JP5383780B2 - レセプターを活性化し得る融合ポリペプチド - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、標的レセプターを活性化し得るマルチマー融合タンパク質、このような融合ポリペプチドを産生する方法、およびこの標的レセプターの活性化が所望される疾患または状態の処置、診断またはモニタリングするための方法に関する。

（関連技術の説明）
可溶性Ｅｐｈリガンドドメインをクラスター化して、それらの同族レセプターを活性化し得るマルチマーを作製することは、特許文献１に記載されている。特許文献２は、抗体を用いてエリスロポエチンレセプターを活性化する方法を記載する。

米国特許第５，７４７，０３３号明細書 米国特許第６，３１９，４９９号明細書

（発明の簡単な要旨）
本発明は、活性化されるためにマルチマー化を必要とする標的レセプターを活性化し得るマルチマー融合ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、標的レセプターの活性化が望ましい状態を処置するために有用であり、種々のインビトロおよびインビボでの診断用途および予後診断用途を有する。本発明のポリペプチドは、例えば、標的特異的抗体または天然のリガンドと比較して改善された標的レセプター活性化能力を示す、単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）または二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）のテトラマーであり得る。

従って、第一の局面では、本発明は、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子は、融合ポリペプチド（Ａ）_ｘ−Ｍ−（Ａ’）_ｙをコードし、ここで、Ａは、標的レセプターに特異的なポリペプチドであり、Ｍは、マルチマー化成分であり、Ａ’は、Ａと同じ標的レセプターに特異的なポリペプチドであり、そしてｘおよびｙは、独立して、１〜１０の間の数である。

第一の実施形態では、ＡおよびＡ’は、標的レセプターに特異的な、抗体または抗体フラグメントであり、そして標的レセプターに特異的な、同じ、抗体または抗体フラグメントである。別の実施形態では、ＡおよびＡ’は、同じ標的レセプターに特異的な、異なる、抗体または抗体フラグメントである。好ましくは、ＡおよびＡ’は、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメントである。この融合ポリペプチドがヒト治療剤として意図される場合、本発明は、ヒト化抗体またはヒト化抗体フラグメントを包含する。

第二の実施形態では、ＡおよびＡ’は、同じ標的レセプターに特異的な、リガンドまたはリガンドフラグメントである。より特定の実施形態では、ＡおよびＡ’は、同じ標的レセプターに特異的な、異なる、リガンドまたはリガンドフラグメントである。別の特定の実施形態では、ＡおよびＡ’は、同じリガンドまたはリガンドフラグメントである。

第三の実施形態では、Ａは、標的レセプターに特異的な、抗体または抗体フラグメントであり、そしてＡ’は、同じ標的レセプターに特異的な、リガンドまたはリガンドフラグメントである。好ましい実施形態では、Ａは、Ｔｉｅレセプター（Ｔｉｅ−１またはＴｉｅ−２）に対する、抗体または抗体フラグメントであり、Ａ’は、Ｔｉｅレセプターのフィブリノゲンドメインである。

特定の実施形態では、Ｍは、別の融合ポリペプチド上のマルチマー化成分とマルチマー化して、融合ポリペプチドのマルチマーを形成する、マルチマー化成分である。好ましい実施形態では、Ｍは、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＩｇＧの重鎖である。ＩｇＧのＦｃドメインは、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプから選択され得る。

第二の局面では、本発明は、（Ａ）_ｘ−Ｍ−（Ａ’）_ｙを含む融合ポリペプチドを提供し、ここで、Ａ、Ｍ、Ａ’、ｘおよびｙは、上記の通りである。

第一の実施形態では、ＡおよびＡ’は、標的レセプターに特異的な、抗体または抗体フラグメントであり、そして標的レセプターに特異的な、同じ、抗体または抗体フラグメントである。別の実施形態では、ＡおよびＡ’は、同じ標的レセプターに特異的な、異なる、抗体または抗体フラグメントである。好ましくは、ＡおよびＡ’は、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメントである。

第二の実施形態では、ＡおよびＡ’は、同じ標的レセプターに特異的な、リガンドまたはリガンドフラグメントである。より特定の実施形態では、ＡおよびＡ’は、同じ標的レセプターに特異的な、同じかまたは異なる、リガンドまたはリガンドフラグメントである。

第三の実施形態では、Ａは、標的レセプターに特異的な、抗体または抗体フラグメントであり、そしてＡ’は、同じ標的レセプターに特異的な、リガンドまたはリガンドフラグメントである。

第三の局面では、本発明は、本発明の２つの融合ポリペプチドを含む、活性化ダイマー融合ポリペプチド（例えば、上記で規定した通りの（Ａ）_ｘ−Ｍ−（Ａ’）_ｙという２つのポリペプチドから形成されたダイマー）を提供する。抗体が２個以下のレセプターをクラスター形成する能力と比較して、本発明の活性化ダイマーは、４個以上のレセプターに結合してクラスターを形成して、レセプター活性化をもたらし得る。

１つの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドの成分は、互いに直接連結される。他の実施形態では、スペーサー配列は、１以上の成分の間に含まれ得、このスペーサー配列は、１以上の分子（例えば、アミノ酸）を含み得る。例えば、スペーサー配列は、ドメイン含有成分にもともと連結された１以上のアミノ酸を含み得る。スペーサー配列はまた、融合ポリペプチドの発現を増強するために用いられる配列を含んでもよく、制限部位を提供してもよく、成分ドメインに最適な三次構造および四次構造を形成させてもよく、そして／または成分ドメインによって成分とその標的レセプターとの相互作用を増強させてもよい。１つの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、１以上の成分の間に１以上のペプチド配列を含み、このペプチド配列は、１〜２５の間のアミノ酸である。さらなる実施形態は、シグナル配列を、本発明の融合ポリペプチドの開始部、すなわちアミノ末端に含み得る。このようなシグナル配列は、細胞にとってネイティブなものであっても、組換え体であってもまたは合成のものであってもよい。

本発明の融合ポリペプチドの成分は、種々の配置で配置され得る。例えば、融合ポリペプチドの開始部、すなわちアミノ末端から記載すると、（Ａ）_ｘ−Ｍ−（Ａ’）_ｙ、（Ａ）_ｘ−（Ａ’）_ｙ−Ｍ、Ｍ−（Ａ）_ｘ−（Ａ’）_ｙ、（Ａ’）_ｙ−Ｍ−（Ａ）_ｘ、（Ａ’）_ｙ−（Ａ）_ｘ−Ｍ、Ｍ−（Ａ’）_ｙ−（Ａ）_ｘ、（Ａ）_ｘ−Ｍ−（Ａ’）_ｙ、（Ａ）_ｘ−（Ａ’）_ｙ−Ｍ、Ｍ−（Ａ）_ｘ−（Ａ’）_ｙなどであり、ここでｘ＝１〜１０であり、ｙ＝１〜１０である。さらにより特定の実施形態では、ｘ＝１およびｙ＝１、またはｘ＝２およびｙ＝２である。

第四の局面では、本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターを特徴とする。本発明はさらに、本発明の核酸を含む発現ベクターを特徴とし、ここでこの核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結されている。また提供されるのは、本発明の融合ポリペプチドの産生のための宿主−ベクター系であり、この系は、融合ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞または宿主生物体に導入された本発明の発現ベクターを含み、このような細胞または生物体としては、トランスジェニック動物が挙げられるがそれには限定されない。

第五の局面では、本発明は、本発明の融合ポリペプチドを産生する方法を特徴とし、この方法は、本発明の核酸配列を含むベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、この宿主細胞からのこのポリペプチドの発現に適切な条件下で培養する工程、およびこのようにして産生された融合ポリペプチドを回収する工程を包含する。

第六の局面では、本発明は、標的レセプター関連疾患または標的レセプター関連状態の処置のための治療方法を特徴とし、この方法は、治療有効量の本発明の活性化ダイマーを、その必要のある被験体に投与する工程を包含し、ここでこの標的レセプターが活性化され、そしてこの疾患または状態は、改善または阻害される。

したがって、第七の局面では、本発明は、本発明の活性化ダイマーを、薬学的に受容可能なキャリアとともに含む、薬学的組成物を特徴とする。このような薬学的組成物は、ダイマータンパク質またはコード核酸を含み得る。

