KR20230173373A - 패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)의 골질환 예방 또는 치료 용도 - Google Patents

패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)의 골질환 예방 또는 치료 용도 Download PDF

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Abstract

일 양상은 패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A의 골질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따르면, 패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A는 파골세포 분화 관련 인자의 발현을 억제함으로써, 파골세포의 분화를 억제할 수 있다. 따라서, 상기 패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A는 골질환 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)의 골질환 예방 또는 치료 용도 {Use of Ishophloroglucine A or Ishige okamurae extracts for prevention or treatment of osteoporosis}
패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A의 골질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
골조직은 조골세포(osteoblasts)에 의해 형성되고 파골세포(osteoclasts)에 의해 파괴 및 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다. 골의 항상성은 파골세포에 의한 골흡수와 조골세포에 의한 골 형성의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절되어 유지된다.
그러나 파골세포의 지나친 활성이나 조골세포 활성의 저하는 리모델링 과정의 불균형을 초래하여, 골다공증(osteoporosis)과 같은 성인 골격계 질환을 유도한다. 이러한 불균형을 해소하기 위해서 일반적으로 파골세포의 지나친 활성을 억제하거나, 조골세포의 활성을 촉진시키거나, 또는 파골세포의 활성을 억제하고 조골세포의 활성을 촉진하는 방법이 사용되고 있으며, 이들은 골다공증의 치료에 대한 효과적인 치료적 접근 방법으로 인지되고 있다.
파골세포는 조혈모세포의 단핵구로부터 유래되는 세포로서, 마우스의 RAW 264.7 단핵구 세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB ligand)에 의해 융합하여 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다. 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 미토겐 활성 단백질 키나아제 (mitogen-activated protein kinase, MAPK), 또는 NF-κB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시키고, 이를 통해 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현이 증가되는데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수할 수 있다. 특히, 파골세포의 생존 및 골흡수 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달 분자로 밝혀진 ERK와 NF-κB에 의해 파골세포 분화에 특이적인 AP-1 또는 NFAT가 조절될 수 있다고 보고되어 있다. 따라서, RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중 하나로 인지되고 있다.
한편, 패(Ishige okamurae)는 패과에 속하는 갈조류로서, 중국, 일본, 태국 연안에 분포하며, 우리나라에서는 서해안, 남해안, 제주도 해안가의 바위에 붙어 자생한다. 패는 xanthopophyll, fucoxanthin 등을 함유하여 다양한 범위의 생산물에 있어서 alginate 및 항염증, 항산화제의 훌륭한 공급원이 되며, 패의 폴리페놀 성분으로 알려져 있는 phlorotannin은 생리활성 물질로 항플라즈민 억제 효과 및 항산화 활성이 있다고 보고되었다. 패는 이처럼 다양한 생리활성 물질을 함유하지만 골질환 치료에 관한 연구는 미흡한 실정이다.
따라서, 패 추출물 또는 패 추출물 내 유효성분 중 하나인 아이소플로로글루신 A(IPA)의 파골세포 분화 억제 효과를 확인함으로써, 패 추출물 또는 IPA의 골질환 예방 또는 치료 용도를 개발하게 되었다.
한국등록특허 제10-1632111호
일 양상은 패(Ishige okamurae) 추출물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A, IPA)를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 패(Ishige okamurae) 추출물을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)를 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 패 추출물(Ishige okamurae)을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 골질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 패 추출물(Ishige okamurae)의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 골질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)의 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 패(Ishige okamurae) 추출물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 용어 “패(Ishige okamurae)”란, 갈조식물문 갈조강 패과에 속하는 갈조류(brown algae)를 의미하는 것으로서, 상기 패는 딱딱한 나뭇가지처럼 좁은 잎과 두꺼운 외피층, 뾰족한 정점 및 거친 표면 배열을 가지며, 색은 암갈색이고 건조되면 흑색이 되는 특징을 가진다.
상기 패 추출물(Ishige okamurae extracts, IOE)은 패의 줄기, 잎, 열매, 꽃, 뿌리, 지하부, 지상부 또는 이들의 혼합물을 다양한 추출 방법을 이용해 제조되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 패 추출물은, 냉침추출, 온침추출, 열 추출, 초음파 추출, 초임계 추출, 여과법, 열수추출, 침지추출 및 환류 냉각추출로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 추출 방법을 통해 제조되는 것일 수 있다.
또한, 상기 패 추출물이 추출 용매를 통해 제조되는 경우, 상기 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올(메탄올, 에탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 디클로로메탄, 이산화탄소 및 펜탄으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 추출 용매일 수 있다.
또한, 예를 들어, 상기 패 추출물은 물, 에탄올, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 에틸에테르, 헥산 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매로 분획(fractionation)되어 제조되는 것일 수 있다.
상기 “분획”이란 용해도, 크기, 모양 또는 전하와 같은 특징들을 이용하여 혼합물로부터 물리화학적 특성이 다른 물질을 분리하는 과정을 의미한다.
