JP5295760B2 - Rna用の注入溶液 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
本発明は、宿主生物内/内部のRNA移送、及び/またはRNA翻訳を向上させるために、RNA注入溶液を調製する際の、RNA、及び、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩(必要に応じて)、並びに乳酸塩(必要に応じて)を含む水溶性の注入緩衝液の利用に関する。
遺伝子治療、遺伝子ワクチン注射といった、分子医学的処置は、数多くの疾患の治療及び予防に重要な役割を果たす。そのような処置は、患者の細胞または組織内への核酸の導入、次いで導入された核酸によりコードされる情報のプロセッシング(すなわち、所望のポリペプチドまたはタンパクの翻訳)に基づくものである。DNA及びRNAはともに、導入可能な核酸として考えられている。
むき出しのプラスミドDNAを注入する遺伝子ワクチン接種が、1990年代初期に、マウスにおいて示された。しかしながら、この技術が、ヒトにおいて、マウスの研究により生じた期待を満足できないことが、臨床試験のフェーズI/IIの間で明らかになった。数多くの遺伝子ワクチン接種、及びDNAの細胞への導入方法(特に、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリプレントランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、DNAウィルスのDNA移送手段としての利用)が開発されてきた。
15年前、Wolff らは、マウスに、プラスミドDNA(pDNA)、またはmRNAの形態で、むき出しの遺伝情報を注入することにより、タンパクを発現することができることを示した。これらの結果に次いで、むき出しのpDNAがワクチン接種に利用され得ることを示す研究が成された3-5 。しかしながら、ワクチン接種のためのmRNAの利用は、1990年代後半まで、ほとんど注意が払われていなかった。1990年代後半に、樹状細胞へのmRNAの移送が免疫応答の引き金になることが示された。しかしながら、ワクチン接種のための、むき出しのmRNAの直接注入は、ほんの少しのテーマが残されおり、3つの異なる研究グループによる4つの論文のみで議論されている7-10。この主な理由の1つは、リボヌクレアーゼによる迅速な消化に起因するmRNAの不安定性にあり、これに関連して、インビボでの遺伝ツールとしてのmRNAの有効性に限界がある。しかしながら、先頃、数多くのmRNAを安定化する方法が、従来技術(例えば、EP−A−1083232,WO99/14346,US5,580,859、及びUS6,214,804)に示されている。
遺伝子移送手段としてのRNAは、DNAに対し、数多くの利点を有している。この利点は、
i)細胞内へ導入されるRNAは、ゲノムに挿入されない(これに対し、DNAは、一定量ゲノムに挿入され、これにより、宿主細胞ゲノムの無傷な遺伝子に挿入される。その結果、この遺伝子が変異し、遺伝情報が部分的もしくは全部欠損するか、もしくは情報が誤り得る)。
ii)RNAの効率的な転写のために、プロモーターなどといった、ウィルスの配列を必要としない(これに対し、細胞内に導入されたDNAの発現のためには、強力なプロモーター(例えばウィルスのCMVプロモーター)が必要になる。宿主細胞ゲノムへこのようなプロモーターを挿入することにより、遺伝子の発現制御に予期しない変化が生じる。)。
iii)導入されたRNAの消化は、限られた時間(数時間)に起きる11,12 。このため、一過的な遺伝子発現を実現することができる。この発現は、必要な治療期間後に、中断され得る(これに対し、ゲノムに挿入されたDNAでは、これは不可能である)。
iv)RNAにより、患者に病原性抗RNA抗体が導入されない(これに対し、抗DNA抗体の導入により、望ましくない免疫応答が起きることが知られている)。
v)RNAは、広範に利用できる。ワクチン接種のために、患者個人ベースで、所望の所定タンパクのための任意の所望のRNAが、間際に調製され得る。
を包含する。
要するに、インビボでの外因性遺伝情報の移送に適したベクターするのに必要な前提条件があるDNAと異なり、mRNAは、全ての生物のコードされる遺伝情報の一過的なコピーを示し、タンパク合成のモデルとして使われることが注目され続ける。
上記した核酸の宿主生物(特に哺乳類)への移送に、特に適した処置は、核酸の注入である。従来、このような注入のために、DNAが、水、NaCl、またはPBS注入緩衝液に希釈されるのに対し、RNAは、従来注入緩衝液のみに希釈されていた。RNA注入緩衝液として、リン酸緩衝塩溶液(特にPBS及びHEPES緩衝塩溶液(HBS))等の、標準緩衝液が用いられていた。mRNAを移送する場合、このようなRNA注入溶液は、投与前に、mRNAの2次構造を取り去るために、好ましくは短時間加熱されていた。RNA注入溶液としてこのような標準緩衝液を用いたとき、RNAの皮内への移送が非常に困難になるという不都合が生じる。さらに、移送されたRNAの翻訳率が非常に低いという不都合が生じる。さらに、標準緩衝液では、RNAが、しばしば2次構造(例えば、いわゆるヘアピン構造)を形成することがあり、この2次構造が、細胞質ゾルへのRNA取り込みの効率を顕著に低減させ得るという不都合が生じる。
したがって、本発明の目的は、宿主生物への皮内RNA移送が向上する一方、移送したRNAの翻訳効率が増加したシステムを提供することにある。
この目的は、請求項に特徴付けられた本発明の形態により達成される。
本発明の一形態は、宿主生物内/内部のRNA移送及び/またはRNA翻訳を増加させるためにRNA注入溶液を調製する際の、RNA、及び水性の注入緩衝液の利用であって、注入緩衝液は、ナトリウム塩(好ましくは少なくとも50mM)、カルシウム塩(好ましくは少なくとも0.01mM)、及び必要に応じてカリウム塩(好ましくは少なくとも3mM)を含有する、利用を提供する。本発明のさらなる態様はまた、そのように調製された注入液を提供する。よって、上記注入液は、上記注入緩衝液、及び該注入緩衝液に溶解したRNAから得られる。
好ましい形態によれば、上記注入緩衝液に含有される、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び必要に応じてカリウム塩は、ハロゲン化合物(塩化物、ヨウ化物、または臭化物)、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩の形態である。ここで言及した例として、ナトリウム塩は、NaCl、NaI、NaBr、NaCO、NaHCO、NaSOであり、必要に応じて存在するカリウム塩は、KCl、KI、KBr、KCO、KHCO、KSOであり、カルシウム塩は、CaCl、CaI、CaBr、CaCO、CaSO、Ca(OH)である。上述の陽イオンの有機陰イオンはまた、上記注入緩衝液に含有され得る。
本発明におけるRNA及び注入緩衝液の利用の、特に好ましい形態では、本発明の注入緩衝液は、塩として、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カルシウム(CaCl)、及び必要に応じて塩化カリウム(KCl)を含有し、上記塩化物に加え、他の陰イオンが存在し得る。通常、これらの塩は、上記注入緩衝液中に、少なくとも50mMの濃度で塩化ナトリウム(NaCl)、少なくとも0.01mMの濃度で塩化カルシウム(CaCl)、及び必要に応じて少なくとも3mMの濃度で塩化カリウム(KCl)が存在する。