他の目的および利点は、次の詳細な説明の概観から明らかになる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（Ａ） _ｘ −Ｍ−（Ａ’） _ｙ を含む融合ポリペプチドであって、ここで、成分Ａおよび成分Ａ’は、標的レセプターを結合し得るポリペプチドであり、成分Ｍは、マルチマー化成分であり、そしてｘおよびｙは、独立して、１〜１０の間の数である、融合ポリペプチド。
（項目２）
ＡおよびＡ’が、各々、前記標的レセプターに特異的な抗体由来の、抗体またはフラグメントである、項目１に記載の融合ポリペプチド。
（項目３）
ＡおよびＡ’が、同じかまたは異なる、抗体または抗体フラグメントである、項目２に記載の融合ポリペプチド。
（項目４）
ＡおよびＡ’が、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメントである、項目３に記載の融合ポリペプチド。
（項目５）
Ａが、前記標的レセプターに特異的な抗体由来の、抗体またはフラグメントであり、そしてＡ’が、同じ標的レセプターを結合し得るリガンドまたはリガンドフラグメントである、項目１に記載の融合ポリペプチド。
（項目６）
Ａが、Ｔｉｅレセプターに対する抗体または抗体フラグメントであり、そしてＡ’が、Ｔｉｅレセプターリガンドのフィブリノゲンドメインである、項目５に記載の融合ポリペプチド。
（項目７）
前記ＴｉｅレセプターがヒトＴｉｅレセプターであり、Ａがヒト化抗体またはヒト化抗体フラグメントであり、そしてＡ’がヒトＡｎｇ−１またはＡｎｇ−２のフィブリノゲンである、項目６に記載の融合ポリペプチド。
（項目８）
ＡおよびＡ’が、各々、同じ標的レセプターに結合し得る、リガンドまたはリガンドフラグメントである、項目１に記載の融合ポリペプチド。
（項目９）
前記マルチマー化成分が、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖のＦｃドメイン、ならびに重鎖のＣ _Ｈ ２定常領域およびＣ _Ｈ ３定常領域からなる群より選択される、項目１〜８のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
（項目１０）
前記標的レセプターが、活性化されるためにマルチマー化を必要とする、項目１に記載の融合ポリペプチド。
（項目１１）
前記標的レセプターが、ＥＰＯレセプター、Ｇ−ＣＳＦレセプター、ＧＭ−ＣＳＦレセプター、ＧＨレセプター、ＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＶＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、Ｅｐｈファミリーレセプター、ＴＧＦ−βレセプターファミリー、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２からなる群より選択される、項目１０に記載の融合ポリペプチド。
（項目１２）
前記融合ポリペプチドの成分が、（Ａ） _ｘ −Ｍ−（Ａ’） _ｙ 、（Ａ） _ｘ −（Ａ’） _ｙ −Ｍ、Ｍ−（Ａ） _ｘ −（Ａ’） _ｙ 、（Ａ’） _ｙ −Ｍ−（Ａ） _ｘ 、（Ａ’） _ｙ −（Ａ） _ｘ −Ｍ、Ｍ−（Ａ’） _ｙ −（Ａ） _ｘ 、（Ａ） _ｘ −Ｍ−（Ａ’） _ｙ 、（Ａ） _ｘ −（Ａ’） _ｙ −Ｍ、およびＭ−（Ａ） _ｘ −（Ａ’） _ｙ からなる群より選択される配置で配置される、項目１〜１１のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
（項目１４）
項目１３に記載の融合ポリペプチドのうちの２つによって形成される、ダイマー。
（項目１５）
融合ポリペプチドを産生する方法であって、項目１３に記載の核酸を含むベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、該宿主細胞からのタンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程、およびこのようにして産生された融合タンパク質を回収する工程を包含する、方法。
（項目１６）
項目１４に記載のダイマーおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。

（詳細な説明）
本方法を記載する前に、特定の方法および記載された実験条件は変化し得るので、本発明がこのような特定の方法、および記載された実験条件に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語が、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定することを意図しないこともまた理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。

他に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載した方法および材料と類似または均等な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

（定義）
本明細書中で用いられる場合、用語「標的レセプター関連状態または標的レセプター関連疾患」とは、一般に、特定の標的レセプターと関連した哺乳動物宿主（特に、ヒト宿主）の状態を包含する。従って、標的レセプター関連状態を処置することは、標的レセプター活性の減少を反映する症状を有するか、または疾患、状態もしくは処置のレジメンに応じてこのようなレベルの低下を有することが予想される、哺乳動物（特に、ヒト）の処置を包含する。標的レセプター関連状態または標的レセプター関連疾患を処置することは、ヒト被験体の処置を包含し、ここで、本発明の活性化ダイマーを用いた標的レセプターの活性化の促進は、標的レセプター関連状態または標的レセプター関連疾患から生じる望ましくない症状の改善をもたらす。本明細書中で用いられる場合、「標的レセプター関連状態」はまた、特定の標的レセプターの活性化を一時的に、または長期にわたって変更することが望ましい状態を包含する。

（標的レセプター）
標的レセプターの例は、Ｅｐｈファミリーのメンバー（例えば、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ５、ＥｐｈＢ６）、Ｔｉｅレセプター（例えば、Ｔｉｅ−１またはＴｉｅ−２）である。適切なリガンドまたはそのフラグメントとしては、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）（例えば、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２、エフリン−Ｂ３）の可溶性ドメイン、およびアンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）（例えば、アンジオポエチン−１（ａｎｇ−１）、ａｎｇ−２、ａｎｇ−３、および／またはａｎｇ−４）のフィブリノゲンドメインが挙げられる。

適切な標的レセプターは、マルチマー化された場合に活性化されるレセプターである。このクラスのレセプターとしては、内在性キナーゼドメインを保有するレセプターが挙げられるがこれに限定されない。このクラスの内在性キナーゼレセプターには、ホモダイマーを形成するレセプター、または同じレセプターのクラスターを形成するレセプター（例えば、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＴｒｋファミリーおよびＥｐｈファミリーのレセプター）、ならびにヘテロダイマーもしくはクラスターを形成するレセプター（例えば、ＶＥＧＦレセプターであるＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦレセプターであるＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβ、ならびにＴＧＦファミリーのレセプター）がある。適切な標的レセプターとしてはまた、キナーゼが会合するレセプターのクラスが挙げられるがこれらに限定されない。これらのレセプターとしては、ホモダイマーまたはクラスターを形成するレセプター（例えば、成長ホルモンレセプター、ＥＰＯＲおよびＧ−ＣＳＦレセプターＣＤ１１４）、ならびにヘテロダイマーまたはクラスターを形成するレセプター（例えば、ＧＭ−ＣＳＦレセプターであるＧＭＲαおよびＧＭＲβ）が挙げられる。

（標的レセプター特異的抗体および標的レセプター特異的リガンド）
特定の実施形態では、本発明の活性化ダイマーは、選択された標的レセプターに対して作製された抗体から単離された１以上の免疫グロブリン結合ドメインを含む。用語「免疫グロブリン」または「抗体」とは、本明細書中で用いられる場合、抗原（本発明の場合、標的レセプターまたはその一部である）に特異的に結合して抗原を認識する、免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域またはそのフラグメントを含む、哺乳動物（ヒトを包含する）ポリペプチドをいう。意図される活性化ダイマーが哺乳動物治療剤として用いられる場合、免疫グロブリン結合領域は、対応する哺乳動物免疫グロブリンに由来すべきである。活性化ダイマーが非治療用途（例えば、診断およびＥＬＩＳＡ）を意図される場合、免疫グロブリン結合領域は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）のいずれかに由来し得る。ヒト免疫グロブリン遺伝子または遺伝子フラグメントとしては、κ定常領域、λ定常領域、α定常領域、γ定常領域、δ定常領域、ε定常領域、およびμ定常領域、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかであると分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεと分類され、次いで、それぞれ、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定する。各ＩｇＧのクラス内には、異なるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２など）が存在する。代表的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性を決定する際に最も重要である。

ヒトＩｇＧの例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、テトラマーを構成する。各テトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの軽鎖（約２５ｋＤ）および１つの重鎖（約５０ｋＤ〜約７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う、約１００〜１１０またはそれより多くのアミノ酸からなる可変領域を規定する。用語「可変軽鎖」（Ｖ_Ｌ）および可変重鎖（Ｖ_Ｈ）とは、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。

抗体は、インタクトな免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼを用いた消化によって産生される充分に特徴付けられた多数のフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）’_２、Ｆａｂ’など）として存在する。従って、用語「免疫グロブリン」または「抗体」はまた、本明細書中で用いられる場合、抗体全体の改変によって産生された抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成された抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定される抗体フラグメント）を包含する（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４を参照のこと）。さらに、本発明の融合ポリペプチドの標的レセプター結合ドメイン成分は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）または軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）、ならびにそれらの標的レセプター結合部分を包含する。このような可変領域を産生するための方法は、Ｒｅｉｔｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９０：６８５−６９８に記載される。

