JP5461712B2 - Ｎ−（ブロモアセチル）−３，３−ジニトロアゼチジンの合成及び単離法並びにそれを含む組成物 - Google Patents

Description

優先権主張
本願は、２０１０年２月９日出願の米国特許出願第１２／７０２，７８２号“Ｎ−（ブロモアセチル）−３，３−ジニトロアゼチジンの合成及び単離法並びにそれを含む組成物(METHODS OF SYNTHESIZING AND ISOLATING N-(BROMOACETYL)-3,3-DINITROAZETIDINE AND A COMPOSITION INCLUDING THE SAME)”の出願日の利益を主張する。

本発明の態様は、Ｎ−（ブロモアセチル）−３，３−ジニトロアゼチジン（ＡＢＤＮＡＺ）の合成及び単離法に関する。さらに詳しくは、本発明の態様は、従来法と比較して高純度及び高収率のＡＢＤＮＡＺを製造するＡＢＤＮＡＺの合成及び単離法に関する。本発明の態様は、ＡＢＤＮＡＺを含む組成物にも関する。

ＡＢＤＮＡＺのような環状ニトロ化合物は、がん治療におけるそれらの使用可能性について研究が進められている。ＡＢＤＮＡＺの合成法は、ベドナルスキー(Bednarski)らによる米国特許第７，５０７，８４２号（“ベドナルスキー”）などに記載されている。ベドナルスキーでは、ＡＢＤＮＡＺは、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３，３−ジニトロアゼチジン（ＤＮＡＺ）をブロモアセチルブロミド及び三フッ化ホウ素エーテラートと反応させることによって合成されている。生成するＡＢＤＮＡＺ１モル毎に１モルのＤＮＡＺの臭化水素塩（ＤＮＡＺ ＨＢｒ）も副産物として生成する。ＡＢＤＮＡＺは、ＤＮＡＺ ＨＢｒから、反応混合物を冷却し、ジクロロメタンを加え、そしてＤＮＡＺ ＨＢｒをろ過することによって単離される。固体のＤＮＡＺ ＨＢｒは、衝撃、摩擦、及びその他の外部刺激に敏感なので注意深く取り扱われねばならない。ジクロロメタンろ液を水洗し、乾燥させた後、ジクロロメタンを蒸発させて粗ＡＢＤＮＡＺ混合物を得る。該生成物を順にジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて、純度約９８％のＡＢＤＮＡＺを約７５％の収率（ブロモアセチルブロミドを基にして）で得る。ＡＢＤＮＡＺ中に残留している２％の不純物は、ブロモ酢酸、未反応ＤＮＡＺ、及びＤＮＡＺ ＨＢｒを含むと考えられる。このＡＢＤＮＡＺの製造法を本明細書中ではベドナルスキー法と呼ぶ。ベドナルスキー法は、まずまずの純度及び収率でＡＢＤＮＡＺを提供するが、その純度は製薬学的使用には不十分である。さらに、ベドナルスキー法の最中に生成する固体のＤＮＡＺ ＨＢｒは爆発性化合物なので、これがＡＢＤＮＡＺ製造の複雑さを増している。

米国特許第７，５０７，８４２号明細書

ＤＮＡＺ ＨＢｒのような爆発性中間体の取扱いに伴う危険性を最小化又は削減する方法によってＡＢＤＮＡＺを合成及び単離するのが望ましいであろう。得られるＡＢＤＮＡＺは、ベドナルスキー法によって製造されるそれと比べて、同等又は高い収率及び純度を有するであろう。

本発明の態様はＡＢＤＮＡＺの製造法を含む。該方法は、ＤＮＡＺを溶媒中でブロモアセチルブロミド及び三フッ化ホウ素エーテラートと反応させて、ＡＢＤＮＡＺとＤＮＡＺの塩とを含む反応混合物を製造することを含む。水及び追加量の溶媒を反応混合物に加えて、ＡＢＤＮＡＺを含む有機相とＤＮＡＺの塩を含む水性相を形成させる。有機相と水性相を分離して、ＡＢＤＮＡＺを含むＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液と、ＤＮＡＺの塩を含む水性相とを製造する。非溶媒をＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液に加え、ＡＢＤＮＡＺ／溶媒／非溶媒混合物を製造する。その後、ＡＢＤＮＡＺを回収する。

本発明の別の態様はＡＢＤＮＡＺの別の製造法を含む。該方法は、ＤＮＡＺをジクロロメタン中でブロモアセチルブロミド及び三フッ化ホウ素エーテラートと反応させて、ＡＢＤＮＡＺとＤＮＡＺの臭化水素塩とを含む反応混合物を製造することを含む。水及び追加量のジクロロメタンを反応混合物に加えて、ジクロロメタン及びＡＢＤＮＡＺを含む有機相と水及びＤＮＡＺの臭化水素塩を含む水性相を形成させる。有機相を水性相から分離し、ジクロロメタン及びＡＢＤＮＡＺを含む有機相にエタノールを加える。ジクロロメタンを減圧下で蒸発させ、ＡＢＤＮＡＺ／エタノール懸濁液を形成させる。次に、エタノールをＡＢＤＮＡＺ／エタノール懸濁液からろ過する。

本発明の更なる態様は、約９９．５％より高い純度のＮ−ＡＢＤＮＡＺ及び製薬学的に有効なビヒクルを含む組成物を含む。
本明細書は、本発明と見なされることを特に指摘し、明確に主張している特許請求の範囲で締め括られているが、本発明の利点は、以下の本発明の説明を添付の図面と併せて読むことにより、より容易に確認できるであろう。

図１は、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−ヒドロキシメチル−３−ニトロアゼチジン（ＨＭＮＡＺ）からＤＮＡＺを製造するための反応を示す。 図２は、ＤＮＡＺからＡＢＤＮＡＺを製造するための反応を示す。 図３は、ＤＮＡＺと臭化水素（ＨＢｒ）水溶液からＤＮＡＺのＨＢｒ塩（ＤＮＡＺ ＨＢｒ）を製造するための反応を示す。

