JP5356518B2 - 遠隔制御エネルギー転移染料錯体 - Google Patents

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Description

本願発明は、請求項１による蛍光共鳴エネルギー転移ペア（ＦＲＥＴペア）を構成するための少なくとも２つの異なるフルオロフォア（蛍光色素分子）の使用に関する。
さらに、本願発明は、ドナー（供与体）フルオロフォアとしての少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）と、アクセプター（受容体）フルオロフォアとしての少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）と共に、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）を結合する特別な有機ラジカルを具備する蛍光共鳴エネルギー転移錯体（ＦＲＥＴ錯体）に関する。
また、本願発明は、蛍光共鳴エネルギー転移システム（ＦＲＥＴシステム）に関する。
さらに、本願発明は、いろいろな目的、特にサンプルにおけるイベントの検出、標的分子又は標的構造との相互作用、及び／若しくは標的分子又は標的向上の検出又は同一化又は測定のための本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの本願発明による使用に関する。
さらにまた、本願発明は、さらなる応用のために、例えば染料として、特に蛍光染料として、又は、バイオセンサー又はバイオプローブにおいて、特にＦＲＥＴプローブのために、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの使用に関する。
最後に、本願発明は、ドナーフルオロフォアとして作用する少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）及びアクセプターフルオロフォアとして作用する少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）からなるＦＲＥＴ対である少なくとも２つの異なるフルオロフォアを具備する蛍光共鳴エネルギー転移対（ＦＲＥＴ対）に関する。
有機金属希土類元素錯体、特にそのβ−ジケトナート及び芳香族カルボン酸塩は、それらの独特な発光機構（又は「アンテナ効果」）が例えばバイオセンサーにおいて有益であるいろいろな分野で応用をされている。
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、従来技術において知られているような自然イベントであり、そこでは、励起蛍光染料（ドナー又はドナーフルオロフォアとして参照される）のエネルギーが、第２の蛍光染料（アクセプター、アクセプターフルオロフォア又は消光剤として参照される）に移動される。エネルギー転移又はＦＲＥＴの強度は、２つのフルオロフォアの間の距離に依存する。ＦＲＥＴの基本的な原理は、蛍光することができる２つの染料の間で、励起ドナーフルオロフォアのエネルギーは、アクセプターフルオロフォアに移動し、このエネルギーは、蛍光の形で生じることがなく無放射性の形の蛍光アクセプターに、例えば双極子／双極子相互作用を介して移動することができる。
放射なしのエネルギー転移を、ＦＲＥＴを使用するアクセプターに行うために、いろいろな基準が満足されなければならない。一方で、ドナーの発光スペクトルは、アクセプターの吸収スペクトルと重ならなければならない。他方で、ドナーとアクセプターは、平行な電子偏光面を有する必要があり、２つのフルオロフォアの間の距離の６乗でＦＲＥＴ信号の強度が減少するので、ドナー及びアクセプターは、１ナノメータ又は数ナノメータのみでお互いに離れていなければならない。ＦＲＥＴの強度は、とりわけ２つのフルオロフォアの間の距離に依存するので、ＦＲＥＴの使用は、光学上のナノメータスケールとしての所定の範囲で、特に生化学及び細胞生物学において達成されており、プリテイン／プロテイン、プロテイン／核酸及び核酸／核酸相互作用、特に生体分子における立体構造変化のような空間構造変化を検出することがこの結合において可能となるものである。これについて、ホモ二量化及びヘテロ二量化の間の相互作用又はプロテインのオリゴマー化は、ＦＲＥＴイベントに基づいて測定することができる。ドナー及びアクセプターフルオロフォアが同一の分子に結合する場合、プロテインへの立体構造変化を測定することが可能となる。同様に、分子生物学の領域において、リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を使用する核酸の数量化におけるＦＲＥＴの原理は、特別なプローブの使用を介して実際に実行される。
この結合において、特別な加水分解プローブである「LightCycler（登録商標）」プローブの使用によって核酸の数値化にＦＲＥＴを利用することができ、それぞれドナー又はアクセプターと分類されるいろいろなオレゴヌクレオチドが、核酸分子の標的配列と並んで結合され、ＦＲＥＴがＰＣＲ生成物のためのプローブとして使用されるので、ドアー及びアクセプターをお互いに十分に接近させるものである。
ＦＲＥＴのさらなる一般的なオプションは、特別な加水分解プローブである「TaqMan（登録商標）」プローブの応用からなり、ここでこのプローブは、一端でアクセプター又は消光剤として分類され、他端でドナー又はレポータ蛍光染料として分類させる。無傷加水分解プローブで、ドナーフルオロフォアの蛍光は、無放射性のエネルギー転移（ＦＲＥＴ）の結果として消光剤によって抑制される。ＰＣＲのサイクルの間、プローブはドナー蛍光発光が抑制されたままである間、補完的なＤＮＡ鎖と混成される。タックポリメラーゼは、ＰＣＲサイクルの間、プローブの５’端を構成する。ドナーの蛍光発光は、決して消光剤によって消光されず、測定される。
プローブとしての「分子指標」の使用は、ＦＲＥＴの利用によるＰＣＲ生成物のリアルタイム数量化のさらなるオプションである。分子指標は、ドナーへ且つ消光剤又はアクセプターへの両方に結合されるオリゴヌクレオチドである。プローブの５’端のヌクレオチドは、３’端のヌクレオチドを補完するので、分子指標のループ状二次構造特徴が構成される。この状態において、ステムループとして知られているように、ドナーは、アクセプターへの接近の結果として蛍光発光を示さない。ＰＣＲサイクルの間、補完的なＤＮＡ配列へのループ領域の接続によって、ドナーとアクセプターの間の距離は、ドナー発行蛍光が観測されるような方法において増加する。
分子指標の構造的及び機能的原理は、チャギ及びクラーメン（１９９６）「分子指標：混成で蛍光発光するプローブ」ナチュラルバイオテクノロジー１４、３０３−３０８に、詳しく記載されている。それらは、米国特許５，９２５，５１７の主題であり、これによって分子指標の構造及び機能に関する開示を目的としてその全体を参照することができる。
５’端の５’−（２−アミノエチル）−アミノナフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）は、フルオロフォア／消光剤ペアとして知られ、且つ３’端の４−（４’−ジメチルアミノ）フェニルアゾ安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）が消光剤として知られている。５’端でフルオレセインと結合したＤＡＢＣＹＬの使用も、適している（G. Leone, von Schijndel H., van Gemen B., Kramen R. F. and Schon D. (1998) 「ＲＮＡのＮＡＳＢＡ可能同質リアルタイム検出による増幅と結合する分子指標プローブ」:核酸調査 26, 9, 2150-2155）。
ＦＲＥＴによって生じる消光により、分子指標は、発光しないか、非常に少ない蛍光発光放射するか、２つのフルオロフォアの使用でスペクトルシフトを生じるかであり、これによってサンプル配列が標的配列に混成されないときにその信号を測定範囲から排除するので、分子指標は、超過プローブの洗い出しが望まれていないか可能でないかである検出システムにおいてプローブとして特に効果的であることが判明した。これは、リアルタイムＰＣＲの場合、又は、生体細胞の核酸の検出の場合に適用される（Liu X., Farmerie W., Schuster S., Tan W. (2000): 「マイクロメータ以下の寸法までのマイクロメータを有するＤＮＡ生体センサーのための分子指標」: Analytical Biochemistry 283, 56-63）。
しかしながら、生体細胞のような複雑な生体系においてですら、例えば細胞構成要素の非特異性の蛍光発光が、公知の分子指標又はＦＲＥＴプローブを使用したとしても、検出方法自体の有効性及び特異性を著しく減少させるエラーの実質的に系統的な原因であることが判明した。例えば、ヘモグロビン又は芳香族炭化水素は、ＵＶ光によって励起される非特異性蛍光発光を示し、この蛍光発光は、バックグラウンド放射としてそれ自身悪影響を示すものである。そのため、実際の測定信号は、重ね合わされる。このバックグラウンド放射は、サンプル環境又はサンプル媒体の自己蛍光発光と呼ばれる。
ＦＲＥＴ過程の範囲内で、特にその分子生体応用に関して、個々のＦＲＥＴプローブの効果を実質的に向上させる必要がある。使用される染料の特異的な選択及び調節が、この例において著しく重要であるだけでなく、染料間の空間的距離を考慮してプローブの構造である。上述したように、ＦＲＥＴイベントは、ドナーとアクセプターの間の大変小さい空間で発生し、前記染料間又はフルオロフォア間の距離の６乗で減少する。これを考慮して、従来技術でうまくいった試み（必ずしも全体的ではなく）は、効果的なプローブ、特に分子指標を前もって提供させた。従来技術のプローブは、測定サンプル又はサンプル媒体の自己蛍光発光との発光スペクトルの差別化に作用する最適な発光スペクトルを必ずしも有していない。さらに、励起後数ナノセコンド後で弱まるために、ＦＲＥＴプローブの発光は、励起信号と同時に時間分解された測定の範囲内で検出されなければならないので、これに関して発光時間は最適でなく、信号の検出及び評価に関して好ましくない。また、従来技術から知られるＦＲＥＴプローブによる最適なＦＲＥＴが必ずしも存在しないので、ドナーの消光は必ずしも最適ではない。