抗体を調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｈａｒｌｏｗ ＆
Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。目的の抗体の重鎖をコードする遺伝子および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングされ得る（例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローニングされて組換えモノクローナル抗体を産生するために用いられ得る）。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーもまた、ハイブリドーマまたは形質細胞から作製され得る。重鎖遺伝子産物および軽鎖遺伝子産物のランダム組合せは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生じる。単鎖抗体または組換え抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号；米国特許第４，８１６，５６７号）は、本発明の融合ポリペプチド、活性化ダイマーおよび方法において用いられる抗体を産生するために適応され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物体（例えば、他の哺乳動物）は、ヒト抗体またはヒト化抗体を発現させるために用いられ得る。あるいは、ファージディスプレイ技術は、抗体、抗体フラグメント（例えば、可変ドメイン）および選択された抗原に特異的に結合するヘテロマーＦａｂフラグメントを同定するために用いられ得る。ファージディスプレイは、本明細書中に記載される本発明に従って他の弱いバインダーと合わせた場合に強い結合活性化ダイマーを生じる、弱く結合する抗体またはそのフラグメントを、免疫していない動物から単離するために特に有用なものである。

好ましい免疫グロブリン（抗体）のスクリーニングおよび選択は、当該分野で公知の種々の方法によって行われ得る。標的レセプターに特異的なモノクローナル抗体の存在についての最初のスクリーニングは、例えば、ＥＬＩＳＡベースの方法またはファージディスプレイの使用によって行われ得る。第二のスクリーニングは、好ましくは、本発明の融合ポリペプチドの構築において使用するための所望のモノクローナル抗体を同定して選択するために行われる。第二のスクリーニングは、当該分野で公知の任意の適切な方法を用いて実施され得る。

（核酸の構築および発現）
本発明の融合ポリペプチドの個々の成分は、当該分野で公知の分子生物学的方法を用いて、核酸分子から産生され得る。核酸分子は、適切な宿主細胞中に導入された場合に融合ポリペプチドを発現し得るベクター中に挿入される。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ＤＮＡフラグメントをベクターに挿入するための当業者に公知の任意の方法を用いて、転写／翻訳制御シグナルの制御下で本発明の融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを構築し得る。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組換えを包含し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｗｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。

本発明の核酸分子の発現は、この分子が、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように、第二の核酸配列によって調節され得る。例えば、本発明の核酸分子の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御され得る。

（免疫グロブリン由来の成分）
核酸構築物は、抗標的レセプター抗体由来の結合ドメインをコードする領域を含む。一般に、このような結合ドメインは、Ｖ_Ｈ鎖可変領域またはＶ_Ｌ鎖可変領域に由来する。所望の結合特性を示す抗体の同定および選択の後、各抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域が単離され、増幅され、クローニングされ、そして配列決定される。アミノ酸をコードするおよび／もしくは制限部位を保有するヌクレオチド配列の付加、アミノ酸をコードするヌクレオチド配列の欠失、またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の置換を含め、改変は、Ｖ_Ｈヌクレオチド配列およびＶ_Ｌヌクレオチド配列に行われ得る。

本発明は、ヒト化されているかまたはキメラである、抗体または抗体フラグメントを包含する。「ヒト化」形態またはキメラ形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリン由来の、抗原結合に必要な最少配列を含むそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列）である。これらは、キメラ抗体またはヒト化抗体の構築のための出発材料を提供するマウス抗体または他の非ヒト抗体と同じかまたは類似の結合特異性および親和性を有する。キメラ抗体は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから（代表的には遺伝子操作によって）軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が構築されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒト定常（Ｃ）セグメント（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４）に連結され得る。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。従って、代表的なキメラ抗体は、マウス抗体由来のＶドメインまたは抗原結合ドメインと、ヒト抗体由来のＣドメインまたはエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と称される）由来である可変領域フレームワーク残基および実質的にマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）由来である相補性決定領域（ＣＤＲ領域）を有する。Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）ならびにＷＯ ９０／０７８６１、米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，２２５，５３９号を参照のこと。存在する場合、定常領域もまた、実質的にまたは完全に、ヒト免疫グロブリン由来である。ヒト可変ドメインは通常、フレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するマウス可変領域ドメインと高度の配列同一性を示す、ヒト抗体から選択される。重鎖可変領域フレームワーク残基および軽鎖可変領域フレームワーク残基は、同じかまたは異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよく、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。ＷＯ ９２／２２６５３を参照のこと。ヒト可変領域フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸配列は、ＣＤＲのコンホメーションおよび／または抗原への結合に対する可能な影響に基づいて、置換のために選択される。このような可能な影響の調査は、モデリング、特定の位置でのアミノ酸の特徴の検査、または特定のアミノ酸の置換もしくは変異誘発の影響の経験的観察による。例えば、マウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間であるアミノ酸が異なる場合、このヒトフレームワークアミノ酸は、通常、そのアミノ酸が以下であると合理的に予想されるならば、マウス抗体由来の均等なフレームワークアミノ酸によって置換されるべきである：（１）抗原を直接、非共有結合的に結合する；（２）ＣＤＲ領域に隣接する；（３）他の点でＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Ａ内にある）、または（４）Ｖ_Ｌ−Ｖ_Ｈインターフェースに関与する。他の置換候補は、ヒト免疫グロブリンにとってその位置で普通ではない、アクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の均等な位置またはより代表的なヒト免疫グロブリンの均等な位置由来のアミノ酸で置換され得る。他の置換候補は、ヒト免疫グロブリンにとってその位置で普通ではない、アクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。ヒト化免疫グロブリンの可変領域フレームワークは、通常、ヒト可変領域フレームワーク配列またはこのような配列のコンセンサスに対して、少なくとも８５％の配列同一性を示す。

完全ヒト抗体は、当該分野で公知の任意の方法によって作製され得る。例えば、米国特許第６，５９６，５４１号は、完全ヒト抗体を作製する方法を記載する。手短に述べると、最初に、ヒト可変領域（ＶＤＪ／ＶＪ）およびマウス定常領域を含むハイブリッド抗体を産生するトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製する。これは、マウス可変領域（ＶＤＪ／ＶＪ）遺伝子の、そのヒト対応物による直接インサイチュ置換によって達成される。次いで、このマウスは、ヒト抗原またはその免疫原性フラグメントに曝露される。得られるハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座は、Ｂ細胞発達の間に天然の再配置プロセスを経て、所望の特異性を有するハイブリッド抗体を産生する。本発明の抗体は、上記の通りに選択される。その後、マウス定常領域を所望のヒト対応物で置換することにより、完全ヒト抗体が作製される。完全ヒト抗体はまた、重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座についてのヒト導入遺伝子またはミニ染色体を発現する、マウスまたは他のトランスジェニック動物（例えば、ウシ）から単離され得る（Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１：１１−２３およびＩｓｈｉｄａら（２００２）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．４：９１−１０２）。完全ヒト抗体はまた、このタンパク質が投与されたヒトから単離され得る。完全ヒト抗体はまた、免疫系がヒト幹細胞、ヒト脾細胞またはヒト末梢血細胞の移植によって再生されている、免疫無防備状態のマウスから単離され得る（Ｃｈａｍａｔら（１９９９）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１８０：２６８−７７）。目的のタンパク質に対する免疫応答を増強するために、ヒト抗体トランスジェニック動物において、目的のタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし得る。

（レセプター結合ドメイン）
本発明に従って、核酸構築物は、標的レセプターリガンド由来の結合ドメインをコードする成分を含む。所望の結合特性を示す、リガンドの標的レセプター結合ドメインの同定後、このようなドメインをコードする核酸が、核酸構築物において用いられる。このような核酸は、アミノ酸をコードするかおよび／もしくは制限部位を保有するヌクレオチド配列の付加、アミノ酸をコードするヌクレオチド配列の欠失、またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の置換を含め、改変され得る。

本発明の核酸構築物は、当該分野で公知の方法により、発現ベクターまたはウイルスベクターに挿入され、ここで、この核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結される。また提供されるのは、適切な宿主細胞中に導入されている本発明の発現ベクターを含む、本発明の融合ポリペプチドおよび活性化ダイマーの産生のための宿主−ベクター系である。適切な宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＢＨＫ細胞またはＮＳ０細胞）であり得る。

本発明はさらに、発現ベクターで形質転換された細胞をその融合ポリペプチドの産生を許容する条件下で増殖させ、そしてこの融合ポリペプチドから形成される活性化ダイマーを回収することによる、本発明の活性化ダイマーを産生するための方法を包含する。細胞はまた、本発明の核酸構築物を含む組換えウイルスで形質導入され得る。

