(1 hr)	-	14.4	16
	HT	-	15	24.4
	전체 수율	-	29.4	40.4

실험3	RT(4 hr)	28(DM=30%)^#	31.6(DM=29%)	30(DM=19%)
	HT	5.6	5.8	13.5
	전체 수율	33.6	37.4	43.5
* 5㎎/㎖ 미정제 펄프 섬유질 현탁액을 사용하였다. 괄호안의 수는 EDTA 첨가후의 섬유질 현탁액의 pH를 나타낸다. + RT, 실온; HT, 가열 # DM, 메틸화도

EDTA를 이용한 추출 전과 후의 섬유질 현탁액의 pH

	추출 조건^*
	pH 7.0 EDTA 및20mM pH 5.0 NaOAc	pH 7.0 EDTA	pH 8.0 EDTA
EDTA 첨가후의 pH	5.0	6.4	7.7
RT 추출후의 pH	5.06	6.4	7.74
재현탁하고, 새EDTA첨가 후 HT 추출하기 전의 pH	5.15	6.8	8.56
* pH 3.5인 5㎎/㎖미정제 펄프 섬유질 현탁액을 사용하였다. RT, 실온; HT, 가열

EDTA 추출에 의한 알로에 펙틴 수율(%, w/w)에 미치는 pH 효과에 대한 추가 평가

		EDTA 존재하에 가열에 의한 추출^*
섬유질 원료	추출 온도⁺	pH 5.0(20mM pH 5.0 NaOAc 중의 pH 7.0 EDTA)	pH 7.7(pH 8.0 EDTA 단독물)	pH 8.5(pH 8.0 EDTA 및 NaOH를 이용한 pH 조정)
펄프, 미정제	HT	18(DM=27%)^#	32.4(DM=29%)	44.8(DM=30%)
외피,미정제	RT	26(DM=〈10%)	26(DM=〈10%)	32(DM=〈10%)
* 5㎎/㎖ 섬유질 현탁액을 사용하였다. DM, 메틸화도 + RT,실온; HT,가열 # DM, 메틸화도

비EDTA계 추출에 의해 수득되는 알로에 펙틴 수율

	추출 조건^*
	수중 가열	pH 1.5(HCl로 조정)에서 가열	pH 6.5에서 가열(pH6.5 PBS)	50mM Na₂CO₃(pH 10.5)4℃에서 1시간	50mM Na₂CO₃(pH 10.5)RT에서 1시간
수율(%,w/w)	0	9.6	10.6	7.5	0
* 5㎎/㎖ 미정제 펄프 섬유질 현탁액을 사용하였다.

녹색 외피 섬유질 유래의 알로에 펙틴 추출

	신선한 알로에 베라 잎
	펄프	외피
분리후 습윤 중량	188g(33%)	376g(67%)

균질화, 18#체 여과 및 세척 후 수득되는 섬유질	0.34g	5.23g

펙틴 수율^*
EDTA-RT(1회)	10.8%(w/w)	17.5%(w/w)
EDTA-HT(2회)	26.4%(w/w)	25.5%(w/w)
전체	37.2%(w/w)	43%(w/w)

펙틴 분말 색	백색-회백색	담녹색-갈색
* 섬유질은 5㎎/㎖로 추출되었고, RT 추출은 1시간동안 실시하였다.

실시예 5

우론산 분석법

m-히드록실디페닐계 우론산 분석법은 문헌[Blumenkratz and Asboe-Hansen(1973), Analytical Biochemistry 54, pp. 484-489]에 개시된 바와 같이 실시하였다. 간략히 설명하면, 발열원 제거된 물 200 ㎕ 중에 용해시킨 샘플 또는 표준물을 0.0125M 사붕산나트륨을 함유하는 농축 H₂SO₄1.2㎖와 혼합한 다음, 즉시 얼음에 집어넣었다. 샘플을 그 다음 비등수 중에 5분 동안 방치한 뒤 빙수조 중에서 냉각시켰다. 0.5% NaOH 중의 0.15%(w/v) m-히드록실디페닐 20 ㎕를 각 반응물에 첨가하였다. 혼합한 후, 샘플을 실온에서 30 분 동안 방치하였다. 그 다음, 520 nm에서의 흡광도를 측정하였다. Gal A를 사용하여 표준 곡선을 작도하였다(0, 1, 2, 4, 6, 8 및 10 ㎍). 만노즈는 중성 당 대조군으로서 사용하였다. 모든 샘플은 20㎍ 또는 그 이하의 농도로 시험하였다.

여러 알로에 펙틴의 평균 Gal A 함량은 70% 이상이었다(표 1). 여러 조건하에서 추출시킨 펙틴의 Gal A 함량 간에는 큰 차이가 없었다.

실시예 6

당 조성 및 결합 분석

형광단을 보조로 한 탄수화물 전기영동("FACE")은 당 조성의 분석에 있어 신속하고 간단한 기법이다. 이 기법은 각종 샘플을 1차적 조사 및 비교하는 것으로, FACE 당 조성 분석 키트(Glyco,Inc.)와 함께 구비된 절차에 따라 실시하였다. 간략히 설명하면, 다당류를 2N 트리플루오로아세트산(TFA)으로 100℃에서 5시간 동안 가수분해한 후, 형광 염료(AMAC, 2-아미노아크리돈)로 표지화하고 전기영동하였다. 자외선(Fotodyne 3-3000)으로 탄수화물 밴드를 가시화하였다. 키트에 구비된 중성 당 표준물 외에도 Gal A 및 Glc A도 사용하였다.

TMS 유도체화에 의한 조성 분석 샘플을 2N TFA중에서 105℃하에 2 시간 동안 예비 수성 가수분해시켰다. TFA는 질소하에 증발시켜 제거하고, 부분 가수분해된 탄수화물 잔기는 2M 메탄올성 HCl 중에서 80℃하에 16 시간 동안 메탄올분해시켜 완전히 가수분해시키고 메틸 글리코시드를 얻었다. 메탄올성 HCl은 질소하에 제거하고, 메틸 글리코시드는 메탄올-피리딘-아세트산 무수물 중에서 실온하에 6 시간 동안 N-아세틸화시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물은 Tri-Sil을 사용하여 80℃에서 20분 동안 트리메틸시릴화하였다. 얻어지는 TMS-메틸글리코시드는 대량 선발 검출기를 구비한 30m DB-5 모세관 컬럼을 사용하여 GC-MS로 분석하였다.

결합 분석 초중수소화물 환원을 이용한 메틸화의 하코모리 방법(Hakomori, Journal of Biochemistry, 1984, 55, pp.205-212)을 사용하였다. 샘플을 DMSO 중에 현탁시키고 배쓰형 초음파기로 60℃에서 36 시간 동안 초음파처리하였다. 샘플은 칼륨 메틸설포닐 카르보 음이온(3.6M)을 사용하여 메틸화한 다음, 50 내지 100배 과량의 요오드화메틸을 첨가하였다. 부분 메틸화된 물질은 역상 카트리지 크로마토그래피로 분리하고, 카르복실 환원처리하였다. 샘플을 그 다음 정제하고, 하코모리 절차에 따라 재메틸화시켰다. 샘플을 그 다음 가수분해하고 부분 메틸화된 알디톨 아세탈로 전환시켰다. 얻어지는 PMAA 유도체를 30 m SP-2300 모세 컬럼을 사용하여 GC-MS로 분석하였다.

FACE를 사용한 당 조성의 분석 결과, 추출된 펙틴이 세포벽 섬유질과 비교하였을 때 GalA가 더 고농도임을 확인하였다. 상세한 조성은 TMS 유도체화 및 GC-MS 분석으로 얻었다. 표 7에는, 3가지 샘플, 즉 AP10679, AP10679(실시예 4에 기재된 바와 같이 정제됨) 및 AP97-1의 당 조성을 제시한 것이다(표 1도 참조). 샘플 AP10679는 실시예 3에 기재된 바와 같이 알콜 처리된 섬유질로부터 HT 추출에 의해 얻은 것이다. 샘플 AP97-1은 비알콜 처리된 미정제 섬유질로부터 추출된 시험 생산 샘플이다. 섬유질은 실온에서 2회 추출한 뒤 HT 추출하여 얻었다. 2가지 추출 조건하에서 얻은 펙틴을 합하였는데, RT에서 추출한 펙틴 대 HT 추출로 얻은 펙틴의 비는 ~2:1이었다.

알로에 펙틴의 당 조성(%, mol/mol)

	AP 10679(5)^*	AP 10679(정제)(5)	AP 97-1(5)
Ara	4.2	1.8	4.0
Rha	11.1	4.4	10.3
3-Me-Rha	0.8	0.5	0.8
Fuc	0.6	0.4	0.6
Xyl	3.9	1.2	2.4
Man	1.6	0.3	3.5
Gal	8.5	6.8	14.8
Glc	1.1	0.7	0.4
Gal A	67.5	83	63.2
DM	LM(9.4)(천연)	LM(천연)	LM(4.4)(천연)
DAc	9.0	≤2.8	9.1
총 페놀(%,w/w)	0.058	-	〈0.03
Rha/Gal A	0.16	0.05	0.16
Gal/Gal A	0.13	0.08	0.23
* 괄호안의 수는 참조문헌 번호이다. 참조문헌 목록은 표 12 마지막을 참조하라.

당 조성 분석 결과, Gal A가 주요 당으로서, AP10679에서는 67%이고, AP97-1에서는 63.2%인 것으로 확인하였다. 람노즈와 갈락토즈는 각각 10 내지 11.1% 및 8.5 내지 14.8%를 차지하는 가장 풍부한 중성 당이다. 소량의 중성 당 중에서, 변형 당인 3-OMe-람노즈가 검출되었고, 이것은 총 람노즈의 약 10%를 차지하였다. 당 조성은 두 샘플이 매우 유사하였는데, 단 AP10679에서는 소량(〈0.5%)의 GalNAc 및 글리세롤이 검출되었다.