ＡＢＤＮＡＺの合成及び単離法を開示する。ＡＢＤＮＡＺがベドナルスキー法よりも高い収率で製造される。製造されるＡＢＤＮＡＺは、ベドナルスキー法で製造されるものより高い純度も有する。さらに、本発明の方法は、衝撃及び摩擦感受性の固体爆発性中間体の取扱いも排除する。本発明の方法は、プロセスにおける作業の総数も削減する。

本明細書において、用語“含む(comprising)”、“含む(including)”、“含有する”、“特徴とする”、及びそれらの文法的同等語は、追加的な未掲出の構成要素又は方法ステップを除外しない包括的又はオープンエンドな用語であるが、より制限的用語“〜からなる”及び“本質的に〜からなる”及びそれらの文法的同等語も含む。本明細書において、材料、構造、特徴又は方法行為に関する用語“〜でありうる(may)”は、本発明の態様の実施においてそれらが使用を想定されていることを示し、そのような用語は、それらと組み合わせて使用可能な他の互換的な材料、構造、特徴及び方法は除外されるべき又はされねばならないというような何らかの含意を回避するために、より制限的用語の“〜である(is)”よりも好んで（優先的に）使用される。

ＡＢＤＮＡＺは、図１に示されているように、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−ヒドロキシメチル−３−ニトロアゼチジン（ＨＭＮＡＺ）を酸化的ニトロ化して、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３，３−ジニトロアゼチジン（ＤＮＡＺ）を製造することによって合成できる。酸化的ニトロ化反応は、約３０℃以下の温度で約３時間〜約７４時間実施されうる。次に、図２に示されているように、ＤＮＡＺを三フッ化ホウ素エーテラートの存在下、溶媒中でブロモアセチルブロミドと反応させて、ＡＢＤＮＡＺ及びＤＮＡＺ ＨＢｒを製造することができる。ＡＢＤＮＡＺに変換されるＤＮＡＺの半モル当量ごとに対し、ＤＮＡＺのもう半モル当量は酸掃去剤として機能し、ＤＮＡＺ ＨＢｒを形成する。本明細書において、用語“溶媒”は、ＤＮＡＺ及びＡＢＤＮＡＺが実質的に可溶で、ＡＢＤＮＡＺの結晶化に使用される非溶媒と実質的に混和性の有機溶媒を意味及び包含する。溶媒と非溶媒は、溶媒が合成の次の時点で容易に除去されるように十分異なる沸点を有しうる。本明細書における態様では溶媒をジクロロメタンと記載しているが、所望の特性を有する他の有機溶媒も使用できる。例えば、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどであるが、これらに限定されない。

ＤＮＡＺ ＨＢｒは、ＡＢＤＮＡＺから水性抽出によって分離できる。ＡＢＤＮＡＺはその後、非溶媒を加え、溶媒を除去することによって、溶媒から直接結晶化できる。本明細書において、用語“非溶媒”は、ＡＢＤＮＡＺが実質的に不溶の有機溶媒を意味及び包含する。非溶媒と溶媒は互いに実質的に混和性でありうる。本明細書における態様では非溶媒をエタノールと記載しているが、所望の特性を有する他の有機溶媒、例えばメタノール、イソプロパノール、又はヘプタンなどのアルカンも使用できる。反応によって生成する副産物又は不純物は、ＡＢＤＮＡＺよりも非溶媒に可溶でありうる。従って、副産物はその後の非溶媒の洗浄で除去される。このような様式によるＡＢＤＮＡＺの回収は、ＡＢＤＮＡＺの合成及び単離法全体で利用される再結晶及び洗浄作業の数を減らすことができる。

酸化的ニトロ化反応において、ＨＭＮＡＺはＤＮＡＺを製造するための出発材料として使用できる。ＨＭＮＡＺは、パリッシュ・ケミカル・カンパニー(Parish Chemical Company)社（ユタ州バインヤード）から市販されている。ＨＭＮＡＺは最初に水酸化ナトリウム水溶液と反応させることができる。酸化的ニトロ化反応に使用される水酸化ナトリウム対ＨＭＮＡＺの比率は少なくとも１：１であろう。しかしながら、ＨＭＮＡＺの溶解を確実にするために、ＨＭＮＡＺに比べて過剰の水酸化ナトリウムを使用することもできる。非制限的例として、１モル当量のＨＭＮＡＺあたり約３．５モル当量までの水酸化ナトリウムが使用できる。ＨＭＮＡＺと水酸化ナトリウムと水は、ニトロン酸塩水溶液を形成しうる。ニトロン酸塩水溶液は、酸化的ニトロ化反応中に発生する発熱を最小化及び制御するために希釈してよい。ニトロン酸塩の完全形成を確実にするため及び酸化的ニトロ化反応中の塩基性条件を維持するために過剰の水酸化ナトリウムも存在してよい。撹拌しながら水酸化ナトリウムを水に添加すると、水酸化ナトリウム溶液が生成する。本明細書中に記載のすべての撹拌作業に関し、試薬は、添加される試薬の量に応じて、オーバーヘッド撹拌機又は磁気撹拌棒を用いて撹拌できる。撹拌速度は、媒体中に添加された試薬を溶解又は懸濁するのに足る速度でありうる。水酸化ナトリウムの水への添加は発熱性なので、添加作業の実施前に水酸化ナトリウム溶液を約２５℃に冷却するのがよい。ＨＭＮＡＺは、水酸化ナトリウム溶液を製造して４時間以内に水酸化ナトリウム溶液に添加することができる。この添加中、溶液は約２０℃〜約２７℃の温度に維持される。ＨＭＮＡＺを水酸化ナトリウム溶液と約１時間〜約２時間撹拌すると、ニトロン酸塩溶液が形成されうる。ニトロン酸塩溶液は、酸化的ニトロ化反応に使用される追加の試薬を添加する前に、準備を整えて約２時間まで又はそれより長く貯蔵できる。ＨＭＮＡＺの添加の少なくとも１時間後、ニトロン酸塩溶液は約１０℃以下に冷却できる。