本出願人によるドイツ特許ＤＥ１０２５９６７７Ｂ４は、サンプルの微生物を特定し且つ数量化する方法に関し、標的核酸は、微生物の分離及びＰＲＣ容器への分離された微生物を移動に続いて増幅され、前記標的核酸は、ＦＲＥＴペアを構成する少なくとも２つのプローブを具備する特別なプローブを使用して測定される。使用されるＦＲＥＴプローブは、標的ヌクレオチドを有するブローブの混成に続いて識別可能信号を放出し、その信号は、サンプル環境の自己蛍光発光に比べて延長された継続時間を有するので、測定信号は、時間分解された蛍光発光測定によるサンプル環境の自己蛍光発光から区別される。これに関連して、使用されるＦＲＥＴプローブに関しては、ＥｕＴＴＡＰｈａｎ及びＣｙ５に基づく特別なＦＲＥＴペアが予め適用される。この種の蛍光発光染料の組合せは、発光作用に関して従来技術に渡って著しい改善を示しているが、この点における特性は、必ずしも最適ではない。特に、上記ドイツ特許に記載されたブローブは、たとえ所定の範囲であるにしても、対応する蛍光発光染料間の距離を設定することができる「単色分析物」である。
ＤＥ １０２ ５９ ６７７ Ｂ４
これを考慮して、本願発明の目的は、上述した応用に適合され、従来技術の少なくとも複数の欠点を防止し又はこれらを軽減するＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムを提供することにある。
特に、本願発明の目的は、例えばリアルタイムＰＣＲの範囲内で、例えば核酸分子のような標的分子の質的及び量的測定及び例えばプロテインの構造変化の測定のための分子生物学的解析法に採用されるＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムを提供することにある。特に、特に発光器官及び発光帯の幅に関して改良された発光作用を有するＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムは、この場合に設けられ、特にサンプルの自己蛍光発光との差別化又は区別化することが可能となる。さらに、染料複合物間の距離の改良された質的設定及びそれによる標的分子又は標的構造との相互反応の質的設定は、本願発明のＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムに基づいて可能となる。
上述された課題を解決するために、本願発明の第１の様相によれば、本願発明は、請求項１記載の蛍光共鳴エネルギー転移ペア（ＦＲＥＴペア）を構成するための少なくとも２つの異なるフルオロフォアの使用を提案する。さらに、本願発明に係る使用の有益な構成は、関連した従属請求項の主題である。
本願発明の第２の様相によれば、本願発明のさらなる主題は、ドナーフルオロフォアとしての少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）と、アクセプターフルオロフォアとしての少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）を具備し、該フルオロフォア（Ａ）及び該フルオロフォア（Ｂ）が、２価及び／若しくは２化学結合有機ラジカル、特にリンカー及び／若しくはスペーサを介して、お互いに連結及び／若しくは化学結合される蛍光共鳴エネルギー転移錯体（ＦＲＥＴ錯体）において、お互いに独立した第１のフルオロフォア（Ａ）及び前記第２のフルオロフォア（Ｂ）が、それぞれ希土類元素の有機金属錯体に基づいて構成されること、前記フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）がお互いに異なる希土類元素を具備することを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転移錯体である。
さらに、本願発明の第３の様相によれば、本願発明のさらなる主題は、ドナーフルオロフォアとしての少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）と、アクセプターフルオロフォアとしての少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）を具備し、該フルオロフォア（Ａ）及び該フルオロフォア（Ｂ）が、２価及び／若しくは２化学結合有機ラジカル、特にリンカー及び／若しくはスペーサを介して、お互いに連結及び／若しくは化学結合される蛍光共鳴エネルギー転移システム（ＦＲＥＴシステム）において、お互いに独立した第１のフルオロフォア（Ａ）及び前記第２のフルオロフォア（Ｂ）が、それぞれ希土類元素の有機金属錯体に基づいて構成されること、前記フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）がお互いに異なる希土類元素を具備することを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転移システム（ＦＲＥＴシステム）である。
さらにまた、本願発明の第４の様相によれば、本願発明のさらなる主題は、サンプルに生じるものの検出に、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムを使用することである。
また、本願発明の第５の様相によれば、本願発明のさらなる主題は、標的分子又は標的構造との相互作用に、本願発明のＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムを使用することである。
本願発明の第６の様相によれば、本願発明のさらなる主題は、標識目的等のための染料として、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムを使用することである。
さらに、本願発明の第７の様相によれば、本願発明の主題は、バイオセンサーとして又は（バイオ）プローブとして、ＦＲＥＴプローブに、本願発明によるＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムを使用することである。
本願発明の第８の様相によれば、本願発明の主題は、少なくとも２つの異なるフルオロフォアを具備する蛍光共鳴エネルギー転移ペア（ＦＲＥＴペア）であって、該ＦＲＥＴペアがドナーフルオロフォアとして作用する少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）と、アクセプターフルオロフォアとして作用する少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）を有するものにおいて、お互いに独立した前記第１のフルオロフォア（Ａ）及び前記第２のフルオロフォア（Ｂ）がそれぞれ希土類元素の有機金属錯体に基づいて構成されること、該フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）がお互いに異なる希土類元素を具備することを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転移ペア（ＦＲＥＴペア）である。
重複を避けるために、本願発明の１つの様相に関して以下に記載された構成、具体例、利点等は、本願発明の他の様相に適用されることはもちろんである。
出願人は、上述した記載された課題が、下記に定義されるように、蛍光共鳴エネルギー転移ペア（ＦＲＥＴペアと同義語的に呼ばれる）のための少なくとも２つの特別な別々のフルオロフォアを使用することによって解決されることを見出した。前記ＦＲＥＴペアは、ドナーフルオロフォアとしての第１のフルオロフォア（Ａ）と、アクセプターフルオロフォアとしての第２のフルオロフォアとを具備する。本願発明に係る使用は、お互いに独立した第１のフルオロフォア（Ａ）と第２のフルオロフォア（Ｂ）が、それぞれ希土類元素の有機金属錯体に基づいて構成される。本願発明の範囲内で、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）は、お互いに異なる希土類元素を具備するように選択される。
本願発明に係る使用の範囲内で構成されるＦＲＥＴペアは、生化学又は分子生物学的解析方法の範囲内で、例えば特別な標的分子又は標的構造、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、プロテイン等の生体分子をサンプル内で検出するための使用に、これによってＦＲＥＴプローブとして効果的に適合され、またこの場合、本願発明に係る使用の範囲内で構成されるＦＲＥＴペアは、標的分子又は標的構造と相互に反応する特定の部分又は構成を具備する。さらに、本願発明の範囲内で調合されたＦＲＥＴペアは、例えばプロテイン又は核酸の分子への構造変化の確認又は検出に適合される。生体分子の分裂及び付着過程は、本願発明によって調製されたＦＲＥＴペアによって検査される。さらに、染料として使用することができる。
本願発明の範囲内において、効果的なシステム又は錯体は、特に異なる希土類分子を有し、さらにお互いに関連するフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の空間的配置に関連した（下記に記載されるような）ＦＲＥＴシステムの特別な構成を有するフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の特別な選択によって調製され、前記システム又は錯体は、特に検出又は発見のための分子生物学的解析又は生化学解析に、且つ特定の標的分子又は標的構造への空間的変化の解析のために、使用されるＦＲＥＴ解析又はＦＲＥＴ検査の範囲内で適合される。
この場合、本願発明の範囲内で調製されるＦＲＥＴペアは、それらが大変狭い照射帯を有する限定された発光スペクトルを具備し、本願発明によって調製されたＦＲＥＴペアの発光スペクトルが、非特異性背景放射からの所望の測定信号の優れた識別が達成される方法においてサンプル環境の非特異性蛍光発光を自己蛍光発光から十分に異ならせることから、それは優れた検出可能性を生じるものである。