정제된 AP10679에서는 GalA 함량의 증가 및 중성당 함량의 감소가 관찰되었는데, 이것은 미정제 샘플에서 검출되는 중성 당 중 일부가 펙틴에 관련된 것이 아님을 암시하는 것이다. 람노즈와 갈락토즈는 여전히 가장 풍부한 중성당이었다. 또한, 3-OMe-람노즈 역시 존재하였고, 총 람노즈의 ~10%를 차지하였다.

AP10679 및 AP97-1에 대한 당 결합 데이터는 표 8과 9에 제시하였다. 검출되는 주 결합은 1,4-결합된 GalA 및 1,2-결합된 람노즈가었다. GalA에 대한 1,4-결합은 다른 펙틴과 마찬가지이며, 기타 GalA에 대한 다른 결합은 검출되지 않았다(표 8 및 9). 1,2-결합외에도, 람노즈 잔기는 1,2,4-결합되어 있고, 소량(0.6 또는 0.7%)은 1,2,3-결합되어 있었다. 1,2 및 1,2,4 결합을 가진 람노즈가 총 람노즈 잔기의 대부분을 차지하였는데, 이것은 검출되는 람노즈 잔기의 대부분이 펙틴 골격 중에 존재하는 것임을 암시한다. 두 샘플 모두에서 1,2,3 결합 보다는 1,2,4 결합된 람노즈가 훨씬 많기 때문에, 중성당 측쇄는 람노즈 잔기의 O-4 위치의 골격에 결합될 가능성이 가장 크다.

AP 10679 중의 글리코실 결합

단당류	결합	총면적%^*	면적비
아라비노스	말단(fur)말단(pyr)5-결합(fur)2-결합(pyr)2,3-결합(pyr)	7.20.61.10.70.6	0.390.030.060.040.03
람노즈	말단2-결합3-결합2,3-결합2,4-결합	4.014.72.20.76.3	0.220.80.120.040.34
크실로스	말단4-결합2,4-결합	5.54.81.2	0.30.260.07
푸코스	말단3,4-결합	3.91	0.210.05
만노즈	말단4-결합	1.24	0.070.22
갈락토즈	말단3,4-결합3,6-결합4,6-결합	5.71.40.60.5	0.310.060.030.03
글루코즈	4-결합	2.5	0.14
갈락투론산	말단4-결합	2.818.3	0.151
글루쿠론산	말단2-결합2,4-결합(GalUA/GlcUA)	2.62.30.9	0.140.130.05
* 총면적%는 1,4-결합 갈락투론산에 대하여 정규화하였다.

AP 97-1 중의 글리코실 결합

단당류	결합	총면적%^*	면적비
아라비노스	말단(fur)말단(pyr)5-결합(fur)2-결합(pyr)2,3-결합(pyr)	6.201.60.80.7	0.3400.090.040.04
람노즈	말단2-결합3-결합2,3-결합2,4-결합	3.811.11.50.610.7	0.210.610.080.030.58
크실로스	말단4-결합2,4-결합	6.92.91.1	0.380.160.06
푸코스	말단3,4-결합	3.30.8	0.180.04
만노즈	말단4-결합	2.78.2	0.150.45
갈락토즈	말단3,4-결합3,6-결합4,6-결합	5.31.50.50.6	0.290.080.030.03
글루코즈	4-결합	1.7	0.09
갈락투론산	말단4-결합	2.618.3	0.141
글루쿠론산	말단2-결합2,4-결합(GalUA/GlcUA)	2.32.50.9	0.120.140.05
* 총면적%는 1,4-결합 갈락투론산에 대하여 규정화하였다.

시판 펙틴(미정제)과 비교한 알로에 펙틴의 당 조성(%, mol/mol)

	AP10679(5)^*	AP97-1	사과(1)	사과 K(9)	사과 U(9)	레몬 A(4)	레몬 B(4)	감귤류(8)	감귤류(2)	사탕무(6)
Ara	4.2	4.0	1.4	7.23	3.42	2.9	2.7	1.44	3.3	13.2
Rha	11.1	10.3	2.9	2.03	1.83	1.8	1.4	1.74	1	3.2
3-Me-Rha	0.8	0.8	-	-	-	-	-	-	-	-
Fuc	0.6	0.6	-	-	-	-	-	-	-	-
Xyl	3.9	2.4	2.2	1.24	0.46	0.17	0.16	0.16	0.1	0.3
Man	1.6	3.5	tr	0.11	0.11	0.17	0.16	0.21	0.2	0.3
Gal	8.5	14.8	3.4	9.6	7.43	6.0	6.7	5.41	4.8	7.1
Glc	1.1	0.4	4.7	18.87	8.57	0.5	0.87	0.89	0.6	0.4
Gal A	67.5	63.2	85	64	76.68	88	88	90.2	90	58.8
DM	LM(9.4)(천연)	LM(4.4)(천연)	LM(28)	LM(42)	HM(73.6)	HM(71.5)	HM(72)	-	HM(71.4)	HM(66.6)
DAc	9	9.1	-	-	-	1.4	1.6	-	〈1	25.4
Rha/Gal A	0.16	0.16	0.034	0.004	0.015	0.02	0.016	0.016	0.011	0.054
Gal/Gal A	0.13	0.23	0.04	0.15	0.1	0.068	0.076	0.06	0.053	0.12
분말색	백색/회백색	황갈색	담황색/갈색	황갈색
용액투명도	투명	혼탁	혼탁
* 참조번호. 표12의 마지막에 제시한 참고목록 참조.

다른 정제 펙틴과 비교한 정제된 알로에 펙틴의 당 조성(%, mol/mol)

	AP10679(정제)/Chela^*(5)^#	감귤류 /산⁺(15)	감귤류 /산(2)	사과/Chela(11)	사과/산(9)	사과/산(9)	사과/Chela(12)	사탕무/산(13)	사탕무/Chela(13)	사탕무/Chela(11)
Ara	1.8	1.9	1.8	13	2.77	2.1	4	9.8	2.9	16
Rha	4.4	0.6	0.7	2	1.16	0.58	1	3.1(+Fuc)	1.1(+Fuc)	2
3-Me-Rha	0.5	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Fuc	0.4	-	-	-	-	-	-	-	-	tr
Xyl	1.2	0.2	0.1	1	1.04	0.35	1	0.3	0.3	tr
Man	0.3	0.1	-	-	0.11	-	tr	0.06	0.02	-
Gal	6.8	2.7	3.2	3	5.2	5.02	3	4	3.3	6
Glc	0.7	0.2	0.2	1	2.08	1.75	1	0.2	0.3	tr
Gal A	83	66.3	94	88	87.38	89.95	90	82	92	76
DM	LM(천연)	HM(79.1)	HM(72)	-	HM(75.8)	HM(72.3)	-	HM(62)	HM(60)	-
DAc	≤2.8	2	〈1	-	-	-	-	35	15	-
Rha/Gal A	0.053	0.009	0.007	0.022	0.013	0.006	0.011	(0.038)	(0.012)	0.026
Gal/Gal A	0.08	0.04	0.034	0.034	0.06	0.06	0.033	0.0	0.036	0.078
* Chela, 킬레이트화제로 추출 + 산, 산성 조건하에 추출. # 참조 번호. 표 12의 마지막에 제시된 참고 문헌 목록 참조.

킬레이트화제로 추출한 다른 펙틴과 비교한 알로에 펙틴의 당 조성(%, mol/mol)

	AP10679 (5)^*	AP97-1 (5)	사과 (14)	사과 (12)	사과 (11)	감귤류 (10)	평지씨(3)	해바라기(8)	사탕무(12)	사탕무(15)	감자 (7)
Ara	4.2	4.0	28	15	4.9	4	27	0.75	25	15	2.8
Rha	11.1	10.3	3	2.9	1.6	1	2.0	1.77	2.5	2.2 (+fuc)	2.2
3-Me-Rha	0.8	0.8	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Fuc	0.6	0.6	0.01	0.1	-	-	0.6	-	-	-	0.3
Xyl	3.9	2.4	4	3.9	1.4	〈1	8.2	0.31	-	0.6	0.5
Man	1.6	3.5	1	-	tr	1	3.0	0.1	-	0.3	1.3
Gal	8.5	14.8	8	8.4	6.5	2	9.2	0.68	7.7	5	14.6
Glc	1.1	0.4	1	1.2	3.9	2	3.2	1.18	-	0.7	0.9
Gal A	67.5	63.2	55	67.4	81	90	47	95.6	64.1	76	77.3
DM	LM(9.4)(천연)	LM(4.4) (천연)	HM(82)	HM(75)	HM(60)	HM(79)	-	LM(38.5)(천연)	HM(58)	HM(64)	~50%
DAc	9.0	9.1	13	12	2	2	-	2.01	33	20.6	-
Rha/Gal A	0.16	0.16	0.055	0.043	0.019	0.011	0.045	0.008	0.039	0.029	0.028
Gal/Gal A	0.13	0.23	0.15	0.12	0.08	0.02	0.19	0.01	0.12	0.066	0.189
* 참조 번호. 이하 참고문헌의 목록 참조

표 7, 10, 11 및 12의 참고 문헌

1. Axelos, M.A.V. and Thibault, J.F. (1991). Int. J. Biol. Macromol. 13,

77-82.

2. Axelos, M.A.V., Thibault, J.F., and Lefebvre, J.(1989). Int. J. Biol.

Macromol. 13, 77-82.

3. Eriksson, I., Andersson, R., and Aman, P.(1997). Carbo. Res. 301, 177-185.

4. Kravtchenko, T.P., Voragen, A.G.J., and Pilnik, W.(1992). Carbo. Polymers

18, 17-23, 1992.

5. Analysis reports on Aloe pectins from Complex Carbohydrate Research Center

at University fo Georgia.