活性化ダイマーは、任意の技術によって精製され得、これはその後の安定なダイマーの形成を許容する。例えば、そして限定ではないが、活性化ダイマーは、細胞から、可溶性ポリペプチドまたは封入体のいずれかとして回収され得、封入体から、活性化ダイマーは、８Ｍ塩酸グアニジニウムおよび透析によって定量的に抽出され得る。活性化ダイマーをさらに精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲルろ過が用いられ得る。活性化ダイマーはまた、真核生物細胞または原核生物細胞からの分泌後、馴化培地から回収され得る。

（スクリーニング方法および検出方法）
本発明の活性化ダイマーはまた、標的レセプターを検出することおよび／または標的レセプターのレベルを測定することが所望される場合、インビトロまたはインビボでのスクリーニング方法において用いられ得る。スクリーニング方法は、当該分野で周知であり、そして無細胞アッセイ、細胞ベースのアッセイおよび動物アッセイを包含する。インビトロアッセイは、固体状態または可溶性のいずれかであり得る。標的レセプター検出は、標的レセプターに結合した活性化ダイマーを同定し得る標識または検出可能な基の使用を含め、当該分野で公知の多数の方法で達成され得る。検出可能な標識は、免疫アッセイの分野において十分に開発されており、そして一般に、本発明の活性化ダイマーを用いるアッセイに関連して用いられ得る。

（治療方法）
本発明の活性化ダイマーがそれらのレセプターへの高親和性結合を示す能力によって、これらは、それらのレセプターを効率的に活性化するために治療的に有用となる。従って、特定の例では、標的レセプター（例えば、エフリン）についての内因性リガンドの効果を増加させることが所望され得る。例えば、神経系外傷の領域では、特定の状態は、エフリン応答性の増加から利益を獲得し得る。それゆえ、本明細書中に記載される組成物の使用によって、このような状態を罹患する患者におけるエフリンの結合親和性を増大させることが有益であり得る。

本明細書中の本発明はさらに、Ｔｉｅ−２レセプターを発現する細胞、組織または器官に関与する障害を罹患する患者の処置のための治療剤として本明細書中に記載される活性化ダイマーの開発を提供する。このような分子は、ヒトもしくは動物の身体の処置方法において、または診断方法において、用いられ得る。

Ｔｉｅ−２レセプターとして公知の標的レセプターは、内皮細胞に関連して同定されており、そして以前に実証されたように、このレセプターのアゴニスト（例えば、Ｔｉｅ−２リガンド１（Ａｎｇ１））のブロッキングは、血管新生を防止することが示されている。従って、標的レセプターがＴｉｅ−２である本発明の活性化ダイマーは、血管新生が示される疾患または障害における血管新生の誘導に有用であり得る。このような疾患または障害としては、創傷治癒、虚血および糖尿病が挙げられる。このリガンドは、動物モデルにおいて試験され得、そして他の薬剤（例えば、血管形成性である別の内皮細胞特異的因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））について記載される通りに、治療的に使用され得る。１９９４年７月２６日発行のＦｅｒｒａｒａら、米国特許第５，３３２，６７１号。Ｆｅｒｒａｒａらは、虚血性心筋層への血流を増強する際に、創傷治癒を増強する際に、そして新脈管形成（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）が所望される他の治療場面における脈管形成因子の影響を実証するために用いられ得る、インビトロおよびインビボでの研究を記載する。本発明によれば、このようなＴｉｅ−２特異的活性化ダイマーは、単独で、または１以上のさらなる薬学的に活性な化合物（例えば、ＶＥＧＦまたは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ））と組み合わせて用いられ得る。

（投与方法）
因子（例えば、タンパク質または核酸）の治療送達について当該分野で公知の方法（例えば、細胞トランスフェクション、遺伝子治療、送達ビヒクルもしくは薬学的に受容可能なキャリアを用いた直接投与、本発明の活性化ダイマーをコードする核酸を含む組換え細胞を提供することによる間接的送達）は、被験体における標的レセプターを活性化するために、本発明の活性化ダイマーまたは活性化ダイマーをコードする核酸の治療送達のために用いられ得る。

種々の送達系（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、化合物を発現し得る組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）が公知であり、そして本発明の活性化ダイマーを投与するために用いられ得る。導入方法は、腸内または非経口であり得、そして皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、肺経路、鼻腔内経路、眼内経路、硬膜外経路および経口経路を包含するがこれらに限定されない。これらの化合物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮内層もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通した吸収によって、投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身投与または局所投与であり得る。さらに、本発明の薬学的組成物を、脳室内注射および髄腔内投与を包含する任意の適切な経路によって中枢神経系に導入することが所望され得る；脳室内注射は、（例えば、Ｏｍｍａｙａレザバのようなレザバに取り付けられた）脳室内カテーテルによって促進され得る。例えば、吸入器またはネブライザおよびエアゾール化剤を用いた処方物の使用によって、肺投与もまた用いられ得る。

特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが所望され得る；これは、例えば、非限定的に、手術中の局所注入、表面塗布（ｔｏｐｉｃａl ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、注射、カテーテル、または移植片により達成さ
れ得、この移植片は、膜（例えば、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜）、繊維、または市販の皮膚代用品を含め、多孔性、非多孔性またはゲル状の材料である。

別の実施形態では、この活性因子は、小胞（特に、リポソーム）内で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３を参照のこと）。なお別の実施形態では、この活性因子は、徐放系内で送達され得る。１つの実施形態では、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）前出を参照こと）。

（薬学的組成物）
本発明はまた、本発明の活性化ダイマーおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を提供する。用語「薬学的に受容可能な」とは、連邦の統制機関もしくは州政府によって承認されるかまたは米国薬局方もしくは動物、より特定にはヒトにおいて使用するための他の一般的に認識される薬局方に列挙されることを意味する。用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、佐剤、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的キャリアは、無菌の液体（例えば、水および油（石油起源、動物起源、植物起源もしくは合成起源の油（例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む））であり得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米粉（ｒｉｃｅ，ｆｌｏｕｒ）、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ，ｇｌｙｃｏｌ）、水、エタノールなどが挙げられる。この組成物はまた、所望の場合、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放処方物などの形態を採り得る。この組成物は、トリグリセリドのような伝統的結合剤およびキャリアを用いて、坐剤としても処方され得る。経口処方物は、標準的キャリア（例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。

好ましい実施形態では、この組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組成物として、慣用的な手順に従って処方される。必要な場合、この組成物はまた、可溶化剤および注射部位での痛みを和らげるための局所麻酔剤（例えば、リドカイン）を含み得る。この組成物が注入によって投与されるべき場合、これは、無菌の薬学的グレードの水または生理食塩水を含む注入ビンに分配され得る。この組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用滅菌水または滅菌生理食塩水のアンプルが提供され得る。

本発明の活性因子は、中性形態または塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離アミノ基を用いて形成される塩（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される塩）および遊離カルボキシル基を用いて形成される塩（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される塩）が挙げられる。

（キット）
本発明はまた、本発明の少なくとも１つの活性化ダイマーが充填された１以上の容器を備える、薬学的パックまたは薬学的キットを提供する。必要に応じて、このような容器に関連して、医薬品または生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定される形式の通知が存在し得、この通知は、（ａ）ヒトへの投与のための製造、使用もしくは販売の、当該機関による認可、（ｂ）指示書、またはその両方を反映する。

（トランスジェニック動物）
本発明は、本発明の融合ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物を包含する。トランスジェニック動物は、核酸を、（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）受精した卵母細胞の雄性前核に導入し、偽妊娠した雌性養母動物においてこの卵母細胞を発生させることによって生成され得る。発現ベクターにおいて有用な調節配列または他の配列のいずれかは、トランスジェニック配列の一部を形成し得る。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作動可能に連結されて、特定の細胞への導入遺伝子の発現を導き得る。本発明の融合ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物は、このような融合タンパク質を産生する手段としてを含め、種々の適用において有用である。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのようにして作製して使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、発明者が発明と考えられている範囲を限定することを意図しない。用いられる数字（例えば、量、温度など）に関して、精度を確実にするために努力を行ったが、ある程度の実験誤差および実験偏差が考慮されるべきである。そうでないと示されない限り、部は、重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏の度であり、そして圧力は大気圧またはその付近である。