本発明の注入緩衝液は、高浸透圧性、または等張性、あるいは低浸透圧性の注入緩衝液として存在し得る。本発明と関係して、注入緩衝液は、各基準媒体(reference medium)に対し、高浸透圧性、または等張性、あるいは低浸透圧性である。換言すると、本発明の注入緩衝液は、各基準媒体と比較して、塩の含有量が、高いか、または、等しいか、あるいは低い。用いられる上述の塩の濃度は、好ましくは、浸透作用、または他の濃度の影響により細胞にダメージが生じない濃度である。ここで、基準媒体は、例えば、血液、リンパ液、細胞質ゾル液、または体内で起こる他の流体といった、インビボ(in vivo) 処理で起こる液体、あるいは、インビトロ(in vitro)処理で通常用いられる液体または緩衝液である。このような液体は、当業者にとって公知である。
上記注入緩衝液は、さらなる化合物、例えば糖類(単糖類、二糖類、三糖類、または多糖類)、特にグルコースまたはマンニトールを含み得る。しかしながら、好ましい形態では、本発明の利用のために使用される注入緩衝液に、糖類が存在しないだろう。本発明の緩衝液は、例えば糖類といった、無電荷の化合物を全く含有しないことが好ましい。通常、本発明の緩衝液は、特に、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、または陰イオン、特に上述の陰イオンの群からの金属陽イオンのみを含有する。
本発明の注入緩衝液のpH値は、好ましくは1から8.5まで、好ましくは3から5まで、より好ましくは5.5から7.5まで、特に好ましくは5.5から6.5までである。注入緩衝液は、必要に応じて、注入緩衝液を緩衝されるpH値に固定する緩衝系を含み得る。このような系は、例えば、リン酸緩衝系、HEPES、NaHPO/NaHPOであり得る。しかしながら、注入緩衝液が、上述の緩衝系を含有しないか、または緩衝系が全く存在しないときに、本発明に基づいて用いられる注入緩衝液に与えられることが、特に好ましい。
本発明に基づいて用いられる注入緩衝液は、上述のように、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び必要に応じてカリウム塩を含有する。ナトリウムまたはカリウムは、通常、注入緩衝液中で、一価の陽イオン(Na、K)の形態で存在している。カルシウムは、二価の陽イオン(Ca2+)の形態で存在している。好ましい形態によれば、これらに加え、あるいは、本発明に基づいて用いられる注入緩衝液に含まれる一価及び二価の陽イオンの代わりに、二価の陽イオン(特に、例えば、マグネシウム(Mg2+)、鉄(Fe2+)といった、アルカリ土類金属の群からの陽イオン)、及び一価の陽イオン(特に、例えばリチウム(Li)といった、アルカリ金属の群からの陽イオン)が存在し得る。これらの一価の陽イオンは、塩の形態(例えば、ハロゲン化合物(塩化物、ヨウ化物、または臭化物)の形態、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、または硫酸塩の形態)で存在することが好ましい。ここで言及した例として、リチウム塩は、LiCl、LiI、LiBr、LiCO、LiHCO、LiSOであり、マグネシウム塩は、MgCl、MgI、MgBr、MgCO、MgSO、及びMg(OH)であり、鉄の塩は、FeCl、FeBr、FeI、FeF、Fe、FeCO、FeSO、Fe(OH)である。同様に、上述の一価及び/または二価の陽イオンの全ての組み合わせが含まれる。よって、本発明の注入緩衝液には、二価の陽イオンのみを含有するもの、一価の陽イオンのみを含有するもの、または、二価及び一価の陽イオンを含有するものが含まれる。また、本発明の注入緩衝液には、1種類のみの二価または一価の陽イオン(特に好ましくは、例えばCa2+陽イオンのみ)、またはその塩(例えばCaCl)を含有するものが含まれる。
注入液調製用に本発明に基づいて用いられる注入緩衝液に、Ca2+、及びNa1+に代えて、異なる一種の二価または一価の陽イオン、または異なる複数種の二価または一価の陽イオン(特にアルカリ金属またはアルカリ土類金属の群からの異なる陽イオン)が用いられるとき、注入緩衝液において、(二価の陽イオンとしての)Ca2+、及び(一価の陽イオンとしての)Na1+として示されるモル濃度(すなわち、通常少なくとも50mMのNa、少なくとも0.01mMのCa2+、及び必要に応じて少なくとも3mMのK)が、考慮されることが好ましい。上述のように、本発明に基づいて用いられる注入緩衝液において、Ca2+及びNa1+は、異なる二価または一価の陽イオン(例えば、(Ca2+に代えて)異なる二価の陽イオンの組み合わせ、及び/または(Na1+に代えて)異なる一価の陽イオンの組み合わせ;特にアルカリ土類金属の群からの異なる二価の陽イオンの組み合わせ、またはアルカリ金属の群からの異なる一価の陽イオンの組み合わせ)により完全に変換され得る。とはいえ、部分的にCa2+及びNa1+を変換することが好ましい。すなわち、Ca2+及びNa1+は、Ca2+及びNa1+を有する注入緩衝液中の一価または二価の陽イオンの総モル濃度に対し、少なくとも20%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは80%を占める。しかしながら、本発明に基づいて用いられる注入緩衝液は、二価の陽イオンとしてCa2+のみを含有し、一価の陽イオンとしてNa1+を含有する(すなわち、Ca2+が二価の陽イオンの総モル濃度の100%を示し、Na1+が一価の陽イオンの総モル濃度の100%を示す)ことが、特に好ましい。
注入緩衝液の調製は、好ましくは、室温(25℃)及び常圧で行われる。この調製は、従来技術の任意の所望の処理に基づいて、行われ得る。好ましくは、これに含まれるイオンまたは塩が水性溶液に希釈される。これにより、濃度比が、特定の条件に基づいて選択される。上記特定の条件は、RNA注入溶液が注入された宿主生物(特に哺乳類)、宿主生物の健康状態、宿主生物の年齢、化合物の溶解度及び干渉の条件、反応温度、反応時間等である。
水性の注入緩衝液に含有する化合物(ナトリウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン(必要に応じて)、及び乳酸(必要に応じて)(後述の実施形態参照))は、注入緩衝液またはRNA注入溶液の調製中の反応温度及び反応圧力と同様に、特に、これら化合物の水に対する溶解度、互いの化合物の干渉に依存する。
本発明に基づいて用いられる注入緩衝液は、水性溶液(すなわち、水、注入緩衝液用に本発明に基づいて用いられる塩、及び乳酸(必要に応じて)からなる溶液)に基づいている。上述の一価または二価の陽イオンの塩は、必要に応じて、水性溶液に対し、難溶性、または、不溶性であり得る。上記塩の溶解度は、溶解度積から計算され得る。溶解度及び溶解度積を正確に定量する処理は、当業者に公知である。この水性溶液は、該溶液に含まれる塩の30モル%以下、好ましくは25モル%以下、さらに好ましくは20モル%以下、さらに好ましくは15モル%、さらに好ましくは10モル%、さらに好ましくは5モル%、さらに好ましくは2モル%の、不溶性または難溶性の塩を含有する。本発明の範囲内において、その溶解度積が10−4よりも小さい(<10−4)塩は、難溶性であると考えられる。その溶解度積が10−4よりも大きい(>10−4)塩は、可溶性であると考えられる。