또한, 상기 패 추출물은 동결 건조, 진공 건조, 열풍 건조 또는 분무 건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상 추출물 또는 고형상의 추출물을 포함할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 패 추출물은 파골세포(osteoclasts)의 분화를 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 패 추출물은 파골세포의 분화를 억제함으로써, 파골세포 분화 및 골 흡수에 관련된 유전자 및 파골세포 표지 인자들의 발현이 억제되고, 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
보다 구체적으로는, 일 양상에 있어서, 상기 패 추출물은 CT-R(calcitonin receptor), CTK(cathepsin K), MMP-9, MMP-13, TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), ERK, JNK, IκB, p65, p50, NFATc1, c-Fos, c-Jun, nfkb2 및 foxo1a2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 구체적으로는 CT-R, CTK, MMP-9, MMP-13, TRAP, ERK, JNK, IκB, p65, p50, NFATc1, c-Fos, c-Jun, nfkb2 및 foxo1a2의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 CT-R, CTK, MMP-9, MMP-13, TRAP, nfkb2 및 foxo1a2의 mRNA들의 발현을 억제하는 것일 수 있고, ERK, JNK, IκB, p65, p50, NFATc1, c-Fos 및 c-Jun의 단백질들의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
상기 용어 “파골세포(osteoclasts)”는 여러 개의 핵을 가지는 다핵세포를 의미하고, 상기 파골세포는 골의 성장 및 형성 시 골의 기질을 흡수하는 역할을 한다.
상기 용어 “유전자”는 생물체의 개개의 유전 형질을 발현시키는 원인이 되는 인자를 의미하며, DNA 및 RNA를 포함할 수 있다. 상기 유전자의 발현은 DNA 및 RNA의 발현을 의미할 수 있으며, 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현을 의미할 수도 있다. 따라서, 상기 유전자 발현의 억제는 DNA 발현의 억제, 상기 DNA가 코딩하는 mRNA 발현의 억제 또는 상기 mRNA가 코딩하는 단백질 발현의 억제를 의미할 수 있다.
상기 CT-R, CTK, MMP-9, MMP-13 및 TRAP은 파골세포 분화 및 골 흡수에 관련된 유전자이며, NFATc1, c-Fos 및 c-Jun은 파골세포 표지 인자들의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 nfkb2 및 foxo1a2는 골 형성에 관련된 유전자이며, ERK, JNK 및 NF-κB 관련 유전자인 IκB, p65 및 p50은 NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 발현의 상위 기전으로서 파골세포 표지 인자들의 발현에 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 상기 패 추출물은 파골세포의 분화를 억제함으로써, 상기 유전자들의 발현이 억제되고, 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 “골질환”은 골다공증, 골소공증, 골연화증, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 골형성 부진증, 골감소증, 골위축, 디스크, 구루병, 섬유성 골이형성증, 골파제트병, 외상성 골절 및 피로 골절로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 골질환일 수 있고, 구체적으로, 골다공증, 골소공증, 골연화증, 골형성 부진증 및 골감소증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 골질환일 수 있고, 보다 구체적으로 골다공증일 수 있다.
상기 용어 “예방”이란 골질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 상기 용어 “치료”란 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골질환이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 용어 “투여”는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 약학적 조성물을 개체에게 물리적으로 도입하는 것을 의미한다.
상기 용어 “개체”란 골질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 구체적으로, 인간 또는 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말, 돼지, 토끼 및 소 등의 포유류일 수 있으며, 양서류, 파충류, 조류, 어류 등의 척추동물일 수 있다.
상기 “약학적 조성물”은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 동맥내 주사, 골수내 주사, 심장내 주사, 경막내 주사, 경피주사, 비강내 주사, 장관내 주사, 국소주사, 설하 주사, 또는 흉부내 주사 주입방식과 같은 비경구 투여 및 경구 투여가 가능할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 패 추출물은 1 내지 200 μg/ml의 농도로 개체에 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 패 추출물은 1 내지 40 μg/ml, 1 내지 80 μg/ml, 1 내지 120 μg/ml, 1 내지 160 μg/ml, 1 내지 200 μg/ml, 40 내지 80 μg/ml, 40 내지 120 μg/ml, 40 내지 160 μg/ml, 40 내지 200 μg/ml, 80 내지 120 μg/ml, 80 내지 160 μg/ml, 80 내지 200 μg/ml, 120 내지 160 μg/ml, 120 내지 200 μg/ml 또는 160 내지 200 μg/ml의 농도로 개체에 투여될 수 있다.
상기 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다. 예를 들어, 격일로 투여되는 것일 수도 있으며, 일주일에 하루 투여되는 것일 수도 있다.
상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 새롭게 개발되는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 혼합되어 제공될 수 있다. 상기 약학적 조성물이 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단독 투여 또는 다른 골질환 치료제와 병용 투여되는 것일 수 있다. 즉, 상기 약학적 조성물은 골질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 골질환 치료제와 병행하여 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 파골세포에 패 추출물(IOE)을 각각 25, 50 또는 100 μg/ml의 농도로 5일간 처리한 결과, 파골세포의 주요 마커인 TRAP의 활성도가 패 추출물의 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(실시예 1 (1) 참조).