6. Guillon, F. and Thilbault, J-F(1990). Carbo. Polymers 12, 353-374.

7. Jarvis, M.C., Hall, M.A., Threlfall, D.R., and Friend, J.(1981). Planta

152, 93-100.

8. Miyamoto, A. and Chang, K.C.(1992). J. Food Sci. 57, 1439-1443.

9. Pilnik, W.(1981) APRIA symposium on fiber in Human nutrition. P.91, Paris.

10. Ros, J.M., Schols, H.A., and Voragen, A.G.J.(1996). Carbo. Res. 282, 271-

284.

11. Renard, C.M.G.C, Voragen, A.G.J., Thibault, J.F., and Pilnik, W.(1990).

Carbo. Polymers I2, 9-25.

12. Renard, C.M.G.C. and Thibault, J-F.(1993). Carbo. Res. 244, 99-114.

13. Roumbouts and Thibault(1986). Carbo. Res. 244, 99-114.

14. Schols et al(1995). Carbo. Res. 275, 343-360.

15. Thilbault, J.F.(1988). Carbo. Polymers 8, 209-223.

16. Thibault, J-F. and Dreu, R.D., Geraeds, C.C.J.M., and Rombouts, F.M.

(1988). Carbo. Polymers 9, 119-131.

결합 실험은 보다 강한 GalA 피크에 중첩되어 있어 조성 실험에서 검출되지 않은 GlcA를 검출하였다(표 8 및 9). 당들 중에서, 갈락토즈는 1,3,4-결합되거나 말단 결합되어 있고, 소량은 1,3,6 또는 1,4,6-결합이기도 하며, 아라비노스(fur)는 1,5 결합 또는 말단 결합성이고, 아라비노스(pyr)는 1,2 결합성, 푸코스는 1,3,4 결합성, 크실로스는 1,4 결합성, 만노즈는 주로 1,4 결합성, 글루코즈는 1,4 결합성, 그리고 GlcA는 1,2 결합성이었다. 1,4 결합된 만노즈는 펄프 엽육 세포 내부의 액체 겔에서 발견되는 만난에 대한 결합과 유사하다. 즉, 1,4 결합된 만노즈의 존재는 엽육 세포벽 섬유질과 결합 상태를 유지하는 잔류 액체 겔의 결과물일 가능성이 있다.

실시예 7

산성 다당류 겔 전기영동

산성 다당류를 분리하기 위한 겔 전기영동은 바이오래드(Bio-Rad) 미니겔 장치를 사용하여 문헌[Misevic, Methods in Enzymology, 1989, 179, pp.95-110]에 개시된 바와 같이 실시하였다. 겔 및 진행 완충액으로서 트리스-붕산(pH 9.0)을 사용하였다. 15% 폴리아크릴아미드 겔이 가장 적당한 것으로 관찰되었다. 겔의 염색에는 알시안 블루를 사용하고, 탈염에는 2%(v/v) 아세트산을 사용하였다.

실시예 8

알로에 펙틴의 효소 분해

알로에 펙틴을 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0) 중에 용해시켰다. 그 다음, 엔도폴리갈락투로나제(EC3.2.1.15)를 다양한 농도(0.25 내지 25mU)로 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 샘플을 즉시 샘플 완충액(pH 9.0)과 혼합하고, 전술한 바와 같은 산성 다당류 겔 전기영동으로 분리하였다.

엔도폴리갈락투로나제는 펙틴 중의 α1,4-결합된 GalA 잔기에 특이적이다. 결과는 이 효소가 알로에 펙틴을 용량 의존적 방식으로 분해하는 바, 효소 농도가 높으면 높을수록, 겔 중의 급속 이동을 통해 알 수 있듯이 남은 펙틴 분자의 크기는 작아졌다. 비펙틴 대조군인 헤파린에서는 이러한 효과가 관찰되지 않았다. 이 결과로부터 알로에 펙틴 중의 GalA 잔기 사이의 결합이 1,4 결합이고, 이 결합의 형태도 α임을 알 수 있었다.

실시예 9

아세틸화, 메틸화 및 총 페놀

아세틸화 및 메틸화

아세틸 기는 히드록실아민 HCl 및 제2철산을 사용한 유도체화로 검출하였다. 표준물로서 아세틸콜린(0.001 내지 0.0005N)을 사용하였다. 샘플을 다양한 농도(0.2 내지 0.8 ㎎/㎖)로 시험하였다. 샘플 및 표준물은 0.001 N 아세트산염 완충액 1㎖ 중에 제조하여, 히드록실아민 HCl 시약(2M 히드록실아민 HCl과 3.5N NaOH의 1:1 혼합물) 2㎖와 혼합하였다. 약 1분 후, 4N HCl 1㎖를 첨가하였다. 혼합후, 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 아세틸기의 양(mol)은 표준물의 선형 회귀 곡선에 외삽하여 결정하였다. 펙틴의 아세틸화도(DAc)는 GalA의 %(몰/몰)로서 나타내었다.

메틸화도(DM)는 문헌[Maness, Analytical Biochemistry, 1990, 185, pp.346-352]에 기재된 선택적 환원 방법을 약간 변형시켜 측정하였다. 펙틴 샘플은 1M 이미다졸-HCl 완충액(pH 7.0)으로 제조하였다. 각 시험을 위해, 1 ㎎ 샘플을 400 ㎕씩 사용하였다. NaBH₄(40 ㎎)를 첨가하고, 샘플을 얼음상에 1 시간 동안 방치시켜 메틸 에스테르화된 GalA 잔기를 선택적으로 환원시켰다. 그 다음, 아세트산 0.1㎖를 첨가하여 남아있는 NaBH₄를 제거하였다. 샘플을 물 0.5㎖로 희석하고, 95% 에탄올 4 부피량을 사용하여 펙틴을 침전시켰다. 건조 후, 샘플을 물에 용해시키고, GalA 함량은 전술한 바와 같이 측정하였다. 대조군에도 NaBH₄를 첨가하는 것을 제외하고는 동일한 단계로 처리하였다. DM은 다음과 같은 식으로 결정하였다.

DM=[(대조군내 Gal A mol - 환원물 내 Gal A mol)/대조군내 Gal A mol]x100

알콜 침전 및 건조 단계는 결과에 영향을 미침이 없이 제외시킬 수 있음을 확인하였다. 즉, 아세트산을 첨가한 후, 물 9.5㎖를 첨가하여, 펙틴 농도를 우론산 분석의 상한치인 0.1 ㎎/㎖ 또는 20㎍/200㎕으로 만들었다.

전체 페놀의 측정

롬부츠와 티바울트[Rombouts and Thibault, Carbohydrate Research, 1986, 282, pp.271-284]에 기재된 방법을 사용하였다. 물 0.6㎖ 중의 펙틴 샘플을 폴린시오칼튜(Folin-Ciocalteu) 시약 0.6㎖와 혼합하였다. 3분 후, 1M 탄산나트륨 0.6㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 RT에서 1시간 동안 방치한 후, 750 nm 흡광도를 측정하였다. 표준물로서 페룰산을 사용하였다. 펙틴 샘플은 시약과 혼합된 후 약간의 침전물을 형성하였다. 이 침전물은 무색으로서, 3,000 rpm에서 15분 동안 원심분리로 제거한 후, 750nm 흡광도를 측정하였다.

메틸화, 아세틸화 및 전체 페놀

선택적 환원법으로 얻은 결과로부터, 알로에 펙틴의 DM이 40% 이하, 종종 〈10%인 것을 알 수 있었다(표 1). 시그마 케미컬 컴패니(Sigma Chemical Co.)에서 입수한 두 펙틴 샘플의 DM(감귤류 LM 및 감귤류 HM)은 상기 방법으로 측정하였을 때, 공급자가 제공하는 수치(각각 28% 및 64%)와 일치하는 24%(±3.5) 및 58%(±3.5)이었다.

RT 추출법으로 얻어지는 알로에 펙틴의 DM은 HT 추출법으로 얻어지는 DM과 비교하였을 때 5 내지 10% 낮았다(표 1). 또한, pH 7.7에서의 RT 추출은 pH 5.0 또는 6.4에서의 RT 추출과 비교하였을 때 DM이 -10% 더 낮은 펙틴을 생성하는 것으로 나타났다(표 2). 이 결과는 RT에서 pH를 증가시키는 것이 β-제거에 비해 탈메틸화 반응에 유리하다는 사실과 일치하는 것이었다. 이에 반해, HT 추출은 여러 pH(5.0 내지 8.5)에서 실시한 결과 차이가 없는 것으로 관찰되었다(표 4).

외피 펙틴 역시 LM이었다(표 1). 실제로, 전술한 바와 같이 DM이 10% 낮은 것으로 나타났다(표 1 및 4). 이것은, 외피 펙틴이 본래 펄프 펙틴의 DM에 비하여 DM이 훨씬 낮을 수 있다는 것을 암시한다.

아세틸화는 전술한 화학적 방법으로 측정하였다. AP 10679 및 AP97-1은 각각 DAc가 9.0% 및 9.1%인 것으로 나타났다. 하지만, 정제한 AP 10679의 DAc는 ≤2.8%로 확인되었다. 이것은 알로에 펙틴의 아세틸화도가 낮다는 것을 암시한다(표 7).

알로에 펙틴은 극소량의 페놀(0 내지 0.22%, w/w)을 함유한다(표 1).

실시예 10

크기별 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 분자량 측정

SEC는 TSK-Gel G5000 PWXL 컬럼(Toso Haas)을 사용하여 실시하였다. 샘플은 0.05%(w/v) 아지화나트륨을 함유한 물 중에 0.3㎎/㎖의 농도로 제조하였다. 샘플 50㎕를 주입하고, 0.05% 아지화 나트륨으로 1㎎/㎖의 속도로 용출시켰다. 굴절률은 횡대로 측정하였다. 풀루란(4.04x10⁵, 7.88x10⁵및 1.66x10⁵Da)은 표준물로서 사용하였다. 표준물의 선형 회귀선을 기초로 분자량을 측정하였다.

