JP5485181B2

JP5485181B2 - 天然物の塩漬け発酵方法及びその発酵抽出物

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Publication number: JP5485181B2
Application number: JP2010548618A
Authority: JP
Inventors: ジュンソンパク; ヘユンパク; ジンヨンイ; ンジュキム; イヨンカク; キュンヒソ; トクヒキム; ハンコンキム
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2029-02-27
Also published as: US20110002911A1; WO2009107996A2; ATE554662T1; WO2009107996A3; CN101959426B; KR101483563B1; JP2011512814A; EP2250908B1; EP2250908A4; KR20090093862A; WO2009107996A9; CN101959426A; US8524296B2; EP2250908A2

Description

本発明は、天然物の塩漬け発酵方法及びその発酵抽出物に関し、より詳細には、生薬及び穀類などの天然物に一定量の塩を添加して自然発酵させた後、これを溶媒で抽出することによって、人体に有害な腐敗菌、大膓菌及び嫌気性細菌など雑菌の繁殖を防止し、悪臭などを除去し、既存の発酵方法より副作用が少なくて且つ安全な天然物の塩漬け発酵方法及びその発酵抽出物に関する。

最近、伝統発酵食品に対する関心が高くなるに伴い、このような発酵技法を活用した多様な抽出物の製造方法が開発されている。これにより、漢方薬材などを発酵させて、既存の漢方薬材の性能より優れた性能を有する漢方薬材抽出物を活用した機能性食品、化粧品などが開発されている。

従来、漢方薬材に公知の微生物などを入れて発酵させる方法が採用されていた。その例として、特許文献１には、野菜及び漢方薬材の抽出液とラクトバチルスプランタルム（Lactobacillus plantarum ATCC 11542）を利用した発酵方法が開示され、特許文献２には、黄耆及び枸杞子などが混合された漢方薬材から漢方薬材抽出液を製造し、この抽出液にラクトバチルスブルガリクス培養液を混合し、培養、熟成させる方法が開示されている。

最近、健康的な生活様式を追求する傾向などに従って、人工的な要素が加味されていない天然発酵方法を利用した漢方薬材の発酵方法に対する要求が増加しており、これを活用した製品に対する要求が続いている。しかしながら、このような天然発酵方法は、人体に有害な大膓菌、嫌気性細菌などによる腐敗及び汚染の危険性に起因して、実際には製品に活用することが困難である。これを解決するために、煮沸法などの発酵前の殺菌方法が考案されたが、熱によって効能成分などが破壊され得るので、非殺菌方法による発酵法の開発が要求されていることが現況である。

韓国特許登録第１０−０３１９３７７号公報韓国特許登録第１０−０４６５２６１号公報

本発明者らは、前述したような従来の発酵方法の問題点を補完するような天然発酵方法を探すために研究したところ、生薬などの天然物を塩に漬けた後、発酵させる塩漬け発酵方法を利用して、既存の天然発酵が有する腐敗及び汚染の危険性を解決することができることを知見し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、天然物の腐敗及び汚染を防止する塩漬け発酵方法及びその発酵抽出物を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明では、（１）生薬及び穀類などの天然物に１０〜３０重量％の塩溶液を添加し、長期熟成発酵させる段階と、（２）上記塩漬け発酵天然物を水または有機溶媒で抽出し、発酵抽出物を収得する段階と、を含む皮膚外用剤用の塩漬け発酵抽出物の製造方法を提供する。

また、本発明では、上記方法で得た塩漬け発酵抽出物を提供する。

本発明による上記塩漬け発酵方法は、非殺菌方法であって、天然物内の効能成分の変化を防止し、また、人体に有害な大膓菌または嫌気性細菌などによる腐敗及び汚染を防止することができ、更に、その抽出物は、健康食品及び皮膚外用剤の効能原料として使用することができる。