（実施例１：抗Ｔｉｅ−２ハイブリドーマの生成）
５匹の８週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに、精製ヒトＴｉｅ−２−Ｆｃ（ｈＴｉｅ２−Ｆｃ）を最初に免疫した；各マウスに、２００μｌの乳濁液（１００μｇの精製ｈＴｉｅ２−Ｆｃタンパク質および１００μｌのフロイント完全アジュバントを含む）を皮下注射した。最初の注射の１５日後、各マウスは、２００μｌの乳濁液（１００μｌのＰＢＳおよび１００μｌのフロイント不完全アジュバント中に１００μｇの精製ｈＴｉｅ２−Ｆｃを含む）の皮下注射を受けた。この注射を、この５匹のマウスについて、７日後に繰り返した。１匹のマウスを、ｈＴｉｅ−２に対するハイブリドーマの作製のために用いた。４匹の残りのマウスの各々に、ｈＴｉｅ２−Ｆｃの最初の注射の６ヵ月後、２００μｌの乳濁液（各々、１００μｌのＰＢＳおよび１００μｌのフロイント不完全アジュバント中に１００μｇの精製ラットＴｉｅ−２−Ｆｃ（ｒＴｉｅ２−Ｆｃ）を含む）の皮下注射を行った。１１日後、ｒＴｉｅ２−Ｆｃに対するマウスの免疫応答を、各マウスについて、２００μｌの乳濁液（１００μｌのＰＢＳおよび１００μｌのフロイント不完全アジュバント中に１００μｇの精製ｒＴｉｅ２−Ｆｃを含む）の皮下注射によって追加免疫（ｂｏｏｓｔ）した。マウス血清を、注射の３日後、尾静脈から収集し、次いで、ｒＴｉｅ２−Ｆｃに対する抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定した。最大の力価を有する２匹のマウスに、１００μｌ ＰＢＳ中の１００μｇの精製ｒＴｉｅ２−Ｆｃの尾静脈注射により、最後の追加免疫を与えた。このマウスを３日後に屠殺し、そしてそれらの脾細胞を、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞との融合のために収集した。

ハイブリドーマを作製するために、マウス脾細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させた。手短には、脾臓をマウスから無菌的に取り出した後、各脾臓の１つの先端部を切り開き、そして脾細胞を収集した。脾細胞をＤ−ＭＥＭで２回洗浄し、そして血球計算板を用いて細胞数を計数した。２×１０^８個の脾細胞を、対数増殖期にある３×１０^７個のＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞と合わせた。この細胞混合物を３０ｍｌのＤ−ＭＥＭでで洗浄した。３７℃の１ｍｌの５０％ ＰＥＧを、攪拌しながら細胞ペレットにゆっくりと添加した。Ｄ−ＭＥＭをこの混合物に添加して、体積を１０ｍｌにした。この細胞を４００×ｇで１０分間スピンダウン（ｓｐｉｎ ｄｏｗｎ）した。上清の除去後、この細胞を、４．５ｇ／Ｌグルコース、２０％ ＦＣＳ、１０％ ＮＣＴＣ１０９培地、１０％ハイブリドーマクローニング因子、１ｍＭオキサロアセテート、２ｍＭグルタミン、０．２単位／ｍｌ インスリンおよび３μＭ グリシンとともに６０％ Ｄ−ＭＥＭを含む２０ｍｌの増殖培地中にゆっくりと再懸濁した。この細胞を、各々１００ｍｌの増殖培地を含む２本のＴ２２５フラスコに移し、そして組織培養インキュベーター中に入れた。翌日、１×ＨＡＴをこの培地に添加して、融合しなかった骨髄腫細胞を除去するように選択した。融合の９日後、培養物に新鮮な培地を補充した。ヒトＩｇＧを、１ｍｇ／ｍｌにてこの培養物に添加した。融合の１０日後、２．６×１０^７個の融合細胞を、室温にて、増殖培地中で、１μｇ／ｍｌビオチン−ｒＴｉｅ２−Ｆｃで１時間、そして２．５μｇ／ｍｌフィコエリトリン（ＰＥ）結合体化ストレプトアビジンで４５分間、逐次染色した。コントロールとして、１×１０^６個の融合細胞を、室温にて、２．５μｇ／ｍｌ ＰＥ−ストレプトアビジンで４５分間染色した。これらの細胞を、各染色の後に、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。染色後、これらの細胞を、０．１％ ＦＣＳを含むＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＭｏＦｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）におけるフローサイトメトリーによって分析した。ビオチンｒＴｉｅ２−ＦｃおよびＰＥ−ストレプトアビジンの両方で染色された細胞集団（総細胞の４％）は、未染色細胞およびＰＥ−ストレプトアビジン単独で染色した細胞よりも高い蛍光を示した。この４％のゲートにおける細胞を、単一細胞を選別して１ウェルあたり２００μｌの増殖培地を含む２枚の９６ウェルプレートに入れることによりクローン化した。これらの細胞を１０日間培養し、その後、２セットの９６ウェルプレートに分けた。１セットのプレートにおける細胞を、マウスＩｇＧ重鎖可変領域のＲＴ−ＰＣＲのために処理し、その後、配列決定した。これらのクローンを１４個のビンにグループ分けし、各ビンのメンバーは、重鎖可変領域において同一の配列を有した。各ビン中のハイブリドーマ細胞の馴化培地を、培養したラット大動脈内皮細胞（ＲＡＥＣ）におけるｒＴｉｅ−２のリン酸化を刺激する能力について試験した。

２つのハイブリドーマＢ２およびＡ１２Ａ由来の抗体を、さらなる研究のために選択した。なぜなら、これらは、ＲＡＥＣにおけるＴｉｅ−２のリン酸化において活性であり、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって決定したところ、ｒＴｉｅ−２に対する結合について競合しなかったからである。さらに、これらの抗体は、Ｔｉｅ−２の天然のリガンドであるアンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）およびアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）の誘導体の結合をブロックしなかった。

（実施例２：ＳｃＦｖ（Ｂ２およびＡ１２Ａ）の構築）
一般に、ｒＴｉｅ−２に特異的な抗体を発現するハイブリドーマ由来の抗体可変領域を、マウス抗体可変領域遺伝子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を最初に決定し、次いでこの決定した配列に基づいて特異的プライマーを用いて、ＳｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントを増幅することによってクローニングした。これらのＳｃＦｖ ＤＮＡフラグメントをクローニングし、その結果、これらは、複数のプラスミドとカセット交換されて、活性化ダイマーの全ての組合せを生じ得た。例えば、１つの増幅されたＳｃＦｖフラグメントは、Ｎ末端においてシグナル配列に、そしてＣ末端においてＩｇＧ Ｆｃドメインについてのコード配列に融合され得るか、または、このフラグメントは、ＳｃＦｖコード配列の３’末端が翻訳停止コドンを含むように、ＩｇＧ Ｆｃコード配列のＣ末端に融合され得る。

Ｂ２ハイブリドーマは、ＲＡＥＣにおけるＴｉｅ−２レセプターのリン酸化を誘導し得る抗体を発現することが見出された。総ＲＮＡを、ｐｒｏｍｅｇａ ＳＶ９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてこのハイブリドーマから単離し、そして等モル量の５’プライマー（配列番号１〜７）および３’プライマー（配列番号８）を含むＲａｔｎｅｒプライマーセット（Ｗａｎｇら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３：１６７）由来の重鎖プライマーとともにＱｉａｇｅｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ系（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて可変重鎖ｃＤＮＡを合成した。同様に、軽鎖可変領域を、等モル量の軽鎖特異的プライマー（配列番号９および配列番号１０）を用いてｃＤＮＡから増幅した。増幅された可変領域フラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＤＮＡ配列を決定した。Ｂ２抗体についての決定した可変領域の配列に基づいて、可変重鎖配列（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした可変領域をテンプレートとして用い、そして５’プライマーおよび３’プライマー（配列番号１９および配列番号２０）の等モル量混合物を用いて、ＰＣＲ増幅した。可変軽鎖配列（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を、類似のストラテジーを用いてＰＣＲ増幅した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした可変領域を、テンプレートとして用い、そして５’プライマーおよび３’プライマー（配列番号２１および配列番号２２）の等モル量混合物を用いた。これらの可変領域を、（Ｇ４Ｓ）３リンカーによって連結した；ＳｃＦｖ遺伝子をアセンブルし、そして等モル量の上記の特異的な可変重鎖および可変軽鎖のＰＣＲ産物ならびに５’Ｂ２重鎖プライマー（ｈｅａｖｙ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号１９）および３’軽鎖プライマー（ｌｉｇｈｔ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２２）の等モル量混合物を用いて、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ｐＲＧ１０３９を得た。配列を確認し、その後、７４４ｂｐのＡｓｃＩ／ＳｒｆＩをサブクローニングして、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント（ｈＦｃ）をコードするＤＮＡのＮ末端にＳｃＦｖ遺伝子を融合させたか、または７５３ｂｐのＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメントをサブクローニングして、ｈＦｃをコードするＤＮＡのＣ末端に同じＳｃＦｖを融合させた。