다른 실시예에 따르면, 파골세포에 패 추출물을 각각 25, 50 또는 100 μg/ml의 농도로 처리하여 파골세포 분화 유도 및 골 흡수 관련 인자인 CT-R, CTK, MMP-9 및 TRAP 유전자의 발현을 측정한 결과, 패 추출물을 25 및 50 μg/ml의 농도로 처리할 경우, CT-R 및 TRAP 유전자 발현이 감소하였으며, 패 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리할 경우, 상기 4가지 유전자 모두 발현이 감소함을 확인하였다(실시예 2 (1) 참조).
또 다른 실시예에 따르면, 파골세포에 패 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리할 경우, ERK, JNK 및 NF-κB 관련 유전자인 IκB, p65 및 p50 유전자의 발현이 감소함을 확인하였고(실시예 3 (1) 참조),
파골세포에 패 추출물을 각각 25, 50 또는 100 μg/ml의 농도로 처리한 뒤, 파골세포 표지 인자들의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 유전자의 발현을 측정한 결과, 패 추출물을 25 및 50 μg/ml의 농도로 처리할 경우, NFATc1 및 c-Fos 유전자의 발현이 감소하였으며, 패 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리할 경우, 상기 3가지 유전자 모두 발현이 감소함을 확인하였다(실시예 3 (1) 참조).
또 다른 실시예에 따르면, 척추뼈 생성이 감소된 제브라피쉬 치어에 패 추출물을 50 μg/ml의 농도로 처리한 in vivo 실험 결과, 파골세포 분화 및 골 형성에 관련된 유전자인 MMP-9, MMP-13, nfkb2 및 foxo1a2의 발현이 감소함을 확인하였다(실시예 4 참조).
일 양상에 있어서, 상기 패 추출물은 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A, IPA)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 패 추출물은 아이소플로로글루신 A를 1 내지 20 중량%로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 패 추출물은 아이소플로로글루신 A를 1 내지 5 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 15 중량%, 1 내지 20 중량%, 5 내지 10 중량%, 5 내지 15 중량%, 5 내지 20 중량%, 10 내지 15 중량%, 10 내지 20 중량% 또는 15 내지 20 중량%로 포함할 수 있다.
상기 “아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A, IPA)”는 패에 존재하는 것으로 알려진 물질로, 하기 화학식 1의 구조로 이루어진 화합물일 수 있다:
[화학식 1]
.
일 실시예에 따르면, 패 추출물 내에서 IPA의 함량을 확인하기 위하여 HPLC 분석을 수행한 결과, IPA의 함량이 3.42 중량%임을 확인하였다(실시예 5 참조).
다른 양상은, 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A, IPA)를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 “아이소플로로글루신 A”, “골질환”, “예방”, “치료”, “약학적 조성물” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 아이소플로로글루신 A는 파골세포(osteoclasts)의 분화를 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 아이소플로로글루신 A는 파골세포의 분화를 억제함으로써, 파골세포 분화 및 골 흡수에 관련된 유전자 및 파골세포 표지 인자들의 발현이 억제되고, 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
보다 구체적으로는, 일 양상에 있어서, 상기 아이소플로로글루신 A는 CT-R, MMP-9, TRAP, ERK, IκB, p65, p50, NFATc1 및 c-Fos로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 구체적으로는 CT-R, MMP-9, TRAP, ERK, IκB, p65, p50, NFATc1 및 c-Fos의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 CT-R, MMP-9, TRAP, ERK, IκB, p65, p50, NFATc1 및 c-Fos 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 아이소플로로글루신 A는 파골세포의 분화를 억제함으로써, 상기 유전자들의 발현이 억제되고, 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 골소공증, 골연화증, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 골형성 부진증, 골감소증, 골위축, 디스크, 구루병, 섬유성 골이형성증, 골파제트병, 외상성 골절 및 피로 골절로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 골질환일 수 있고, 구체적으로, 골다공증, 골소공증, 골연화증, 골형성 부진증 및 골감소증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 골질환일 수 있고, 보다 구체적으로 골다공증일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 아이소플로로글루신 A는 1 내지 20 μg/ml의 농도로 개체에 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 아이소플로로글루신 A는 1 내지 4 μg/ml, 1 내지 8 μg/ml, 1 내지 12 μg/ml, 1 내지 16 μg/ml, 1 내지 20 μg/ml, 4 내지 8 μg/ml, 4 내지 12 μg/ml, 4 내지 16 μg/ml, 4 내지 20 μg/ml, 8 내지 12 μg/ml, 8 내지 16 μg/ml, 8 내지 20 μg/ml, 12 내지 16 μg/ml, 12 내지 20 μg/ml 또는 16 내지 20 μg/ml의 농도로 개체에 투여될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 파골세포에 IPA를 각각 2.5, 5 또는 10 μg/ml의 농도로 5일간 처리한 결과, IPA를 10 μg/ml의 농도로 처리할 경우 파골세포의 주요 마커인 TRAP의 활성도가 골다공증 치료제인 알렌드론산(Alendronate) 100 nM 처리 시의 TRAP 활성도 수준만큼 감소함을 확인하였다(실시예 1 (1) 참조).