알로에 펙틴은 일반적으로 단지 1개의 주피크를 나타내었다. 이것은 다른 펙틴과 마찬가지였다. RT 추출로 얻은 알로에 펙틴은 평균 분자량이 1.1x10⁶(0.785 내지 1.36x10⁶Da)으로 HT 추출에 의해 얻은 알로에 펙틴의 평균 크기 1.9x10⁵(0.375 내지 6.08x10⁵Da)보다 약 5배 더 컸다. RT 추출의 잔류 섬유질로부터 HT에 의해 추출한 펙틴은 새로운 섬유질에서 HT로 추출한 펙틴과 분자량이 유사하였다.

또한, 펙틴의 크기는 산 다당류 겔 전기영동으로 분석하였다. 겔 전기영동에 의해 얻어지는 프로필은 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 얻어진 결과와 일치하는 것으로, 즉 RT 추출에 의해 얻어지는 펙틴의 크기는 HT 추출에 의해 얻어지는 펙틴의 크기보다 훨씬 컸다(겔에서 더 느리게 이동). 또한, 이 기법을 사용하여 저pH(5.0)에서 HT로 추출한 펙틴은 RT 추출에서 얻은 펙틴과 크기가 비슷한 것으로 확인되었다. 이것은, 가열도 중요하지만, 얻어진 펙틴의 크기를 측정하는데 있어, pH가 가장 중요한 인자라는 것을 암시한다. 이러한 발견은 펙틴의 일반적 성질과 일치하는 것으로, 즉 펙틴은 저pH(3 내지 4)와 저온에서 가장 안정하다.

종합해보면, 저pH(5.0)에서 RT 추출 또는 HT 추출에 의해 얻어지는 펙틴은 고분자량 (HMW) 펙틴으로 분류되고, pH7.0 이상에서 HT 추출에 의해 얻어지는 펙틴은 저분자량(LMW) 펙틴으로 분류된다. 따라서, 크기별로 구분되는 2가지 알로에 펙틴은 추출 온도를 변화시켜 쉽게 얻을 수 있다. 이는 도 4에 개략된 연속 추출 방식에 따라 가장 잘 수행될 수 있다.

HMW 알로에 펙틴의 평균 크기(1.1x10⁶Da)는 LMW 알로에 펙틴의 크기와 비슷한 시판용 펙틴(0.7 내지 1.4x10⁵Da)의 크기보다 상당히 크다. 이러한 크기 차이를 확인하기 위하여, 3가지 시판용 감귤류 펙틴 샘플, 즉 하나는 LM(P-9311, lot74H1092; 시그마 케미컬 컴퍼니)이고 2개는 HM(P-9436, lot96H0788; 시그마 케미컬 컴퍼니 및 PE100, lotJR071, 스펙트럼 케미컬 컴퍼니)인 샘플을 동일 조건하에서 SEC로 분석하였다. 크기는 HMW 알로에 펙틴의 크기에 비해 매우 작은 2.0 내지 4.6x10⁵Da 범위이었다. 감귤류 펙틴의 크기는 보통 사과 펙틴의 크기보다는 크다(Pilnik and Voragen, Advances in Plant Biochemistry and Biotechnology, 1992, 99, pp.219-270).

실시예 11

점도

고유 점도는 우벨호데 점도계(No.2)를 사용하여 측정하였다. 펙틴을 0.0005 내지 0.2%(w/v)의 농도로 0.1M NaCl에 용해시켰다(Owens, Journal of the American Chemical Society, 1946, 68, pp. 186-191). 고유 점도(η)는 2중 휴긴스(η_sp/c=η+k¹η²c) 및 크라에머([lnη_rel]/c=η+ k¹η²c) 외삽법(0차 농도)을 사용하여 측정하였다(Axelos and Thibault, International Journal of Biological Macromolecules, 1989, 11 pp.186-191; Doublier and Cuvelier, Carbohydrates in Food, ed. A.C. Eliasson, Marcel Dekker, New York, 1996, pp. 283-318). 이 2가지 방정식에 의해 얻어지는 값의 평균을 MW와 비교하여 표 13에 제시하였다.

최고 고유 점도(978 ㎖/g)는 RT 추출에 의해 얻어지는 외피 펙틴에서 얻어졌다. HMW 알로에 펙틴의 고유 점도는 일반적으로 LMW 펙틴보다 높았다. HMW 알로에 펙틴의 고유 점도는 또한 여기에서 시험된 사과 펙틴 및 시판용 감귤류 펙틴의 고유 점도가 일반적으로 더 높았다. 이것은, HMW 알로에 펙틴과 시판용 펙틴간의 분자량 차이에 일치하는 것이다.

알로에 펙틴의 고유 점도

펙틴	섬유질 원료	크기(Da)	고유 점도(η,㎖/g)
AP 97-1	펄프, 미정제	1.36 x 10⁶(HMW)	740
AP 10679	펄프, BAM	3.75 x 10⁴(LMW)	68
AP B15	펄프, BAM	7.87 x 10⁵(HMW)	262
AP B15-2	펄프, BAM	6.45 x 10⁴(LMW)	68
AP B16	펄프, 미정제	1.06 x 10⁶(HMW)	550
AP B16-2	펄프, 미정제	6.08 x 10⁵(LMW)	337

AP 외피 B1	외피, 미정제	ND^*	978
AP 외피 B1-2	외피, 미정제	ND	523
AP 외피 B2	외피, 미정제	ND	846

시그마 LM 감귤류	-	2.18x10⁵	51
시그나 HM 감귤류	-	2.02x10⁵	178
스펙트럼 HM 감귤류	-	4.56x10⁵	297
HF HM 감귤류	-	ND	201
HF HM 사과	-	ND	277
* 측정되지 않음

실시예 12

칼슘 겔 형성

다양한 농도의 알로에 펙틴 수용액을 시판용 LM 및 HM 펙틴과 함께 다양한 농도의 염화칼슘 용액과 혼합하였다. RT에서 최대 24시간동안 방치한 후, 튜브를 뒤집었다. 샘플이 쉽게 유동한다면 겔 형성이 일어나지 않은 것으로 간주하였다. 샘플이 자신의 중량하에서 유동하거나 변형하지 않았다면 겔형성이 일어난 것이다. 샘플이 유동하지 않았지만 변형(즉, 표면이 튜브를 수평 위치로 유지했을 때 형성되는 튜브의 면과 수직인 직선을 유지하지 못한 경우)되었다면 샘플은 연질 겔로 간주하였다. 실험 결과는 펄프 또는 외피 섬유질에서 RT 또는 HT 추출에 의해 얻은 알로에 펙틴은 LM 감귤류 펙틴 및 폴리갈락투론산과 마찬가지로 칼슘의 존재하에 단단한 겔을 형성하는 것으로 관찰되었다(표 14). 동일한 조건하에, HM 감귤류 펙틴은 겔을 형성하지 못하였다. 이 결과는 알로에 펙틴이 LM 펙틴이라는 사실과 일치하는 것이다. 감귤류 및 사과 유래의 펙틴은 본래 HM 펙틴이다. LM 펙틴은 HM 펙틴을 탈메틸화하여 얻는다. 알로에 펙틴의 추출 동안에는 어떤 극한 조건이 사용되지 않기 때문에(특히 RT 추출의 경우), 알로에 펙틴은 천연 LM 펙틴이다.

0.2% 알로에 펙틴 용액의 경우, 겔 형성에 필요한 염화칼슘의 최소 농도는 1 내지 2mM(50 내지 100㎎ CaCl₂/g 펙틴)인 것으로 측정되었다. 펙틴 및/또는 염화칼슘의 농도를 증가시키면, 겔은 서서히 더욱 단단하게 되었다. 겔 형성에 소요되는 시간과 겔의 경도를 통해 알 수 있듯이 HMW 알로에 펙틴이 LMW 알로에 펙틴에 비하여 보다 쉽게 겔을 형성하는 것으로 관찰되었다.

이온 강도를 증가시키면 칼슘 겔 형성이 용이해진다. 겔 형성의 속도는 일정량의 염화칼슘을 첨가한 후 NaCl 농도(0 내지 0.2M)를 증가시킴에 따라 서서히 증가하였다.

실시예 13

1가 양이온에 의한 겔 형성

알로에 펙틴을 다양한 농도로 물에 용해시켰다. 이 펙틴 용액을 동등량의 0.3M NaCl(2x식염수), 0.3M NaCl 및 40mM 아세트산나트륨(pH5.0), 또는 2xPBS(pH 7.4)와 RT에서 혼합하였다. 최종 부피는 1 또는 2㎖이었다. 튜브(12x75㎜)를 그 다음 4℃의 냉장고 또는 얼음상(0℃)에 방치하였다. 겔 형성은 실시예 12에서와 같이 판단하였다. 튜브는 그 다음 RT으로 꺼내어 겔이 용액으로 복귀되는지를 측정하였다. 겔 형성에 대해 다양한 NaCl 농도(0.05 내지 1M)를 시험하였다. 또한, 칼륨염(KCl)도 시험하였다. 이 염과 펙틴 용액은 항상 동등 부피(1:1)로 혼합하였다. 겔 형성시 엔도폴리갈락투로나제의 효과를 측정하기 위하여, pH5.0의 아세트산염 완충액을 최종 농도가 20mM이 되게 펙틴 용액에 첨가하였다. 그 다음 상기 효소를 소정의 농도로 첨가하였다. RT에서 30 분 동안 방치한 후, 그 용액을 동등 부피의 0.3M NaCl과 혼합한 다음 얼음상에 방치하였다. 겔 형성은 전술한 바와 같이 조사하였다.