亜硝酸ナトリウムとフェリシアン化カリウムの水溶液は、亜硝酸ナトリウムとフェリシアン化カリウムを水中に溶解することによって製造できる。亜硝酸ナトリウム／フェリシアン化カリウム溶液は、最大約３時間撹拌してよい。過剰の水を利用して希釈溶液を製造すれば、酸化的ニトロ化反応中にその後発生する発熱を氷浴を用いて容易に制御できる。フェリシアン化カリウムは、酸化的ニトロ化反応において、触媒濃度、例えばＨＭＮＡＺに対して約５モル％〜約１５モル％利用すればよい。亜硝酸ナトリウムは、ＨＭＮＡＺからＤＮＡＺへの完全変換を確実にするために、１モル当量のＨＭＮＡＺあたり約１モル当量〜約４モル当量使用できる。亜硝酸ナトリウムとフェリシアン化カリウムは水溶液中で安定なので、互いに著しく反応しない。従って、亜硝酸ナトリウムとフェリシアン化カリウムの水溶液は準備を整えて約３時間まで貯蔵できる。

亜硝酸ナトリウム／フェリシアン化カリウム溶液は、冷却された（約１０℃以下）ニトロン酸塩溶液に添加できる。添加時に温度上昇（約０℃〜約１５℃）が予想されるので、ニトロン酸溶液を冷却して、得られる最大発熱が約３０℃を超えないようにする。しかしながら、両溶液とも希薄性のため、二つの溶液を合わせた場合に予想される最大発熱は、たとえ溶液を急速混合したとしても約２０℃である。添加後、亜硝酸ナトリウム／フェリシアン化カリウム溶液とニトロン酸塩溶液の組合せは、約１５℃以下、例えば約１０℃〜約１５℃に冷却されうる。次いで過硫酸ナトリウムを添加できる。過硫酸ナトリウムは、１モル当量のＨＭＮＡＺあたり約１モル当量〜約２モル当量使用できる。過硫酸ナトリウムの添加は、ニトロン酸塩の分解を最小限にするために、亜硝酸ナトリウム／フェリシアン化カリウム溶液とニトロン酸塩溶液の混合後約３０分以内に完了されうる。過硫酸ナトリウムの添加後、反応混合物の温度は、結果的発熱によって反応混合物の温度が約３０℃より高くならないように、約１５℃以下に維持されうる。反応混合物の温度は、約５℃〜約２０℃の発熱が発生する前に、初期に約５℃降下しうる。反応混合物の温度は冷浴を用いて維持できる。冷浴は、反応混合物の温度上昇が停止したら除去できる。冷浴の除去後、酸化的ニトロ化反応は、少なくとも約１時間の撹拌に伴って進行しうる。酸化的ニトロ化反応が実施される周辺環境が温度変動を受ける場合、酸化的ニトロ化反応の温度が確実に約３０℃より高くならないように、周辺環境の温度はモニターされうる。

酸化的ニトロ化反応によりＤＮＡＺ及び水溶性副産物が生成する。ＤＮＡＺは、二相性の酸化的ニトロ化反応溶液から、溶媒による多段洗浄を用いて抽出することができる。使用される溶媒の量は、ＤＮＡＺを効果的に抽出するのに足る量でありうる。溶媒は、ＤＮＡＺは実質的に可溶であるが、酸化的ニトロ化反応の副産物は実質的に不溶の有機溶媒であろう。簡便性及び便宜上、酸化的ニトロ化反応溶液からＤＮＡＺを抽出するのに使用される溶媒は、ＤＮＡＺ、ブロモアセチルブロミド、及び三フッ化ホウ素エーテラートの反応が行われるのと同じ溶媒でよい。抽出による水性相（酸化的ニトロ化反応の副産物を含む）は廃棄してよいが、有機（溶媒）相は回収して一つにまとめる。抽出による水性相は、水に溶解した水酸化ナトリウム、フェリシアン化カリウム、亜硝酸ナトリウム、又は硫酸ナトリウムを含みうる。有機相はＤＮＡＺを含むので、無水硫酸ナトリウム又は無水硫酸マグネシウムなどの乾燥剤で乾燥されうる。有機相は本明細書ではＤＮＡＺ／溶媒溶液と呼ばれる。ＤＮＡＺ／溶媒溶液の乾燥（すなわち実質的に水分を含まない）を確実にするために、固体の乾燥剤が溶液中で自由流動する（さらさらになる）まで十分な量の乾燥剤をＤＮＡＺ／溶媒溶液に加えることができる。乾燥剤は、ＤＮＡＺ／溶媒溶液から減圧ろ過によって除去することができる。非制限的例として、ジクロロメタンが溶媒として使用される場合、ＤＮＡＺ／ジクロロメタン溶液は、乾燥剤で乾燥する前に０．１４２％の水分を含むのに対し、乾燥後は０．０９１％の水分量となることが測定されている。酸化的ニトロ化反応によって、ＤＮＡＺは約８０％〜約１００％の収率（ＨＭＮＡＺを基にして）で製造できる。ＤＮＡＺの純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定で、約９７％より高い。

次の作業を実施する前にＤＮＡＺを貯蔵することになる場合、溶媒の少なくとも一部を減圧下での蒸発などによって除去し、濃縮ＤＮＡＺ／溶媒溶液を形成することができる。実質的にすべての溶媒が除去されると、得られるＤＮＡＺは周囲条件で液体状態になるであろう。本明細書中に記載の通り、減圧下での蒸発を含む作業は、真空レベルで及び各溶液又は懸濁液が約３０℃以上の温度に約１０時間以上暴露されない十分な時間実施できる。濃縮ＤＮＡＺ／溶媒溶液又はＤＮＡＺは、約０℃〜約３０℃の範囲の温度で約９６時間まで又はそれ以上貯蔵できる。ＤＮＡＺの分解は、約７５℃より高い温度で起こることが知られているので、ＤＮＡＺ／溶媒溶液は、分解がほとんど又は全く無いことを確実にするために、約３０℃未満の温度で維持されうる。

