JP2018535196A - 多重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規多重特異性抗体、それらの製造方法、それら抗体を含む薬学的組成物、およびそれらの使用に関する。
2種類以上の抗原に結合する能力を有する二重特異性抗体または多重特異性抗体などの改変タンパク質は、当技術分野において公知である。そのような多重特異性結合タンパク質は、細胞融合、化学的コンジュゲーション、または組換えDNA技法を使って作製することができる。
・a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1の軽鎖、
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1の重鎖、
c)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第2の軽鎖、および
d)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第2の重鎖
をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
・第2の抗体として、両抗体のうち、より高い凝集開始温度(Tagg)および/または熱安定性を有する抗体を選択して、ドメインの入れ替えを導入する工程、
・さらに、より低い凝集開始温度(Tagg)および/または熱安定性を有する第1の抗体の重鎖の定常ドメインCH1および軽鎖の定常ドメインCLにのみ、以下のアミノ酸置換を導入する工程:
・第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で、互いに独立して置換され、第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、EまたはDから選択されるアミノ酸で、互いに独立して置換され、第2の重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されている。
I)定義
用語「1つの(a)」「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、一般に複数の指示対象を包含する。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性: Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性: Asp、Glu;
(4)塩基性: His、Lys、Arg;
(5)鎖の配向に影響を及ぼす残基: Gly、Pro;
(6)芳香族: Trp、Tyr、Phe。
一方の結合アームにCL-CH1の入れ替えが施された多重特異性抗体(CrossMabCH1-CL)は、WO 2009/080253およびSchaefer, W. et al, PNAS, 108(2011)11187-1191(これらは参照により本明細書に組み入れられる)に詳述されている。これらの抗体では、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の軽鎖と第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体の間違った重鎖とのミスマッチが原因となる副産物形成を(そのようなドメイン交換を伴わないアプローチと比較すると)かなり低減させることができる。しかし、それらの調製物は副生成物を全く含まないわけではない。副生成物プロファイルは、一方の結合アームにCL-CH1の入れ替え/交換が施された多重特異性抗体の構造に依存する。さらにまた、1つの結合アームにおけるCL-CH1の入れ替え/交換は、生産、精製および長期安定性にとって重要な特徴である抗体の凝集温度のわずかな低下につながる場合もある。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の軽鎖および第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖および第2の重鎖と
を含み、第2の軽鎖では定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられ、第2の重鎖では定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられており、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、互いに独立して、正荷電アミノ酸で置換されており、第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、互いに独立して、負荷電アミノ酸で置換されている、
多重特異性抗体に関する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の軽鎖および第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖および第2の重鎖と
を含み、第2の軽鎖では定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられ、第2の重鎖では定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられており、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、互いに独立して、正荷電アミノ酸で置換されており、第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、互いに独立して、負荷電アミノ酸で置換されており、
第2の軽鎖は第2の抗体の可変ドメインVLを含み、第2の重鎖は第2の抗体の可変ドメインVHを含む、多重特異性抗体に関する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の軽鎖および第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖および第2の重鎖と
を含み、第2の軽鎖では定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられ、第2の重鎖では定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられており、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で、互いに独立して置換されており、第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、EまたはDから選択されるアミノ酸で、互いに独立して置換されている、
多重特異性抗体に関する。
a)N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置(すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL)を含む第1の軽鎖、ならびにN末端からC末端に向かってVHドメインおよびCH1ドメインの連続的配置(すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1)を含む第1の重鎖(ここで、第1の軽鎖および第1の重鎖は、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する)と、
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖および第2の重鎖であって、第2の軽鎖では、定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2の重鎖では、定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2の軽鎖および第2の重鎖と
を含み、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている。