水に対する、塩、イオン、またはイオン化合物の溶解度は、生じるエントロピーを考慮すると、格子エネルギー及び水和エネルギーに依存する。溶解度積という用語は、より正確には、塩、イオン、またはイオン化合物が水中で溶解したときに生じる平衡状態に用いられる。一般的に、溶解度積は、飽和電解液中でのイオン濃度の積として定義される。例えば、アルカリ金属(例えば、Na,Kといった)は、アルカリ土類金属塩(例えばCa2+塩といった)よりも、水に対し、高濃度で溶解する。すなわち、これらは、より大きい溶解度積を有する。換言すると、本発明における注入緩衝液の水性溶液中のカリウム及びナトリウムの塩は、存在するカルシウム塩よりも溶解しやすくなっている。それゆえ、これらイオンの濃度を決定するに際し、とりわけ、カリウム、ナトリウム、及びカルシウム塩間の干渉を考慮する必要がある。
本発明の利用においては、注入緩衝液は、50mMから800mMまで、好ましくは60mMから500mMまで、より好ましくは70mMから250mMまで、さらに好ましくは60mMから110mMまでの塩化ナトリウム(NaCl);0.01mMから100mMまで、好ましくは0.5mMから80mMまで、より好ましくは1.5mMから40mMまでの塩化カルシウム(CaCl);及び、必要に応じて、3mMから500mMまで、好ましくは4mMから300mMまで、より好ましくは5mMから200mMまでの塩化カリウム(KCl)を含有することが好ましい。
上述の無機の陰イオン(例えば、ハロゲン化物、硫酸塩、または炭酸塩)に加え、有機の陰イオンが、さらなる陰イオンを起こし得る。これらの間で、記述は、コハク酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩(maleonate) 等(これらは、組み合わさって存在する)を構成する。本発明に基づいて用いられる注入緩衝液は、乳酸塩を含有する。特に好ましくは、このような、有機の陰イオンが存在する注入緩衝液は、有機の陰イオンとして乳酸塩のみを含有する。本発明の範囲内において、乳酸塩は、任意の所望の乳酸塩、例えばL‐乳酸塩及びD‐乳酸塩であり得る。本発明と関連して、注入緩衝液が、一価の陽イオンとしてNaのみ、二価の陽イオンとしてCa2+のみを含有するとき、乳酸塩として、乳酸ナトリウム、及び/または乳酸カルシウムが生じる。
本発明の利用の好ましい形態では、本発明の注入緩衝液は、好ましくは15mMから500mMまで、より好ましくは15mMから200mMまで、さらに好ましくは最も好ましくは15mMから100mMまでの乳酸塩を含有する。
本発明によれば、RNA注入溶液(すなわち、RNAを含有し、そのRNAの注入に適した注入液)のために、上述の化合物を含有する注入緩衝液(必要に応じて乳酸塩を有するか、または有しないか;後述のように、化合物の乳酸塩が存在しない場合、「RL注入緩衝液」、または化合物の乳酸塩が存在する場合、「乳酸塩を有するRL注入緩衝液」)を利用することにより、当業者により従来用いられてきた注入緩衝液と比較して、宿主細胞体(哺乳類)の細胞/組織内/内部へのRNAの移送及び翻訳が顕著に増加することがわかる。
上述の化合物、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カルシウム(CaCl)、乳酸塩(特に乳酸ナトリウム)、及び必要に応じて塩化カリウム(KCl)を有する溶液は、「リンゲル液」、または「リンゲル乳酸塩」として知られている。リンゲル乳酸塩は、例えば適合性薬物処理のために(血液)容量負荷及びキャリア溶液として用いられる、結晶性の完全電解液(full electrolyte solution) である。例えば、リンゲル乳酸塩は、特に幼児及び小児の(嘔吐、下痢、腸閉塞、または火傷による)流動及び電解のロスの場合、初期の容量負荷剤として用いられる。また、リンゲル乳酸塩は、抹消及び/または中心静脈の通路を開いた状態に保つのに用いられる。しかしながら、本発明における、リンゲル乳酸塩の、RNA注入溶液の注入緩衝液としての利用は、従来技術で示されていない。
本発明の範囲内において、RNAは、任意の所望のRNAであり、例えば、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA,一本鎖または二本鎖のRNA、ヘテロ二本鎖のRNA等である。用いられる上記RNAは、所定の任意のタンパクをコードし得る。本発明に基づいて用いられるRNAは、好ましくはむき出しのRNAである。特に好ましくは、mRNAであり、より好ましくは、むき出しのmRNAである。
本発明の範囲内において、むき出しのRNA、特にむき出しのmRNAは、例えばポリカチオン分子と複合体を形成しないRNAであるとして理解される。むき出しのRNAは、一本鎖の形態だけでなく、二本鎖の形態、すなわち二次構造(例えば、いわゆるヘアピン構造)で存在し得る。このような二本鎖の形態は、その分子内に相補するリボヌクレオチド配列が存在するとき、特にむき出しのRNA内、とりわけむき出しのmRNA内で起きる。
しかしながら、本発明によれば、上記RNA、特にmRNAは、複合体の形態で存在し得る。本発明の上記RNA(特にmRNA)の、このような複合体化/凝縮の結果、RNAの、被処理生物における被処理細胞または被処理組織内部への効果的な移送が改善され得る。上記複合体化/凝縮は、上記RNAを、(ポリ)陽イオン性の重合体、ペプチド、またはタンパクと一体にする、または結合させることによりなされる。このようなRNA(mRNA)は、好ましくは、少なくとも1つの陽イオン性またはポリ陽イオン性の薬剤で、複合体化または凝縮される。このような陽イオン性またはポリ陽イオン性の薬剤は、好ましくは、プロタミン、ポリ‐L‐リジン、ポリ‐L‐アルギニン、ヌクレオリン、スペルミン、及び、ヒストンまたはヒストンあるいはプロタミンの誘導体からなる群から選択される薬剤である。ポリ陽イオン性核酸結合タンパクとして、プロタミンを使用することが特に好ましい。RNAを安定化するための手順は、例えばEP‐A‐1083232に記載されており、関連する対応開示内容は、全て本発明に含まれる。
本発明のRNAは、さらに改変され得る。これらの改変は、特にRNAの安定性を増加させるためのものである。RNAは、好ましくは、1つ以上(自然に生じる、または人工的)の改変(特に化学的改変)を有している。この改変により、生物でのRNAの半減期が増加するか、または、mRNAの細胞質ゾル内翻訳効率が、改変していないmRNAの細胞質ゾル内翻訳効率よりも向上する。本発明の改変により、上記翻訳効率は、改変していないmRNAの細胞質ゾル内翻訳効率と比較して、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも75%、さらに好ましくは少なくとも85%、最も好ましくは少なくとも100%向上している。