ＤＮＡＺが原液で貯蔵されている場合、追加量の溶媒をＤＮＡＺに添加することができる。ＤＮＡＺをＡＢＤＮＡＺに変換する前に、ＤＮＡＺ／溶媒溶液は、窒素などの無水不活性ガスでパージされ、水分の存在を最小限にすることができる。水は周囲環境の相対湿度由来の空中湿気として存在しうる。水は、存在すると、三フッ化ホウ素エーテラートの活性に影響を及ぼしうる又は加水分解反応に敏感なブロモアセチルブロミドと反応しうる。ＤＮＡＺ／溶媒溶液は、図２に示されているように、三フッ化ホウ素エーテラートの存在下でブロモアセチルブロミドと反応してＡＢＤＮＡＺを生成しうる。反応が起こると、大部分のＡＢＤＮＡＺは溶媒中に溶解した状態で残るが、大部分のＤＮＡＺ ＨＢｒは固体として沈殿する。従って、ＡＢＤＮＡＺ反応混合物は不均一である。三フッ化ホウ素エーテラートとブロモアセチルブロミドは、ＤＮＡＺ／溶媒溶液に約１５分以内に添加されうる。２モル当量のＤＮＡＺを溶媒中で１．５モル当量のブロモアセチルブロミドと反応させることができる。これに対し、ベドナルスキー法では１モル当量のＤＮＡＺあたり化学量論量のブロモアセチルブロミド（半モル当量）が使用された。本発明の方法では、触媒量の三フッ化ホウ素エーテラート、例えばＤＮＡＺに対して約５モル％〜約１５モル％が使用されうる。本明細書中の態様には、三フッ化ホウ素エーテラートを添加後、ブロモアセチルブロミドを添加すると記載されているが、試薬は任意の順序で添加できる。三フッ化ホウ素エーテラートとブロモアセチルブロミドの添加は著しく発熱性でないため、そしてこの反応は加熱還流されるため、これらの試薬の添加速度は、得られるＡＢＤＮＡＺの収率又は純度に実質的に影響しない。ＡＢＤＮＡＺ反応混合物は、大部分のＤＮＡＺがＡＢＤＮＡＺに変換されるまで約４時間〜約７時間、加熱されて穏やかに還流され撹拌されうる。熱はその時点で取り除かれる。これに対し、ベドナルスキー法では還流は２時間実施された。本発明の態様において、ＡＢＤＮＡＺ反応混合物が加熱される温度は溶媒の沸点より低い。非制限的例として、ジクロロメタンを溶媒として使用する場合、ＡＢＤＮＡＺ反応混合物は反応の経過中、約４０℃未満に加熱されうる。ＡＢＤＮＡＺ反応混合物は、衝撃、摩擦、及びその他の外部刺激に敏感な乾燥固体形のＤＮＡＺ ＨＢｒも含みうる。１モル当量のＡＢＤＮＡＺあたり１化学量論的当量のＤＮＡＺ ＨＢｒが生成する。ＤＮＡＺ ＨＢｒは白色／黄色固体であろう。ＡＢＤＮＡＺ反応混合物は、ＨＢｒ及び約２０％までの未反応ＤＮＡＺも含みうる。これは、以下に説明するように除去される。

反応の完了後、追加量の溶媒及び水をＡＢＤＮＡＺ反応混合物に添加し、約１時間〜約２４時間撹拌することができる。添加される溶媒及び水の量は、ＤＮＡＺ ＨＢｒを水に、何らかの沈殿ＡＢＤＮＡＺがあればそれを溶媒中に溶解するのに十分な量でありうる。ＤＮＡＺ ＨＢｒは水溶性なので、ＤＮＡＺ ＨＢｒは水性相に分配されうるが、ＡＢＤＮＡＺは有機（溶媒）相に残る。次に、有機及び水性相を従来の液液分離技術などによって分離し、水性相を廃棄することができる。ＡＢＤＮＡＺを含む有機相を本明細書ではＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液と呼ぶ。分離中、ＤＮＡＺ ＨＢｒは水溶液中に残るので、ＤＮＡＺ ＨＢｒは容易に処分できる。固体形のＤＮＡＺ ＨＢｒの取扱いをなくすることにより、ＡＢＤＮＡＺは、非エネルギー的プロセスによって合成及び単離できる。その結果、ＡＢＤＮＡＺの製造業者は、爆発性化合物を取り扱うための認定又は資格が不要になる。さらに、従来の装置及び設備を使用してＡＢＤＮＡＺを製造できるので、その合成及び単離のコスト及び複雑さを削減する。これに対し、ベドナルスキー法では、固体のＤＮＡＺ ＨＢｒがろ過によって除去される。

ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液を水で何度も洗浄して、あらゆる微量のＤＮＡＺ ＨＢｒを除去することができる。水洗中、追加の溶媒をＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液に加えれば、ＡＢＤＮＡＺの結晶化を防止することができる。添加される水又は溶媒の量は、所望の化合物を除去又は抽出するのに十分な量でありうる。ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液の純度は、プロトン核磁気共鳴（^１Ｈ ＮＭＲ）によってモニターし、実質的にすべてのＤＮＡＺ ＨＢｒが除去されたことを確認することができる。ＤＮＡＺ ＨＢｒがＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液中に残留している場合、ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液が実質的にＤＮＡＺ ＨＢｒを含まないと判定されるまで、追加の水洗を実施すればよい。使用される水の量は、所望の化合物を抽出するのに十分な量でありうる。非制限的例として、ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液は、水洗後は約０．４％未満のＤＮＡＺ ＨＢｒしか含まないであろう。ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液は、硫酸ナトリウムなどの乾燥剤を用い、その固体が溶液中で自由流動する（さらさらになる）まで乾燥させることができる。乾燥剤は減圧ろ過によって除去できる。ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液は、減圧下での蒸発などによって濃縮でき、ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液の約半量を除去することができる。