本願発明によって調製されたＦＲＥＴペアが大変長い発光時間を有しているので、言い換えると、本願発明に係るＦＲＥＴペア又はＦＲＥＴプローブが、それに応じて適切な励起信号によって、励起に続いて時間的に延長された発光信号を放出し、その発光信号がさらに検出可能性を改善するので、以下に記載された本願発明によるＦＲＥＴペア又はＦＲＥＴプローブ及びこれによるＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムのこの特性が改善される。これによって、本願発明に係るＦＲＥＴペアの信号放射の期間は、数ミリ秒であると共に、サンプル環境の自己蛍光に基づく好ましくない干渉蛍光発光は、励起信号の停止に続いてナノ秒（例えば約２００ナノ秒）の範囲内で低下する。これは、測定信号と干渉信号との間の微分可能性又は識別においてさらなる改善を生じる。
本願発明によるＦＲＥＴペア又はＦＲＥＴシステムのさらなる決定的な利点は、この例では、別々の希土類元素からなるフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の所定の選択の結果としてそれらは２色分析であり、この分析は、相互反応又は構造変化等の質的及び量的解析に適応される。本願発明の好ましい例によれば、本発明に係るＦＲＥＴシステムが、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の短い距離及び最大エネルギー転移を有するフルオロフォア（Ａ）及び（ｂ）のための特別なテルビウム及びユウロピウム錯体の使用で赤色を発光することができると共に、フルオロフォアが、長い距離で黄色発光を示す。その中間状態において、言い換えると、フルオロフォア間の平均距離では、本願発明の係るＦＲＥＴペア又はＦＲＥＴシステムは、オレンジ色範囲内で発光するもので、特にフルオロフォア間の距離によって赤色から黄色までの対応する色の変化で発光するものである。これは、染料として本願発明に係るＦＲＥＴペアの使用についての特別な利点である。
これに関連して、本願発明の範囲内で調製されたＦＲＥＴペア又はＦＲＥＴプローブ且つこれによるＦＲＥＴシステム又はＦＲＥＴ錯体は、生化学又は分子生物学及び細胞生物学の分野での使用に適応される。これに関して、本願発明によって調製されるＦＲＥＴペアは、プロテイン／プロテイン、プロテイン／核酸及び核酸／核酸相互反応の測定、立体構造変化の測定、及び生体分子の分裂過程又は生体分子における分裂過程の測定に適応させ、二色分析としての特別な構成の結果として、根本的なイベントの量的な解析が可能である。本願発明によるＦＲＥＴシステムが、核酸の量的な分析範囲内で、例えばリアルタイムＰＣＲの範囲内で最適である。
第１の様相によれば、本願発明の主題は、蛍光共鳴エネルギー転移ペア（ＦＲＥＴペア）を構成するために、少なくとも２つの異なるフルオロフォアの使用であると共に、ＦＲＥＴペアは、ドナーフルオロフォアとして作用する少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）及びアクセプターフルオロフォアとして作用する少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）からなるものである。本願発明による使用は、お互いに独立した第１のフルオロフォア（Ａ）と第２のフルオロフォア（Ｂ）が、それぞれが希土類元素の有機金属錯体に基づいて構成され、前記フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）が、お互いに異なる希土類元素からなることを特徴とするものである。
これによって、本願発明の根本的な原理は、ＦＲＥＴペアに関して、第１のフルオロフォア（Ａ）は、希土類元素の群から選択される中心元素を具備するドナーとして使用されるという事実として見なされる。さらに、本願発明によれば、第2のフルオロフォア（Ｂ）は、同様に中心元素として希土類元素を具備し、この場合、この希土類元素は、第１のフルオロフォア（Ａ）とは異なる元素である。第１のフルオロフォア（Ａ）及び第２のフルオロフォア（Ｂ）に関して希土類元素の選択的使用は、この群から選択された異なる元素が、それぞれのフルオロフォアにおいて使用されることを条件として、狭い発光帯、長い放射又は発光時間、２色分析の範囲内でのフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の距離の関数として発光スペクトルへの量的変化のような発光特性に関して本願発明による使用の範囲内で調製されたＦＲＥＴペアによる優れた特性を生じ、ドナー信号の最適な消光を有するフルオロフォアの間の短い距離を有する優れたＦＲＥＴを生じる。
本願発明の範囲内において、第１のフルオロフォア（Ａ）と第２のフルオロフォア（Ｂ）は、第１のフルオロフォア（Ａ）から第２のフルオロフォア（Ｂ）へのエネルギー転移が、励起エネルギーの影響及び／若しくは効果及び／若しくは適用に基づいて実行されるように選択され、特に第１のフルオロフォア（Ａ）から第２のフルオロフォア（Ｂ）へのエネルギー転移が、実質的無放射法において生じる。この種のエネルギー転移は、ＦＲＥＴの意味の範囲内でフルオロフォア間の短い距離で実行される。
距離が上昇すると、ＦＲＥＴは減少する。励起エネルギーに関して、ドナーを最適するか、又はドナーに適用する電磁放射が使用される。これは従来技術の当業者に知られる。
第１のフルオロフォア（Ａ）から第２のフルオロフォア（Ｂ）へのエネルギー転移は、例えば双極子／双極子相互作用を介して実行されることが望ましい。エネルギー転移の存在は、フルオロフォア（Ａ）又はドナーフルオロフォアの蛍光発光における減少によって、且つ／又は第２のフルオロフォア（Ｂ）又はアクセプターフルオロフォアの蛍光発光における上昇によって検出される。
蛍光顕微鏡、蛍光光度計等は、検出及び測定装置の限定されない例である。
第１のフルオロフォア（Ａ）から第２のフルオロフォア（Ｂ）へのエネルギー転移は、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の距離に依存している。これに関して、エネルギー転移、特にエネルギー転移の強さ及び／若しくは効率は、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の空間的距離の減少に伴って増加する。一方で、第１のフルオロフォア（Ａ）と第２のフルオロフォア（Ｂ）の距離における増加は、発光スペクトルへの変換を伴ってエネルギー転移の減少を生じる。例えば、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の距離へのこの種の変化は、相互反応又は相互作用の範囲内で、特に２つのフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の距離での上昇、特に距離に応じて変化を生じる標的分子又は標的構造へのＦＲＥＴの結合を生じるものである。基本的な結果は、発光スペクトルへの変化、距離の増加に伴うドナー信号の増加及び／若しくはアクセプター信号の減少を生じる。もし距離が減少すると、それに対応してドナー信号が減少し、アクセプターの消光効果の結果としてアクセプター信号が上昇する。
これに関して、第１のフルオロフォア（Ａ）から第２のフルオロフォア（Ｂ）へのエネルギー転移は、第１のフルオロフォア（Ａ）の蛍光発光における減少及び第２のフルオロフォア（Ｂ）の蛍光発光における増加を生じる。
本願発明によれば、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）は、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）が（例えば、同じプロテインに）固定されるならば特別に重要である両極性の少なくとも実質的に平行な電子平面を有することが利益的である。プロテインとの相互作用又はプロテイン自体への空間構造的変化の範囲内で、お互いに関連したフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の位置における変化を有するＦＲＥＴ信号への変化は、両極性の平面への変化およびこれによるお互いに関連した２つのフルオロフォアの位置への変化を、これによって説明することができる。
すでに説明したように、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）は、エネルギー転移、特に蛍光共鳴エネルギー転移を可能にするために、短い距離で離れていなければならず、その距離は、一般的に数ナノメータで測定される。これは、ＦＲＥＴ信号の強度が、フルオロフォア間の距離の６乗で減少するからである。これについて、エネルギー転移の効果が、フルオロフォアペアの「移動径」に依存する。フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）の間の短い距離の基準は、ある程度は作用可能な本願発明による使用の範囲内で調製されたＦＲＥＴペアを生じ、例えば、分子生物学的又は生化学的方法の範囲内で、フルオロフォアの間の距離の質的及び量的な測定に適応され、標的分子又は標的構造との相互作用及び空間的構造変化のような基本的な主なイベントに関する質的及び量的な結論を引き出すものである。
エネルギー転移、特に蛍光共鳴エネルギー転移、特にフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の短い距離について、第１のフルオロフォア（Ａ）の状態が、第２のフルオロフォア（Ｂ）の状態と、少なくとも一部で重なっていることが望ましいものである。
さらに、お互いに独立した第１のフルオロフォア（Ａ）及び／若しくは第２のフルオロフォア（Ｂ）は、染料であり、且つ／又は染料からなり、特に蛍光染料であり、蛍光染料からなることが望ましい。
本願発明の範囲内において、お互いに独立した第１のフルオロフォア（Ａ）及び／若しくは第２のフルオロフォア（Ｂ）が、少なくとも１つのコア、好ましくは希土類元素からなるコアを具備することが利益的である。お互いに独立した第１のフルオロフォア（Ａ）及び／若しくは第２のフルオロフォア（Ｂ）が、配位錯体又は配位化合物の形で、又は、キレート化合物の形で、存在することが特に好ましく、該中心原子は、希土類元素によって構成されることが望ましい。本願発明の範囲内において（もし多数核配位錯体が使用されるならば）、同じ希土類元素に基づくコアが、錯体に、これによるフルオロフォアに使用されることが好ましい。