例えば、改変mRNAのコーディング領域のGC含量は、対応する野生型mRNAのコーディング領域のGC含量と比較して、増加され得る。好ましくは、改変mRNAによりコードされるアミノ酸配列が、野生型mRNAによりコードされるアミノ酸配列に対し変化しないままになっている。この改変は、翻訳されるmRNA領域の配列が、mRNAの効率的な翻訳に重要であるという事実に基づいている。ここで、種々のヌクレオチドの配置及び配列に重要性がある。特に、G(グアノシン)/C(シトシン)含量が高い配列は、A(アデノシン)/U(ウラシル)含量が高い配列よりも安定している。さらに、翻訳されるアミノ酸配列をそのままに保持する一方、より多くのG/Cヌクレオチドを含有するように、野生型mRNAに照らしてコドンを改変することが有利である。同一のアミノ酸をコードするコドンが複数ある(いわゆる、遺伝コードの縮重)という事実から、安定性に有利な(好ましくは最大G/C含量を有する)コドンを決定することが可能になる。結果として、注入緩衝液中のRNAは、G/C含量が、最大G/C含量(すなわち、G/C含量を最大にする目的で、遺伝コードの縮重を用いてコードされるアミノ酸配列を変えずに、生来の配列を根幹としてコード領域の潜在的なトリプレット全てを改変した後のG/C含量)を基に、好ましくは少なくとも30%まで、より好ましくは少なくとも50%まで、さらに好ましくは少なくとも70%まで、さらに好ましくは少なくとも80%まで増加している。最も好ましくは、注入緩衝液中のRNAは、G/C含量が最大G/C含量になっている。最大G/C含量は、コードされるアミノ酸配列が変化せずに、そのG/C含量が最大化した配列により与えられる。
改変mRNAによりコードされるアミノ酸に依存して、野生型mRNAと比較してmRNAを改変するための、種々の可能性が存在する。アミノ酸が、GまたはCのヌクレオチドのみを含有するコドンによりコードされている場合、コドンの改変は必要ない。このような例として、Pro(CCCまたはCCG)、Arg(CGCまたはCGG)、Ala(GCCまたはGCG)、及びGly(GGCまたはGGG)のコドンが挙げられる。
一方、A及び/またはUのヌクレオチドを含有するコドンは、同じアミノ酸をコードしA及び/またはUを含有しない、異なるコドンへの置換により改変され得る。このような例として、
‐Proのコドンは、CCUまたはCCAから、CCCまたはCCGへ改変され得る。
‐Argのコドンは、CGU、CGA、AGAまたはAGGから、CGCまたはCGGへ、改変され得る。
‐Alaのコドンは、GCUまたはGCAから、GCCまたはGCGへ、改変され得る。
‐Glyのコドンは、GGUまたはGGAから、GGCまたはGGGへ、改変され得る。
コドンからA及びUのヌクレオチドを除去することが不可能であるが、A及び/またはUのヌクレオチドの含量が小さいコドンを用いることで、A及びUの含量を低減することが可能である場合がある。このような例として、
‐Pheのコドンは、UUUからUUCへ改変され得る。
‐Leuのコドンは、UUA、UUG、CUUまたはCUAから、CUCまたはCUGへ、改変され得る。
‐Serのコドンは、UCU、UCAまたはAGUから、UCC、UCGまたはAGCへ、改変され得る。
‐Tyrのコドンは、UAUからUACへ改変され得る。
‐Cysのコドンは、UGUからUGCへ改変され得る。
‐Hisのコドンは、CAUからCACへ改変され得る。
‐Glnのコドンは、CAAからCAGへ改変され得る。
‐Ileのコドンは、AUUまたはAUAから、AUCへ改変され得る。
‐Thrのコドンは、ACUまたはACAから、ACCまたはACGへ、改変され得る。
‐Asnのコドンは、AAUからAACへ改変され得る。
‐Lysのコドンは、AAAからAAGへ改変され得る。
‐Valのコドンは、GUUまたはGUAから、GUCまたはGUGへ、改変され得る。
‐Aspのコドンは、GAUからGACへ改変され得る。
‐Gluのコドンは、GAAからGAGへ改変され得る。
‐終止コドンUAAは、UAGまたはUGAへ改変され得る。
野生型mRNA(オリジナル配列)に比べ改変mRNAのG/C含量を増加させるために、上記でリストした置換は、個々に用いるか、あるいは可能な限り組み合わせて用いることが可能である。好ましくは、上記の置換の組み合わせの可能性として、例えば以下の置換が用いられる。すなわち、
‐オリジナル配列(野生型mRNA)におけるThrをコードする全てのコドンをACC(またはACG)に置換する。元々Serをコードする全てのコドンをUCC(UCGまたはAGC)に置換する、
‐オリジナル配列におけるIleをコードする全てのコドンをAUCに置換する。元々Lysをコードする全てのコドンをAAGに置換する。元々Tyrをコードする全てのコドンをUACに置換する、
‐オリジナル配列におけるValをコードする全てのコドンをGUC(またはGUG)に置換する。元々Gluをコードする全てのコドンをGAGに置換する。元々Alaをコードする全てのコドンをGCC(またはGCG)に置換する。元々Argをコードする全てのコドンをCGC(またはCGG)に置換する、
‐オリジナル配列におけるValをコードする全てのコドンをGUC(またはGUG)に置換する。元々Gluをコードする全てのコドンをGAGに置換する。元々Alaをコードする全てのコドンをGCC(またはGCG)に置換する。元々Glyをコードする全てのコドンをGGC(またはGGG)に置換する。元々Asnをコードする全てのコドンをAACに置換する、
‐オリジナル配列におけるValをコードする全てのコドンをGUC(またはGUG)に置換する。元々Pheをコードする全てのコドンをUUCに置換する。元々Cysをコードする全てのコドンをUGCに置換する。元々Leuをコードする全てのコドンをCUG(またはCUC)に置換する。元々Glnをコードする全てのコドンをCAGに置換する。元々Proをコードする全てのコドンをCCC(またはCCG)に置換する、等といった置換が用いられる。
改変mRNAのタンパクコード領域におけるG/C含量の変化に関しては、このG/C含量は、野生型mRNAのタンパクコード領域におけるG/C含量と比較して、少なくとも7%ポイントまで、より好ましくは少なくとも15%ポイントまで、さらに好ましくは少なくとも20%ポイントまで、さらに好ましくは少なくとも30%ポイントまで、増加されるであろう。これに関連して、改変mRNA(特にタンパクコード領域)のG/C含量を、野生型配列と比較して、最大限増加させることが特に好ましい。
また、野生型mRNAのリボソーム結合部位の領域のA/U含量と比較して、改変mRNAのリボソーム結合部位の領域のA/U含量を増加させることが好ましい。この改変により、リボソームのmRNAへの結合効率が増加する。リボソームの効率的なリボソーム結合部位(コザック(Kozak) 配列:GCCGCCACCAUGG、AUGは開始コドンを形成する)への結合は、代わりに、mRNAの効率的な翻訳に影響する。上記増加は、上記結合部位(すなわち、AUG開始コドンのAから、−20〜+20)に、少なくとも1つ(通常、少なくとも3つ)の付加的なA/Uユニットを導入して成される。