ＡＢＤＮＡＺを結晶化させるためには、十分量の非溶媒をＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液に加えて、ＡＢＤＮＡＺ／溶媒／非溶媒混合物を形成させればよい。ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液への非溶媒の添加は、ＡＢＤＮＡＺを非溶媒中で高純度で結晶化させること可能にする。ＡＢＤＮＡＺ／溶媒／非溶媒混合物に残留する何らかの不純物は非溶媒に可溶でありうる。不純物は、ＤＮＡＺ、ＤＮＡＺ ＨＢｒ、ブロモ酢酸、及び硫酸ナトリウムなどであるが、これらに限定されない。非溶媒は、ＡＢＤＮＡＺが実質的に不溶で、溶媒の除去が容易に達成されるように溶媒より十分に高い沸点を有する有機溶媒でありうる。また、ＡＢＤＮＡＺは、ＡＢＤＮＡＺの結晶化に使用される温度で、実質的に非溶媒と非反応性でありうる。ＡＢＤＮＡＺはヒト又は他の哺乳動物に投与されるので、非溶媒は相対的に非毒性の有機材料でありうる。

ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液への非溶媒の添加は、ＡＢＤＮＡＺの溶解性を変更しうる。具体的には、ＡＢＤＮＡＺの溶解度は、非溶媒をＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液に添加すると低下しうる。ＡＢＤＮＡＺのＡＢＤＮＡＺ／溶媒／非溶媒混合物中の溶解度は、例えば減圧下での溶媒の蒸発によって（すなわち回転蒸発器を使用して）溶媒を除去することにより、さらに変更できる。溶媒の除去速度は、ＡＢＤＮＡＺの結晶化に影響しうる。溶媒が急速除去されると、ＡＢＤＮＡＺは不純物をその中にトラップしたアモルファス性固体材料として形成されうる。これに対し、溶媒をゆっくり除去すると、ＡＢＤＮＡＺはより純粋な形態で結晶化できる。溶媒が除去されると、ＡＢＤＮＡＺ／溶媒／非溶媒混合物の体積は減少するので、ＡＢＤＮＡＺの沈殿及びＡＢＤＮＡＺ／非溶媒懸濁液の形成が可能になる。溶媒の除去は、ＡＢＤＮＡＺ／非溶媒懸濁液中に残っている液体の量が、回転蒸発器の回転中ＡＢＤＮＡＺの表面をちょうど覆うほどになったら停止できる。ＡＢＤＮＡＺ／非溶媒懸濁液は約３０分間約０℃に冷却され、ＡＢＤＮＡＺの結晶が減圧ろ過などによって回収できる。ＡＢＤＮＡＺは、透明の無色又は白色結晶として得られる。ＡＢＤＮＡＺは、実質的にすべての不純物がＡＢＤＮＡＺから除去されたことを確実にするために、追加量の冷却非溶媒で濯ぐことができる。次いで、非溶媒ろ液は廃棄されうる。ＡＢＤＮＡＺは真空下で貯蔵できる。及び又は、ろ紙上のＡＢＤＮＡＺに空気を約１時間〜約１６時間通して、実質的に残留溶媒、非溶媒又は水が確実に残らないようにすることもできる。これに対し、ベドナルスキー法では、粗ＡＢＤＮＡＺは、ジクロロメタンの蒸発によって単離される。次に、粗ＡＢＤＮＡＺを二相性ジエチルエーテル濯ぎで洗浄し、純度約９８％のＡＢＤＮＡＺを得る。

本発明の方法によって合成及び単離されたＡＢＤＮＡＺは、約９９．５％より高い純度を有しうる（ＨＰＬＣによる測定）。これに対し、ベドナルスキー法によって合成及び単離されたＡＢＤＮＡＺは純度約９８％で、残りの２％は、ブロモ酢酸、未反応ＤＮＡＺ、及びＤＮＡＺ ＨＢｒを含む。また、本発明の方法によって製造されたＡＢＤＮＡＺは、色がベドナルスキー法によって製造されたＡＢＤＮＡＺの帯黄色と比べてより白い。本発明の方法によって製造されたＡＢＤＮＡＺの収率は、約８０％〜約１００％であろう（ＨＭＮＡＺからＤＮＡＺへの推定１００％収率を基にして）。

本発明の一態様では、ジクロロメタンが溶媒として使用され、エタノールが非溶媒として使用される。何らかの特定の理論に拘束されるのではないが、ジクロロメタンとエタノールの使用は、それらの沸点の差がジクロロメタンを低温で蒸発によって除去することを可能にする一方で、エタノールはＡＢＤＮＡＺを結晶化するために残るため、ＡＢＤＮＡＺの効果的な単離を提供すると考えられている。さらに、結晶化中の温度は、ＡＢＤＮＡＺとエタノール間で実質的に反応が起こらないほど十分低い。本発明の方法で、ＡＢＤＮＡＺを首尾よく結晶化させるためのエタノールの使用は予期せぬことであった。なぜならば、エタノールを高温で使用して（エタノールを還流して）ＡＢＤＮＡＺを再結晶化しようとする以前の試みは、二つの新規不純物の形成をもたらしたからである。しかしながら、本発明の方法の結晶化中の温度は、ジクロロメタンを除去するほど十分高い。ＡＢＤＮＡＺとエタノール間で反応の可能性があるとしても、エタノールは、ＡＢＤＮＡＺが高い収率及び純度で製造されるので、再結晶化用の良好な非溶媒であることがわかった。さらに、エタノールは、ジクロロメタンに比べてヒト及び動物への毒性が実質的に低い。