もし希土類元素が、スカンジウム、イットリウム、ランタン、セリウム、プラセオジミウム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム及びルテチウムからなる群から選択されるならば、本願による使用の範囲内で調製されたＦＲＥＴペアの上述した特性に関する良好な結果が達成される。
本願発明の範囲内において、希土類元素は、ランタニドの元素、特にセリウム、プラセオジミウム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム及びルテチウムからなる群から選択されることが望ましい。
ランタニドは、空気に晒されて酸化されて艶消しになる銀色で、輝く、相対的に柔らかい且つ反応金属である。水中で、それらは、多かれ少なかれ素速く反応し、水素ガスを放出する。ランタニドは、一般的に、第３亜属の下位カテゴリーと見なされる元素の周期律表の第６周期からの合計１４の元素である。原子価核の同様の構造の結果として、ランタニドは、いわゆるスカンジウム及びイットリウムである元素周期律表の第３群の元素のそれと比較して化学的に反応する。これらと共に、ランタニドは、希土類元素の群を構成する。
特に本願発明の範囲内で調製されたＦＲＥＴペアの関する良好な結果が、希土類元素がユウロピウム及びテルビウムの群から選択された場合に得られるものである。
これについて、出願人は、ＦＲＥＴペアに関する優れた特性が、フルオロフォア（Ａ）が希土類金属としてのテルビウムを、特にテルビウム（ＩＩＩ）の形で具備する場合に生じることを見出した。
これについて、フルオロフォア（Ｂ）が、希土類金属としてユウロピウムを、特にユウロピウム（ＩＩＩ）の形で具備する場合に特に利益的であることが証明された。
本願発明による使用の範囲内で調製されたＦＲＥＴペアが、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）を具備し、フルオロフォア（Ａ）が希土類金属としてテルビウムを、テルビウム（ＩＩＩ）の形で具備し、フルオロフォア（Ｂ）が希土類金属としてユウロピウムを、ユウロピウム（ＩＩＩ）の形で具備することが、本願発明の範囲内で特に好ましいものである。この種のＦＲＥＴペアは、生化学又は分子生物学の分野での分析的使用に使用されるように、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の短い距離と、狭い発光帯で定義された発光作用と、延長された発光期間を有するエネルギー転移、特に蛍光共鳴エネルギー転移の存在下で、テルビウム及びユウロピウムに基づくＦＲＥＴが、消光作用に関して優れた特性を示す。
本願発明による使用の範囲内で調製されたＦＲＥＴペアのフルオロフォアの構成に関して、希土類元素が、それぞれフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）においてそれぞれの場合で、少なくとも１つのリガンド、特に錯化剤及び／若しくはキレート剤、特に複数のリガンド、好ましくは４つのリガンドと合成されることが本願発明の範囲内で好ましく、且つ／又は、お互いに独立したフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の希土類元素が、少なくとも１つのリガンドと、特に複数のリガンドと、好ましくは４つのリガンドと、イオン結合され、配位結合され、且つ／又は共有結合され、特に共有結合されることが本願発明の範囲内で好ましい。
これに関して、リガンド、特に錯化剤及び／若しくはキレート剤は、多座、特に二座様式において構成されるべきである。これに関して、リガンドは、希土類金属に基づくコア又は中心原子と、複数の配位結合、イオン結合又は供給結合をとることが望ましい。原則的に、同一又は異なるリガンドが、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）に関して使用されることが、本願発明の範囲内において可能である。同一又は異なるリガンドは、それぞれフルオロフォア（Ａ）又は（Ｂ）自体に使用されることも可能である。
本願発明の好ましい例によれば、リガンド、特に錯化剤及び／若しくはキレート剤は、ピコリン酸、ピコリネート及び／若しくはその誘導体、特に置換誘導体、好ましくはヒドロキシル誘導体である。
フルオロフォア及び少なくとも分子又は有機ラジカルの間の結合を可能にするために、リガンド、特に錯化剤及び／若しくはキレート剤、特にピコリン酸、ピコリネート及び／若しくはその誘導体は、特に好ましくは共有結合及び／若しくは有機分子の結合のための置換基及び／若しくは官能基を具備することが望ましい。これについて、置換基及び／若しくは官能基は、アミノ酸、カルボン酸塩、イソシアン酸塩、チオイソシアン酸塩、エポキシ、チオール及びヒドロキシル基からなる群から選択されることが望ましい。分子に関する又は少なくとも１つの有機ラジカルの「結合点」は、それぞれのフルオロフォア（Ａ）又は（Ｂ）に設けられる。例えば、下記するように、有機分子は、標的分子若しくは標的構造への補完、又はそれらと相互作用するユニットである。
特に好ましい例によれば、前記置換基又は官能基は、ヒドロキシル基であることが望ましい。
さらに、本願発明の範囲内において、リガンド、特に錯化剤及び／若しくはキレート剤が、ヒドロキシピコリン酸及び／若しくはヒドロキシピコリン酸塩であることが好ましい。これについて、もしフルオロフォア（Ａ）及び／若しくは（Ｂ）に対する共有結合又は有機分子との結合が意図されるならば、リガンドの少なくとも１つが、上述した化合物によって構成されることが望ましい。
さらにまた、本願発明の範囲内において、フルオロフォア（Ａ）が、図５の化学式による有機金属錯体であることが望ましい。
また、前記フルオロフォア（Ａ）が、テトラ（４−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシラト）テルビウム（ＩＩＩ）、トリス−（ピリジン−２−カルボキシラト）（４−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシラト）テルビウム（ＩＩＩ）、ビス（ピリジン−２−カルボキシラト）−ビス（４−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシラト）テルビウム（ＩＩＩ）、（ピリジン−２−カルボキシラト）−トリス（４−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシラト）テルビウム（ＩＩＩ）及び／若しくはその誘導体からなる群から選択されることが、本願発明によって提供されることが望ましい。
前記フルオロフォア（Ａ）のための化合物に関して、対応する塩、特にナトリウム塩が、使用されることが望ましい。
さらに、フルオロフォア（Ａ）が、下記する一般化学式による化合物であることが望ましい。
Figure 0005356518
尚、この化学式において：
・Ｔｂは、テルビウム（ＩＩＩ）である。
・Ｐｉｃは、ピコリネートである。
・Ｙは、官能基であり、特にアミノ酸、カルボキシレート、イソシアネート、チオイソシアネート、エポキシ、チオール及びヒドロキシル基からなる群から選択された官能基であり、好ましくはヒドロキシル基である。
・ｘは、１〜４までの整数であり、特に１又は２であり、好ましくは１である。且つ
・ｙ及びｚは、それぞれ０から４までの整数であり、ｙ＋ｚ＝４である。
フルオロフォア（Ｂ）に関して、このフルオロフォア（Ｂ）は、図４の化学式４による有機金属錯体であることが望ましい。
これについて、本願発明によれば、フルオロフォア（Ａ）は、図５の化学式で示される有機金属錯体であり、フルオロフォア（Ｂ）が図４の化学式で示される有機金属錯体であることが好ましい。
さらに、前記フルオロフォア（Ｂ）は、テトラ（４−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシラト）ユウロピウム（ＩＩＩ）、トリス−（ピリジン−２−カルボキシラト）（４−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシラト）ユウロピウム（ＩＩＩ）、ビス（ピリジン−２−カルボキシラト）−ビス（４−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシラト）ユウロピウム（ＩＩＩ）、（ピリジン−２−カルボキシラト）−トリス（４−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシラト）ユウロピウム（ＩＩＩ）及び／若しくはその誘導体から選択されることが望ましい。
フルオロフォア（Ｂ）に関する化合物に関しては、例えば、対応する塩、特にナトリウム塩が、使用されることが望ましい。
フルオロフォア（Ｂ）に関して、下記に示される一般化学式の化合物が提供されることが望ましい。
Figure 0005356518
尚、この化学式において、
・Ｅｕはユウロピウム（ＩＩＩ）である。
・Ｐｉｃ’は、ピコリン酸塩である。
・Ｙ’は、官能基であり、特にカルボキシレート、イソシアネート、チオイソシアネート、エポキシ、チオール及びヒドロキシル基からなる群から選択された官能基であり、好ましくはヒドロキシル基である。
・ｘ’は、１から４までの整数であり、特に１又は２であり、好ましくは１である。
・ｙ’及びｚ’は、それぞれ０から４までの整数であり、ｙ’＋ｚ’＝４である。
例えば、ＦＲＥＴペア又はＦＲＥＴプローブのフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）は、例えば分子、特に生体分子、例えばプロテイン等へのフルオロフォアの結合又は連結によって構成又は配置されるものであり、上述されたように、蛍光共鳴エネルギー転移は、短い空間距離で実行され、発光スペクトルが、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の距離の増加及びエネルギー転移の減少に伴って変化するものであり、それは分子への空間構造的変化のための基準又は指標として使用されることが望ましい。