0.15M NaCl(생리식염수) 중의 알로에 펙틴 용액은 4℃로 냉각하였을 때 겔이 얻어졌다. 이 겔은 4℃로 유지시켰을 때 칼슘겔과 같이 단단하고 자유직립성이지만, RT(22℃)이 되면 빠르게 용액화되었다. 이러한 가역적 용액-겔 전이는 온도 변화를 통해 수회라도 반복될 수 있었다.

HMW 및 LMW 알로에 펙틴에 의해 효과적으로 일어나는 칼슘 존재하의 겔 형성과 달리, 1가 양이온에 의한 겔 형성은 펄프 또는 외피 섬유질에서 얻어지는 HMW 알로에 펙틴에 대해서만 효과적으로 나타났다. 분자량이 〉1x10⁶Da인 샘플 AP97-1과 유사물은 0.15M NaCl의 존재하에 1㎎/㎖만큼의 저농도에서도 단단한 겔을 형성할 수 있었다. 이러한 겔은 또한 펙틴 농도가 5㎎/㎖ 이하일 때 투명하였다. 펙틴 농도(〉5㎎/㎖)가 증가하면, 겔은 더 단단해지지만 약간 혼탁해졌다. 1㎖ 용량의 경우, 겔은 튜브를 얼음에 배치한 후 약 15분내에 형성되었고, RT로 복귀시킨 후 거의 동일 시간내에 용액화되었다. 하지만, 겔은 15℃ 정도의 온도에서는 용액으로 변하지 않았다. 겔은 pH7.4(PBS 중) 뿐만 아니라 pH5.0(20mM pH 5.0의 아세트산나트륨을 함유한 식염수 중)에서도 형성되었다.

LMW(0.375 내지 6.08x10⁵Da) 알로에 펙틴은 고농도(≥5㎎/㎖)에서만 상기와 같은 겔을 형성하였다. 1㎎/㎖에서는, 0.15M NaCl 중의 일부 LMW 샘플에 의해 연질 겔만이 형성되었다. 가장 작은 알로에 펙틴 샘플(0.375x10⁵Da)은 0.15M NaCl 중의 1㎎/㎖인 경우 겔을 형성하지 않았다. 이 샘플에 의한 연질 겔은 펙틴 농도가 0.2M NaCl 중에서 10㎎/㎖인 경우 형성되었다. 이것은, 1가 양이온에 의한 겔 형성의 효율이 펙틴 분자의 크기에 좌우된다는 것을 암시한다. 실시예 8에 관찰된 바와 같이, 알로에 펙틴은 엔도폴리갈락투로나제에 의해 분해될 수 있다. 따라서, 20mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 중에 AP97-1 펙틴 2㎎/㎖을 용해시킨 용액 300 ㎕를 다양한 농도의 상기 효소로 분해한 후, 동등량의 0.3M NaCl과 혼합하고 얼음상에 방치하였다. 결과적으로, 대조군(효소가 첨가되지 않음)은 겔을 형성한 반면, 최고 농도의 효소를 첨가한 샘플은 용액 상태로 남아있었다(표 15). 대조군과 최고 효소 농도 사이의 샘플은 용액과 겔 중간의 전이 상태를 나타내었는데, 즉 최소 효소 농도에서 완전한 용액이 되기 전까지의 효소 농도에서는 농도의 증가에 따라 겔이 더욱 연화되었다. 이러한 결과는 1가 양이온에 의한 겔 형성에 있어 알로에 펙틴 분자의 크기가 중요한 인자라는 것을 시사한다.

겔 형성은 또한 NaCl 농도에도 좌우되었다. 0.1M NaCl에서는 AP97-1과 같은 샘플에 의해서만 연질의 겔이 얻어졌다. 0.15M 및 0.2M NaCl이 되었을 때 단단한 겔이 형성되었다. 0.15M NaCl에 의해 형성된 겔은 RT로 복귀되었을 때 완전 가역성인 반면, 0.2M NaCl에 의해 형성된 겔은 특히 HMW 알로에 펙틴의 경우 쉽게 가역화되지 않았다. RT에서 1 시간 또는 그 이상 동안 방치한 후, 0.2M NaCl에 의해 형성된 겔은 종종 용해 작용을 일으켰는데, 즉 겔로부터 액체가 분리되었다. 고농도 NaCl(≥0.4M)을 사용한 경우에는 RT에서 침전물을 형성하였다. 침전물은 백색이고 높은 NaCl 농도(0.6 내지 1M)에서 무정형이었다. 0.4M NaCl에서는 미세과립으로 나타났다.

이러한 저온 겔화는 사용되는 1가 양이온의 종류에 매우 민감하다. KCl(0.05 내지 1M)의 경우에, RT에서 고농도의 KCl(≥0.4M)에 의해 침전물은 형성시켰지만 저온 겔 형성을 일으키지는 못하였다.

높은 염 농도와 RT에서의 펙틴의 침전은 이미 관찰한 바 있다. 하지만, 생리적 조건(0.15M NaCl, pH 7.4)하에서 상기 가역성 1가 양이온(NaCl)에 의한 저온 겔화는 어떤 다른 펙틴에 의해 실험된 바가 없다. 즉, 이러한 겔화 시스템은 문헌에 보고된 임의의 다른 중합체 또는 물질에 의해 확인된 바 없는 것이다. 시판용 폴리갈락투론산, LM 펙틴 및 HM 펙틴을 사용한 경우에는 이러한 1가 저온 겔화가 형성되지 않았다.

실시예 14

조절 방출용 캡슐화제로서의 알로에 펙틴의 용도

캡슐화를 위해 APase 및 APase-항체(APase-Ab) 접합체를 사용하였다. 이것을 선택한 이유는 APase 기재 pNPP를 사용하여 방출 활성을 직접 측정할 수 있기 때문이다. 10 또는 15㎎/㎖ 농도의 알로에 펙틴 수용액을 최종 농도가 10 내지 20 ㎍/㎖인 APase 또는 APase-Ab와 혼합하였다. 이 혼합물을 RT에서 200mM CaCl₂배쓰에 약 30분 간에 걸쳐 적가하여 직경이 약 1㎜인 비드를 만들었다. 액을 따라 내어 분리한 비드를 세척하고, 4℃의 수중에 방치하였다. 먼저, 펙틴 농도와 펙틴 분자의 크기와 관련하여 자발적인 방출을 조사하였다. 방출 실험을 위해, 동일한 수의 비드(3 내지 5개)를 물이나, 식염수(150mM NaCl), TN 완충액 또는 NaCl을 포함하지 않는 다양한 pH의 완충액 100 ㎕ 중에서 실온하에 2시간 동안 항온처리하였다. 10 mM 아세트산나트륨 완충액을 사용하여 pH 3 내지 5를 얻었고, Tris 완충액을 사용하여 pH 6 내지 8을 얻었다. 항온처리 말에 항온처리 배지 10㎕를 취하여 APase 기질(pNPP) 100㎕와 혼합하였다. 15분 후, 2M NaOH 50㎕를 사용하여 반응을 정지시키고 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.

결과를 통해, 펙틴 농도가 10㎎/㎖ 이상일 때 자발적 방출을 효과적으로 억제할 수 있으며, 크기가 보다 큰 펙틴이 보다 효과적으로 표적 제제를 포집할 수 있는 것으로 관찰되었다(도 5a 및 도 5b). 그 다음, 방출을 자극할 수 있는 조건을 조사하였다. 포집된 효소는 식염수(150mM NaCl) 또는 pH 7.0 이상에서만 방출되는 것으로 관찰되었다(도 5c). TN 완충액(25mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4)으로 대표되는 상기 2가지 조건의 조합이 가장 효과적인 방출을 제공하였다(도 5c).

본 실험에 사용된 단백질 분자는 크기가 큰 것(APase, 140kDa; APase-IgG, ~350kDa)이지만, 상기 결과들은 알로에 펙틴-칼슘 겔에 의한 방출 기작이 염농도 및 pH에 의해 조절된다는 것을 분명하게 시사하고 있다. 따라서, 생리적 조건(150mM NaCl, pH 7.0 내지 7.4)은 비드가 생체내 전달된 즉시 방출을 개시시킬 것이지만, 저장 조건에서는 방출을 전혀 나타내지 않거나 또는 최소의 방출만을 일으킬 것이다. 이러한 알로에 펙틴-칼슘 겔 캡슐화 시스템은 항체 및 백신과 같은 단백질 분자용으로 적합하다.

알로에 펙틴의 겔 형성 및 메틸화도(DM)

	알로에 펙틴	감귤류 펙틴	감귤류 펙틴	폴리갈락투론산
Ca⁺⁺겔 형성	유	유	무	유
DM	LM(〈50%)	LM(〈28%)	HM(64%)	0

1가 양이온(NaCl) 존재하에 알로에 펙틴의 저온 겔화에 미치는 엔도폴리갈락투로나제의 효과

	엔도갈락투로나제(유니트/㎖)
	0	0.053	0.105	0.21	0.42
겔 형성	경질 겔	경질 겔	연질 겔	보다 연질 겔	액체

실시예 15

항원 항체 침전 반응용 신규 매트릭스로서 1가 양이온계 알로에 펙틴 겔의 용도

침전 분석은 병원균 특이적 항원 또는 항체를 검출하는데 일반적인 측정 방법이다. 이 방법은 항체 용액 위에 항원 용액을 조심스럽게 중층시키거나 그 반대로 실시하는 것을 포함한다. 중층 단계는 중요한 단계로, 두 용액 간에 혼란을 유발하지 않도록 주의를 기울여야 한다. 확산의 결과로서 두 용액간의 백색 침전선의 형성은 양성 결과를 나타내는 것이다. 별법으로, 이 분석은 한천 확산분석법이라고도 불리는 한천에서도 실시된다. 이 분석법은 한천의 제조를 포함하고 결과를 얻는데 더 오랜 시간이 소요된다.