a)N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置(すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL)を含む第1の軽鎖、ならびにN末端からC末端に向かってVHドメイン、CH1ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの連続的配置(すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1-CH2-CH3)を含む第1の重鎖(ここで、第1の軽鎖および第1の重鎖は、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する)と、
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖および第2の重鎖であって、第2の軽鎖では、定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2の重鎖では、定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2の軽鎖および第2の重鎖と
を含み、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている。
・一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、突起を境界面内に生成しており、該突起は、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置し、該突起は、境界面内で他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置され得、かつ
・他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、くぼみを境界面内に生成しており、該くぼみは、前記他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置し、該くぼみ中に、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起がその中に配置され得る、
本発明の多重特異性抗体に関する。この態様による多重特異性抗体を本明細書では「CH3(KiH)改変多重特異性抗体」ともいう(ここで「KiH」という略号は「ノブ・イントゥ・ホール技術」を意味する)。
a)一方の重鎖のCH3ドメインが、多重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面と接する一方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面内で、あるアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、一方の重鎖のCH3ドメインの境界面内に、他方の重鎖のCH3ドメインの境界面内のくぼみ中に配置されうる突起を生成するように、改変されていること、および
b)他方の重鎖のCH3ドメインが、多重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの元の境界面と接する第2のCH3ドメインの元の境界面内で、あるアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のCH3ドメインの境界面内に、第1のCH3ドメインの境界面内の突起が内部に配置されうるくぼみを生成するように、改変されていること
を特徴とする、本発明の多重特異性抗体に関する。この態様の多重特異性抗体を、本明細書では、「CH3(KiH)改変多重特異性抗体」ともいう(ここで略号「KiH」は「ノブ・イントゥ・ホール技術」を意味する)。
・N、R、Q、K、D、E、およびWから選択されるアミノ酸による411番目のアミノ酸T(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)の置換、
・R、W、Y、およびKから選択されるアミノ酸による399番目のアミノ酸D(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)の置換、
・E、D、R、およびKから選択されるアミノ酸による400番目のアミノ酸S(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)の置換、
・I、M、T、S、V、およびWから選択されるアミノ酸による405番目のアミノ酸F(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)の置換、
・R、K、およびDから選択されるアミノ酸による390番目のアミノ酸N(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)の置換、ならびに
・V、M、R、L、F、およびEから選択されるアミノ酸による392番目のアミノ酸K(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)の置換
である。
・第2の抗体として、両抗体のうち、より高い凝集開始温度(Tagg)および/または熱安定性を有する抗体を選択して、ドメインの入れ替えを導入する工程、
・さらに、より低い凝集開始温度(Tagg)および/または熱安定性を有する第1の抗体の重鎖の定常ドメインCH1および軽鎖の定常ドメインCLにのみ、以下のアミノ酸置換を導入する工程:
・第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で、互いに独立して置換され、第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、EまたはDから選択されるアミノ酸で、互いに独立して置換され、さらに任意で、第2の重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換される。
・a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1の軽鎖、
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1の重鎖、
c)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第2の軽鎖、および
d)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第2の重鎖
をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の軽鎖であって、第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではKまたはRで、好ましい一態様ではKで)互いに独立して置換されている第1の軽鎖、
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の重鎖であって、第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)が、EまたはDから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではEで)互いに独立して置換されている第1の重鎖、
c)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖であって、第2の軽鎖において、定常ドメインCLは第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられている第2の軽鎖、および
d)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の重鎖であって、第2の重鎖において、定常ドメインCH1は第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている第2の重鎖
をコードする核酸を含むベクターで形質転換される。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の軽鎖、
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の重鎖、
c)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖であって、第2の軽鎖において、定常ドメインCLは第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、