ＤＮＡＺ ＨＢｒをＡＢＤＮＡＺ反応混合物から効果的に除去するための水性抽出の能力は、ＤＮＡＺ ＨＢｒは実質的に水に不溶であると予想されていたため、予想外であった。しかしながら、定性的実験で、ＤＮＡＺ ＨＢｒは、ＡＢＤＮＡＺよりも水に可溶であることが測定された。ＡＢＤＮＡＺは、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約１．３ｍｇ／ｍｌの水中溶解度、及び約３０ｍｇ／ｍｌのジクロロメタン中溶解度を有する。ＤＮＡＺ ＨＢｒの水中でのかなりの溶解度は、ＤＮＡＺ ＨＢｒの相当部分が、従来水に可溶でない非極性の炭素及び水素部分を含むため、驚くべきことであった。ＤＮＡＺ ＨＢｒとＡＢＤＮＡＺ間の構造的類似性に基づくと（図２参照）、ＤＮＡＺ ＨＢｒとＡＢＤＮＡＺは、溶媒中で類似の溶解性を有すると予想された。さらに、ＤＮＡＺ ＨＢｒは、水性抽出が可能なほど水に十分可溶でないと考えられていた。塩ではあるが、ＤＮＡＺ ＨＢｒの分子量の大部分は、ＡＢＤＮＡＺよりも炭素及び水素原子に帰せられるので、二つの化合物は類似の水中溶解度を有することが示唆される。従ってＡＢＤＮＡＺとＤＮＡＺ ＨＢｒの溶媒中対水中における著しく異なる溶解度は意外であった。

水性抽出も思いがけず、製造されたＡＢＤＮＡＺの収率及び純度を改良した。何らかの特定の理論に拘束されるのではないが、ＡＢＤＮＡＺ反応混合物に対して実施される水性抽出は、ＡＢＤＮＡＺ及びＤＮＡＺ ＨＢｒをそれぞれ有機相（溶媒）及び水性相（水）に別々に強制的に溶解させると考えられる。ＡＢＤＮＡＺは水中よりも溶媒中に著しくより可溶であるので、ＡＢＤＮＡＺは有機相に残る。反対に、ＤＮＡＺ ＨＢｒは溶媒中よりも水中に著しくより可溶であるので、ＤＮＡＺ ＨＢｒは水性相に分配される。ＡＢＤＮＡＺとＤＮＡＺ ＨＢｒの溶媒中及び水中における溶解度は十分異なるので、最少量のＡＢＤＮＡＺしか水性相にトラップされ得ず、最少量のＤＮＡＺ ＨＢｒしか溶媒中に溶解し得ない。従って、ＡＢＤＮＡＺ/溶媒溶液から最終的に回収されるＡＢＤＮＡＺは、比較的純粋であり、比較的高収率で単離できる。

さらに、ＡＢＤＮＡＺとＤＮＡＺ ＨＢｒの効果的な分離のために水性抽出を使用することは、ＡＢＤＮＡＺが水に対してわずかに反応性であるため、思いも寄らぬことであった。ＡＢＤＮＡＺを水に暴露すると、望ましくない加水分解副産物が生成すると予想された。しかしながら、水は、これらの条件下では、ＡＢＤＮＡＺと実質的に反応することなく、ＤＮＡＺ ＨＢｒを溶解することが観察された。

ＡＢＤＮＡＺとＤＮＡＺ ＨＢｒの分離に水性抽出及び水性洗浄を使用することの追加の利点は、ＡＢＤＮＡＺ反応混合物から未反応ＤＮＡＺを除去する可能性である。未反応ＤＮＡＺは、ＡＢＤＮＡＺ反応混合物中に最大約２０％存在しうる。未反応ＤＮＡＺは、図３に示されているように、水性ＨＢｒと反応して更なるＤＮＡＺ ＨＢｒを形成しうる。ＨＢｒは、ＡＢＤＮＡＺ反応混合物中に、ＤＮＡＺからＡＢＤＮＡＺへの変換の副産物として存在しうる。あるいは、ＤＮＡＺと反応する水性ＨＢｒは、ＨＢｒ水溶液として供給されてもよい。ＨＢｒ水溶液は、約１％ＨＢｒ〜約４８％ＨＢｒを含みうる。非制限的例として、ＡＢＤＮＡＺ反応混合物又はＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液に対して実施される水洗の一つを、ＨＢｒ水溶液を含む洗浄で置換することもできる。生成する追加のＤＮＡＺ ＨＢｒは水溶性なので、ＤＮＡＺ ＨＢｒは、その後の水性抽出又は水性洗浄によってＡＢＤＮＡＺ反応混合物又はＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液から容易に除去できる。本発明の方法のように、ＡＢＤＮＡＺの合成及び単離の早期段階で未反応ＤＮＡＺを除去すると、ベドナルスキー法と比べて、より高い純度及び収率でＡＢＤＮＡＺを製造することが可能となる。ベドナルスキー法では、未反応ＤＮＡＺはジクロロメタン中に残り、溶媒が真空下で除去されるとＡＢＤＮＡＺ中にトラップされる。その後、ＤＮＡＺは、二相性エーテル洗浄によって部分的にしか除去されない。最終的に、本発明の方法によってＨＭＮＡＺからＡＢＤＮＡＺを合成及び単離するために利用される結晶化及び洗浄作業の総数は、ベドナルスキー法のそれと比べて削減できる。

本発明の方法によって製造されたＡＢＤＮＡＺの治療有効量は、ベドナルスキーに記載されているように、医薬組成物に配合することができる。医薬組成物は、製薬学的に許容しうるビヒクル、ＡＢＤＮＡＺ、及び所望により、湿潤剤又は乳化剤の少なくとも一つ、ｐＨ緩衝剤、助剤、安定剤、懸濁化剤、分散剤、可溶化剤、増粘剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、香味剤、又は保存剤を含みうる。医薬組成物は、ＡＢＤＮＡＺの他に、製薬学的活性剤又は治療剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、ベドナルスキーに記載されているように、異常細胞増殖を特徴とする疾患又は障害の治療又は予防のために、ヒト又はその他の哺乳動物などの患者に投与されうる。

以下の実施例は、本発明の態様をさらに詳細に説明する役割を果たす。これらの実施例は、本発明の範囲に関して、包括的、排他的、又はそうでなければ制限的と解釈されてはならない。