4℃의 PBS에서 겔을 형성하는 HMW 알로에 펙틴의 성질을 통하여 보다 간단한 신규 분석을 디자인하게 되었다. 제1 용액을 4℃에서 고체 상태로 유지하여, 제2 용액이 쉽고 일정하게 제1 용액의 상부에 중층될 수 있도록 하는 것이다. 실온으로 복귀시키면, 겔은 비점성 용액으로 다시 변하여 확산을 일으킬 수 있다.

이러한 잠재적 용법을 시험하기 위하여, 마우스 IgG(항원)와 항마우스 IgG 항체(항체)를 사용하였다. 다양한 농도의 항원 10㎕를 PBS 중의 1㎎/㎖ 농도의 AP97-1 0.4㎖와 혼합하였다. 튜브를 그 다음 얼음 상에 방치하고, 겔이 형성되었을 때 PBS 중의 항체 용액 200 ㎕를 겔에 직접 첨가하였다. 튜브를 그 다음 실온으로 복귀시켰다. 30분 후, 두 용액 사이에 침전선이 나타났다. 펙틴의 유무에 관계없이 실온에서 항원을 항체 용액에 첨가하였을 때, 침전선 또는 확산 침전선 조차도 관찰되지 않았다. 이것은 알로에 펙틴 겔을 매트릭스로서 사용하면 항원 항체 침전 테스트를 단순화할 뿐만 아니라 테스트 감도도 향상시킬 수 있음을 암시한다.

실시예 16

초임계 유액에 의한 추출

세포벽 섬유질(실시예 3에서 얻어짐)을 초임계 유액(SF) 추출 세포에 충전한 다음 밀봉하였다. SF 발생기를 가동시키고, 온도와 압력에 있어 바람직한 조건에 도달하면 그 즉시 적당한 유속으로 SF를 추출 세포에 펌프 주입하였다. 펙틴 고농도의 방출액을 감압실에서 냉각시켰다. 그 다음, 냉각액을 처리하여 펙틴을 분리하였다. 1가지 분리 방법은 상기 유액 또는 부분 증발액에 수용성 유기 용액, 예컨대 에탄올을 첨가하여 펙틴을 침전시키는 것이다. 침전물을 그 다음 여과 또는 원심분리로 분리하고 건조하였다. 또한, 펙틴은 동결 건조 또는 증발을 통해 유액을 제거하여 유액으로부터 분리할 수 있다. SF 추출에 사용되는 유액은 물 또는 산이나 염기, 완충액염 또는 수용성 유기 개질제, 또는 이 첨가제들의 임의의 혼합물을 포함하는 수용액일 수 있다. 이 공정은 약 300℃ 내지 약 800℃ 사이의 온도와 약 200 atm 내지 약 1000 atm 사이의 압력에서 작동될 수 있다.

실시예 17

효소를 이용한 알로에 펙틴의 추출

세포벽 섬유질을 물로 세척하고, 사용되는 효소의 최대 활성을 제공하는 완충액 중에 적당한 농도로 현탁시킨다. 사용될 수 있는 효소로는 엔도아라비나제, 엔도갈락타나제 및 람노갈락투로나제가 있다. 엔도폴리갈락투로나제는 천연 HM 펙틴에 사용할 수 있지만 본래 LM 펙틴인 알로에 펙틴에는 적합하지 않다. 그 다음, 효소를 첨가한다. 이 섬유질 현탁액을 20 내지 37℃에서 일정 시간(1 내지 24시간) 동안 유지시킨다. 남은 섬유질은 여과로 제거한다. 펙틴을 알콜로 침전시킨 후, 건조시킨다.

실시예 18

미생물을 이용한 알로에 펙틴의 추출

세포벽 섬유질을 물로 세척하고, 물에 적당한 농도로 현탁시킨다. 세포벽으로부터 펙틴을 해리시킬 수 있는 효소를 생산하는 세균나 곰팡이 같은 미생물을 상기 섬유질 현탁액에 첨가한다. 이러한 세균 중 일 예가 바실러스 서브틸리스이다. 생산되는 효소로는 엔도아라비나제, 엔도갈락타나제, 엔도폴리갈락투로나제, 및/또는 람노갈락투로나제가 있다. 주로 엔도폴리갈락투로나제를 생산하는 미생물은 알로에 펙틴이 본래 LM 펙틴이기 때문에 피하는 것이 좋다. 추출은 20 내지 37℃에서 일정 시간(5 내지 24 시간) 동안 지속한다. 남은 섬유질은 조여과로 제거한다. 여과물을 그 다음 미세필터를 통해 통과시켜 미생물을 제거한다. 최종 여과물을 알콜(에탄올)과 혼합한다. 펙틴 침전물을 수거하여 건조시킨다.

실시예 19

약리학적 제제의 저장 매트릭스로서의 1가 양이온계 겔의 용도

약리학적 제제는 흔히 0 내지 8℃의 완충 또는 비완충 생리 식염수(0.15M NaCl) 중에 저장한다. 약리학적 제제는 동물이나 식물 같은 생물계에 생리적 영향을 미치는 모든 물질을 의미한다. 이 물질을 저장시 종종 발생하는 문제는 시간 경과에 따른 침전 및 응집물 형성이다.

알로에 펙틴의 1가 양이온에 의한 열적 가역성 겔은 극소량의 펙틴(1㎎/㎖)에 의해 저온(4℃)에서 생리적 조건(0.15M NaCl, pH 7.4)하에 형성될 수 있다. 겔 중에 약리학적 제제를 주입하면 응집의 기회를 감소시키는 매트릭스가 얻어진다. 1가 양이온계 겔은 RT(22℃)로 복귀하는 즉시 용액으로 빠르게 복원되고 저장 제제를 용액 형태로 사용할 수 있게 된다.

생리 식염수(0.15M NaCl) 중에 용해시킨 모델 단백질인 소혈청 알부민(BSA)을 0.15M NaCl 중의 2㎎/㎖ 알로에 펙틴과 동등량으로 혼합하였다. 그 결과, 최종 BSA 농도는 20㎎/㎖이고, 최종 알로에 펙틴 농도는 1㎎/㎖ 이다. 이 혼합물을 얼음상에 방치한 결과, 15분 후 겔이 형성되었다. 이는 1가 양이온계 겔이 고농도 생물 제제를 보유할 수 있음을 시사하는 것이다.

블랙 인디아 잉크는 현탁액을 미혼란 상태로 유지할 때 시간 경과에 따라 침전하는 경향이 있는 미세 탄소 입자로 제조된다. 1가 양이온계 겔이 침전을 방지하는 작용을 할 수 있는지를 입증하기 위하여, 블랙 인디아 잉크를 상기 겔 시스템에 첨가하였다. 블랙 인디아 잉크(Higgins, Faber-Castell Corporation, NJ)는 0.15M NaCl 중에 1000배로 희석하였다. 희석 잉크를 0.15M NaCl 중의 2㎎/㎖ 알로에 펙틴 또는 대조군으로서 0.15M NaCl과 동등량으로 혼합하였다. 이 혼합물을 얼음상에 방치하였다. 펙틴을 함유한 혼합물을 빠르게 겔을 형성하였고, 대조군은 용액 상태를 유지하였다. 그 다음, 두 샘플을 4℃에 저장하였다. 48시간 후, 대조군 용액의 상부는 하부에 비해 희미해졌고, 바닥은 농후한 흑색 영역을 형성하고 있었다. 이는 인디아 잉크 입자의 침전을 의미하는 것이다. 한편, 겔은 균일한 흑색이었고, 튜브 바닥에서도 농후한 흑색 영역이 관찰되지 않았다. 겔이 RT에서 용액으로 복원되었을 때에도, 용액은 균일한 흑색이었다. 이는, 겔이 응집을 초래할 수 있는 제제의 침전을 방지함을 시사하는 것이다.

실시예 20

알로에 펙틴의 물리적, 화학적 특성

최종 생성물 및 용액의 외관 펄프 섬유질에서 얻은 건조 알로에 펙틴은 외관이 회백색이다. 이 색은 감귤류 펙틴으로부터 제조된 폴리갈락투론산을 포함하는 감귤류 및 사과의 시판 펙틴 및 해바라기 펙틴과 같이 현재 개발 중인 기타 다른 펙틴과는 매우 대조적이다. 사과 및 해바라기 펙틴은 모두 황갈색이고, 감귤류 펙틴은 밝은 황갈색이다. 이와 같이 펄프로부터 얻은 알로에 펙틴의 우수한 색 품질은 펄프의 투명하고 무색성 때문인 것으로 추정된다.

물에 용해시켰을 때, 5㎎/㎖ 농도의 알로에 펙틴 용액은 거의 투명한 반면, 시판 펙틴은 다양한 정도의 혼탁도를 나타냈고, 그 중 사과 펙틴이 가장 혼탁하였다. 이러한 관찰은 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 확인하였다(표 16). 펄프 섬유질에서 추출한 알로에 펙틴의 600 nm에서의 흡광도는 기타 다른 펙틴의 흡광도보다 2배 이상 낮았다.

녹색 외피 섬유질로부터 얻은 알로에 펙틴은 감귤류 펙틴과 유사한 정도의 연녹갈색 분말의 색을 나타내었다. 그 용액은 펄프 펙틴에 비해 투명도가 적었지만, 최상의 감귤류 펙틴만큼은 투명하였다(표 16).