第2の重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではKまたはRで、好ましい一態様ではKで)互いに独立して置換されている、第2の軽鎖、および
d)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の重鎖であって、第2の重鎖において、定常ドメインCH1は第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられており、
第2の軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、EまたはDから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではEで)互いに独立して置換されている、第2の重鎖
をコードする核酸を含むベクターで形質転換される。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の軽鎖をコードする、本発明による核酸を含むベクター、
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の重鎖をコードする、本発明による核酸を含むベクター、
c)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖をコードする、本発明による核酸を含むベクター、および
d)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の重鎖をコードする、本発明による核酸を含むベクター
を含む宿主細胞である。
以下に本発明の具体的態様を列挙する。
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖および第2の重鎖であって、第2の軽鎖では、定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2の重鎖では、定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2の軽鎖および第2の重鎖
を含み、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
多重特異性抗体。
第1の重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、EおよびDから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではEで)置換されており、
ii)第2の重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、EおよびDから選択されるアミノ酸(好ましい一態様ではE)で置換されており、
第2の軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで)置換されている、
前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
・一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、突起を境界面内に生成しており、該突起は、前記一方の重鎖のCH3ドメイン内に位置し、該突起は、境界面内で他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置され得、
・他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、くぼみを境界面内に生成しており、該くぼみは、前記他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置し、該くぼみ中に、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起が配置され得る、
前記態様のいずれか1つの多重特異性抗体。
a)一方の重鎖のCH3ドメインが、多重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面と接する一方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面内で、あるアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、一方の重鎖のCH3ドメインの境界面内に、他方の重鎖のCH3ドメインの境界面内のくぼみ中に配置されうる突起を生成するように、改変されていること、および
b)他方の重鎖のCH3ドメインが、多重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの元の境界面と接する第2のCH3ドメインの元の境界面内で、あるアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のCH3ドメインの境界面内に、第1のCH3ドメインの境界面内の突起が内部に配置されうるくぼみを生成するように、改変されていること
を特徴とする、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
b)SEQ ID NO:24の可変重鎖ドメイン(VH)(<VH VEGF>)およびSEQ ID NO:25の可変軽鎖ドメイン(VL)(<VL VEGF>)を含む、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する、前記態様のいずれかの多重特異性抗体。
b)第2の抗体がSEQ ID NO:24の可変重鎖ドメイン(VH)(<VH VEGF>)およびSEQ ID NO:25の可変軽鎖ドメイン(VL)(<VL VEGF>)を含む、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する、前記態様のいずれかの多重特異性抗体。
b)好ましい一態様ではSEQ ID NO:24の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:25の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトVEGFに特異的に結合する第2の抗体由来の第2の軽鎖および第2の重鎖であって、第2の軽鎖では、定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2の重鎖では、定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2の軽鎖および第2の重鎖
を含み、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して(好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで)置換され、かつ第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して(好ましい一態様ではEで)置換されている、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
b)好ましい一態様ではSEQ ID NO:24の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:25の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトVEGFに特異的に結合する第2の抗体由来の第2の軽鎖および第2の重鎖であって、第2の軽鎖では、定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2の重鎖では、定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2の軽鎖および第2の重鎖
を含み、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して(好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで)置換され、かつ第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して(好ましい一態様ではEで)置換されている、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