図１は、各試験物質の揮発性塩基窒素含量を測定した結果を示すグラフである。図２は、各試験物質のＤＰＰＨ酸化抑制効果を測定した結果を示すグラフである。図３は、塩が有害微生物の成長に及ぶ影響を調べるために、大膓菌（Escherichia coli ATCC 8739）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）の培養時に、天日塩溶液を塗抹した後、阻止円の生成可否を確認した結果を示す。図４は、実施例１と比較例１の、抽出する前の発酵物の結果を示す写真である。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、（１）生薬及び穀類などの天然物に一定量の塩を添加し、長期熟成発酵させる段階と、（２）上記塩漬け発酵天然物を水または有機溶媒で抽出し、発酵抽出物を収得する段階と、を含む塩漬け発酵方法に関する。

上記（１）段階で、塩漬けに使用される塩としては、精製した塩化ナトリウム、天日塩、岩塩及び竹塩などが好ましく、塩の濃度は、全体発酵物に対して１０〜３０重量％が好ましい。塩の含量が１０重量％未満では、所期の効果を発揮しにくく、３０重量％を超過すれば、効果の変化が微々たるものである。

本発明の発酵工程は、４〜４０℃の間で行い、十分な発酵が起きることができるように、３０日〜約１年、好ましくは、６ヶ月〜約１年発酵させることが良い。４℃未満では、有用微生物の成長が良好に進行せず、４０℃を超過する場合は、微生物の成長が非常に過度に進行し、生薬の性能に影響を及ぼすこととなりえる。

また、本発明による塩漬け発酵方法を適用させることができる天然物としては、柚子（Citrus junos fruit）、黄耆（Astragalus）、紅花（safflower）、当帰（angelica）、生姜（ginger）、桔梗（Platycodon grandiflorum）及び枳實（Poncirus trifoliata fruit）などを含む生薬と、大豆、米、大麦及び小麦などを含む穀類を挙げることができるが、これらにのみ限定されるものではない。

上記（２）段階で使用する抽出溶媒としては、精製水、メタノール、エタノール、グリセリン、エチルアセテート、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジクロロメタン及びヘキサンよりなる群から選択された１種を単独に、または２種以上を混合して使用することができる。この際、抽出温度は、１０℃〜８０℃であることが好ましく、６時間〜２４時間抽出することができる。上記抽出温度及び抽出時間から逸脱すれば、抽出効率が劣化するか、または成分の変化が発生することがあり得る。

本発明では、上記（２）段階の後に、当業界に知られた通常の方法に従って常温で冷浸（cold-water extraction）、加熱及び濾過して液状物を得、または追加して溶媒を蒸発、噴霧乾燥または凍結乾燥して、天然物の塩漬け発酵抽出物を製造することができる。

本発明による塩漬け発酵抽出物は、その使用において特に限定されず、例えば、健康食品の添加物、化粧料組成物及び薬剤組成物などに使用されることができる。

以下、本発明の内容を実施例及び試験例によりさらに具体的に説明する。これらの実施例は、本発明の内容を理解するために提示されるものに過ぎず、本発明の権利範囲がこれらの実施例に限定されるものではなく、当業界における周知の変形、置換及び挿入などを行うことができ、それも本発明の範囲に含まれる。

［試験例１］塩漬け抽出物の最適の塩投与濃度の設定実験Ｉ
洗浄した柚子１ｋｇを各々０〜４０重量％濃度の塩溶液に混合した後、陶器に入れて準備し、４℃で約３０日間発酵させた後、これに８０％エタノール水溶液５Ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾過布を利用した濾過と遠心分離により残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して抽出物を得た。最適の塩投与濃度を決定するために、各試料の揮発性塩基窒素（ＶＢＮ：volatile basic nitrogen）の含量を分析した。揮発性塩基窒素実験は、タンパク質分解によって発生し、悪い味と臭いを誘発する物質である揮発性塩基窒素を定量することによって、食品の腐敗度を把握することができる実験方法であって、魚などの水産物では、腐敗度による悪臭の発生程度を予測することができる。各抽出物の約５ｇを遠心分離管に取って、蒸留水２５ｍＬと２０％ＴＣＡ５ｍＬを加えた後、３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み液を濾過した後、２％ＴＣＡで５０ｍＬに定容し、試料として使用した。Ｃｏｎｗａｙ微量拡散容器の内室にホウ酸吸収剤１ｍＬを加え、外室に飽和Ｋ₂ＣＯ₃ １ｍＬと各試料１ｍＬを加えた後、直ちに蓋体で覆ってクリップで固定した。微量拡散容器を前後左右に傾けながら回転し、外室にある試料とＫ₂ＣＯ₃飽和溶液がよく混じるようにした。これを３０℃で２時間放置し、０．１ＮＨＣｌで滴定して測定した。