일 실시예에 따르면, 파골세포에 IPA를 각각 2.5, 5 또는 10 μg/ml의 농도로 처리하여 파골세포 분화 유도 및 골 흡수 관련 인자인 CT-R, MMP-9 및 TRAP 유전자의 발현을 측정한 결과, IPA를 2.5 및 5 μg/ml의 농도로 처리할 경우, CT-R 유전자 발현이 감소하였으며, IPA를 10 μg/ml의 농도로 처리할 경우, 상기 3가지 유전자 모두 발현이 감소함을 확인하였다(실시예 2 (2) 참조).
다른 실시예에 따르면, 파골세포에 IPA를 10 μg/ml의 농도로 처리할 경우, ERK 및 NFκB 관련 유전자인 IκB, p65 및 p50 유전자의 발현이 감소함을 확인하였고(실시예 3 (2) 참조),
파골세포에 IPA를 각각 2.5, 5 또는 10 μg/ml의 농도로 처리한 뒤, 파골세포 표지 인자들의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 유전자의 발현을 측정한 결과, NFATc1 및 c-Fos 유전자의 발현이 감소함을 확인하였다(실시예 3 (2) 참조).
또 다른 양상은, 패(Ishige okamurae) 추출물을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 “패 추출물”, “골질환”, “예방” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 패 추출물은 파골세포(osteoclasts)의 분화를 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 패 추출물은 CT-R, CTK, MMP-9, MMP-13, TRAP, ERK, JNK, IκB, p65, p50, NFATc1, c-Fos, c-Jun, nfkb2 및 foxo1a2 유전자의 발현을 억제하고, 골질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다.
상기 용어 “개선”이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 이때, 상기 건강기능식품은 골질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질병의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품에서, 유효성분은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 상기 건강기능식품은 원료에 대하여 구체적으로 약 15 중량% 이하, 보다 구체적으로 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 일 양상에 따른 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에도, 일 양상에 따른 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
상기 건강기능식품은 종래에 알려져 있는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 새롭게 개발되는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 혼합되어 제공될 수 있다. 상기 건강기능식품이 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 단독 섭취 또는 상기 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되는 것일 수 있다. 상기 건강기능식품은 골질환의 예방 또는 개선 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병행하여 섭취될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 섭취될 수 있으며, 단일 또는 다중 섭취될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 섭취하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 양상은, 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)를 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 “아이소플로로글루신 A”, “골질환”, “예방”, “개선”, “건강기능식품” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 아이소플로로글루신 A는 파골세포(osteoclasts)의 분화를 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 아이소플로로글루신 A는 CT-R, MMP-9, TRAP, ERK, IκB, p65, p50, NFATc1 및 c-Fos 유전자의 발현을 억제하고, 골질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다.
또 다른 양상은 패 추출물(Ishige okamurae)을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 “패 추출물”, “개체”, “투여”, “골질환”, “예방”, “치료” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 패 추출물은 파골세포(osteoclasts)의 분화를 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 패 추출물은 CT-R, CTK, MMP-9, MMP-13, TRAP, ERK, JNK, IκB, p65, p50, NFATc1, c-Fos, c-Jun, nfkb2 및 foxo1a2 유전자의 발현을 억제하고, 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또 다른 양상은 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 “아이소플로로글루신 A”, “개체”, “투여”, “골질환”, “예방”, “치료” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 아이소플로로글루신 A는 파골세포(osteoclasts)의 분화를 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 아이소플로로글루신 A는 CT-R, MMP-9, TRAP, ERK, IκB, p65, p50, NFATc1 및 c-Fos 유전자의 발현을 억제하고, 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또 다른 양상은 골질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 패 추출물(Ishige okamurae)의 용도를 제공하는 것이다.
상기 “골질환”, “예방”, “치료”, “패 추출물” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 골질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)의 용도를 제공하는 것이다.
상기 “골질환”, “예방”, “치료”, “아이소플로로글루신 A” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 따르면, 패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A는 파골세포 분화 관련 인자의 발현을 억제함으로써, 파골세포의 분화를 억제할 수 있다. 따라서, 상기 패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A는 골질환 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a는 파골세포에 패 추출물(Ishige okamurae extracts, IOE)을 처리한 후 측정한 파골세포의 분화 양상 및 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 활성도를 나타낸다.
도 1b는 파골세포에 IPA(Ishophloroglucine A)를 처리한 후 측정한 파골세포의 분화 양상 및 TRAP 활성도를 나타낸다.
도 2a는 파골세포에 패 추출물을 처리한 후 측정한 CT-R(calcitonin receptor), CTK(cathepsin K), MMP-9 및 TRAP 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 2b는 파골세포에 IPA를 처리한 후 측정한 CT-R, MMP-9 및 TRAP 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 3a는 파골세포에 패 추출물을 처리한 후 측정한 ERK 및 JNK 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 3b는 파골세포에 패 추출물을 처리한 후 측정한 IκB, p65 및 p50 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 3c는 파골세포에 패 추출물을 처리한 후 측정한 NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 3d는 파골세포에 패 추출물을 처리한 후 측정한 NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 핵 내 이동(nuclear translocation) 양상을 나타낸다.