さらに好ましい改変は、次のmRNAに関連する。すなわち、このmRNAでは、改変mRNAにおける、コード領域、及び/または、5’‐及び/または3’‐非翻訳領域が、野生型mRNAと比較して改変されており、非安定化配列エレメントを全く含有しない。そして、好ましくは、改変mRNAにおけるコードされるアミノ酸配列が、野生型mRNAと比較して、変化していない。非安定化配列エレメント(DSEs)は、例えば真核生物のmRNAの配列で生じ、このmRNAに非安定化配列エレメントシグナルタンパクが結合し、インビトロで酵素によるmRNAの分解を制御することが知られている。よって、本発明によれば、さらに改変mRNAを安定化させるために、非安定化配列エレメントが領域内に全く存在しないか、またはほとんど存在しなくなるように、タンパクのコード領域に、野生型mRNAの対応領域と比較して1つ以上の改変が行われ得る。本発明によれば、このような改変により、mRNAから、非翻訳領域(5’‐及び/または3’‐UTR)に存在するDSEsを除去することが可能になる。
このような非安定化配列エレメントは、例えば、AUリッチ配列(「AURES」)である。この配列は、エンドヌクレアーゼ認識配列モチーフ(例えば、Binderら,EMBO J. 1994, 13: 1969〜1980)と同様に、多くの不安定なmRNAにおける3’‐UTR領域にもある(Caput ら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670〜1674)。
また、好ましくは、改変mRNAは、安定化のために、5’‐キャップ構造を有している。本発明にしたがって用いられるキャップ構造の一例は、m7G(5’)ppp、5’(A,G(5’)ppp(5’)A、及びG(5’)ppp(5’)Gである。
改変mRNAは、好ましくは少なくとも25ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも70ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも200ヌクレオチドのポリAテールを有していることが好ましい。
また、改変mRNAは、少なくとも1つのIRES、及び/または、少なくとも1つの5’‐及び/または3’‐安定化配列を有していることが好ましい。本発明によれば、1つ以上のいわゆるIRES(リボソーム内部進入配列)が改変mRNAに導入され得る。IRESは、翻訳される複数のタンパク、ペプチド、またはポリペプチドをコードするmRNAを、リボソーム(マルチシストロンのmRNA)により互いに独立して提供する機能を有する以外に、単一のリボソーム結合部位として機能する。本発明にしたがって用いられ得るIRES配列は、例えば、ピコルナウィルス(例えばFMDV)、ペストウィルス(CFFV)、ポリオウィルス(PV)、脳心筋炎ウィルス(ECMV)、口蹄疫ウィルス(FMDV)、C型肝炎ウィルス(HCV)、豚コレラウィルス(CSFV)、マウス白斑ウィルス(MLV)、サル免疫不全症候群ウィルス(SIV)、またはコオロギ麻痺病ウィルス(CrPV)に由来する配列である。
また、改変mRNAは、少なくとも1つの5’‐及び/または3’‐安定化配列を有していることが好ましい。5’‐及び/または3’‐非翻訳領域におけるこれら安定化配列は、細胞質ゾルでのmRNAの半減期を増加させるという効果を奏する。このような安定化配列は、(ウィルス、バクテリア、及び真核生物で生じる)天然(naturally occurring) の配列と、100%配列ホモロジーがある。しかしながら、この配列は、部分的または全体的に合成した天然物であり得る。本発明にしたがって用いられ得る安定化配列の一例として、(例えばホモサピエンス(Homosapiens) またはアフリカツメガエル(Xenopus laevis)の)グロブリン遺伝子における非翻訳配列(UTR)が挙げられる。安定化配列の他の例は、一般式(C/U)CCANCCC(U/A)PyUC(C/U)CCを有している。この配列は、α‐グロブリン、(I)‐コラーゲン、15‐リポキシゲナーゼ、または、チロシン‐ハイドロキシラーゼをコードする、非常に安定化したmRNAの3’‐UTRに含まれている(Holcikら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 〜2414参照)。もちろん、このような安定化配列は、個々に用いられるか、もしくは互いに組み合わせて用いられ得る。当業者に公知な他の安定化配列とも組み合わせて用いられ得る。
本発明の好ましい形態では、改変mRNAは、少なくとも1つの、天然ヌクレオチドのアナログを含有している。この/これらアナログは、改変mRNAをさらに安定にするのに働く。これは、細胞内に生じるRNA‐分解酵素(RNA-degrading enzymes) が、優先的に、基質として天然ヌクレオチドを認識するという事実に基づいている。よって、上記RNAにヌクレオチドアナログを導入することにより、RNAの分解は、より起こり難くなる。しかしながら、特にmRNAのコード領域への、これらアナログの導入は、翻訳効率に正または負の効果を与える。本発明にしたがって用いられ得るヌクレオチドアナログは、特に限定されないが、例えば、ホスホロアミダート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、ホスホン酸メチル、7‐デアザグアノシン、5‐メチルシトシン、及びイノシンが挙げられる。このようなアナログの調製は、例えば、US特許4,373,071、US4,401,796、US4,415,732、US4,458,066、US4,500,707、US 4,668,777、US4,973,679、US5,047,524、US5,132,418、US5,153,319、US5,262,530及び5,700,642から、当業者に公知である。このようなアナログは、改変mRNAの非翻訳領域及び翻訳領域の両方で生じ得る。
本発明のさらに好ましい形態では、改変mRNAは、付加的に、シグナルペプチドをコードする配列を含有する。シグナルペプチドをコードするこの配列は、好ましくは、10アミノ酸から100アミノ酸までをコードする、30ベースから300ベースまでの長さである。より好ましくは、シグナルペプチドをコードするこの配列は、15アミノ酸から60アミノ酸までをコードする、45ベースから180ベースまでの長さである。本発明にしたがって用いられるRNAを改変するために、一例として、表1に示された以下の配列が用いられ得る。表1に示されたこれら配列は、表1に示された配列の比較して、1ベースから20ベースまで、好ましくは1ベースから10ベースまで、さらに好ましくは1ベースから5ベースまでのA、T、C、またはGの置換を有するものも含まれる。