同様に、ＦＲＥＴペア又はＦＲＥＴプローブの構造について、本願発明に範囲内において、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）は、お互いに、２価及び／若しくは２化学結合の有機ラジカル、特にリンカー及び／若しくはスペーサを介して連結及び／若しくは接続されることが可能である。
これに関して、分子又は分子錯体は、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）とラジカルとを具備するように製造される。有機ラジカルの目的のある選択及び特別なフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）に対する調節は、ＦＲＥＴペア又はＦＲＥＴプローブを最適化し又は調整することが可能であり、最適な蛍光共鳴エネルギー転移は、ドナー信号の最大消光に関して実行され、距離の増加に伴って、狭い帯域を有する発光スペクトル及び長い発光期間への良好に限定された変化が得られる。
本願発明の範囲内において、有機ラジカルは、蛍光共鳴エネルギー転移が、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）の間で実行されるように選択されることが望ましい。これは、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の短い距離があるとき、例えばもし標的分子又は標的構造との相互反応がない場合に、特に適用される。これによって、蛍光共鳴エネルギー転移は、高い蛍光共鳴エネルギー転移に伴って、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間に短い間隔を生じるスペーサ、小さいスペーサ、言い換えると短い鎖の長さを有する分子の目標とされる選択によって個々に調整され又は最適化される。しかしながら、長いラジカル又はスペーサは、例えば折り返し及び／若しくは挿着又は混成過程を介して、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の短い間隔を生じると共に、例えば分子指標を有する場合である。
有機ラジカルによるフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の距離の個々の調節によって、発光スペクトルが明確に調整されて、特定の波長又は発光帯域を有する発光スペクトルがＦＲＥＴで製造され、いわゆる色特性がフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の距離の選択的調整によって個々に調整されるので、それは、染料として製品又は使用の範囲内で特に著しく重要である。
全体的に見ると、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の距離及びこれによる蛍光共鳴エネルギー転移及びそれによるＦＲＥＴペアの発光波長は、有機ラジカルの長さによって、又は、その構造、空間的配置又は空間的構造によって、調整される。前記有機ラジカルは、上述されたように、例えば有機ラジカルがそれぞれの置換基に、及び／若しくは、錯体剤及び／若しくはリガンドのそれぞれの官能基に接続されるように、フルオロフォアに接続又は結合されることが望ましい。
本願発明の範囲内において、有機ラジカルが、フルオロフォア（Ａ）及び／若しくはフルオロフォア（Ｂ）に共有結合されることが望ましく、特に有機ラジカルが、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）のリガンドの官能基に共有結合され及び／若しくは化学結合されることが望ましく、且つ／又は、有機ラジカルが、リガンドの官能基に、共有結合され及び／若しくは連結される官能基を具備することが望ましい。
前記有機ラジカルは、お互いに独立しているフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）が、有機ラジカルに、有機ラジカルのそれぞれの端部に、ある程度まで、末端に化学結合され又は連結されるように、官能基に連結又は結合される。
これに関して、有機ラジカルは、特に有機ラジカルに関して、例えば末端ポリウレタン基の構成に伴って、末端でフルオロフォア（Ａ）及び／若しくは（Ｂ）に共有結合される。
本願発明によれば、お互いに独立しているそれぞれのフルオロフォアが、それぞれ有機ラジカルを具備することが望ましく、それは、発明による使用の範囲内で調製されたＦＲＥＴペアが、混成プローブ型のＦＲＥＴプローブとして使用される場合であることが望ましい。この場合、有機ラジカルは、例えば、オリゴヌクレオチドであることが望ましい。本願発明による使用によって調製されたＦＲＥＴペアが提供されるか、加水分解プローブタイプのＦＲＥＴプローブとして使用される場合に、有機ラジカルへのフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の末端の化学結合又は連結が存在する。
有機ラジカルに関して、この有機ラジカルは、標的分子及び／若しくは標的構造と相互に反応するラジカルであることが望ましい。有機ラジカルは、標的分子及び／若しくは標的構造と相互作用することができるラジカルであることが望ましい。
本願発明の範囲内において、有機ラジカルと標的分子及び／若しくは標的構造との間の相互作用及び／若しくは相互反応が、フルオロフォア（Ａ）からフルオロフォア（Ｂ）への蛍光共鳴エネルギー転移における変化、特に減少を生じさせることが望ましい。
これは、相互反応又は相互作用によれば、フルオロフォアの間のエネルギー転移減少し、且つこれによって発光作用が減少するように、第１のフルオロフォア（Ａ）及び第２のフルオロフォア（Ｂ）の間の距離が増加することにおいて達成される。前記相互反応又は相互作用は、サンプルの発光スペクトル（の変化）の確認によって検出されることが望ましい。
例えば、有機ラジカルは、ヌクレオチド配列、特にＤＮＡ又はＲＮＡ配列、好ましくはオリゴヌクレオチドであるか又は具備することが望ましい。
例えば、これは、本願発明による使用によって調製されるＦＲＥＴペアが、混成プローブ、加水分解プローブ及び／若しくは分子指標として使用される場合である。
本願発明による使用によって調製されるＦＲＥＴペアが、分子指標として使用されるときに、ヌクレオチド配列が、その５’端及び３’端に、相補的ヌクレオチド配列部を具備することが望ましく、特に標的分子及び／若しくは標的構造との相互反応がない場合に、相補的ヌクレオチド配列部の混成があることが望ましい。分子指標の特徴である上述された構造が、ステムループの形で存在するように、ヌクレオチド配列の相補的末端部の結果として、ある程度、末端の自己混成が生じるものである。この状態において、フルオロフォア（Ａ）は、フルオロフォア（Ｂ）からの距離が短い結果として蛍光発光を示さないか、減少した蛍光発光を示すものである。例えばＦＣＲサイクルの間、標的分子又は標的構造として相補的ＤＮＡ配列へのループ領域の装着がある場合に、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）の間の距離は、この場合、蛍光発光又は減少した蛍光共鳴エネルギー転移によって生じる蛍光発光における変化が、フルオロフォア（Ａ）において生じるように、上昇するものであり、これは、従来技術における当業者に知られている装置又は方法を使用して観察又は検出されるものである。
上述したように、本願発明のよる使用によって調製されたＦＲＥＴペアは、例えば分子指標（ＭＢ）であることが望ましい。これについて、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）が、補完的ヌクレオチド配列部で、特にその５’端及び３’端で、ヌクレオチド配列に共有結合することによって、分子指標（ＭＢ）を構成することが望ましい。
同様に、ほんがん発明の範囲内において、有機ラジカルは、ペプチド及び／若しくはアミノ酸配列、特にオリゴペプチドであるか又は具備することが望ましいものである。
これに関して、例えば、標的構造又は標的分子に指向する酵素又は限定されたアミノ酸配列であることが望ましい。同様に、それは、空間構造自体が確定されるペプチド又はアミノ酸配列である。
さらに、本願発明の範囲内において、有機ラジカルは、飽和又は不飽和炭化水素ラジカル、好ましくは不飽和、分岐又は線形炭化水素ラジカルであるか又は具備することが望ましい。
これについて、炭化水素ラジカルが、少なくとも２個の炭素原子、特に２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１５個の炭素原子、より好ましくは２〜１２個の炭素原子の鎖長を有することが望ましい。
上述したように、この場合において、炭化水素ラジカルの長さは、エネルギー転移、特にフルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）の間に設定される蛍光共鳴エネルギー転移を考慮して選択されることが望ましい。
本願発明による好ましい例によれば、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）は、有機ラジカルと共に、図３に示される化学式による錯体を構成する。尚、この化学式において、ｎは、１から２０までの範囲内の整数であり、特に２から１５まで、好ましくは２から１２までの範囲内の整数である。
図３乃至５の化学式によれば、フルオロフォア（Ａ）は４個のヒドロキシピコリネートを有するテルビウム錯体によって構成され、フルオロフォア（Ｂ）は４個のヒドロキシピコリネートを有するユウロピウム錯体によって構成される。前記フルオロフォアは、末端ウレタン接着で炭化水素ラジカルによって相互に接続されているものである。
また、有機ラジカルは、ヌクレオチド配列及び／若しくはアミノ酸配列及び／若しくは炭化水素基を有する混合された分子であることが望ましい。