・第2の重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、EおよびDから選択されるアミノ酸(好ましい一態様ではE)で置換され、第2の軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで)置換されている、
態様33〜36のいずれかのヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
・a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する態様1〜37のいずれか1つに定義する第1の軽鎖、
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する態様1〜37のいずれか1つに定義する第1の重鎖、
c)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する態様1〜37のいずれか1つに定義する第2の軽鎖、および
d)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する態様1〜37のいずれか1つに定義する第2の重鎖
をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
・a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖および第2の重鎖であって、第2の軽鎖では、定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2の重鎖では、定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2の軽鎖および第2の重鎖
をコードする核酸であって、多重特異性抗体の副生成物の形成を低減するために、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して(好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで)置換され、第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して(好ましい一態様ではEで)置換され、かつ第2の重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、EおよびDから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではEで)置換されている、
態様43の方法。
・第1の軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで)置換され、第1の重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、EおよびDから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではEで)置換されており、かつ
・第2の重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、EおよびDから選択されるアミノ酸(好ましい一態様ではE)で置換され、第2の軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで)置換されている。
・定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、多重特異性抗体の修飾された第1の軽鎖を提供する工程、
・第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)が、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、多重特異性抗体の修飾された第1の重鎖を提供する工程、および
・修飾された第1の軽鎖、修飾された第1の重鎖、第2の軽鎖および第2の重鎖を含む多重特異性抗体を提供する工程
を含む、方法。
・修飾された第1の軽鎖、修飾された第1の重鎖、第2の軽鎖および修飾された第2の重鎖を含む多重特異性抗体が提供される、
態様47〜50のいずれか一つの方法。
b)態様1〜37のいずれか1つに定義する第2の軽鎖、
c)態様1〜37のいずれか1つに定義する第1の重鎖、または
d)態様1〜37のいずれか1つに定義する第2の重鎖
のアミノ酸配列をコードする核酸。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)に提供されている。抗体鎖のアミノ酸は、Kabat(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))によるナンバリングに従ってナンバリングされ、言及される。
DNAの操作には、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的方法を使用した。分子生物学用試薬は製造者の説明書に従って使用した。
所望の遺伝子セグメントは、化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた600〜1800bp長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによってアセンブルし、次に、表示した制限部位、例えばKpnI/SacIまたはAscI/PacIによって、pPCRScript(Stratagene)系pGA4クローニングベクターにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列はDNA配列決定によって確認した。遺伝子合成フラグメントは、Geneart(ドイツ・レーゲンスブルク)に、所与の仕様書に従って発注された。
DNA配列は、MediGenomix GmbH(ドイツ・マルティンストリート)またはSequiserve GmbH(ドイツ・ファターシュテッテン)において行われた両鎖シーケンスによって決定された。
配列の生成、マッピング、解析、アノテーションおよび図解には、GCG(Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソン)のソフトウェアパッケージ・バージョン10.2およびInfomaxのVector NTl Advanceスイート・バージョン8.0を使用した。
記載する抗体の発現には、CMV-イントロンAプロモーターを持つcDNA編成またはCMV-イントロンAプロモーターを持たないcDNA編成に基づくか、CMVプロモーターを持つゲノム編成に基づく、一過性発現(例えばHEK293 EBNAまたはHEK293-Fにおける一過性発現)細胞用の発現プラスミドの変異体を応用した。
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、および
・大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含有していた。
・5'端のユニーク制限部位(1つまたは複数)
・ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・次に、cDNA編成の場合はイントロンA配列、
・ヒト抗体遺伝子の5'-非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・cDNAとしての、または免疫グロブリンエクソン-イントロン編成を持つゲノム編成としての、ヒト抗体鎖(野生型またはドメイン交換されたもの)
・ポリアデニル化シグナル配列を含む3'非翻訳領域、および
・3'端のユニーク制限部位(1つまたは複数)。
Current Protocols in Cell Biology(2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M.(eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的細胞培養技法を使用した。