도 4는 파골세포에 IPA를 처리한 후 측정한 ERK, JNK, IκB, p65, p50, NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 5a는 척추뼈 생성이 감소된 제브라피쉬 치어에 패 추출물을 처리한 후 측정한 척추뼈 개수 및 형광 세기를 나타낸다.
도 5b는 척추뼈 생성이 감소된 제브라피쉬 치어에 패 추출물을 처리한 후 측정한 MMP-9, MMP-13, nfkb2 및 foxo1a2 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 6은 패 추출물 내 유효성분에 대한 HPLC(high-performance liquid chromatography) 분석 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
실험 방법 1. 패( Ishige okamurae ) 추출물의 제조
패(Ishige okamurae)는 제주도에서 채집하였으며, 수세 후 상온에서 2주 동안 건조시켰다. 건조된 패는 그라인더로 간 후에, 건조된 패 분말(100 g)을 70% 에탄올(1 L)로 3회 추출하고 여과하였다. 여과액을 40℃에서 회전 증발시켜 농축하여 추출물을 얻었다. 상기 패 추출물의 수율은 11.2%((건조된 패 추출물(g)/패 건조물(g))×100)임을 확인하였다.
실험 방법 2. IPA(Ishophloroglucine A)의 분리
패 추출물에서 IPA를 분리하기 위해 먼저 제조된 에탄올 추출물을 증류수에 현탁하고 에틸아세테이트로 분별하였다. 에틸아세테이트 분획은 HPCPC(High-performance centrifugal partition chromatography)를 이용하여 정제하였다. HPCPC는 n-헥산:에틸아세테이트:물(1:9:4.5:6.5, v/v)로 구성된 이상용매시스템을 사용하였다. HPCPC 컬럼(column)은 먼저 고정상을 포화하였고, 이동상을 2 mL/min의 유속으로 컬럼에 공급하면서 1000 rpm으로 회전시켰다. 에틸아세테이트 분획 500 mg을 CPC 용매상의 물:메탄올(1:1, v/v) 6 mL에 용해하여 주입 밸브를 통해 주입하였고, 240 nm UV 디텍터(detector)로 모니터링되어 테스트 튜브로 수집되었다. 정제된 화합물은 DMSO에 용해시키고 배양 배지에서의 최종 농도를 0.01% 미만으로 조정하여 실험에 사용하였다.
실험 방법 3. 면역형광염색
4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포를 고정하고, 항체의 비특이적인 결합을 방지하기 위해 1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)로 1시간 동안 상온에서 블락킹(blocking)하였다. 그 후 0.4% Triton X-100을 30분간 처리하여 항체가 세포 안으로 통과할 수 있도록 세포막에 구멍을 내준 후에 1차 항체(anti-p65, anti-NFATc1, anti-c-Fos 또는 anti-c-Jun, 1:100)를 4℃에서 밤새 반응시켰다. 1차 항체를 제거한 후, Alexa fluor 488이 라벨된 2차 항체(1:800)를 상온 하에 어두운 곳에서 1시간 반 동안 반응시켰다. 그 후 핵 염색을 위해 Hoechst 33342 40 μg/ml를 상온에서 10분간 처리하고 마운팅(mounting)하였다. 형광이미징은 LSM 700 Zeiss confocal laser scanning microscope로 수행하였다.
실험 방법 4. 제브라피쉬(zebrafish) 실험
성체 제브라피쉬(zebrafish)는 시중(춘천, 한국)에서 구입하여 실험에 사용하였으며, 수온 28.5±1℃, 14/10시간 명암 주기 조건의 3.5 L 아크릴 탱크에서 관리하며 1일 2회 식이를 급여하였다. 실험은 한국기초과학지원연구원 동물실험윤리위원회의 승인 하에 이루어졌다. 실험 하루 전 성체 암컷 1마리, 수컷 2마리를 짝짓기 우리(mating cage)에 옮겼고, 다음 날 빛으로 자극하여 제브라피쉬 배아를 얻었다. 배아를 부화시키고 수정 후 10일(10 dpf) 후에 부화된 제브라피쉬 치어에 덱사메타손(dexamethasone) 25 μM을 처리하여 척추뼈 생성 감소를 유도하였다.
실험 방법 5. HPLC(high-performance liquid chromatography) 분석
농축된 패 추출물을 100% 메탄올에 2 mg/ml의 농도로 용해시킨 후 0.2 μm PTFE 시린지(syringe) 필터로 불순물을 제거하였다. 패 추출물 내의 유효성분의 함량은 Agilent 1260 Infinity Ⅱ gradient LC 시스템 VL 장비로 Agilent poroshell 120EC-C18 컬럼(column) (4.6 mm × 150 mm, 4 μm), 230 nm UV 디텍터(detector)를 사용하여 측정하였다. 물과 아세토니트릴을 함유한 이동상 용매시스템을 이용하여 0.3 mL/min 유량으로 용출하였다.