本願発明の第２の様相によれば、本願発明は、ドナーフルオロフォアとしての少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）と、アクセプターフルオロフォアとしての少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）とを具備する蛍光共鳴エネルギー転移錯体（ＦＲＥＴ錯体）に関し、該フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）は、２価の及び／若しくは２接着の有機ラジカル、特にリンカー又はスペーサを介してお互いに連結又は接続されている。本願発明に係るＦＲＥＴ錯体は、お互いに独立している第１のフルオロフォア（Ａ）及び第２のフルオロフォア（Ｂ）がお互いに希土類元素の有機金属策定に基づいて構成されること、前記フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）が、お互いに異なる希土類元素を具備することを特徴とするものである。
本願発明の好ましい例によれば、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体は、下記する化学式に対応する。
Figure 0005356518
尚、この化学式において、
・ＤＦは、ドナーフルオロフォア、特にフルオロフォア（Ａ）である。
・ＡＦは、アクセプターフルオロフォア、特にフルオロフォア（Ｂ）である。
・Ｓは、特に２価及び／若しくは２接着有機ラジカルであり、特にリンカー及び／若しくはスペーサである。
本願発明によるＦＲＥＴ錯体に関する構造について、上述された本願発明による使用に関する構造を参照することができ、これら構造は、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体に関して同様に適用される。
例えば、解析方法に関して、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体は、例えば混成プローブ、加水分解プローブ又は分子指標の形で、構成されることが望ましい。
さらに、本願発明の第３の様相によれば、本願発明は、ドナーフルオロフォアとしての少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）と、アクセプターフルオロフォアとしての少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）とを具備する蛍光共鳴エネルギー転移システム（ＦＲＥＴシステム）に関する。本願発明に係るＦＲＥＴシステムは、お互いに独立している第１のフルオロフォア（Ａ）及び第２のフルオロフォア（Ｂ）が、それぞれ希土類元素の有機金属錯体に基づいて構成されること、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）がお互いに異なる希土類元素を具備することを特徴とするものである。
本願発明のこの様相によれば、このＦＲＥＴシステムは、例えばそれぞれの錯体ＤＦ’−Ｍ及びＡＦ’−Ｍ’の形で存在することが望ましい。尚、ＤＦ’は、ドナーフルオロフォア、特にフルオロフォア（Ａ）であり、ＡＦ’は、アクセプターフルオロフォア、特にフルオロフォア（Ｂ）であり、Ｍ及びＭ’は、お互いに独立した有機ラジカルであり、それぞれのラジカルＭ及びＭ’は、前記ドナーフルオロフォアに又は前記アクセプターフルオロフォアに共有結合的に結合されるものである。
本願発明に係るこの例によれば、フルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）は、ともに、例えば、それぞれの場合で、標的構造又は標的分子、例えばヌクレオチド配列又はアミノ酸配列との相互作用及び／若しくは相互反応、及び／若しくは装着に適用される有機ラジカルを具備するものである。これについて、有機ラジカルの上述した定義が参照可能である、これによって、本願発明の例によれば、本願発明のＦＲＥＴシステムは、例えば、「混成」プローブであることが好ましい。
本願発明のこの様相によれば、お互いに独立したフルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）がそれぞれ上述されたような有機ラジカルを具備することが好ましいものである。
また、前記フルオロフォア（Ａ）及び前記フルオロフォア（Ｂ）は、上述されたように、特に２価の及び／若しくは２結合の有機ラジカル、特にリンカー及び／若しくはスペーサを介したお互いに連結及び／若しくは結合されることが望ましい。
例えば、この例によれば、分子指標が、含まれることが望ましい。
全体的に見ると、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムは、上述されたように、混成プローブ、加水分解プローブ、及び分子指標であることが望ましい。これについて、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムのエネルギー転移特性又はパラメータは、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の選択及び有機ラジカルの選択によって調製されることが望ましい。このように調製されたエネルギー転移特性は、それぞれの末端で特別なフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）を備え、これによってオリゴヌクレオチドの形の有機ラジカルがスペーサ又はリンカーとして作用する混成されたヌクレオチド分子の分子内の距離又は間隔を測定するのに使用される。適当な標的配列又は標的構造を使用する生化学誘導が、ループの端部が分離又は離脱されるときに、改良されたエネルギー転移の結果として改良された発光応答が提供されるように、ループ状の閉鎖されたヌクレオチド配列を開くものである。
本願に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムは、良好に調整された発光スペクトルを具備し、発光期間が組み込まれた信号による励起の後ミリ秒範囲内で存在するものであり、これによって非特異性自己蛍光発光からの付加的な識別が可能となるものである。これら２つの要素は、測定信号の分析に関して複雑なレーザ及び評価システムを無くさせることができるものである。さらに、最適な消光が、フルオロフォア間の小さい間隔を有し、信号品質を改善するものである。
さらに、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムに関して、非常に特別な且つ意味深いリアルタイム検出は、バイオセンサーとして対応する使用の範囲内において、例えば標的核酸の増幅の範囲内において、低い検出閾値で、特にコンパクトで簡単なサーモサイクラー(Thermocycler)におけるリアルＰＣＲの範囲内において実行されることが望ましい。
本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの使用は、核酸の結合に限定されるものではない。本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムが、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）を結合する有機ラジカルとしてプロテインの形で存在することも可能であり、且つ、プロテインが分裂する場合、又は、空間構造的変化によって、例えばリガンドへ結合する場合に、発光スペクトルの変化が存在するように、そこにフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の空間的間隔の変化が存在することが可能である。この場合には、ドナーフルオロフォア及びフルオロフォア（A）の蛍光発光が、特に解明される。これにより、本願発明のＦＲＥＴ錯体及びＦＲＥＴシステムは、プロテインまたはペプチド解析に使用することが可能となる。
さらに、本願発明によるＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムは、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）のような等温性増幅に使用される。本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムは、配列技術に使用される。さらに、固体基質への本願発明のＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの装着又は接続が、たとえばバイオチップまたはバイオセンサーに使用可能なものである。アプタマーの形の本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの使用を考慮することができる。全体的に見て、医療、分子生物学的及び生化学的解析及び診断の大変広い分野が、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムへ開かれている。
本願発明の第３の様相に関する例に関して、本願発明の第１の様相及び第２の様相に関する上記例を参照することができ、したがってそれらを適用することができる。
本願発明の第４の様相によれば、本願発明のさらなる主題は、サンプル内で生じるイベントを検出するための本願発明に係る上述されたＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの本願発明に係る使用である。