図１の結果から、塩濃度が１０重量％未満では、発酵抽出物の腐敗に起因してＶＢＮ含量が増加するが、塩濃度が１０重量％以上の場合には、適正なＶＢＮ含量を維持し、発酵抽出物は腐敗されず、きれいに維持されることを確認することができた。

［試験例２］塩漬け抽出物の最適の塩投与濃度設定実験II−抗酸化効果試験（ＤＰ
ＰＨテスト）
発酵抽出物の効能に及ぶ最適の塩投与濃度を確認するために、上記試験例１と同様に０〜４０重量％の塩濃度で製造した抽出物について、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ：1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl）の酸化抑制効能を確認した。すなわち、有機ラジカルであるＤＰＰＨの還元による（抗酸化剤は酸化される）吸光度の変化によって抗酸化能を評価する方法を使用した。上記抽出物によってＤＰＰＨの酸化が抑制され、吸光度が対照群に比べて減少する程度を測定し、対照群の吸光度に比べて５０％以下の吸光度を示す濃度を有効抗酸化濃度として評価した。

１００μＭ（エタノールに溶解）のＤＰＰＨ溶液１９０μＬに上記塩濃度別試料を各々１０μＬずつ入れて反応液を作り、３７℃で３０分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。対照試料としては、広く使用されている合成抗酸化剤であるトロロクス（Trolox）を使用した。各試料のＤＰＰＨ分析結果は、図２に示し、ＩＣ₅₀は、添加した試料によって吸光度が５０％減少したときの試料濃度を意味する。

図２の結果から分かるように、塩濃度が１０重量％未満の場合には、有意な抗酸化効能を示さないが、１０重量％以上の濃度では、有意に抗酸化効能が増加することを確認することができた。しかし、塩濃度が３０重量％を超過する場合には、塩濃度に比例して増加した抗酸化効能がむしろ減少することを確認することができた。したがって、上記結果に基づいて、本発明では、塩漬け発酵抽出物の製造時に最も適切な塩の濃度を１０〜３０重量％に決定した。

［実施例１］柚子塩漬け発酵抽出物の製造
洗浄した柚子１ｋｇを１０重量％濃度の塩溶液に混合した後、陶器に入れて準備し、４℃で約３０日間発酵させた後、これに８０％エタノール水溶液５Ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾過布を利用した濾過と遠心分離により残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍＬで３回抽出した。得られた全体の１−ブタノール層を減圧濃縮して１−ブタノール抽出物を得、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに添加し、生成した沈殿物を乾燥することによって、柚子塩漬け発酵抽出物２００ｇを収得した。

［実施例２］枳實塩漬け発酵抽出物の製造
乾燥した枳實１ｋｇを準備し、実施例１と同一の方法で抽出し、枳實塩漬け発酵抽出物１５０ｇを収得した。

［比較例１］柚子発酵抽出物の製造
洗浄した柚子１ｋｇをイオン水溶液に混合した後、陶器に入れて準備し、４℃で約３０日間発酵させた後、これに８０％エタノール水溶液５Ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾過布を利用した濾過と遠心分離により残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍＬで３回抽出した。得られた全体の１−ブタノール層を減圧濃縮して１−ブタノール抽出物を得、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに添加し、生成された沈殿物を乾燥することによって、柚子発酵抽出物１７０ｇを収得した。