실시예
실시예 1. 패 추출물( Ishige okamurae extracts, IOE) 또는 IPA(Ishophloroglucine A)의 파골세포(osteoclasts) 분화 억제 효과 확인
패 추출물 또는 패 추출물에 포함되어 있는 것으로 알려진 IPA의 파골세포 분화 억제 효과를 확인하기 위해서, 하기 실험을 수행하였다.
(1) 패 추출물의 파골세포 분화 억제 효과 확인
우선, 대식세포인 RAW 264.7 세포에 패 추출물(IOE)을 각각 25, 50 또는 100 μg/ml의 농도로 2시간 동안 전처리한 후, RANKL(Receptor-activator of nuclear factor kappa B ligand)을 100 ng/ml의 농도로 5일간 처리하여 성숙한 파골세포로의 분화에 대한 억제 정도를 확인하였다. 배지는 2일 간격으로 교체하였다. 파골세포의 활성도는 파골세포의 주요 마커인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)을 염색하여 측정하였다.
그 결과, TRAP의 활성도가 패 추출물의 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(도 1a 참조). 이는, 파골세포의 분화가 패 추출물의 농도 의존적으로 억제됨을 의미한다.
(2) IPA의 파골세포 분화 억제 효과 확인
추가적으로, RAW 264.7 세포에 각각 2.5, 5 또는 10 μg/ml의 IPA 또는 골다공증 치료제인 알렌드론산(Alendronate)을 각각 10 또는 100 Nm의 농도로 2시간 동안 전처리한 후, RANKL을 100 ng/ml 농도로 5일간 처리하여 파골세포 분화와 TRAP 활성을 측정하여 비교하였다.
그 결과, IPA를 10 μg/ml의 농도로 처리하였을 경우, TRAP 활성도가 알렌드론산 100 nM 처리 시의 TRAP 활성도 수준만큼 감소함을 확인하였다 (도 1b 참조).
상기 실험을 통해, 패 추출물 또는 IPA의 파골세포 분화 억제 효과를 검증하였다.
실시예 2. 패 추출물 또는 IPA의 파골세포 분화 유도 인자 억제 효과 확인
패 추출물 또는 IPA의 파골세포 분화 유도 및 골 흡수 관련 인자 억제 효과를 확인하기 위해서, 하기 실험을 수행하였다.
(1) 패 추출물의 파골세포 분화 유도 인자 억제 효과 확인
상기 실시예 1과 유사하게, RAW 264.7 세포에 패 추출물(IOE)을 각각 25, 50 또는 100 μg/ml의 농도로 2시간 동안 전처리한 후, RANKL을 100 ng/ml의 농도로 5일간 처리하여, 파골세포 분화 유도 및 골 흡수 관련 인자인 CT-R(calcitonin receptor), CTK(cathepsin K), MMP-9 및 TRAP 유전자 발현을 측정하였다.
그 결과, RANKL 처리 시 CT-R, CTK, MMP-9 및 TRAP 유전자 발현이 모두 증가하였으나, 패 추출물을 25 및 50 μg/ml의 농도로 처리할 경우, CT-R 및 TRAP 유전자 발현이 감소하였으며, 패 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리할 경우, 상기 4가지 유전자 모두 발현이 감소함을 확인하였다(도 2a 참조).
(2) IPA의 파골세포 분화 유도 인자 억제 효과 확인
추가적으로, RAW 264.7 세포에 IPA를 각각 2.5, 5 또는 10 μg/ml의 농도로 2시간 동안 전처리하고 RANKL을 100 ng/ml의 농도로 처리하여, 파골세포 분화 유도 및 골 흡수 관련 인자인 CT-R, MMP-9 및 TRAP 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하였다.
그 결과, RANKL 처리 시 CT-R, MMP-9 및 TRAP 단백질 발현이 모두 증가하였으나, IPA를 2.5 및 5 μg/ml의 농도로 처리할 경우, CT-R 단백질 발현이 감소하였으며, IPA를 10 μg/ml의 농도로 처리할 경우, 상기 3가지 단백질 모두 발현이 감소함을 확인하였다(도 2b 참조).
상기 실험을 통해, 패 추출물 또는 IPA가 파골세포 분화 유도 인자들의 발현을 억제함으로써, 파골세포의 분화를 억제함을 검증하였다.
실시예 3. 패 추출물 또는 IPA의 파골세포 분화 억제 기전 확인
패 추출물 또는 IPA가 파골세포의 분화를 억제하는 기전을 확인하기 위해서, 하기 실험을 수행하였다.
(1) 패 추출물의 파골세포 분화 억제 기전 확인
RAW 264.7 세포의 처리 방식에 따라, i) 아무 처리도 하지 않은 그룹(대조군), ii) 패 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리한 그룹, iii) RANKL을 100 ng/ml의 농도로 처리한 그룹 및 iv) 패 추출물 100 μg/ml 및 RANKL 100 ng/ml를 처리한 그룹의 4가지 그룹으로 나누어 ERK 및 JNK 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 측정하였다.
그 결과, 패 추출물만 처리하였을 경우, 단백질 발현에 변화가 관측되지 않았고, RANKL만 처리하였을 경우, ERK 및 JNK 단백질 발현이 증가하였으나, 패 추출물 및 RANKL을 함께 처리하였을 경우, ERK 및 JNK 단백질 발현이 감소함을 확인하였다(도 3a 참조).