上述の改変を行うための、種々の処理が、当業者にとって公知である。例えば、本発明の改変mRNAのコドンの置換のために、コード領域が比較的短い場合、標準的な技術を用いて、mRNA全長を化学的に合成することが可能である。しかしながら、従来のターゲット変異導入(target-oriented mutagenesis) (例えばManiatisら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001参照)技術を用いて改変mRNAを調製するために、塩基の改変、付加、または除去は、好ましくは、DNAマトリックスを用いて導入される。このような処理では、上記mRNAを調製するために、対応するDNA分子が、インビトロで転写される。このDNAマトリックスは、インビトロ転写のために、適切なプロモーター(例えばT7またはSP6プロモーター)、それに続いて、調製されるmRNAの所望のヌクレオチド配列、及びインビトロ転写の終止シグナルを有している。調製されるRNA構造体のマトリックスを形成するDNA分子は、発酵による増殖、それに続いて、バクテリア内で複製されたプラスミドの一部分の分離(isolation) により、調製され得る。そして、所望のヌクレオチド配列は、当業者に公知な分子生物学の方法に従って、適切なプラスミドにクローン化され得る。この方法では、結果となる切断部位で短い一本鎖(塩基)転位を有する短い合成DNAオリゴヌクレオチドを用いるか、あるいは、化学合成により調製された遺伝子を用いる(Maniatisら、supra 参照)。そして、DNA分子は、プラスミド内で、1コピーまたは多コピー存在し得、制限酵素消化により、プラスミドから切断される。
本発明の範囲内において、上述の、RNA(特にmRNA)の改変は、単独で、または互いに組み合わせて、起こり得る。そして、1つ以上の改変は、上述したRNA(特にmRNA)の複合体化と組み合わせ得る。
本発明の目的は、宿主生物内のRNA移送及び/またはRNA翻訳を増加させることである。本発明の範囲内では、宿主生物は、生物内へ細胞または組織のRNAが移送され得、それに続いてRNAが翻訳される任意の生物であると理解される。本発明の範囲において、宿主生物は、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サルおよびヒトからなる群より選ばれる哺乳類であることが好ましく、特にヒトである。
本発明では、ルシフェラーゼをコードするRNA(特にmRNA)が本発明の(乳酸塩を有する、もしくは乳酸塩を有さない)RL注入緩衝液に希釈されており、このRNAが、RNA用に従来用いられる(HBSまたはPBSといった)標準緩衝液で希釈したmRNAよりも翻訳率が有位に高くなっていることが示されている(図1参照)。さらに、注入されたmRNAの移送及び翻訳の効率が、高い度合いで、カルシウムイオンの存在に依存していることが示されている。これに対応して、(乳酸塩を有するか、もしくは乳酸塩を有する)RL注入緩衝液中のカルシウムイオンの有無でおこなった対照試験では、カルシウム非存在下では、RNA移送効率が、標準緩衝液PBS及びHBSのものに匹敵するレベルに顕著に減少することがわかった(図2参照)。
よって、第1に、本発明の、(乳酸塩を有するか、もしくは乳酸塩を有する)RL注入緩衝液は、RNA移送を顕著に増加させること、第2に、この向上したRNA移送は、さらに他の因子、カルシウム濃度が100mMまで高くなった、本発明の(乳酸塩を有するか、もしくは乳酸塩を有する)RL注入緩衝液により増加することがわかった。
好ましくは、本発明の注入緩衝液は、RNA注入溶液中のRNAと組み合わせて、用いられる。よって、本発明は、さらに、RNA、及び注入緩衝液を含有する、宿主生物内/内部のRNA移送及び/またはRNA翻訳を増加させるためのRNA注入溶液を提供する。この注入緩衝液は、少なくとも50mMの塩化ナトリウム(NaCl)、少なくとも0.01mMの塩化カルシウム(CaCl)、及び必要に応じて少なくとも3mMの塩化カリウム(KCl)を含有する。好ましくは、本発明のRNA注入溶液は、上記注入緩衝液が、50mMから800mMまで、好ましくは60mMから500mMまで、より好ましくは70mMから250mMまで、さらに好ましくは60mMから110mMまでの塩化ナトリウム(NaCl)、0.01mMから100mMまで、好ましくは0.5mMから80mMまで、より好ましくは1.5mMから40mMまでの塩化カルシウム(CaCl)、及び、必要に応じて、3mMから500mMまで、好ましくは4mMから300mMまで、より好ましくは5mMから200mMまでの塩化カリウム(KCl)を含有する。
本発明のRNA注入溶液の注入緩衝液は、さらに乳酸塩を含有することが好ましい。本発明のRNA注入溶液の注入緩衝液は、好ましくは、15mMの乳酸塩を含有する。好ましくは、本発明のRNA注入溶液は、上記注入緩衝液が、15mMから500mMまで、好ましくは15mMから200mMまで、より好ましくは15mMから100mMまでの乳酸塩を含有する。
RNA注入溶液は、従来技術からの任意の処理にしたがって、調製され得る。好ましくは、RNAは、RL注入緩衝液、または乳酸塩を含むRL注入緩衝液に希釈され得る。また、RNAは、乾燥(例えば凍結乾燥)RNAの形態で用いられ得る。RL注入緩衝液、または乳酸塩を含むRL注入緩衝液は、このRNAに添加され得る。そして、必要に応じて、希釈を促進するために、温度上昇、攪拌、超音波処理等を行う。濃度比は、特定の条件(例えば、RNA注入溶液が注入される宿主生物(特に、哺乳類)、宿主生物の健康状態、宿主生物の年齢など)に依存して選ばれる。
本発明のRNA注入溶液のRNAは、上で既に定義したように、好ましくは、むき出しのRNA、より好ましくはmRNA、好ましくは、むき出しのmRNAである。
説明したように、本発明のRNA注入溶液は、特に、宿主生物内/内部のRNA移送及び/またはRNA翻訳を増加させるために、用いられ得る。
したがって、本発明は、さらに、宿主生物内/内部のRNA移送及び/またはRNA翻訳を増加させるための、上述したRNA注入溶液の利用を提供する。
(乳酸塩を有するか、もしくは乳酸塩を有する)RL注入緩衝液中の、移送されるRNAの(特に臨床応用のための量及び持続時間に関する)量が調査されてきた。この調査では、マウスにおいて、(100μlの注入容量で)mRNAの量が0.1μg増加する、ヒトにおいては、(150μlの注入容量で)mRNAの量が3μg増加するとき、ルシフェラーゼの発現の増加が見られる。mRNAの翻訳は、一過的に起き、その結果、持続的に、外来分子(タンパク)の発現が一様になるように制御される。繰り返し注入は、発現する外来分子、意図的な作用、生物の(健康)状態と同様に、注入を受ける生物、などといった種々の因子に依存しており、2日毎または毎日を除いて、約3日毎に行われるべきである。同様に、RNAの量は、特に上述した種々の因子に依存的であり、100μlの注入容量で、0.01μgから1000μgまで、好ましくは1μgから800μgまで、より好ましくは2μgから500μgまで、さらに好ましくは5μgから100μgまで、さらに好ましくは10μgから90μgまで、さらに好ましくは20μgから20μgまでであり得る。RNAの量は、100μlの注入容量で60μgであることが特に好ましい。
本発明によれば、RNAと、RL注入緩衝液または乳酸塩を有するRL注入緩衝液と、本発明のRNA注入溶液との両方の利用は、例えば、癌もしくは腫瘍という疾患、アレルギー、自己免疫疾患(多発性硬化症など)、または、ウィルスおよび/もしくは細菌感染の、治療および/もしくは予防、ならびに、治療及び/または予防のための薬剤調製における利用である。上記癌もしくは腫瘍は、例えば、メラノーマ(悪性メラノーマ、皮膚メラノーマなど)、上皮性悪性腫瘍(大腸癌、肺癌(小細胞肺癌など)、腺癌、前立腺癌、食道癌、乳癌、腎癌など)、非上皮性悪性腫瘍、骨髄腫、白血病(特にAML(急性骨髄性白血病))、神経膠腫、リンパ腫、および、芽細胞腫である。