10%Ultra Low IgG FCS(ウシ胎仔血清、Gibco(登録商標))、2mM L-グルタミン(Gibco(登録商標))、および250μg/mlジェネティシン(Gibco(登録商標))を補足したDMEM(ダルベッコ変法イーグル培地、Gibco(登録商標))中で培養した付着培養HEK293-EBNA細胞(エプスタイン・バーウイルス核抗原を発現するヒト胎児腎臓細胞株293; American type culture collection受託番号ATCC#CRL-10852、ロット959218)における各発現プラスミド(例えば重鎖および修飾重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾軽鎖をコードするもの)の一過性共トランスフェクションによって、多重特異性抗体を発現させた。トランスフェクションには、FuGENE(商標)6 Transfection Reagent(Roche Molecular Biochemicals)を、FuGENE(商標)試薬(μl):DNA(μg)の比率を4:1(3:1から6:1までの範囲)にして使用した。タンパク質は、(修飾および野生型)軽鎖および(修飾および野生型)重鎖コードプラスミドの等モル比を用いて、各プラスミドから発現させた。3日目に、4mMのL-グルタミン、グルコース[Sigma]およびNAA[Gibco(登録商標)]を細胞に供給した。トランスフェクション後の5〜11日目に、多重特異性抗体を含有する細胞培養上清を、遠心分離によって収穫し、-20℃で保存した。例えばHEK293細胞などにおけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75(2001)197-203に記載されている。
HEK293-F系(Invitrogen)を製造者の説明書に従って使用し、各プラスミド(例えば重鎖および修飾重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾軽鎖をコードするもの)の一過性トランスフェクションによって、多重特異性抗体を作製した。簡単に述べると、振とうフラスコまたは撹拌発酵槽において無血清FreeStyle(商標)293発現培地(Invitrogen)中で懸濁培養したHEK293-F細胞(Invitrogen)に、4つの発現プラスミドと293fectin(商標)またはfectin(Invitrogen)との混合物で、トランスフェクションを行った。2L振とうフラスコ(Corning)の場合、HEK293-F細胞を1.0E*6細胞/mLの密度で600mLに接種し、120rpm、8%CO2でインキュベートした。翌日、細胞に、約1.5E*6細胞/mLの細胞密度で、A)それぞれ重鎖または修飾重鎖および対応する等モル比の軽鎖または修飾軽鎖をコードするプラスミドDNA(1μg/mL)計600μgを含む20mLのOpti-MEM(Invitrogen)とB)20mlのOpti-MEM+1.2mLの293fectinまたはfectin(2μl/mL)との混合物約42mLを使って、トランスフェクションを行った。発酵中は、グルコース消費量に応じて、グルコース溶液を加えた。分泌された抗体を含有する上清を5〜10日後に収穫し、抗体を上清から直接精製するか、上清を凍結して保存した。
精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従い、アミノ酸配列に基づいて算出されるモル吸光係数を使用し、280nmにおける光学密度(OD)を決定することによって決定した。
プロテインAアガロースビーズ(Roche)を用いる免疫沈降によって細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を見積もった。60μlのプロテインAアガロースビーズをTBS-NP40(50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1%Nonidet-P40)中で3回洗浄した。次に、1〜15mLの細胞培養上清を、前もってTBS-NP40中で平衡化したプロテインAアガロースビーズに適用した。室温で1時間インキュベートした後、ビーズを、Ultrafree-MCフィルターカラム(Amicon)上、0.5mLのTBS-NP40で1回、0.5mLの2×リン酸緩衝食塩水(2×PBS、Roche)で2回、および0.5mLの100mMクエン酸Na pH5.0で手短に4回、洗浄した。35μlのNuPAGE(登録商標)LDS Sample Buffer(Invitrogen)を加えることによって、結合している抗体を溶出させた。試料の半分を、それぞれNuPAGE(登録商標)試料還元剤と混和するか、還元しないでおき、70℃で10分加熱した。その結果、5〜30μlを4-12%NuPAGE(登録商標)Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(非還元SDS-PAGEにはMOPS緩衝液を使用し、還元SDS-PAGEにはNuPAGE(登録商標)酸化防止ランニング緩衝液添加物(Invitrogen)を含むMES緩衝液を使用した)に適用し、クーマシーブルーで染色した。
濾過した細胞培養上清から、標準的プロトコールを参照して、タンパク質を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインA Sepharoseカラム(GE healthcare)に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で達成した後、直ちに試料を中和した。凝集したタンパク質は、PBSにおける、または20mMヒスチジン、150mM NaCl pH6.0におけるサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)によって、単量体型抗体から分離した。単量体型抗体フラクションをプールし、(必要なら)例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)遠心分離濃縮器を使って濃縮し、凍結し、-20℃または-80℃で保存した。試料の一部を、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)または質量分析による、後続のタンパク質分析および分析的キャラクタリゼーション用に用意した。
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を製造者の説明書に従って使用した。具体的には、10%または4-12%NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)、およびNuPAGE(登録商標)MES(NuPAGE(登録商標)酸化防止ランニング緩衝液添加物を含む還元ゲル)またはMOPS(非還元ゲル)ランニング緩衝液を使用した。
純度と抗体完全性を、マイクロ流体Labchip技術(PerkinElmer, USA)を用いてCE-SDSで分析した。HT Protein Express試薬キットを製造者の説明書に従って用い、5μlのタンパク質溶液をCE-SDS分析用に調製し、HT Protein Express Chipを用いてLabChip GXIIシステム上で分析した。LabChip GXソフトウェアを用いてデータを分析した。
抗体の凝集状態およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、HPLCクロマトグラフィーによって行った。簡単に述べると、プロテインA精製抗体を、Dionex Ultimate(登録商標)システム(Thermo Fischer Scientific)で、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに適用するか、Dionex HPLCシステムで、2×PBS中のSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に適用した。溶出したタンパク質をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準とした。
この項では、CL-CH1ドメイン交換が施された多重特異性抗体(CrossMAbCh1-CL)の、その正しいアセンブリに重点をおいたキャラクタリゼーションを説明する。予想一次構造を、脱グリコシル化インタクトCrossMAb、および脱グリコシル化/制限LysC消化CrossMabの特別な場合には、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって分析した。