Ａ１２Ａハイブリドーマはまた、ＲＡＥＣにおけるＴｉｅ−２レセプターのリン酸化を誘導し得る抗体を発現することが見出された。総ＲＮＡを、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてこのハイブリドーマから単離し、そして可変重鎖ｃＤＮＡを、５’重鎖プライマー（配列番号１１〜配列番号１３）および３’プライマー（配列番号８）を含むＷｒｉｇｈｔプライマーセット（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ｋ．Ａ．編，２６７−２９３）からの等モル量のプライマーとともにＱｉａｇｅｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ系を用いて合成した。同様に、軽鎖可変領域を、等モル量の５’重鎖プライマー（配列番号１４〜配列番号１８）および３’プライマー（配列番号１０）を用いてｃＤＮＡから増幅した。増幅した可変領域フラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＤＮＡ配列を決定した。

Ａ１２Ａ抗体についての決定した可変領域配列に基づいて、可変重鎖配列を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした可変領域をテンプレートとして用い、そして５’プライマーおよび３’プライマー（配列番号２３および配列番号２４）の等モル量混合物を用いて、ＰＣＲ増幅した。可変軽鎖配列を、同様のストラテジーを用いてＰＣＲ増幅した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした可変領域をテンプレートとして用い、そして５’プライマーおよび３’プライマー（配列番号２５および配列番号２６）の等モル量混合物を用いた。これらの可変領域を、（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーによって連結した；ＳｃＦｖ遺伝子をアセンブリし、そして上記の特異的な可変重鎖および可変軽鎖のＰＣＲ産物の等モル量混合物、ならびに５’Ａ１２Ａ重鎖プライマー（配列番号２３）および３’軽鎖プライマー（配列番号２６）の等モル量混合物を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＲＧ１０９０を得た。この配列を確認し、その後、７４７ｂｐのＡｓｃＩ／ＳｒｆＩをサブクローニングして、ｈＦｃフラグメントをコードするＤＮＡのＮ末端にＳｃＦｖ遺伝子を融合した。

（実施例３：単一特異性活性化ダイマーおよび二重特異性活性化ダイマーの構築）
単一特異性および二重特異性の四価活性化ダイマーを構築するための一般的スキームは、Ｂ２またはＡ１２ＡのいずれかのＳｃＦｖ遺伝子が、１セットの制限酵素で切断した場合はマウスＲＯＲ１シグナル配列（配列番号２７）とｈＦｃをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７０４２１のヌクレオチド８５〜７６５）との間に、または異なるセットの酵素で切断した場合はｈＦｃ遺伝子の後に、挿入される能力に基づいた。ＳｃＦｖ遺伝子のこの設計により、プラスミド内のＳｃＦｖカセットの交換が可能になり、標準的な公知の方法を用いて、ＳｃＦｖとｈＦｃとの異なる組合せが得られた。全ての構築物は、ＳｃＦｖ遺伝子の５’末端への制限部位の操作の結果、シグナルペプチドの切断部位とＳｃＦｖ遺伝子の開始部との間に、必要に応じて３つのアミノ酸リンカー（スペーサー）を有する。同様に、ｈＦｃ遺伝子のアミノ末端に対する融合は、３アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）によって促進され、そしてｈＦｃ遺伝子のカルボキシ末端への融合は、残基Ｇｌｙ_４−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号３２）からなる８アミノ酸配列によって促進された。ＳｃＦｖ遺伝子における末端制限部位リンカーの結果、カルボキシ末端ＳｃＦｖを有する全ての構築物は、アミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙで終わる。

２種類のｓｃＦｖベースのキメラ分子を、ＳｃＦｖベースの分子がｒＴｉｅ−２レセプターを活性化する能力を評価するために構築した。１種類の分子は、ｈＦｃのＮ末端およびＣ末端の両方に融合した１つのＳｃＦｖを用い、その結果、ｒＴｉｅ−２を結合し得る単一特異性四価分子が得られた。この分子は、４つのｒＴｉｅ−２分子を同時に結合し得ると予測された。プラスミドｐＴＥ５８６は、ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２（配列番号２９）についての遺伝子をコードし、その分泌は、ｍＲＯＲ１シグナルペプチドによって指向される。ｐＴＥ５８６におけるＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２の発現は、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトされた場合、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって指向された。このタンパク質は、プロテインＡ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製された。

２つのＳｃＦｖドメインが２つの異なる非競合抗ｒＴｉｅ−２抗体由来であるＳｃＦｖ−Ｆｃ−ＳｃＦｖ分子の構築により、上記のＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２とは対照的に、４つより多くのレセプターをクラスター形成し得る分子が得られる。ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２は、４つのみのレセプターをクラスター形成し得る。ｒＴｉｅ−２に対するＡ１２Ａの結合をＢ２抗体の結合がブロックせず、Ａ１２Ａ結合は、最初にＢ２の結合をブロックしないことが、ＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定された。その結果、これらの抗体から作製されたＳｃＦｖ分子は、４つより多くのレセプターをクラスター形成し得るはずである。二重特異性の四価ＳｃＦｖベースの分子を構築するために、ＳｃＦｖ_Ａ１２Ａ遺伝子をＳｃＦｖ_Ｂ２遺伝子と組み合わせて用いて、ＳｃＦｖ_Ａ１２Ａ−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２（配列番号２８）を得た。ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした場合、プラスミドｐＴＥ５８５は、ＳｃＦｖ_Ａ１２Ａ−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２についての遺伝子をコードし、そしてｍＲＯＲ１シグナルペプチドおよびＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターを有する。ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２およびＳｃＦｖ_Ａ１２Ａ−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２は両方とも、ＣＨＯ細胞中で発現し、そしてプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。

（実施例４：アッセイ）
ｒＴｉｅ−２に対する抗体、およびこれらの抗体に関連するキメラ分子を、培養ラット大動脈内皮細胞においてそれらがＴｉｅ−２のリン酸化を誘導する能力について評価した。継代３回目と６回目との間のコンフルエントなＲＡＥＣ（Ｖｅｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、０．２％ゼラチンでコーティングしたＴ−７５フラスコにおいて、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｖｅｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させた。細胞を、無血清ＤＭＥ−Ｈｉグルコース培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で２時間飢餓させ、その後、０．１％ ＢＳＡおよびチャレンジ分子を含む１．５ｍｌ無血清ＤＭＥ−Ｈｉグルコース培地中で３７℃にて５分間インキュベーションした。次いで、チャレンジ培地を除去し、そして細胞を、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、および１ｍＭ ＰＭＳＦを含む、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭオルトバナジン酸Ｎａ、５ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ中で溶解した。溶解産物を、５μｇ抗Ｔｉｅ−２マウスモノクローナル抗体ＫＰ−ｍ３３、１０μｇビオチン化抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および１００μｌのニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに４℃にて１６時間インキュベートすることにより、Ｔｉｅ−２を免疫沈降させた。ビーズを遠心分離により収集し、ＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、そして結合したタンパク質を、１００℃にて５分間加熱することにより、１０％ β−メルカプトエタノールを含む４０μｌの５×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を用いて溶出させた。４〜１２％のＴｒｉｓ／グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）でのＳＤＳ−ゲル電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、そしてマウス抗ホスホチロシン（ａｎｔｉ−ｐｈｏｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）モノクローナル抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ）でプローブし、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）、続いてＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。ＲＡＥＣにおいてＴｉｅ−２リン酸化を誘導する能力を、各活性化ダイマーについて決定した。活性を、ＦＤ１−Ｆｃ−ＦＤ１（ＢＡ１）（Ｔｉｅ−２の結合および活性化においてＡｎｇ１と同等に活性であることが示されたキメラタンパク質（Ｄａｖｉｓら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：３８−４４））を用いて得られる刺激のレベルとの比較により評価した（ＦＤ１またはＦＤ２＝それぞれ、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２のヒトフィブリノゲンドメイン）。ＢＡ１を約０．５〜１．０μｇ／ｍｌにおいて用いた場合、ＲＡＥＣにおけるＴｉｅ−２の最大刺激（ＥＣｍａｘ）が観察され、そして偽処理細胞におけるリン酸化レベルは低かった。同様に、ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２、ＳｃＦＶ_Ａ１２Ａ−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２、ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ１、およびＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ２のＥＣｍａｘは、約０．５〜１．０μｇ／ｍｌであった。全ての場合、ＳｃＦｖベースの分子は、ハイブリドーマ馴化培地から単離された関連のネイティブ抗体について観察されたよりも多くのリン酸化シグナルを誘導し得た。