例えば、本発明は、特に、上述の疾患を予防する遺伝子治療および/またはワクチン接種(例えば抗ウィルス性または抗腫瘍性ワクチン接種)のための、RNAと、RL注入緩衝液または乳酸塩を有するRL注入緩衝液と、RNA注入溶液との両方の利用を包含する。
本発明の範囲内において、遺伝子治療は、特に、疾患のある細胞へ機能遺伝子を導入することによる体または細胞における欠如した機能の回復、または、対応する遺伝情報による悪化した機能の阻害を意味する。例えば、癌抑制遺伝子の場合、例えばp53は、欠如しているか、もしくは、少量だけ発現している。これは、mRNAの、またはDNAに挿入された形態で、細胞に導入され得る。そして、元々発現に欠陥があったタンパクが、生理的に関連する量に、再び産生され得る。本発明の範囲内において、癌抑制遺伝子として、例えば、p53,TP53,RB1,APC,WT1,NF1,NF2,VHL,BRCA1,BRCA2,DCC,MEN1,MEN2, PTCH,p57/KIP2,MSH2,MLH1,FMS1,FMS2,MET,p16/INK4a/CDKN2,CDK4,RET,EXT1,EXT2,EXT3,PTEN/MMAC1,ATM,BLM,XPB,XPD,XPA,XPG,FACC,FACA,SMAD4/DPC4,p14Art(p19Art),DPC4,E−CAD,LKB1/STK1,TSC2,PMS1,PMS2,MSH6,IIR型TGF-β,BAX,α−CAT,MADR2/SMAD2,CDX2,MKK4,PP2R1B,MCC,等が挙げられる。
本発明の範囲内において、ワクチン接種は、RNA(特にmRNA)の形態の遺伝情報の、生物(特に生物の1またはいくつかの細胞、あるいは、組織)への導入を意味する。そのようにして投与されるmRNAは、生物内において標的分子(例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質)へと翻訳される。すなわち、mRNAによってコードされる標的分子が発現し、免疫反応を引き起こす。抗原提示細胞(APC)は、免疫反応が引き起こされている間、欠かすことのできない役割を担う。なぜなら、抗原提示細胞は、活性化しているときに、抗原特異的免疫細胞の増殖の開始に必要な全てのシグナルを引き起こす唯一の細胞種であるからである。本発明の範囲内において、ワクチン接種を、例えば抗原をコードするRNA(特にmRNA)を用いることによって実施することができる。上記抗原は、腫瘍に対するワクチン接種の場合に腫瘍抗原であり、外来の病原体に対するワクチンの場合に外来の病原体である。本発明における腫瘍抗原としては、例えばT細胞に認識される腫瘍抗原が挙げられ、例えば「癌/精巣」抗原(MAGE、RAGE、NY‐ESO‐1など)、分化抗原(MART‐1/Melan‐A、チロシナーゼ、gp100、PSA、CD20など)、突然変異遺伝子の抗原エピトープ(CDK4、カスパーゼ‐8など)、または、腫瘍胎児抗原(CEA、AFなど)などである。他の腫瘍抗原としては、例えば、T細胞リンパ腫ならびにB細胞リンパ腫に存在する腫瘍抗原のCD5およびCAMPATH‐1(CDw52)、非ホジキンB細胞リンパ腫に存在するCD20、固形腫瘍、特に上皮腫瘍(乳房、腸、および肺)に存在する腫瘍抗原のCEA(癌胎児抗原)、ムチン、CA‐125およびFAP‐a、膠芽腫において付加的に存在するテネイシンおよびメタロプロテアーゼが挙げられる。さらに、腫瘍抗原としては、例えば、肺、乳房、頭、および、首、ならびに、T細胞腫瘍およびB細胞腫瘍に存在する腫瘍抗原のEGF(上皮細胞成長因子)、p185HER2ならびにIL‐2受容体、または、腫瘍抗原のSV40などが挙げられる。
上記のような抗原を複数コードするRNA(特にmRNA)も用いることが可能である。その結果、特定の腫瘍に特異的な異なる抗原を組み合わせることにより、作用の範囲が極めて広くなるので、メラノーマ、上皮性悪性腫瘍、AML、または、神経膠腫を効果的に制御することができる。本発明のRNA(特にmRNA)は、免疫原性タンパク質をさらにコードしてもよい。そのような免疫原性タンパク質は、免疫反応の再活性化を仲介することができる。そのような再活性化は、ほとんど全ての生物が特定の外来分子(例えばタンパク質、特にウィルスタンパク質)の抗原に対する、いわゆる「記憶免疫反応」を有するというの知見に基づく。このことは、生物がそのような外来分子により早い時期に既に感染し、この感染によってその外来分子(例えばウィスルタンパク質)に対する免疫反応がすでに引き起こされ、この免疫反応が「記憶」の中に留まることを、換言すれば貯蔵されることを意味する。生物が同じ外来分子に再び感染したとき、免疫反応が再活性化される。本発明によれば、免疫反応のそのような再活性化を、少なくとも1つの免疫原性タンパク質をコードする領域を少なくとも1つ含むRNA(特にmRNA)を有するワクチン接種によってもたらすことができる。RNA(特にmRNA)は、1以上の抗原と1以上の免疫原性タンパク質とを両方コードすることが好ましい。
本発明の範囲内において、免疫原性タンパク質は、ウィルスの構造タンパク質(特にマトリックスタンパク質、キャプシドタンパク質、および、脂質膜の表面タンパク質)であることが好ましい。また、そのようなウィルスタンパク質としては、例えば、アデノウィルス、ライノウィルス、コロナウィルス、レトロウィルスのタンパク質が挙げられる。本発明において特に好ましいウィルスタンパク質は、B型肝炎ウィルス表面抗原(以下、「HBS抗原」と称する。)、インフルエンザウィルスのマトリックスタンパク質(特に、インフルエンザウィルスのマトリックスタンパク質(M1))である。
また、本発明は、「インビトロ」の処理におけるRNAのRNA移送および/またはRNA翻訳のための(例えば、遺伝子発現分析またはHTS(ハイ・スループット・スクリーニング)によるインビトロのスクリーニングのための)、RNAの、および、上述したRL注入緩衝液または乳酸塩を含むRL注入緩衝液の、あるいは、上述したRNA注入溶液の使用に関する。
また、本発明は、例えば、癌もしくは腫瘍という疾患、アレルギー、自己免疫疾患(多発性硬化症など)、または、ウィルスおよび/もしくは細菌感染の、治療および/もしくは予防のための、ならびに、上記疾患を予防する遺伝子治療および/またはワクチン接種(必要に応じて抗ウィルス性のワクチン接種)のための、宿主生物におけるRNAのRNA移送および/またはRNA翻訳を増加する方法であって、上記方法は、本発明のRNA注入溶液を調製する工程(a)、および、上記工程(a)に由来するRNA注入溶液を宿主生物に投与する工程(b)、を含み、上記癌もしくは腫瘍は、例えば、メラノーマ(悪性メラノーマ、皮膚メラノーマなど)、上皮性悪性腫瘍(大腸癌、肺癌(小細胞肺癌など)、腺癌、前立腺癌、食道癌、乳癌、腎癌など)、非上皮性悪性腫瘍、骨髄腫、白血病(特にAML(急性骨髄性白血病))、神経膠腫、リンパ腫、および、芽細胞腫である、方法を提供する。
工程(a)に由来するRNA注入溶液を、上述したようにして、すなわち、先行技術に由来する任意の所望の処理に従って(好ましくはRL注入緩衝液または乳酸塩を含むRL注入緩衝液中にRNAを希釈することによって)調製することができる。また、濃度比は上記条件(例えば、RNA注入溶液が注入される宿主生物(特に、哺乳類)、宿主生物の健康状態、宿主生物の年齢など)に依存して選ばれる。RNA注入溶液を、例えば注射器(例えば、Sub‐Q、ベクトン・ディッキンソン、ハイデルベルグ、ドイツ)を用いて任意の適切な様式で投与することができる。この適切な様式としては、例えば、経皮内投与、上皮内投与、皮下投与、静脈内投与、血管内(intravasally)投与、動脈内投与、腹内投与、腹腔内投与、節内(intranodally、例えばリンパ節)投与などの様式を挙げることができる。