또한, 상기 4가지 그룹에서의 NF-κB 관련 단백질(IκB, p65 및 p50)의 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 측정하였다.
그 결과, 상기 결과와 유사하게, 패 추출물만 처리하였을 경우, 단백질 발현에 변화가 관측되지 않았고, RANKL만 처리하였을 경우, NF-κB 관련 단백질 발현이 증가하였으나, 패 추출물 및 RANKL을 함께 처리하였을 경우, NF-κB 관련 단백질 발현이 감소함을 확인하였다(도 3b (A) 참조).
또한 상기 4가지 그룹에서 p65의 핵 내 이동(nuclear translocation)을 확인하기 위해, 패 추출물 100 μg/ml을 2시간 동안 전처리하고, RANKL 100 ng/ml을 5분간 처리한 뒤 면역형광염색법을 수행하였다.
그 결과, RANKL을 처리했을 때 p65의 핵 내 이동이 유도된 반면, 패 추출물을 함께 처리했을 때 RANKL에 의해 유도된 p65의 핵 내 이동이 억제되는 경향을 확인하였다(도 3b (B) 참조).
추가적으로, ERK, JNK 및 NF-κB 관련 단백질 발현 감소와 파골세포 분화 억제와의 연관성을 확인하기 위하여, 패 추출물을 100 ng/ml 농도의 RANKL 처리로 인해 파골세포로 분화된 RAW 264.7 세포에 각각 25, 50 또는 100 μg/ml의 농도로 처리한 뒤, NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 단백질의 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, RANKL 처리 시 NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 단백질의 발현이 모두 증가하였으나, 패 추출물을 25 및 50 μg/ml의 농도로 처리할 경우, NFATc1 및 c-Fos 단백질의 발현이 감소하였으며, 패 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리할 경우, 상기 3가지 단백질 모두 발현이 감소함을 확인하였다(도 3c 참조). NFATc1의 핵 내 이동이 감소함을 확인하였다(도 3d 참조).
또한, 주요 전사인자인 NFATc1, c-Fos 및 c-Jun의 양상을 확인하기 위해, 패 추출물 100 μg/ml을 2시간 전처리하고, RANKL 100 ng/ml을 9시간 동안 처리한 뒤 면역형광염색법을 수행하였다.
그 결과, RANKL을 처리했을 때 c-Fos와 c-Jun의 NFATc1의 핵 내 이동이 유도된 반면, 패 추출물을 함께 처리했을 때 RANKL에 의해 유도된 전사인자들의 핵 내 이동이 억제되는 경향을 확인하였다(도 3d 참조).
(2) IPA의 파골세포 분화 억제 기전 확인
RAW 264.7 세포의 처리 방식에 따라, i) 아무 처리도 하지 않은 그룹(대조군), ii) IPA를 10 μg/ml의 농도로 처리한 그룹, iii) RANKL을 100 ng/ml의 농도로 처리한 그룹 및 iv) IPA 10 μg/ml 및 RANKL 100 ng/ml를 처리한 그룹의 4가지 그룹으로 나누어 ERK 및 JNK 단백질의 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, IPA만 처리하였을 경우, 단백질 발현에 변화가 관측되지 않았고, RANKL만 처리하였을 경우, ERK 및 JNK 단백질의 발현이 증가하였으나, IPA 및 RANKL을 함께 처리하였을 경우, ERK 단백질 발현은 감소하나, JNK 단백질 발현은 유의하게 감소하지 않음을 확인하였다(도 4(A) 참조).
또한, 상기 4가지 그룹에서의 NF-κB 관련 단백질(IκB, p65 및 p50)의 발현 정도를 분석한 결과, 상기 실시예 3. (1)에서의 결과와 유사하게, IPA만 처리하였을 경우, 단백질 발현에 변화가 관측되지 않았고, RANKL만 처리하였을 경우, NF-κB 관련 단백질 발현이 증가하였으나, IPA 및 RANKL을 함께 처리하였을 경우, NF-κB 관련 단백질 발현이 감소함을 확인하였다(도 4(B) 참조).
추가적으로, IPA를 100 ng/ml 농도의 RANKL 처리로 인해 파골세포로 분화된 RAW 264.7 세포에 각각 2.5, 5 또는 10 μg/ml의 농도로 처리한 뒤, NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 단백질의 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, RANKL 처리 시 NFATc1, c-Fos 및 c-Jun 단백질의 발현이 모두 증가하였으나, IPA를 처리할 경우, NFATc1 및 c-Fos 단백질의 발현은 감소하나, c-Jun 단백질 발현은 유의하게 감소하지 않음을 확인하였다(도 4(C) 참조).
상기 실험을 통하여, 패 추출물 또는 IPA가 ERK, JNK 및 NF-κB의 활성을 억제함을 확인하였고, 이들의 하위 기전으로 파골세포 표지 인자 발현에 중요한 역할을 하는 c-Fos, c-Jun 및 NFATc1도 억제되어 결과적으로 파골세포 분화가 억제된다는 작용 기전을 규명하였다.