OD 600nm에서 측정된 펙틴 수용액의 혼탁도

원료	펙틴(5㎎/㎖ 수용액)	OD 600nm
알로에 펄프	AP 10679	0.028
	AP 97-1	0.044

알로에 외피	AP 외피 B1(RT)	0.084
	AP 외피 B1-2(IIT)	0.110

시판품	감귤류(LM), 시그마	0.103
	감귤류(HM), 시그마	0.082
	감귤류, 시그마	0.176
	감귤류, 스펙트럼	0.136
	감귤류, HF	0.272
	사과, HF	0.345
	폴리갈락투론산(감귤류), 시그마	0.206

특성 개요

다른 펙틴과 비교했을 때, 알로에 펙틴은 약간의 독특한 특징을 나타낸다. 먼저, 알로에 펙틴은 람노즈 함량이 보다 높다. 이 특징은 문헌에 보고된 실험용 펙틴 및 시판 펙틴과 비교하였을 때 미정제 및 정제 알로에 펙틴 모두에서 나타나는 성질이다(표 10 및 11). 또한, 이것은 추출 조건에 따라 나타나는 성질로, EDTA로 추출한 알로에 펙틴은 이와 유사한 방식(킬레이트화제 사용)으로 추출한 다른 펙틴과 비슷하였다(표 12). 알로에 펙틴 중의 람노즈 함량은 다른 펙틴의 대응 형태와 비교하였을 때 미정제 샘플의 경우에는 3배 이상 높고, 정제 샘플의 경우에는 2배 이상 높았다. 이러한 차이는 알로에 펙틴 중의 람노즈/GalA 비가 마찬가지로 높다는 사실을 통해 더욱 실체화되었다. 골격당인 람노즈는 골격의 유연성에 중요한 영향을 미치는 바, 람노즈 농도가 많을수록 분자의 유연성을 더욱 커질 것이다. 따라서, 알로에 펙틴은 다른 펙틴에 비해 유연성이 더 클 것으로 예상된다. 이것은 알로에 펙틴의 다소 독특한 리올로지 특성을 제공할 수 있다.

또한, 알로에 펙틴은 희귀 당인 3-OMe-람노즈를 함유한다(표 7). 이것은 정제 AP 10679를 비롯한 모든 샘플에서 검출되었다. 그 함량은 총 람노즈의 약 10%를 차지하였다. 이 변형 당의 존재는 다른 펙틴에서는 전혀 보고된 바가 없다. 본 발명의 알로에 펙틴은 섬유질이 비교적 없다. 이와 같이 얻어진 알로에 펙틴의 섬유질 함량은 약 20 중량% 이하, 바람직하게는 약 5 중량% 이하, 보다 더 바람직하게는 약 1 중량% 이하이다.

미정제 펄프 및 외피 섬유질로부터 추출되는 알로에 펙틴의 기타 다른 성질에 대해서는 표 17에 요약하였다.

이상, 분리된 알로에 펙틴의 조성 및 이 펙틴을 얻고 사용하는 바람직한 방법에 대하여 개시하였지만, 당업자라면 전술한 교시에 비추어 다양한 변형 및 수정을 실시할 수 있음을 잘 이해할 것이다. 또한, 이러한 변형 및 수정이 다음 청구의 범위에 기재된 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는다는 것도 당업자에게는 자명한 것이다.

미정제 펄프 및 외피 섬유질로부터 추출된 알로에 펙틴의 특성 개요

섬유질 원료

추출 온도

분말색

용액 투명도

MW(Da)

고유 점도 (η,㎖/g)

Gal A 함량(%, w/w)

DM

DAc

페놀(%,w/w)

Ca⁺⁺겔화

Na⁺겔화

AP B16

펄프

RT

회백색

투명

1.06x 10⁶

550

93

11

ND^*

〈0.03

+

AP B16-2

펄프

HT

회백색

투명

6.08x 10⁵

337

92

18

ND

〈0.03

+

±⁺

AP 97-1

펄프

RT/HT

회백색

투명

1.36x 10⁶

740

91

4.4

9.1

〈0.03

+

AP 외피 B1

외피

RT

담갈색^#

혼탁^#

ND

978

81

4.0

ND

0.045

+

AP 외피 B1-2

외피

HT

담갈색

혼탁

ND

523

84

9.5

ND

0.041

+

±

AP 외피 B2

외피

RT

담갈색

혼탁

ND

846

75

ND

0.219

+

* 측정안됨 + 연질겔 # 색 및 혼탁도가 추가 알콜 세정으로 크게 감소될 수 있음

Claims

메틸화도 약 50 mol% 미만,

람노즈 함량 약 2 내지 약 15 mol%,

3-O-메틸 람노즈 함량 약 0.1 내지 약 5 mol%, 및

칼슘염 용액의 존재하에 겔을 형성할 수 있는 특성 중 하나 이상의 특성을 갖고, 알로에 잎으로부터 초임계 유액, 수용성 유기 용매, 산, 알칼리, 킬레이트화제, 세균, 효소 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 추출에 의해 분리되는 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 초임계 유액에 의한 추출이 온도 약 300℃ 내지 약 800℃에서 압력 약 200 atm 내지 약 1000 atm 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 산에 의한 추출이 온도 약 0℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 0.5 내지 약 3 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 산에 의한 추출이 온도 약 60℃ 내지 약 90℃에서 pH 약 1 내지 약 2 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 알칼리에 의한 추출이 온도 약 0℃ 내지 약 22℃에서 pH 약 9 내지 약 13 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 알칼리에 의한 추출이 온도 약 0℃ 내지 약 4℃에서 pH 약 10 내지 약 11 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 킬레이트화제에 의한 추출이 온도 약 20℃ 내지 약 100℃, pH 약 3 내지 약 7에서 EDTA에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 킬레이트화제에 의한 추출이 온도 약 20℃ 내지 약 100℃, pH 약 7 내지 약 9에서 EDTA에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 펙틴의 분자량이 약 10⁴달톤 내지 약 10⁷달톤인 것이 특징인 알로에 펙틴.
제9항에 있어서, 분자량이 약 10⁴달톤 이상인 알로에 펙틴은 온도 약 -10℃ 내지 약 10℃에서 나트륨염 용액에 의해 겔을 형성하고, 이 겔은 온도가 약 15℃ 이상으로 상승할 때 용액으로 복원되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제10항에 있어서, 나트륨염 용액의 농도가 약 0.1M 내지 약 0.5M인 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 알로에 펙틴의 메틸화도가 약 50% 미만인 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 알로에 펙틴의 고유 점도가 약 100 ㎖/g 내지 약 2000 ㎖/g인 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 추출 후 이온 교환 수지로 알로에 펙틴을 더 정제하여 정제된 알로에 펙틴을 얻는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제14항에 있어서, 메틸화도가 약 50 mol% 미만인 것이 특징인 정제된 알로에 펙틴.
제14항에 있어서, 람노즈 함량이 약 3 내지 약 6 mol%인 것이 특징인 정제된 알로에 펙틴.
제14항에 있어서, 3-O-메틸 람노즈의 함량이 약 0.1 mol% 이상인 것이 특징인 정제된 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 추출이 초임계 유액에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 추출이 산 또는 알칼리에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 추출이 킬레이트화제에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제1항에 있어서, 추출이 세균 또는 효소에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
메틸화도 약 30 mol% 미만,

람노즈 함량 약 3 내지 약 15 mol%,

3-O-메틸 람노즈 함량 약 0.1 내지 약 5 mol%,

칼슘염 용액의 존재하에 겔을 형성할 수 있는 특성,

1가 양이온계 겔을 형성할 수 있는 특성 및 분자량 약 10⁴내지 약 10⁷달톤 중 하나 이상의 특성을 갖고, 알로에 잎으로부터 초임계 유액, 수용성 유기 용매, 산, 알칼리, 킬레이트화제, 세균, 효소 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 추출에 의해 분리되는 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 초임계 유액에 의한 추출이 온도 약 300℃ 내지 약 800℃에서 압력 약 200 atm 내지 약 1000 atm 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 산에 의한 추출이 온도 약 0℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 0.5 내지 약 3 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 산에 의한 추출이 온도 약 60℃ 내지 약 90℃에서 pH 약 1 내지 약 2 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 알칼리에 의한 추출이 온도 약 0℃ 내지 약 22℃에서 pH 약 9 내지 약 13 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 알칼리에 의한 추출이 온도 약 0℃ 내지 약 4℃에서 pH 약 10 내지 약 11 하에 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 킬레이트화제에 의한 추출이 온도 약 20℃ 내지 약 100℃, pH 약 3 내지 약 7에서 EDTA에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 킬레이트화제에 의한 추출이 온도 약 20℃ 내지 약 100℃, pH 약 7 내지 약 9에서 EDTA에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 분자량이 약 10⁴달톤 이상인 알로에 펙틴은 온도 약 -10℃ 내지 약 10℃에서 나트륨염 용액에 의해 겔을 형성하고, 이 겔은 온도가 약 15℃ 이상으로 상승할 때 용액으로 복원되는 것임이 특징인 알로에 펙틴.
제30항에 있어서, 나트륨염 용액의 농도가 약 0.1M 내지 약 0.5M인 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 알로에 펙틴의 메틸화도가 약 30% 미만인 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 알로에 펙틴의 고유 점도가 약 100 ㎖/g 내지 약 2000 ㎖/g인 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 추출 후 이온 교환 수지로 알로에 펙틴을 더 정제하여 정제된 알로에 펙틴을 얻는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제34항에 있어서, 메틸화도가 약 30 mol% 미만인 것이 특징인 정제된 알로에 펙틴.
제34항에 있어서, 람노즈 함량이 약 3 내지 약 6 mol%인 것이 특징인 정제된 알로에 펙틴.
제34항에 있어서, 3-O-메틸 람노즈의 함량이 약 0.1 mol% 이상인 것이 특징인 정제된 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 추출이 초임계 유액에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 추출이 산 또는 알칼리에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 추출이 킬레이트화제에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
제22항에 있어서, 추출이 세균 또는 효소에 의해 실시되는 것이 특징인 알로에 펙틴.
메틸화도 약 30 mol% 미만,

람노즈 함량 약 3 내지 약 15 mol%,

3-O-메틸 람노즈 함량 약 0.1 내지 약 5 mol%,

칼슘염 용액의 존재하에 겔을 형성할 수 있는 성질,

분자량 약 10⁴내지 약 10⁷달톤, 및

약 -10℃ 내지 약 10℃의 온도에서 나트륨염 용액에 의해 겔을 형성할 수 있고, 온도가 약 15℃ 이상으로 상승하면 그 겔이 용액으로 복원하는 특성중 하나 이상의 특성을 갖고,