「イベント」という言葉は、本願発明の範囲内で使用されるように、大変広い意味に解釈される。たとえば、イベントは、たとえば核酸検出の範囲内において、ＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムと、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列又はオリゴヌクレオチドとの間の相互作用及び／若しくは反応及び／若しくは混成である。この場合、本願発明によるＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの有機ラジカルは、ヌクレオチド配列を具備するか又はそれからなることが望ましい。同様に、「イベント」という言葉は、本願発明の係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムのポリペプチド又は酵素との相互作用及び/若しくは相互反応及び/若しくはポリペプチド又は酵素への装着を含むことが望ましい。また、前記イベントは、リガンドからの切断又はリガンドへの結合であることが好ましい。この場合、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの有機ラジカルは、アミノ酸配列又はオリゴペプチド又はポリペプチドであるか、それを具備することが好ましい。同様に、前記イベントは、プロテインへの構造的変化、たとえば立体配置的又は立体配座的変化であることが望ましい。これにより、このイベントは、お互いに関連したフルオロフォア（Ａ）及びフルオロフォア（Ｂ）の空間的配置又は間隔における変化を生じるテストサンプル内のある程度の活動であり、これによってこの変化の結果として又はこの変化によって、変化した測定信号、特にＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの発光スペクトルの変化の識別検出が存在し、蛍光共鳴エネルギー転移の減少に伴うフルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の間の空間的間隔の上昇によって生じるドナーとして作用するフルオロフォア（Ａ）の上昇する信号及びアクセプターの減少する信号に戻るこの変化をトレースすることが可能である。
本願発明のこの様相による使用に関して、ＦＲＥＴ錯体及び／若しくはＦＲＥＴシステムは、励起エネルギーの影響及び／若しくは効果及び／若しくは適用下において、イベントが発生するとき及び/若しくはそのイベントの結果として、その発光スペクトルの変化が生じるものである。さらに、ＦＲＥＴ錯体及び／若しくはＦＲＥＴシステムは、イベントが生じるとき及び／若しくはイベントの結果として、励起エネルギーの影響及び／若しくは効果及び／若しくは適用下において、検出可能信号を放射する。
本願発明によれば、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）の相対的配置が、ＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの発光スペクトルが変化し、且つ／又は、検出可能信号が放射されるように、イベントによって、又はイベントの結果として変化することが望ましいものである。
本願発明によれば、発光スペクトル及び／若しくは検出可能信号の変化がイベントに関して一時的に遅延されること、且つ／又は、発光スペクトル及び／若しくは検出可能信号の変化がイベントが生じた後に実行されることが望ましいものである。
さらに、発光スペクトル及び／若しくは検出可能信号の変化は、時間分解された蛍光発光測定によって確認される。これに関して、発光スペクトルの変化又は自己蛍光発光からの検出可能信号を区別することができる。
これに関して、ＦＲＥＴ錯体及び／若しくはＦＲＥＴシステムの検出可能信号は、自己蛍光発光に比べて、２倍、特に５倍、好ましくは１０倍、好ましくは１００倍で延出することが望ましい。
上述したように、前記イベントは、標的分子及び／若しくは標的構造、特にヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ配列又はペプチド及び／若しくはアミノ酸配列を有するＦＲＥＴ錯体及び／若しくはＦＲＥＴシステムの相互反応及び／若しくは相互作用及び／若しくは混成であることが望ましい。
さらに、イベントは、ＦＲＥＴ錯体及び／若しくはＦＲＥＴシステムの空間的変化、特に立体配置変化及び／若しくは立体配座的変化であることが望ましい。
さらに本願発明の第５の様相によれば、本願発明の主題は、上述したように、特に、標的分子及び／若しくは標的構造を有するＦＲＥＴ錯体及び／若しくはＦＲＥＴシステムの相互作用によって、標的分子及び／若しくは標的構造との相互作用のための、且つ／又は検出及び／若しくは識別のための、且つ／又は、標的分子及び／若しくは標的構造の測定のための本願発明に係るＦＲＥＴ錯体の本願発明による使用である。
これにより、標的分子又は標的構造は、ヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列、ポリペプチド及び／若しくはアミノ酸配列、特に酵素又は抗体であることが望ましい。
同様に、本願発明の範囲内において、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムに基づいてウィルス及び微生物（特にバクテリア）を検出又は識別することが可能となるものである。これに関して、本願発明に係るＦＲＥＴシステム又はＦＲＥＴ錯体の対応する有機ラジカルは、相互作用がウィルス、微生物（特にバクテリア）、抗体等と、上述した生態系の特別な標的構造との間で可能なように、構成されることが望ましい。
例えば、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムは、微生物、特に食料品内の微生物の識別又は数量化、例えば最初に発生する微生物の蓄積について使用又は実行されるものである。限定されない例によれば、これは、リガンドでコートされたキャリヤで実行され、このリガンドは、識別又は数量化される微生物に対して特定されるものである。さらに、蓄積は、抗体でコートされたミクロ粒子を介して実行されることが望ましい。付加的な溶菌及び浄化の後、対応する標的核酸は、本願発明の係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴプローブを使用することで増幅される。
同様に、本願発明は、下記のステップからなるサンプル環境における標的オリゴヌクレオチドの識別又は検出のための方法を具備するものである。その第１段階において、標的核酸は、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムを使用して、培養構成物のそれに続く放射及び蛍光発光の検出によって、時間分解された蛍光発光側的によって培養される。これについて、例えばリアルタイムＰＣＲは、標的核酸を増幅するために使用される。同様に、これについて、本願発明に係る標的核酸又はＦＲＥＴ錯体若しくはＦＲＥＴシステムは、ＦＲＥＴプローブとしてのキャリヤに結合される。
また、本願発明の第６の様相によれば、本願発明は、特に標識化を目的とした染料、特に蛍光発光染料としての上述された本願発明のＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの使用に関する。
希土類金属に基づく特別なフルオロフォアによる特別な構造の結果として、前記フルオロフォアは、フルオロフォアの選択及びフルオロフォアの間の距離の調整の結果として、本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムが染料としての使用に採用されるように、特別な方法において所定の彩色が生じるものである。
染料に関して、定義された彩色は、正確且つ狭い放出帯域の結果として狭いスペクトルの範囲内で可能である。
全体的に、テルビウムの錯体とユウロピウムの錯体の間のエネルギー転移又は蛍光共鳴エネルギー転移の使用に関する本願発明の基本的原理は、発光を（良好に）チューニングし又はバイオセンサー若しくは染料錯体の特性を改善して、研究中の構造の範囲内の価値ある媒体として使用されることである。
さらに、本願発明の第７の様相によれば、本願発明は、バイオセンサーにおいて若しくはバイオセンサーとして、又はプローブ、特にＦＲＥＴプローブにおいて若しくはＦＲＥＴプローブとして上述された本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの使用に関する。
さらにまた、本願発明の第８の様相によれば、本願発明は、少なくとも２つの異なるフルオロフォアを具備する蛍光共鳴エネルギー転移ペア（ＦＲＥＴペア）に関し、このＦＲＥＴペアについて、ドナーフルオロフォアとして作用する少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）と、アクセプターフルオロフォアとして作用する少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）とがあり、お互いに独立している第１のフルオロフォア（Ａ）及び第２のフルオロフォア（Ｂ）がそれぞれ希土類元素の有機金属錯体に基づいて構成され、フルオロフォア（Ａ）及び（Ｂ）がお互いに異なる希土類元素からなるものである。
本願発明の第５から第８の様相に関する例に関して、本願発明の様相に関する上述した例を参照し、適用することができるものである。
本願発明の配置、改良及び変形は、本願発明の範囲から逸脱すること無しに明細書を読むことによって当業者には容易に理解可能であり、再生可能である。
図１は、ドナーフルオロフォアとしてテルビウム錯体（Ｔｂ）及びアクセプターフルオロフォアとしてユウロピウム錯体（Ｅｕ）を具備する本願発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムを示す。２つのフルオロフォアは、有機ラジカル（スペーサ又はリンカー）によって相互結合され、この場合に、前記有機ラジカルは、その末端に補完的に混成されたヌクレオチドを具備するヌクレオチド配列であることが可能である。ヌクレオチド配列の混成されていない部分は、ループ領域を構成する。図１に示された錯体は、閉鎖状態において存在する分子指標（ＭＢ）を示し、この場合、特にユウロピウム錯体へのテルビウム錯体の放射無しのエネルギー転移（ＥＴ）が、励起エネルギーの放射を実行し、ユウロピウム錯体を介した特定の発光（Ｅｍ．）を伴うものである。 図２は、図３に示される発明に係るＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムの光学スペクトルを示す。Ｅｕ錯体のＴｂ錯体の効果的なエネルギー転移の結果として、Ｔｂ錯体を介して十分に減少した又は大変少ない発光が存在するものである。 図３は、フルオロフォア（Ａ）としてのＴｂ錯体に基づき、且つフルオロフォア（Ｂ）としてのＥｕ錯体に基づいた本願発明のよるＦＲＥＴ錯体又はＦＲＥＴシステムを示し、該錯体が、ウレタン架橋を介して線形炭化水素鎖の形の有機ラジカルによって結合されることを示すものである。 図４は、本願発明の範囲内でフルオロフォア（Ｂ）として使用され、リガンドとして４つのヒドロキシピコリネートを具備するユウロピウム錯体を示すものである。 図５は、本願発明の範囲内でフルオロフォア（Ａ）として使用され、リガンドして４つのヒドロキシピコリネートを具備するテルビウム錯体を示すものである。