실시예 4. in vivo에서 패 추출물의 골다공증 억제 효과 확인
in vivo에서 패 추출물의 골다공증 억제 효과를 확인하기 위해서, 하기 실험을 수행하였다.
우선, 제브라피쉬 치어에 덱사메타손(dexamethasone) 25 μM을 처리하여 척추뼈 생성 감소를 유도하였고, 척추뼈 생성이 감소된 제브라피쉬 치어에 패 추출물 50 μg/ml를 처리하였다.
패 추출물을 처리한 결과, 제브라피쉬 치어에서 덱사메타손에 의해 손실된 척추뼈 개수 및 형광 세기가 증가됨을 확인하였다(도 5a 참조).
척추뼈 생성 증가의 원인을 분석하기 위해, 제브라피쉬 배아의 처리 방식에 따라, i) 아무 처리도 하지 않은 그룹(대조군), ii) 패 추출물을 50 μg/ml의 농도로 처리한 그룹, iii) 덱사메타손을 25 μM의 농도로 처리한 그룹 및 iv) 패 추출물 50 μg/ml 및 덱사메타손 25 μM를 처리한 그룹의 4가지 그룹으로 나누어 MMP-9, MMP-13, nfkb2 및 foxo1a2 유전자 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, 패 추출물만 처리하였을 경우, 유전자 발현에 변화가 관측되지 않았고, 덱사메타손만 처리하였을 경우, MMP-9, MMP-13, nfkb2 및 foxo1a2 유전자 발현이 증가하였으나, 패 추출물 및 덱사메타손을 함께 처리하였을 경우, MMP-9, MMP-13, nfkb2 및 foxo1a2 유전자 발현이 감소함을 확인하였다(도 5b 참조).
상기 실험을 통하여, 패 추출물이 in vivo에서 파골세포 분화 관련 인자인 MMP-9, MMP-13, nfkb2 및 foxo1a2 유전자의 발현을 감소시킴으로써, 골다공증 억제 효과를 발휘할 수 있음을 검증하였다.
실시예 5. 패 추출물 내 파골세포 분화 억제 유효성분 함량 확인
패 추출물 내에서 파골세포 분화 억제 효과를 나타내는 유효성분의 함량을 확인하기 위하여 HPLC(high-performance liquid chromatography) 분석을 수행하였다.
그 결과, 추출물 내의 IPA의 함량은 3.42%(건조된 IPA(g)/건조된 패 추출물(g)Х100)로 나타났으며, DPHC(diphlorethohydroxycarmalol)의 함량은 3.13%(건조된 DPHC(g)/건조된 패 추출물(g)Х100)로 나타남을 확인하였다(도 6 참조). DPHC는 이전의 연구에서 NF-κB 활성화 억제를 통한 파골세포 분화 억제 효과가 밝혀진 바 있다. 또한 본 연구에서 IPA의 MAPK와 NF-κB의 활성화 억제를 통한 파골세포 분화 억제 효과를 입증하였다. 이전의 연구와 상기 실험들을 통해 DPHC와 IPA가 패 추출물의 유효성분이자 지표성분으로 사용될 수 있는 가능성을 보여주었다.

Claims (14)

  1. 패(Ishige okamurae) 추출물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 패 추출물은 CT-R(calcitonin receptor), CTK(cathepsin K), MMP-9, MMP-13, TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), ERK, JNK, IκB, p65, p50, NFATc1, c-Fos, c-Jun, nfkb2 및 foxo1a2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는, 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 패 추출물은 파골세포(osteoclasts)의 분화를 억제하는, 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 패 추출물은 1 내지 200 μg/ml의 농도로 개체에 투여되는, 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 패 추출물은 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A, IPA)를 포함하는, 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 패 추출물은 아이소플로로글루신 A를 1 내지 20 중량%로 포함하는, 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 골소공증, 골연화증, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 골형성 부진증, 골감소증, 골위축, 디스크, 구루병, 섬유성 골이형성증, 골파제트병, 외상성 골절 및 피로 골절로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 골질환인, 약학적 조성물.
  8. 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A, IPA)를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 아이소플로로글루신 A는 CT-R, MMP-9, TRAP, ERK, IκB, p65, p50, NFATc1 및 c-Fos로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는, 약학적 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 아이소플로로글루신 A는 파골세포(osteoclasts)의 분화를 억제하는, 약학적 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 아이소플로로글루신 A는 1 내지 20 μg/ml의 농도로 개체에 투여되는, 약학적 조성물.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 골소공증, 골연화증, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 골형성 부진증, 골감소증, 골위축, 디스크, 구루병, 섬유성 골이형성증, 골파제트병, 외상성 골절 및 피로 골절로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 골질환인, 약학적 조성물.
  13. 패(Ishige okamurae) 추출물을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  14. 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)를 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
KR1020220074053A 2022-06-17 2022-06-17 패 추출물 또는 아이소플로로글루신 A(Ishophloroglucine A)의 골질환 예방 또는 치료 용도 KR20230173373A (ko)

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