20mMヒスチジン塩化物(Histidine chloride)、140mM NaCl、pH6.0中、1mg/mLの濃度で試料を調製し、9μLマルチキュベットアレイに移した。Optim1000計器(Avacta Analytical Inc.)においてマルチキュベットアレイを0.1℃/分の一定速度で35℃から90℃まで加熱した。この計器は266nmレーザーの散乱光の強度をおよそ0.5℃ごとのデータポイントで連続的に記録する。光散乱強度を温度に対してプロットした。凝集開始温度(Tagg)は散乱光強度が増加し始める温度として定義される。融解温度Tmは蛍光強度を温度に対してプロットすることによって決定され、Tmはこれらの曲線における変曲点として定義される。
以下の手順に従ってVEGF結合を評価した:
ヒトVEGFA-121への表示の抗体の結合を、表面プラズモン共鳴により、BIACORE(登録商標)T200計器(GE Healthcare)を使って調べた。10000(RU)前後の抗His抗体(1μg/mlの抗His抗体;注文コード:28995056; GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン)を、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、SシリーズCM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)にpH5.0でカップリングした。固定化手順中は、HBS-N(10mM HEPES、150mM NaCl pH7.4、GE Healthcare)をランニング緩衝液として使用した。続く速度論的キャラクタリゼーションでは、試料緩衝液およびランニング緩衝液をpH7.4のPBS-T(0.05%Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水)とした。フローセルを25℃に、また試料ブロックを12℃に設定し、速度論的キャラクタリゼーションに先だってランニング緩衝液で2回プライミングした。
ヒトAng-2-RBD-Fcへの表示の抗体の結合を、表面プラズモン共鳴により、BIACORE(登録商標)T200計器(GE Healthcare)を使って調べた。8000(RU)前後のヤギ抗ヒトF(ab')2(10μg/ml抗ヒトF(ab)'2;注文コード:28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン)を、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、SシリーズCM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)にpH5.0でカップリングした。固定化手順中は、HBS-N(10mM HEPES、150mM NaCl pH7.4、GE Healthcare)をランニング緩衝液として使用した。続く速度論的キャラクタリゼーションでは、試料緩衝液およびランニング緩衝液をpH7.4のPBS-T(0.05%Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水)とした。フローセルを25℃に、また試料ブロックを12℃に設定し、速度論的キャラクタリゼーションに先だってランニング緩衝液で2回プライミングした。
GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使って、6000レゾナンスユニット(RU)前後の捕捉システム(15μg/mlヤギ抗ヒトF(ab')2、注文コード:28958325、GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン)を、pH5.0でCM5チップ上にカップリングした。試料緩衝液およびシステム緩衝液はPBS-T(0.05%Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水)pH7.4とした。50nM溶液を10μl/分の流量で90秒間注入することによって二重特異性抗体を捕捉した。会合は、さまざまな溶液濃度のヒトIL17を、50nMから始まる1:1段階希釈液として、30μl/分の流量で3分間注入することによって測定した。解離相は最大10分間監視し、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによって惹起した。流速30μl/分の10mMグリシンpH2.1溶液による60秒間の洗浄で、表面を2回再生した。ヤギ抗ヒトF(ab')2表面から得られる応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引く(=二重参照)。見掛けのKDおよび他の速度論的パラメータの算出には、ラングミュア1:1モデルを使用した。
センサー表面へのTWEAK分析物の強い非特異的結合ゆえに、TWEAKをリガンドとして使用する逆構成を選んだ。GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使って、100RU前後のTWEAKを、pH5.0でC1チップ表面に固定化した。試料緩衝液およびシステム緩衝液はPBS-T(0.05%Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水)pH7.4とした。会合は、さまざまな溶液濃度の二重特異性抗体を、50nMから始まる1:1段階希釈液として、30μl/分の流量で3分間注入することによって測定した。解離相は最大10分間監視し、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによって惹起した。流速30μl/分の3M MgCl2溶液による30秒間の洗浄で、表面を3回再生した。ブランクカップリング表面から得られる応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引く(=二重参照)。KDおよび他の速度論的パラメータの算出には、ラングミュア1:1モデルを使用した。
一方の結合アームにCL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に1つまたは2つの荷電アミノ酸置換を持つ、アンジオポエチン-2(ANG2)および血管内皮成長因子(VEGF)に結合する二価二重特異性抗体(CrossMAbCH1/CL)の作製および発現
最初の実施例では、ヒトアンジオポエチン-2(ANG2)およびヒト血管内皮成長因子(VEGF)に結合する二重特異性抗体を、一般的方法の項に述べたように古典的な分子生物学技法によって生成し、上述のようにHEK293細胞中で一過性に発現させた。
一方の結合アームにCH1-CLドメイン交換が施され(CrossMAbCH1-CL)、Fabアームに電荷ペア置換を持ち、かつ/またはCH1/CL境界面に1つの追加荷電アミノ酸置換を持つ、ANG2およびVEGFに結合する二価二重特異性抗体のプロテインA精製
上記実施例1Aにおいて発現させた二重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの組合せによって、上清から精製した。二重特異性抗体はすべて、良好な収量で生産することができ、安定である。得られた生成物を、質量分析によってその実体について特徴づけ、またCE-SDSによる純度、単量体含量および安定性などの分析的特性について特徴づけた。
CH1/CL境界面に1組の追加電荷ペアを持つCrossMAbCH1-CLのSEC精製、分析的キャラクタリゼーションおよび熱安定性
二重特異性抗体Ang2VEGF-0454(対照)、-0455、-0456、-0457、-0458、-0459および-0460を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。どの二重特異性抗体も、良好な収量で生産することができ、安定である。得られた生成物を、質量分析によってその実体について特徴づけ、またCE-SDSによる純度、単量体含量および熱安定性などの分析的特性について特徴づけた。
・得られたCrossMAbの分析用SECでの純度は、選択した電荷ペアに依存して増加すること、
・得られたCrossMAbのCE-SDSでの純度は、選択した電荷ペアに依存して増加すること、
・得られたCrossMAbの熱安定性は、選択した電荷ペアに依存して増加すること、