ＡＢＤＮＡＺの合成及び単離に使用された溶媒及び試薬は、商業的供給源、例えばシグマ−アルドリッチ・コー(Sigma-Aldrich Co.)社（ミズーリ州セントルイス）又はパリッシュ・ケミカル・カンパニー社（ユタ州バインヤード）から購入した。水酸化ナトリウム、フェリシアン化カリウム、亜硝酸ナトリウム、過硫酸ナトリウム、ジクロロメタン、硫酸ナトリウム、及びエタノールは試薬グレードのものであった。三フッ化ホウ素エーテラートは再蒸留グレードのものであった。ブロモアセチルブロミドは純度９８^＋％であった。蒸留水がＡＢＤＮＡＺの合成及び単離に使用された。ＨＭＮＡＺは９８％以上の純度であった。

ＡＢＤＮＡＺは、医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）に従って製造された。専用ガラス器具及び加工助剤がＡＢＤＮＡＺの合成及び単離に使用された。使用された全装置（器具）は有機溶媒で濯いで清浄化された。

別途記載のない限り、ＡＢＤＮＡＺの合成及び単離は、連続的な反応又は作業間の休止時間（ダウンタイム）を最小限にして実施した。本明細書において、周囲の(ambient)”という用語は、大気圧及び約２０℃〜約３０℃の範囲の温度のことを言う。ＡＢＤＮＡＺの合成及び単離中の分解を防止するために、各溶液又は懸濁液は３０℃を超える温度に約１０時間を超えて暴露されない。

表１に示されている性質は、従来技術によって測定又は決定されたが、本明細書ではそれらの技術の詳細な説明は省く。ＡＢＤＮＡＺの純度は、赤外（ＩＲ）、ＨＰＬＣ、又はＮＭＲによって測定された。熱的安定性は、２０℃／分の温度勾配(temperature ramp rate)を用いて示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定された。熱的安定性は、溶融開始温度及び分解開始温度として報告される。融点は溶融開始温度として報告される。元素分析は従来技術によって測定された。

実施例１
ＨＭＮＡＺからＤＮＡＺの合成
磁気撹拌棒を備えた三角フラスコに、水（４００ｍＬ）、フェリシアン化カリウム（１７．２ｇ、５２ｍｍｏｌ）、及び亜硝酸ナトリウム（１４３．２ｇ、２０７５ｍｍｏｌ）を装入した。該溶液（本明細書中では“溶液Ａ”と呼ぶ）を全固体が溶解するまで撹拌した（約１５分）。

磁気撹拌棒と熱電対を備えた丸底フラスコに、蒸留水（１４７０ｍＬ）、及び、撹拌しながら、水酸化ナトリウム（７１．２ｇ、１７８０ｍｍｏｌ）を装入した。冷浴を用いて水酸化ナトリウム水溶液を周囲温度（２０℃〜３０℃）に戻し、ＨＭＮＡＺ（９７．６ｇ、５１９ｍｍｏｌ）を加えた。該ニトロン酸塩溶液を周囲条件で約１時間〜約２時間撹拌した。この間にほとんどすべての固体は溶解した。この溶液を本明細書中では“溶液Ｂ”と呼ぶ。溶液Ｂを１０℃に冷却し、溶液Ａを加えた。約１０℃〜約１５℃の温度で、過硫酸ナトリウム（１７３．２ｇ、７２７ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに約１分〜約２分間かけて導入した。発熱が収束し始めたら、冷浴を取り除き、反応混合物を周囲条件で約１６時間撹拌した。得られた橙色／褐色液体を分液漏斗に加え、ジクロロメタンで抽出した（３×４５０ｍＬ）。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウム（約１００ｇ）で乾燥させ、丸底フラスコに加え、回転蒸発器を用いて約４５０ｍＬに濃縮した。

実施例２
ＤＮＡＺからＡＢＤＮＡＺの合成
磁気撹拌棒及びウォーター・ジャケット付き還流冷却器を備えた三口丸底フラスコ（３Ｌ）に、ＤＮＡＺのジクロロメタン溶液（実施例１に記載のように製造）を装入した。装置の窒素ガスパージを開始し、１０分後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（６．３７ｍＬ、５２ｍｍｏｌ）を加え、次いでブロモアセチルブロミド（３３．７７ｍＬ、３８８ｍｍｏｌ）を加えた。冷却器頂部の小通気口を除いてフラスコを密封し、溶液を加熱して穏やかに還流した。６時間（±０．５時間）後、加熱を中止し、ジクロロメタン（１０００ｍＬ）及び蒸留水（８０ｍＬ）をこの順に不均一混合物に加えた。この二相系を全固体（ＤＮＡＺ ＨＢｒ）が溶解するまで１６時間激しく撹拌した。次に、この二相系を分液漏斗に移した。水性相を除去し、有機相を追加の蒸留水で洗浄した（４×５００ｍＬ）。有機層を硫酸ナトリウム（１００ｇ〜１５０ｇ）で乾燥させた後、一口丸底フラスコに移した。該溶液を回転蒸発器上でその初期体積の約半分に濃縮した後、エタノール（２５０ｍＬ）を加えた。残りのジクロロメタンを回転蒸発器によって除去すると、透明の無色結晶の沈殿が起きた。フラスコを氷浴で３０分間冷却した。沈殿物を減圧ろ過によって単離し、追加の冷エタノールで濯ぎ（５×１５０ｍＬ）、乾燥させて純粋なＡＢＤＮＡＺを得た（５６．０４ｇ、収率８１％）。