本願発明は、そこに記載された本願発明に限定されることなしに、下記する実施例を参照して説明される。
配位子（リガンド）修飾：
３アミノピコリン酸又は３−ヒドロキシピコリン酸は、蒸留水に溶解され、１Ｍ水酸化ナトリウムの対応する量で中和され、３−アミノピコリン酸ナトリウム塩又は３−ヒドロキシピコリン酸ナトリウム塩として結晶化される。
０．３２２２ｇの３−アミノピコリン酸ナトリウム塩又は３−ヒドロキシピコリン酸ナトリウム塩（２ｍｍｏｌ）を、１１０℃で、真空（２・１０−２ｍｂａｒ）下で３時間乾燥させ、約３０ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解させ、例えば０．１６２ｍｌのヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ又はＯＣＮ−（ＣＨ２）６−ＣＮＯ）、又は０．２６９ｍｌのドデカメチレンジイソシアネート（ＤＭＤＩ又はＯＣＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＮＯ）（１ｍｍｏｌ）が不活性ガス環境において付加される。その反応は、ナトリウム−３−ヒドロキシピコリネートの反応と共に９０℃の不活性ガスの存在下で２４時間又は７０時間実行される。ＤＭＦは、９０℃の真空下で排除される。
この生成物は、ナトリウム−３−アミノピコリネートの反応ではNaOOC-C5H4N-NH-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-NH-C5H4N-COONa (ＨＤＩによる生成物の場合n=6、またＤＭＤＩによる生成物の場合には n=12)である化合物、且つナトリウム−３−ヒドロキシピコリネートの反応では、NaOOC-C5H4N-O-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-O-C5H4N-COONaである化合物を具備するものである。
モノイソシアネート（フェニルイソシアネート又はブチルイソシアネート）及びブチルイソチオシアネートを有するリガンドの修飾と比較して、２ｍｍｏｌのイソシアネート試薬は、同じ反応のために調合される。
錯体化合物の合成
テトラピコリネート錯体：
０．４３５０ｇのピコリン酸ナトリウム塩（３ｍｍｏｌ）と０．１６００ｇの３−アミノピコリン酸ナトリウム塩（又は３−ヒドロキシピコリン酸ナトリウム塩）（１ｍｍｏｌ）が、溶解される。３０ｍｌの加熱されたＤＭＳＯ（ただ一種類のリガンドを有する錯体との合成に関して、４ｍｍｏｌの対応するナトリウム塩が調合される）、０．３６６４ｇのＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（又は、０．３７３０ｇのＴｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、又は、０．１８３２４ｇのＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ及び０．１８６５ｇのＴｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏの混合錯体）（１ｍｍｏｌ）が少量のＤＭＳＯに溶解され、リガンド溶液が付加される。その混合液は、９０℃で２時間反応に委ねられ、その後ＤＭＳＯは、同じ温度で、真空下で蒸留される。これによって得られたベージュ色の粉末は、１時間還流下ＴＨＦで沸騰され、濾過され且つ８０℃の真空下で１時間乾燥される。
変性リガンドを有する錯体化合物の反応において、ジイソチアネートで変性された０．５ｍｍｏｌのリガンド（又はイソクリアネート又はイソチオシアネートで変性された１ｍｍｏｌのリガンド）が、１ｍｍｏｌの３−アミノピコリン酸ナトリウム塩の代わりに調合される。
ＤＭＤＩ変性リガンドの低い溶解度の結果として、イソシアネートは、希土類錯体で変性され、０．３５ｍｍｏｌの錯体NaEuxTb(1-x)(Pic)3(Pic-Y) （x = 0 to 1, Pic = ピコリネート and Pic-Y = ３−アミノピコリネート又は3-ヒドロキシピコリネート）が、真空（２・１０−２ｍｂａｒ）下、１１０℃で３時間乾燥され、ほとんど溶解される。２０ｍｌのＤＭＳＯ、及び０．０９４ｍｌのＤＭＤＩ（０．０８８ｍｍｏｌ）が、不活性ガス環境において付加される。この反応は、９０℃で２４時間（又は、３−ヒドロキシピコリレートとの反応では７０時間）、アルゴンの存在において実行される。ＤＭＳＯは、同じ温度の真空下で蒸留される。これによって得られたベージュ色の粉末は、還流下ＴＨＦで１時間煮沸され、濾過されて８０℃の真空下で１時間乾燥される。
トリピコリネート錯体：
０．２９００ｇのピコリン酸ナトリウム塩（２ｍｍｏｌ）及び０．１６００ｇの３−アミノピコリン酸ナトリウム塩（又は３−ヒドロキシピコリン酸ナトリウム塩）（１ｍｍｏｌ）が、ほとんど溶解される。３０ｍｌの加熱されたＤＭＦ（１種類のリンがのみを有する錯体の反応で、３ｍｍｏｌの対応するナトリウム塩が調合される）と、０．３６６４ｇのＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（又は０．３７７３０ｇのＴｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、又は０．１８３２ｇのＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ及び０．１８６５ｇのＴｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏの混合錯体）（１ｍｍｏｌ）が、少しの量のＤＭＦに溶解され、リガンド溶液が付加される。生成された沈殿物は濾過され、エタノールで洗浄され、５０℃の真空下で１時間乾燥される。
変性リガンドを有する錯体化合物に反応に関して、０．５ｍｍｏｌのジイソシアネートで変性されたリガンド（又は１ｍｍｏｌのイソシアネート又はイソチオシアネートで変性されたリガンド）が、１ｍｍｏｌの３−アミノピコリン酸ナトリウム塩の代わりに調合される。
例えば、Eu2[NaOOC-C5H4N-O-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-O-C5H4N-COO]3である排他的に変性されたリガンドを有する錯体化合物の反応に関して、沈殿物が、９０℃から１００℃までの加熱によってのみ生成される。
イソシアネート変性ＤＮＡの標識：
錯体NaEuxTb(1-x)(Pic)3(Pic-Y)（例えば緑色発光錯体のみを有する標識ではｘ＝０；赤色発光錯体のみを有する標識ではｘ＝１；緑色及び赤色発光錯体を有する標識ではｘ＝０．５；Ｐｉｃ＝ピコリネート；Ｐｉｃ−Ｙ＝３−アミノピコリネート又は３−ヒドロキシピコリネート）は、１１０℃の真空（２・１０−２ｍｂａｒ）下で３時間乾燥され、ＤＭＳＯに溶解され、乾燥されたＤＭＳＯ（Ｐｉｃ−Ｙ：ＮＣＯのモル比１：１）に、適当な量のＤＮＡ溶液が不活性ガス環境下で付加される。その反応は、アルゴンガスの存在において。９０℃で２４時間（又は３−ヒドロキシピコリネートの反応では７０時間）実行される。必要に応じて、ＤＭＳＯは、真空下同じ温度で蒸留される。
イソチオシアネート変性ＤＮＡの標識：
錯体NaEuxTb(1-x)(Pic)3(Pic-Y)（例えば緑色発光錯体のみを有する標識ではｘ＝０；赤色発光錯体のみを有する標識ではｘ＝１；緑色及び赤色発光錯体を有する標識ではｘ＝０．５；Ｐｉｃ＝ピコリネート；Ｐｉｃ−Ｙ＝３−アミノピコリネート又は３−ヒドロキシピコリネート）は、ＤＭＳＯに溶解され、適当な量のＤＮＡ水溶液、ＤＭＳＯ又はＤＭＳＯ／水の溶液（Ｐｉｃ−Ｙ：ＮＣＳのモル比１：１）が付加される。その反応は、２４時間（又は３−ヒドロキシピコリネートの反応では７０時間）実行される。必要に応じて、ＤＭＳＯ又は水が、真空下同じ温度で蒸留される。

Claims (1)

  1. ドナーフルオロフォアとしての少なくとも１つの第１のフルオロフォア（Ａ）と、アクセプターフルオロフォアとしての少なくとも１つの第２のフルオロフォア（Ｂ）からなる蛍光共鳴エネルギー転移錯体（ＦＲＥＴ錯体）であって、前記第１のフルオロフォア（Ａ）及び前記第２のフルオロフォア（Ｂ）が、有機ラジカルを介してお互いに結合又は化学結合されると共に、お互いに独立した前記第１のフルオロフォア（Ａ）及び前記第２のフルオロフォア（Ｂ）が、それぞれ希土類元素の有機金属錯体に基づいて構成されること、前記第１のフルオロフォア（Ａ）及び前記第２のフルオロフォア（Ｂ）がお互いに異なる希土類元素を具備すること、
    前記第１のフルオロフォア（Ａ）が、化学式
    [Tb x (Pic) y (Pic-Y) z ] (4-3x)-
    で示される化合物であり、この化学式において、
    ・Ｔｂは、テルビウム（ＩＩＩ）であり、
    ・Ｐｉｃは、ピコリネートであり、
    ・Ｙは、アミノ酸、カルボン酸塩、イソシアン酸塩、チオイソシアン酸塩、エポキシ、チオール及びヒドロキシル基からなる群から選択された官能基であり、
    ・ｘは、１〜４までの整数であり、且つ、
    ・ｙ及びｚは、それぞれｙ＋ｚ＝４を満足させる０から４までの整数であること、且つ、
    前記第２のフルオロフォア（Ｂ）が、化学式
    [Eu x’ (Pic’) y’ (Pic’-Y’) z’ ] (4-3x’)-
    で示される化合物であり、この化学式において、
    ・Ｅｕはユウロピウム（ＩＩＩ）であり、
    ・Ｐｉｃ’は、ピコリネートであり
    ・Ｙ’は、カルボキシレート、イソシアネート、チオイソシアネート、エポキシ、チオール及びヒドロキシル基からなる群から選択された官能基であり、
    ・ｘ’は、１から４までの整数であり、且つ、
    ・ｙ’及びｚ’は、それぞれｙ’＋ｚ’＝４を満足させる０から４までの整数であることを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転移錯体。
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