精製されたＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２およびＳｃＦｖ_Ａ１２Ａ−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２を、ｒＴｉｅ−２を結合してリン酸化を誘導する能力について特徴付けた。ｒＴｉｅ−２に対する結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定した。単一特異性活性化ダイマーおよび二重特異性活性化ダイマーの両方とも、ＦＤ１−Ｆｃ−ＦＤ１よりも有意に高いｒＴｉｅ−２親和性を有することが見出された。さらに、ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２およびＳｃＦＶ_Ａ１２Ａ−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２は両方とも、ＦＤ１−Ｆｃ−ＦＤ１に匹敵して、ＲＡＥＣにおいてｒＴｉｅ−２のリン酸化を刺激し得た。

（実施例５：ＳｃＦｖ／リガンド活性化ダイマーの構築）
Ｔｉｅ−２特異的ＳｃＦｖおよびＦＤ１またはＦＤ２の両方を含むように、二重特異性四価分子を構築した。このキメラ分子を、ＳｃＦｖ_Ｂ２をコードする遺伝子をｈＦｃのＮ末端に融合し、そしてＡｎｇ１ ＦＤ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１５３８９のＰｈｅ２８３〜Ｐｈｅ４９８）またはＡｎｇ２ ＦＤ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｏ１５１２３のＰｈｅ２８１〜Ｐｈｅ４９６）をコードする遺伝子をＣ末端に融合することにより作製した。プラスミドｐＴＥ５１４は、ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ１（配列番号３０）についての遺伝子をコードする。そしてプラスミドｐＴＥ５１４は、ｍＲＯＲ１シグナルペプチドおよびＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターを含んでいた。プラスミドｐＴＥ６１４は、ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ２（配列番号３１）についての遺伝子をコードする。そしてプラスミドｐＴＥ６１４は、ｍＲＯＲ１シグナルペプチドおよびＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターを含んでいた。ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２およびＳｃＦｖ_Ａ１２Ａ−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_Ｂ２と同様に、ｐＴＥ５１４から発現されるタンパク質およびｐＴＥ６１４から発現されるタンパク質は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＰｒｏリンカーをｍＲＯＲ１シグナルペプチドとＳｃＦｖ_Ｂ２との間に有し、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＧｌｙリンカーをＮ末端ＳｃＦｖ_Ｂ２とｈＦｃとの間に有し、そしてＧｌｙ_４−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏリンカー（配列番号３２）をｈＦｃのＣ末端とＡｎｇ ＦＤのＮ末端との間に有した。ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ１およびＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ２を両方とも、上記の通りに発現させて精製した。

精製されたＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ１およびＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ２を、上記の通り、ｒＴｉｅ−２を結合してリン酸化を誘導する能力について特徴付けた。ＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定したところ、キメラの活性化ダイマーＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ１は、ＦＤ１−Ｆｃ−ＦＤ１（０．０４ｎＭ）よりも有意に高いｒＴｉｅ−２親和性（２ｎＭ）を有することが見出された。さらに、ＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ１およびＳｃＦｖ_Ｂ２−Ｆｃ−ＦＤ２は両方とも、ＦＤ１−Ｆｃ−ＦＤ１と匹敵して、ＲＡＥＣにおけるｒＴｉｅ−２のリン酸化を刺激することができた。

（実施例６：完全ヒト活性化ダイマーの構築）
二重特異性四価分子を、ｈＴｉｅ−２に特異的なヒト抗体由来の２つのＳｃＦｖ、またはｈＴｉｅ−２に特異的なヒト抗体由来の１つのＳｃＦｖおよびヒトＦＤ１もしくはヒトＦＤ２のいずれかを含む本発明のダイマー化融合構築物から形成する。ｈＴｉｅ−２に特異的なヒトＳｃＦｖを、当該分野で公知の方法により、そして上記の通りに、入手する。１つの実施形態では、ヒトＳｃＦｖを、Ｒｅｉｔｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９０：６８５−６９８およびＧｉｌｌｉｌａｎｄら（１９９６）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７（１）：１−２０に記載の通りに、組換えにより入手する。

（実施例７：ＳｃＦｖ（１−１Ｆ１１および２−１ Ｇ３）の構築）
抗ｒＴｉｅ−２ハイブリドーマの産生に関する上記の手順に従って、抗ｒＴｉｅ−１ハイブリドーマを生成した。手短に述べると、マウスを、精製したラットＴｉｅ−１−Ｆｃタンパク質およびフロイントアジュバントで３回免疫した。最大の抗Ｔｉｅ−１抗体力価を有するマウス由来の脾細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させた。融合後、これらの細胞を、２本のＴ２２５フラスコ中で培養した。翌日、ＨＡＴをこれらの培養物に添加した。融合の９日後、これらの培養物に、新鮮な培地を補充した。ヒトＩｇＧを、１ｍｇ／ｍｌでこれらの培養物に添加した。融合の１０日後、ＨＡＴ耐性細胞を、室温にて増殖培地中で、１μｇ／ｍｌビオチン−ラットＴｉｅ−１−Ｆｃで１時間にわたって、そして２．５μｇ／ｍｌフィコエリトリン（ＰＥ）結合体化ストレプトアビジンで４５分間にわたって、逐次染色した。染色後、これらの細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ｒＴｉｅ１−Ｆｃに結合した細胞を、単一細胞を９６ウェルプレート中に選別することによりクローニングした。９６ウェルプレート培養物を、選別の１０日後に２セットに分けた。マウスＩｇＧ重鎖可変領域のＲＴ−ＰＣＲ、続いて配列決定を、１セットの９６ウェルプレート培養物について行った。独特のＩｇＧ重鎖可変領域配列を有するクローンを同定し、そして抗ｒＴｉｅ−１抗体の産生のために増幅（ｅｘｐａｎｄ）した。抗体をｒＴｉｅ−１タンパク質の結合について試験し、２つのクローン１−１Ｆ１１および１−２Ｇ３を、さらなる詳細な研究のために選択した。

１−１Ｆ１１ハイブリドーマは、ＲＡＥＣにおいてＴｉｅ−１レセプターのリン酸化を誘導し得る抗体を発現することが見出された。メッセンジャーＲＮＡを単離し、そして５’重鎖プライマー（配列番号３５〜３７）および３’プライマー（配列番号３３）を含んでいたＷｒｉｇｈｔプライマーセット（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ｋ．Ａ．編，２６７−２９３）からの重鎖プライマーを用いて、可変重鎖ｃＤＮＡを上記の通りに合成した。同様に、軽鎖可変領域を、等モル量の５’軽鎖プライマー（配列番号３８〜４１）および３’プライマー（配列番号３４）を用いて、ｃＤＮＡから増幅した。増幅された可変領域フラグメントを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＤＮＡ配列を決定した。１−１Ｆ１１抗体についての決定した可変領域配列に基づいて、可変重鎖配列を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした可変領域をテンプレートとして用い、そして５’プライマーおよび３’プライマー（配列番号４２および配列番号４３）の等モル量混合物を用いてＰＣＲ増幅した。可変軽鎖配列を、同様のストラテジーを用いてＰＣＲ増幅した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングされた可変領域をテンプレートとして用い、そして５’プライマーおよび３’プライマー（配列番号４４および配列番号４５）の等モル量混合物を用いた。これらの可変領域を（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーによって連結した；ＳｃＦｖ遺伝子をアセンブルし、そして上記の特異的な可変重鎖および可変軽鎖のＰＣＲ産物の等モル量混合物、ならびに５’重鎖プライマー（配列番号４２）および３’軽鎖プライマー（配列番号４５）の等モル量混合物を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして、ｐＲＧ１１９２を得た。配列を確認し、その後、７４７ｂｐのＡｓｃＩ／ＳｒｆＩをサブクローニングして、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント（ｈＦｃ）をコードするＤＮＡのＮ末端にＳｃＦｖ遺伝子を融合させたか、または７５６ｂｐのＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメントをサブクローニングして、ｈＦｃをコードするＤＮＡのＣ末端に同じＳｃＦｖを融合させた。

２−１Ｇ３ハイブリドーマはまた、ＲＡＥＣにおけるＴｉｅ−２レセプターのリン酸化を誘導し得る抗体を発現することが見出された。メッセンジャーＲＮＡを単離し、そして可変重鎖ｃＤＮＡを、５’重鎖プライマー（配列番号３５〜配列番号３７）および３’プライマー（配列番号３３）を含むＷｒｉｇｈｔプライマーセット（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９９５）前出）からの等モル量のプライマーを用いて上記の通りに合成した。同様に、軽鎖可変領域を、等モル量の５’重鎖プライマー（配列番号３８〜配列番号４１）および３’プライマー（配列番号３４）を用いてｃＤＮＡから増幅した。増幅した可変領域フラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＤＮＡ配列を決定した。