온도 약 20℃ 내지 약 100℃와 pH 약 3 내지 약 7의 범위에서 EDTA를 사용하여 알로에 잎으로부터 추출에 의해 분리되는 알로에 펙틴.
메틸화도 약 30 mol% 미만,

람노즈 함량 약 3 내지 약 15 mol%,

3-O-메틸 람노즈 함량 약 0.1 내지 약 5 mol%,

칼슘염 용액의 존재하에 겔을 형성할 수 있는 성질, 및

약 10⁴내지 약 10⁷달톤의 분자량(이 중 분자량이 약 10⁵내지 약 10⁷달톤인 알로에 펙틴 분획은 약 -10℃ 내지 약 10℃의 온도에서 나트륨염 용액에 의해 겔을 형성하고, 온도가 약 15℃ 이상으로 상승하면 그 겔이 용액으로 변화함)의 특성중 하나 이상의 특성을 갖고,

온도 약 20℃ 내지 약 100℃와 pH 약 7 내지 약 9의 범위에서 EDTA를 사용하여 알로에 잎으로부터 추출에 의해 분리되는 알로에 펙틴.
알로에 잎의 외피 또는 내부 겔 또는 전 알로에 잎을 균질화하여 균질화된 알로에 물질을 제공하는 단계,

이 균질화된 알로에 물질로부터 불수용성 분획을 얻는 단계, 및

상기 불수용성 분획으로부터 초임계 유액, 수용성 유기 용매, 산, 알칼리, 킬레이트화제, 세균, 효소 또는 이들의 조합에 의해 펙틴을 추출하는 단계를 포함하는, 알로에 펙틴의 제조 방법.
제44항에 있어서, 불수용성 분획이 온도 약 0℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 0.5 내지 약 3 하에 추출되는 것이 특징인 제조 방법.
제44항에 있어서, 불수용성 분획이 온도 약 0℃ 내지 약 22℃에서 pH 약 9 내지 약 13 하에 추출되는 것이 특징인 제조 방법.
제44항에 있어서, 불수용성 분획이 킬레이트화제에 의해 추출되는 것이 특징인 제조 방법.
제44항에 있어서, 불수용성 분획이 EDTA에 의해 추출되는 것이 특징인 제조 방법.
제48항에 있어서, 불수용성 분획이 온도 약 20℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 4 내지 약 7 하에 EDTA에 의해 추출되는 것이 특징인 제조 방법.
제49항에 있어서, 불수용성 분획이 온도 약 20℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 7 내지 약 9 하에 EDTA에 의해 추출되는 것이 특징인 제조 방법.
제44항의 제조 방법에 의해 생산되는 생성물.
제48항의 제조 방법에 의해 생산되는 생성물.
제49항의 제조 방법에 의해 생성되는 생성물.
제50항의 제조 방법에 의해 생성되는 생성물.
알로에 잎의 외피 또는 내부 겔 또는 전 알로에 잎을 균질화하여 균질화된 알로에 물질을 얻는 단계,

상기 균질화된 알로에 물질로부터 불수용성 분획을 얻는 단계, 및

온도 약 20℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 4 내지 약 7 하에 EDTA를 사용하여 상기 불수용성 분획으로부터 펙틴을 추출하는 단계를 포함하여, 알로에 잎으로부터 펙틴을 분리하는 방법.
알로에 잎의 외피 또는 내부 겔 또는 전 알로에 잎을 균질화하여 균질화된 알로에 물질을 얻는 단계,

상기 균질화된 알로에 물질로부터 불수용성 분획을 얻는 단계, 및

온도 약 20℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 7 내지 약 9 하에 EDTA를 사용하여 상기 불수용성 분획으로부터 펙틴을 추출하는 단계를 포함하여, 알로에 잎으로부터 펙틴을 분리하는 방법.
제55항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제56항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
알로에 잎의 외피 또는 내부 겔 또는 전 알로에 잎을 균질화하여 균질화된 알로에 물질을 얻는 단계,

상기 균질화된 알로에 물질로부터 불수용성 분획을 얻는 단계,

상기 불수용성 분획으로부터 알로에 펙틴을 추출하는 단계, 및

상기 알로에 펙틴을 음이온 교환 수지로 처리하여 정제된 알로에 펙틴을 얻는 단계를 포함하여, 정제된 알로에 펙틴을 얻는 방법.
제59항에 있어서, 불수용성 분획이 온도 약 0℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 0.5 내지 약 3 하에 추출되는 것이 특징인 방법.
제59항에 있어서, 불수용성 분획이 온도 약 0℃ 내지 약 22℃에서 pH 약 9 내지 약 13 하에 추출되는 것이 특징인 방법.
제59항에 있어서, 불수용성 분획이 킬레이트화제에 의해 추출되는 것이 특징인 방법.
제59항에 있어서, 불수용성 분획이 EDTA에 의해 추출되는 것이 특징인 방법.
제59항에 있어서, 불수용성 분획이 온도 약 20℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 4 내지 약 7 하에 EDTA에 의해 추출되는 것이 특징인 방법.
제59항에 있어서, 불수용성 분획이 온도 약 20℃ 내지 약 100℃에서 pH 약 7 내지 약 9 하에 EDTA에 의해 추출되는 것이 특징인 방법.
제59항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제60항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제61항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제62항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제63항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제64항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제65항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
온도 약 -10℃ 내지 약 10℃에서 분자량이 약 10⁴달톤 내지 약 10⁷달톤인 알로에 펙틴에 나트륨염 용액을 첨가하는 단계를 포함하여, 온도 가역성 겔을 제조하는 방법.
제73항에 있어서, 나트륨염 용액의 농도가 약 0.1M 내지 약 0.5M인 것이 특징인 방법.
제73항에 있어서, 알로에 펙틴의 농도가 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 20 ㎎/㎖인 것이 특징인 방법.
제73항에 있어서, 나트륨염 용액이 pH 약 3 내지 약 9 하에서 알로에 펙틴에 동등량으로 첨가되는 것이 특징인 방법.
제73항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제74항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제75항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
제76항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
분자량이 약 10⁴달톤 내지 약 10⁷달톤인 알로에 펙틴 또는 정제된 알로에 펙틴을 용액중에서 약리학적 제제와 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계, 및

이 혼합물을 2가 양이온 용액에 첨가하여 비드를 제조하는 단계를 포함하여, 캡슐화된 약리학적 제제를 조절 방출하기에 적합한 비드를 제조하는데 알로에 펙틴 또는 정제된 알로에 펙틴을 사용하는 방법.
제81항에 있어서, 알로에 펙틴 또는 정제된 알로에 펙틴의 농도가 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 20 ㎎/㎖인 것이 특징인 방법.
제81항에 있어서, 2가 양이온이 칼슘 또는 아연인 것이 특징인 방법.
제83항에 있어서, 2가 양이온의 농도가 약 0.05M 내지 약 1M인 것이 특징인 방법.
제81항에 있어서, 혼합물이 pH 약 3 내지 약 9인 2가 양이온 용액에 첨가되는 것이 특징인 방법.
제81항에 있어서, 비드의 크기가 약 1 미크론 내지 약 5 ㎜인 것이 특징인 방법.
제81항의 방법에 의해 제조되는 생성물.
제82항의 방법에 의해 제조되는 생성물.
제83항의 방법에 의해 제조되는 생성물.
제84항의 방법에 의해 제조되는 생성물.
제85항의 방법에 의해 제조되는 생성물.
제86항의 방법에 의해 제조되는 생성물.
용액중 농도가 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 20 ㎎/㎖의 범위이고, 분자량이 약 10⁴달톤 내지 약 10⁷달톤인 알로에 펙틴 또는 정제된 알로에 펙틴을 약리학적 제제와 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계, 및

이 혼합물을 pH 약 3 내지 약 9에서 농도가 약 0.05M 내지 약 1M인 칼슘염 용액에 첨가하여 크기가 약 1 미크론 내지 약 5 ㎜인 비드를 제조하는 단계를 포함하여, 캡슐화된 약리학적 제제를 조절 방출하기에 적합한 비드를 제조하는데 알로에 펙틴 또는 정제된 알로에 펙틴을 사용하는 방법.
제93항의 방법에 의해 제조되는 생성물.
분자량이 약 10⁴달톤 내지 약 10⁷달톤인 알로에 펙틴 또는 정제된 알로에 펙틴 용액에 항원을 첨가하여 혼합물을 만드는 단계, 및

이 혼합물을 약 -10℃ 내지 약 10℃의 온도로 냉각시켜 겔 매트릭스를 제공하는 단계를 포함하여, 항원 항체 침전 반응용 매트릭스를 제조하는 방법.
제95항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
분자량이 약 10⁴달톤 내지 약 10⁷달톤인 알로에 펙틴 또는 정제된 알로에 펙틴 용액에 항체를 첨가하여 혼합물을 만드는 단계, 및

이 혼합물을 약 -10℃ 내지 약 10℃의 온도로 냉각시켜 겔 매트릭스를 제공하는 단계를 포함하여, 항원 항체 침전 반응용 매트릭스를 제조하는 방법.
제97항의 방법에 의해 생산되는 생성물.
분자량이 약 10⁴달톤 내지 약 10⁷달톤인 알로에 펙틴 또는 정제된 알로에 펙틴 용액에 약리학적 제제를 첨가하여 혼합물을 만드는 단계, 및

이 혼합물을 약 -10℃ 내지 약 10℃의 온도로 냉각시켜 저장 매트릭스를 제공하는 단계를 포함하여, 약리학적 제제 물질용 저장 매트릭스를 제조하는 방법.
제99항의 방법에 의해 제조되는 생성물.