・得られたCrossMAbの熱安定性は、選択した電荷ペアの位置(交差Fabアームか非交差Fabアームか)に依存して増加すること
が示される。
非交差Fabアーム上に2組の追加電荷ペアを持つCrossMAbCH1-CLのSEC精製、分析的キャラクタリゼーションおよび熱安定性
二重特異性抗体Ang2VEGF-0454(対照)、-0461、-0462、および-0463を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。どの二重特異性抗体も、良好な収量で生産することができ、安定である。得られた生成物を、質量分析によってその実体について特徴づけ、またCE-SDSによる純度、単量体含量および熱安定性などの分析的特性について特徴づけた。
・凝集温度および熱安定性の明らかな総合的増加、
・得られたCrossMAbの分析用SECでの純度は、分取用SEC後はもはや選択した電荷ペアに依存して増加しないが、プロテインAクロマトグラフィー後は明らかに増加したこと(表2参照)、
・K213Dは、CE-SDS単量体含量に関して、非交差FabアームのCH1におけるK213Eよりもわずかに優れているようであること
・得られたCrossMAbのCE-SDSでの純度は、選択した電荷ペアに依存して増加すること、
・得られたCrossMAbのCE-SDSでの純度は、交差Fabアーム中の位置Q124Eにおける単独荷電アミノ酸の追加によって明らかに増加すること
・CLにおける追加単独荷電アミノ酸Q124Eは総合的純度(CE-SDSおよびSEC)にとって有益であり、熱安定性の低下につながらないこと
が示される。
非交差Fabアーム上に2組の追加電荷ペアおよびVH-VL境界面に追加電荷を持つCrossMAbCH1-CLのSEC精製、分析的キャラクタリゼーションおよび熱安定性
二重特異性抗体Ang2VEGF-0454(対照)、-0464、-0465、および-0466を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。どの二重特異性抗体も、良好な収量で生産することができ、安定である。得られた生成物を、質量分析によってその実体について特徴づけ、またCE-SDSによる純度、単量体含量および熱安定性などの分析的特性について特徴づけた。
・得られたCrossMAbの分析用SECでの純度は、分取用SEC後は(CrossMAbCH1-CLと比較して)もはや選択した電荷ペアに依存して増加しないが、プロテインAクロマトグラフィー後は明らかに増加したこと(表2参照)、
・得られたCrossMAbのCE-SDSでの純度は、選択した電荷ペアに依存して増加すること、
・追加荷電アミノ酸であるCL中のQ38EおよびVh中のQ39Kは、総合的純度(CE-SDSおよびSEC)にとって有益であり、熱安定性の減少にはつながらないこと、VL中のQ38EおよびVh中のQ39Kという配向は好ましいこと
が示される。
非交差Fabアーム上または交差Fabアーム上に1組の追加電荷ペアを持ち、電荷ペア修飾を持たないFabアームのCL境界面に1つの追加電荷(Q124E)を持つ、CrossMAbCH1-CLのSEC精製、分析的キャラクタリゼーションおよび熱安定性
二重特異性抗体Ang2VEGF-0454(対照)、-0464、-0465、および-0466を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。どの二重特異性抗体も、良好な収量で生産することができ、安定である。得られた生成物を、質量分析によってその実体について特徴づけ、またCE-SDSによる純度、単量体含量および熱安定性などの分析的特性について特徴づけた。
抗原結合
多重特異性抗体の、それぞれのターゲット抗原、すなわちANG2およびVEGFへの結合を、一般的方法の項で述べたようにBiacore(登録商標)によって評価した。
一方の結合アームにおいてCL-CH1ドメイン交換が施され(CrossMAbCH1/CL)、CH1/CL境界面に1つまたは2つの荷電アミノ酸置換を持つ、TWEAKおよびIL-17に結合する、二価二重特異性抗体の作製および発現
さらなる実施例では、ヒトTWEAKおよびヒトIL17に結合する二重特異性抗体を、一般的方法の項に述べたように古典的な分子生物学技法によって生成させ、上述のようにHEK293細胞中で一過性に発現させる。
一方の結合アームにCL-CH1ドメイン交換が施され(CrossMAbCH1/CL)、CH1/CL境界面に1つまたは2つの荷電アミノ酸置換を持つ、TWEAKおよびIL-17に結合する二価二重特異性抗体のプロテインA精製
上記実施例7において発現させた二重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの組合せによって、上清から精製した。どの二重特異性抗体も、良好な収量で生産することができ、安定である。得られた生成物を、質量分析によってその実体について特徴づけ、またCE-SDSによる純度、単量体含量および安定性などの分析的特性について特徴づけた。
一方の結合アームにCL-CH1ドメイン交換が施され(CrossMAbCH1/CL)、CH1/CL境界面に1つまたは2つの荷電アミノ酸置換を持つ、TWEAKおよびIL-17に結合する二価二重特異性抗体の抗原結合
多重特異性抗体の、それぞれのターゲット抗原、すなわちIL17およびTWEAKへの結合を、一般的方法の項で述べたようにBiacore(登録商標)によって評価した。
Claims (21)
- a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の軽鎖および第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖および第2の重鎖と
を含む多重特異性抗体であって、
第2の軽鎖では定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、
第2の重鎖では定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられており、
i)第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されており、第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)が、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
多重特異性抗体。 - 第2の重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されている、
請求項1に記載の多重特異性抗体。 - 第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、Kで置換されている、
前記請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - 第1の重鎖の定常ドメインCH1において、213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)が、Eで置換されている、
前記請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - 第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)が、Eで置換されている、
請求項4に記載の多重特異性抗体。 - i)第1の軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で置換され、
第1の重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されており、かつ
ii)第2の重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、EおよびDから選択されるアミノ酸(好ましい一態様ではE)で置換され、かつ、第2の軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で(好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで)置換されている、