２−１Ｇ３抗体についての決定した可変領域配列に基づいて、可変重鎖配列を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした可変領域をテンプレートとして用い、そして５’プライマーおよび３’プライマー（配列番号４６および配列番号４７）の等モル量混合物を用いて、ＰＣＲ増幅した。可変軽鎖配列を、同様のストラテジーを用いてＰＣＲ増幅した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした可変領域をテンプレートとして用い、そして５’プライマーおよび３’プライマー（配列番号４８および配列番号４９）の等モル量混合物を用いた。これらの可変領域を、（Ｇ４Ｓ）３リンカーによって連結した；ＳｃＦｖ遺伝子をアセンブリし、そして上記の特異的な可変重鎖および可変軽鎖のＰＣＲ産物の等モル量混合物、ならびに５’２−１Ｇ３重鎖プライマー（配列番号４６）および３’軽鎖プライマー（配列番号４９）の等モル量混合物を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ｐＲＧ１１９８を得た。この配列を確認し、その後、７３８ｂｐのＡｓｃＩ／ＳｒｆＩをサブクローニングして、ｈＦｃフラグメントをコードするＤＮＡのＮ末端にＳｃＦｖ遺伝子を融合したか、または７４７ｂｐのＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメントをサブクローニングして、ｈＦｃをコードするＤＮＡのＣ末端に同じＳｃＦｖを融合した。

（実施例８：単一特異性活性化ダイマーおよび二重特異性活性化ダイマーの構築）
２種類のＳｃＦｖベースのキメラ分子を、ＳｃＦｖベースの分子がｒＴｉｅ−１レセプターを活性化する能力を評価するために構築した。１種類の分子は、ｈＦｃのＮ末端およびＣ末端の両方に融合した１つのＳｃＦｖを用い、その結果は、ｒＴｉｅ−１を結合し得る単一特異性四価分子であった。この分子は、４つのｒＴｉｅ−１分子を同時に結合し得るはずである。プラスミドｐＴＥ７７８は、ＳｃＦｖ_{１−１Ｆ１１}−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_{１−１Ｆ１１}（配列番号５０）についての遺伝子をコードし、ｍＲＯＲ１シグナルペプチドおよびＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターを含む。このタンパク質を、上記の通りに発現させて精製した。

２つのＳｃＦｖドメインが２つの異なる非競合抗ｒＴｉｅ−１抗体に由来するＳｃＦｖ−Ｆｃ−ＳｃＦｖ分子の構築は、上記のＳｃＦｖ_{１−１Ｆ１１}−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_{１−１Ｆ１１}とは対照的に、４つより多くのレセプターをクラスター形成し得る分子を生じると予測される。ＳｃＦｖ_{１−１Ｆ１１}−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_{１−１Ｆ１１}は、４つのみのレセプターをクラスター形成し得る。１−１Ｆ１１抗体の結合はｒＴｉｅ−１に対する２−１Ｇ３の結合をブロックせず、１−１Ｆ１１結合は、最初に２−１Ｇ３の結合をブロックしないことがＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定された。その結果、これらの抗体から作製されたＳｃＦｖ分子は、４つより多くのレセプターをクラスター形成し得るはずである。二重特異性の四価ＳｃＦｖベースの分子を構築するために、ＳｃＦｖ_{２−１Ｇ３}遺伝子をＳｃＦｖ_{１−１Ｆ１１}遺伝子と組み合わせて用いて、ＳｃＦｖ_{２−１Ｇ３}−Ｆｃ−ＳｃＦｖ_{１−１Ｆ１１}（配列番号５１）を得た。両方の構築物を、上記の通りに発現させて精製した。

Claims (22)

1. 形態（Ａ）−Ｍ−（Ａ’）の２つの融合ポリペプチドから形成されるダイマーを含むＴｉｅ−１レセプターを活性化するための組成物であって、ここで、成分Ａおよび成分Ａ’は各々が、Ｔｉｅ−１を結合し得る単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体であり、そして、成分Ｍは、ＩｇＧのＦｃドメインを含むマルチマー化成分であり、該ダイマーは、４つより多くのＴｉｅ−１レセプターに結合し、クラスター形成し得る、組成物。
2. ＡおよびＡ’が異なるｓｃＦｖである、請求項１に記載の組成物。
3. ＭがヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記２つの融合ポリペプチドの各々が、ｓｃＦｖ _{２−１Ｇ３} −Ｆｃ−ｓｃＦｖ _{１−１Ｆ１１} （配列番号５１)を含む、請求項１に記載の組成物。
5. 前記２つの融合ポリペプチドの各々が、ｓｃＦｖ _{１−１Ｆ１１} −Ｆｃ−ｓｃＦｖ _{１−１Ｆ１１} （配列番号５０）を含む、請求項１に記載の組成物。
6. 形態（Ａ）−Ｍ−（Ａ’）の２つの融合ポリペプチドから形成されるダイマーを含むＴｉｅ−１レセプターを活性化するための組成物であって、ここで、成分Ａは、Ｔｉｅ−１を結合し得る単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体であり、成分Ｍは、ＩｇＧのＦｃドメインを含むマルチマー化成分であり、そして、成分Ａ’は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２のフィブリノゲンドメインであり、該ダイマーは、４つより多くのＴｉｅ−１レセプターに結合し、クラスター形成し得る、組成物。
7. 成分Ａ’がＡｎｇ１のフィブリノゲンドメインである、請求項６に記載の組成物。
8. 成分Ａ’がＡｎｇ２のフィブリノゲンドメインである、請求項６に記載の組成物。
9. ＭがヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む、請求項６に記載の組成物。
10. 前記２つの融合ポリペプチドの各々が、ｓｃＦｖ _{１−１Ｆ１１} −Ｆｃ−ＦＤ１（配列番号５２)を含む、請求項６に記載の組成物。
11. 前記２つの融合ポリペプチドの各々が、ｓｃＦｖ _{１−１Ｆ１１} −Ｆｃ−ＦＤ２（配列番号５３）を含む、請求項６に記載の組成物。
12. 形態（Ａ）−Ｍ−（Ａ’）の２つの融合ポリペプチドから形成されるダイマーを含むＴｉｅ−２レセプターを活性化するための組成物であって、ここで、成分Ａおよび成分Ａ’は各々が、Ｔｉｅ−２を結合し得る単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体であり、そして、成分Ｍは、ＩｇＧのＦｃドメインを含むマルチマー化成分であり、該ダイマーは、４つより多くのＴｉｅ−２レセプターに結合し、クラスター形成し得る、組成物。
13. ＡおよびＡ’が異なるｓｃＦｖである、請求項１２に記載の組成物。
14. ＭがヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む、請求項１２に記載の組成物。
15. 前記ダイマーが、各々がｓｃＦｖ _Ａ１２Ａ −Ｆｃ−ｓｃＦｖ _Ｂ２ （配列番号２８)を含む２つの融合ポリペプチドから形成される、請求項１２に記載の組成物。
16. 前記ダイマーが、各々がｓｃＦｖ _Ｂ２ −Ｆｃ−ｓｃＦｖ _Ｂ２ （配列番号２９）を含む２つの融合ポリペプチドから形成される、請求項１２に記載の組成物。
17. 形態（Ａ）−Ｍ−（Ａ’）の２つの融合ポリペプチドから形成されるダイマーを含むＴｉｅ−２レセプターを活性化するための組成物であって、ここで、成分Ａは、Ｔｉｅ−２を結合し得る単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体であり、成分Ｍは、ＩｇＧのＦｃドメインを含むマルチマー化成分であり、そして、成分Ａ’は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２のフィブリノゲンドメインであり、該ダイマーは、４つより多くのＴｉｅ−２レセプターに結合し、クラスター形成し得る、組成物。
18. 成分Ａ’がＡｎｇ１のフィブリノゲンドメインである、請求項１７に記載の組成物。
19. 成分Ａ’がＡｎｇ２のフィブリノゲンドメインである、請求項１７に記載の組成物。
20. ＭがヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む、請求項１７に記載の組成物。
21. 前記２つの融合ポリペプチドの各々が、ｓｃＦｖ _Ｂ２ −Ｆｃ−ＦＤ１（配列番号３０）を含む、請求項１７に記載の組成物。
22. 前記２つの融合ポリペプチドの各々が、ｓｃＦｖ _Ｂ２ −Ｆｃ−ＦＤ２（配列番号３１）を含む、請求項１７に記載の組成物。