［比較例２］枳實発酵抽出物の製造
乾燥した枳實１ｋｇを比較例１と同一の方法で抽出し、枳實発酵抽出物１９５ｇを収得した。

［試験例３］有害細菌の生成阻止実験
培地（Letheen agar）をシャーレーに１次に注いで固めた後、前培養させた大膓菌（Escherichia coli ATCC 8739）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）を、約４０℃となるように調節した培地（Letheen agar）に、最終的に菌の量が１０⁵匹／ｇになるように希釈し、１次培地の上に注いで固めた。滅菌されたペーパーディスク（paper disk）に１０％、２０％及び３０％の天日塩溶液を約０．０２ｍＬ程度注入し、菌が塗抹された培地に載置し、常温で２４時間、溶液が充分に拡散されるようにした後、各々３２℃で最適時間培養し、その後シャーレーに現われる阻止円の生成可否を確認し、その結果を図３に示した。

図３の結果から、塩が有害微生物の成長を阻止することを確認した。
また、実施例１と比較例１の抽出する前の発酵物の結果を図４で確認することができる。図４から明らかなように、実施例１の発酵産物は、柚子の鮮やかな黄色が維持されているが、比較例１の発酵産物は、かびが生えて、緑色になることを確認することができた。更に、実施例１の柚子塩漬け発酵産物の場合、柚子固有の香が残っているが、比較例１の柚子無塩発酵産物の場合、腐敗され、ひどい悪臭が発生した。

［試験例４］塩漬け発酵抽出物の皮膚刺激程度の評価
ニュージーランド白色ウサギの皮膚に、ビヒクル（Vehicle）と実施例１〜２及び比較例１〜２で製造した抽出物を１日２回で４日間、総８回塗布した。塗布後、紅斑及び痂皮形成評点と浮腫評点値を累積させて、皮膚累積刺激指数を求めた。皮膚累積刺激指数は、下記表１に示した判定基準によって評価し、その結果を下記表２に示した。結果に示した刺激指数は、一般的に多く利用されるＤｒａｉｚｅの皮膚一次刺激指数（primary irritation index、P.I.I）の算出方法による（Draize, J.H., Appraisal of the safety of chemical in foods、drugs and cosmetics）。

上記表２の結果から、本発明による非殺菌塩漬け発酵抽出物である実施例１〜２が、対照群であるビヒクル及び非殺菌無塩発酵抽出物である比較例１〜２に比べて、皮膚刺激程度が相当量改善されることを確認することができた。

Claims

（１）生薬または穀類の天然物に１０〜３０重量％の塩溶液を添加し、長期熟成発酵させる段階と、
（２）上記塩漬け発酵天然物を水または有機溶媒で抽出し、発酵抽出物を収得する段階と、を含む皮膚外用剤用の塩漬け発酵抽出物の製造方法。
上記生薬は、柚子、黄耆、紅花、当帰、生姜、桔梗及び枳實よりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤用の塩漬け発酵抽出物の製造方法。
上記穀類は、大豆、米、大麦及び小麦よりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤用の塩漬け発酵抽出物の製造方法。
上記（１）段階において使用する塩は、塩化ナトリウム、天日塩、岩塩及び竹塩よりなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤用の塩漬け発酵抽出物の製造方法。
上記（１）段階において塩の使用量は、発酵物の全体重量に対して１０〜３０重量％であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤用の塩漬け発酵抽出物の製造方法。
上記（２）段階において使用される有機溶媒は、メタノール、エタノール、グリセリン、エチルアセテート、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジクロロメタン及びヘキサンよりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤用の塩漬け発酵抽出物の製造方法。
上記（１）段階の発酵工程は、４〜４０℃で３０日〜１年間発酵させることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤用の塩漬け発酵抽出物の製造方法。
請求項１〜７のいずれかに記載の皮膚外用剤用の塩漬け発酵抽出物の製造方法で製造された塩漬け発酵抽出物。