実施例３
表１に、本発明の方法によって製造されたＡＢＤＮＡＺの２個のサンプルと、ベドナルスキー法によって製造されたＡＢＤＮＡＺの性質をリストアップする。

表１に示されているように、本発明の方法によって製造されたＡＢＤＮＡＺは、ベドナルスキー法によって製造されたＡＢＤＮＡＺと比べて少ない不純物を有していた（高純度）。純度のわずかな改良でさえ、しばしば達成が困難でありうるが、これらの改良は、化合物が医薬組成物に使用予定の場合、特に重要であろう。本発明の方法は、純ＡＢＤＮＡＺを得るのに利用される工程作業数も削減し、乾燥固体爆薬ＤＮＡＺ ＨＢｒの取扱いに伴う危険性も排除する。

本発明は様々な修正及び代替形を取りうるが、例として特定の態様を図面に示し、本明細書中で詳細に記載してきた。しかしながら、本発明を開示された特定の形態に制限するつもりはないことは当然理解されるべきである。それどころか、本発明は、以下の添付の特許請求の範囲及びそれらの法的等価物によって定義されているような本発明の範囲内に入るすべての修正、等価物、及び代替を包含する。

Claims (17)

1. Ｎ−（ブロモアセチル）−３，３−ジニトロアゼチジン（ＡＢＤＮＡＺ）の製造法であって、
   １−ｔｅｒｔ−ブチル−３，３−ジニトロアゼチジン（ＤＮＡＺ）を溶媒中でブロモアセチルブロミド及び三フッ化ホウ素エーテラートと反応させて、ＡＢＤＮＡＺ及びＤＮＡＺの塩を含む反応混合物を製造し；
   水及び追加量の溶媒を反応混合物に加えて、ＡＢＤＮＡＺを含む有機相とＤＮＡＺの塩を含む水性相を形成させ；
   有機相と水性相を分離して、ＡＢＤＮＡＺを含むＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液と、ＤＮＡＺの塩を含む水性相を製造し；
   非溶媒をＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液に加えて、ＡＢＤＮＡＺ／溶媒／非溶媒混合物を製造し；そして
   ＡＢＤＮＡＺを回収する
   ことを含む方法。
2. ＤＮＡＺを溶媒中でブロモアセチルブロミド及び三フッ化ホウ素エーテラートと反応させてＡＢＤＮＡＺ及びＤＮＡＺの塩を含む反応混合物を製造することが、ＤＮＡＺ、ブロモアセチルブロミド、及び三フッ化ホウ素エーテラートを還流で約４時間〜約７時間の間反応させることを含む、請求項１に記載の方法。
3. ＤＮＡＺを溶媒中でブロモアセチルブロミド及び三フッ化ホウ素エーテラートと反応させてＡＢＤＮＡＺ及びＤＮＡＺの塩を含む反応混合物を製造することが、ＤＮＡＺをブロモアセチルブロミド及び三フッ化ホウ素エーテラートとジクロロメタン中で反応させることを含む、請求項１に記載の方法。
4. ＤＮＡＺを溶媒中でブロモアセチルブロミド及び三フッ化ホウ素エーテラートと反応させることが、２モル当量のＤＮＡＺをジクロロメタン中で１．５モル当量のブロモアセチルブロミドと反応させることを含む、請求項１に記載の方法。
5. 水及び追加量の溶媒を反応混合物に加えて有機相と水性相を形成させることが、ジクロロメタン及び水を反応混合物に添加することを含む、請求項１に記載の方法。
6. 非溶媒を加える前に、ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液を水で洗浄することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 水を除去するために乾燥剤をＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液に加え、そして乾燥剤を回収することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. ＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液から溶媒の少なくとも一部分を除去することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 非溶媒をＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液に加えることが、エタノールをＡＢＤＮＡＺ／溶媒溶液に加えることを含む、請求項１に記載の方法。
10. ＡＢＤＮＡＺの回収が、ＡＢＤＮＡＺ／溶媒／非溶媒混合物から溶媒を除去することを含む、請求項１に記載の方法。
11. ＡＢＤＮＡＺの回収が、非溶媒を除去してＡＢＤＮＡＺの結晶を製造することを含む、請求項１に記載の方法。
12. Ｎ−（ブロモアセチル）−３，３−ジニトロアゼチジン（ＡＢＤＮＡＺ）の製造法であって、
    １−ｔｅｒｔ−ブチル−３，３−ジニトロアゼチジン（ＤＮＡＺ）をジクロロメタン中でブロモアセチルブロミド及び三フッ化ホウ素エーテラートと反応させて、ＡＢＤＮＡＺ及びＤＮＡＺの臭化水素塩を含む反応混合物を製造し；
    水及び追加量のジクロロメタンを反応混合物に加えて、ジクロロメタン及びＡＢＤＮＡＺを含む有機相と水及びＤＮＡＺの臭化水素塩を含む水性相を形成させ；
    有機相を水性相から分離し；
    エタノールをジクロロメタン及びＡＢＤＮＡＺを含む有機相に加え；
    減圧下でジクロロメタンを蒸発させてＡＢＤＮＡＺ／エタノール懸濁液を形成させ；そして
    ＡＢＤＮＡＺ／エタノール懸濁液からエタノールをろ過する
    ことを含む方法。
13. ＡＢＤＮＡＺ／エタノール懸濁液からのエタノールのろ過が、ＨＭＮＡＺからＤＮＡＺの推定１００％収率を基にして、約８０％〜約１００％の収率でＡＢＤＮＡＺを製造することを含む、請求項１２に記載の方法。
14. ＡＢＤＮＡＺ／エタノール懸濁液からのエタノールのろ過が、約９９．５％より高い純度を有するＡＢＤＮＡＺを製造することを含む、請求項１２に記載の方法。
15. 約９９．５％より高い純度のＮ−（ブロモアセチル）−３，３−ジニトロアゼチジン（ＡＢＤＮＡＺ）及び製薬学的に有効なビヒクルを含み、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３，３−ジニトロアゼチジンの塩を実質的に含まない組成物。
16. 組成物が、約０．４％未満の１−ｔｅｒｔ−ブチル−３，３−ジニトロアゼチジンしか含まない、請求項１５に記載の組成物。
17. 組成物が、ブロモ酢酸を実質的に含まない、請求項１５に記載の組成物。

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