前記請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - 第1の抗体に由来するCH3ドメインを含む第1の重鎖と第2の抗体に由来するCH3ドメインを含む第2の重鎖とを含み、第1の重鎖と第2の重鎖のヘテロ二量体化を促進するために、両CH3ドメインがアミノ酸置換によって改変されている、前記請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 抗体の三次構造において、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインとが、それぞれの抗体CH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、
第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は各々が、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基が、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換されており、それによって、突起を境界面内に生成しており、
該突起は、前記一方の重鎖のCH3ドメイン内に位置し、
該突起は、境界面内で他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置され得、かつ
他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基が、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換されており、それによって、くぼみを境界面内に生成しており、
該くぼみは、前記他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置し、
該くぼみ中に、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起が配置され得る、
前記請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - 元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基がR、F、Y、およびWから選択され、かつ
元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基がA、S、T、およびVから選択される、
請求項8に記載の多重特異性抗体。 - 導入されたシステイン残基によって一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、
一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸がシステインで置換され、かつ
他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、境界面内で前記第1のアミノ酸に面している第2のアミノ酸がシステインで置換されている、
請求項8または9に記載の多重特異性抗体。 - a)SEQ ID NO:26の可変重鎖ドメイン(VH)(<VH Ang2>)およびSEQ ID NO:27の可変軽鎖ドメイン(VL)(<VL Ang2>)を含み、かつ
b)SEQ ID NO:24の可変重鎖ドメイン(VH)(<VH VEGF>)およびSEQ ID NO:25の可変軽鎖ドメイン(VL)(<VL VEGF>)を含み、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - ・a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1の軽鎖、
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1の重鎖、
c)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2の軽鎖、および
d)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2の重鎖
をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、ならびに
・該宿主細胞培養から多重特異性抗体を回収する工程
を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を調製するための方法。 - a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する請求項1〜11のいずれか一項に定義する第1の軽鎖をコードする核酸を含むベクター、
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する請求項1〜11のいずれか一項に定義する第1の重鎖をコードする核酸を含むベクター、
c)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する請求項1〜11のいずれか一項に定義する第2の軽鎖をコードする核酸を含むベクター、および
d)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する請求項1〜11のいずれか一項に定義する第2の重鎖をコードする核酸を含むベクター
を含む宿主細胞。 - 少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を含む、薬学的組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 多重特異性抗体の凝集開始温度を改善するための方法であって、
該多重特異性抗体は、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する第1の軽鎖および第1の重鎖と、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する第2の軽鎖および第2の重鎖とを含み、第2の軽鎖では定常ドメインCLが第2の重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられ、第2の重鎖では定常ドメインCH1が第2の軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられており、
・定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、多重特異性抗体の修飾された第1の軽鎖を提供する工程、
・第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)が、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、多重特異性抗体の修飾された第1の重鎖を提供する工程、および
・修飾された第1の軽鎖、修飾された第1の重鎖、第2の軽鎖および第2の重鎖を含む、凝集開始温度が上昇している多重特異性抗体を提供する工程
を含む、方法。 - 定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されている、修飾された第2の重鎖を提供する工程
をさらに含み、
修飾された第1の軽鎖、修飾された第1の重鎖、第2の軽鎖および修飾された第2の重鎖を含む多重特異性抗体が提供される、
請求項16に記載の方法。 - 第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatに従う)が、Kで置換されている、請求項16または17に記載の方法。
- 第1の重鎖の定常ドメインCH1において、213番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)が、Eで置換されている、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147番目のアミノ酸(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)が、Eで置換されている、請求項16〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、多重特異性抗体。
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