本発明の方法における宿主生物は、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サルおよびヒトからなる群より選ばれる哺乳類であることが好ましく、特にヒトである。
しかしながら、本発明にしたがって調製される注入溶液も、インビトロでのRNA(特にmRNA)の細胞へのトランスフェクションに用いることができる。このインビトロでのトランスフェクションは、実験室において適切に使用することができるか、または、エキソビボでの遺伝子治療の一環として使用することができる。エキソビボでの遺伝子治療は、すなわち、患者からの細胞の除去、本発明における注入溶液に含まれるRNAのエキソビボでのトランスフェクション、および、その後の患者への再移植である。トランスフェクションを、エレクトロポレーション処理を利用して実行することができる。このとき必要に応じて、パルス幅を10μsから200μsまでに設定して、電流密度を少なくとも2Acm−2に設定して、2kVcm−1から10kVcm−1まで以下の電界強度を有する電圧パルスを印加する。しかしながら、それがトランスフェクションに必要とされない場合、1msから100msまでの範囲のより長いパルス時間を用いることができる。本発明の注入溶液が実験室での用途に用いられる場合、考えられる全ての実験室に存在する細胞株に、この様式でRNAをトランスフェクションすることができる。エキソビボでの遺伝子治療では、多数の細胞種がトランスフェクションについて配慮される。そのような細胞種は、特に、ヒトの初代血液細胞、多分化能を有する前駆血液細胞、繊維芽細胞、神経細胞、内皮細胞、または筋肉細胞である。なお、このリストは例として挙げられたものであって、限定することを意図していない。
本出願に引用された全ての参考文献の全文は、本出願に組み込まれる。
以下の図面および実施例は、本発明をそれらに限定することなく、本発明の説明および図解に用いられる。
〔図面〕
図1から図5において示されている実験において、Photinus属pyralis種のルシフェラーゼをコードするmRNA(図4の100μlのPBSにおけるpDNA)を含んでいる、それぞれの場合に示されている100μlの緩衝液(緩衝液の組成は、下記の(材料)の1.注入緩衝液の項に与えられている)が、BALB/cマウス13の耳介の中に皮内的に注入された。完全なマウスの耳のルシフェラーゼ活性が測定された。上記ルシフェラーゼ活性は、100万分子のルシフェラーゼを単位として表されている。ルシフェラーゼ活性の検出限界は、この図表において、数値が振られた太線によって示されている。この図表の点のそれぞれは、単一の耳のルシフェラーゼの発現を示している。図に与えられている短い棒は、種々の群の平均値を表している。(マンホイットニー検定にしたがって)上記平均値同士の間に有為に差がある群に対してp値が与えられている。図1、2および5の実験において、上記耳は、注入後15時間において取り出された。示されているこのデータは、各群に対して少なくとも3回の独立した実験から得た結果である。
図1は、mRNA用の異なる注入緩衝液:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と、HEPES緩衝生理食塩水(HBS)と、乳酸塩を含むRL注入緩衝液(RL)と、の比較を示している。lacZ mRNAは、陰性対照として用いられている。乳酸塩を含むRL注入緩衝液に希釈されたmRNAは、HBSまたはPBSに希釈されたmRNAよりも有為に高い(p<0.001)ルシフェラーゼの発現が生じることが、本発明にしたがって示されている(図1A)。
図2は、上記mRNAの取り込み効率に対する、(カルシウムまたはカリウムの有無、および乳酸塩の有無の)上記RL注入緩衝液におけるカルシウム(‐CaCl)、カリウム(‐KCl)またはナトリウム乳酸塩(‐NaLa)の非存在の影響を示している。(カルシウムの有無の)RL注入緩衝液、または乳酸塩を含むRL注入緩衝液との比較として、PBSとHBSとの間の主な違いは、(HBSまたはPBSにおける)乳酸塩およびカルシウムの非存在である。したがって、ルシフェラーゼをコードしているmRNAの移入および翻訳が、一方において完全なRL注入緩衝液(乳酸塩を含むRL注入緩衝液)と、他方において、カルシウムのないまたはカリウムのない、あるいは乳酸塩のない、RL注入緩衝液の製剤形態とを用いて比較されるという研究が行われた。これらの研究は、乳酸塩の非存在が、完全なRL注入緩衝液(乳酸塩を含むRL注入緩衝液)を用いたルシフェラーゼの発現と同等の、ルシフェラーゼの発現を生じるということを示した。対照的に、RL注入緩衝液または乳酸塩を含むRL注入緩衝液におけるカルシウムの非存在は、PBSおよびHBSのRNAの移入効率と同等の水準に対して、RNAの移入効率を有為に(p=0.004)低下させた。
図3および4は、インビボにおけるmRNAの翻訳の動態を直接に示している。本発明に係る乳酸塩を含むRLにおけるRNA、およびPBSの標準的な緩衝液におけるDNAを用いた並行的な動態実験が行われ、かつ比較された。注入から10日間後における、(乳酸塩を含むRL注入緩衝液における)mRNAの翻訳(図3)または(PBSにおける)pDNA(図4)が記録され、かつ図表に示されている。両方の試験手法(RNAまたはDNA)において、生きているマウスにおけるルシフェラーゼの活性が、記録された。代表的な耳の結果が示されている。乳酸塩を含むRL注入緩衝液における(ルシフェラーゼをコードしている)mRNAの注入後に検出されたルシフェラーゼの発現は、非常に早く(17時間)最大値に達し、かつ9日後には検出不可能であった(図3)。これに対して、PBSにおける(ルシフェラーゼをコードしている)pDNAの注入は、注入から3日後に最大値に達し、かつ9日間以上も残っているという、より遅いタンパク質の発現を生じた(図4)。これらは、本発明に係る乳酸塩を含むRL注入緩衝液の効率性をふたたび確かめるだけでなく、RNAが、宿主の、特に動物の器官において一過性の遺伝子発現用の手段として、DNAよりもはるかに適しているという結果である。RNAは、一方においてより速やかに、かつ他方において一過性に発現される。つまり、これは、所望の遺伝子が、より速やかに、かつ限られた時間の間に、したがってより標的にされ、かつ特種化された方法によって、標的にされることを可能にする。これらの研究によれば、増大され、成功するRNAの移入および移入に続く効率的な翻訳の両方を明確に示すことができる。
図5は、ルシフェラーゼ発現に対するmRNAの異なる量の効果を示している。これらの実験は、乳酸塩を含むRL注入緩衝液において移入されるRNAの用量を、特に臨床応用のために、量および持続時間について、より厳密に決定するために特に実施された。増量したRNAが、複数のマウスに注入された。mRNAの量を(100μlの注入量における)5μgまで増加させたとき、ルシフェラーゼの発現における増加が検出された。5μg以上の投与量によって、ルシフェラーゼ発現のさらなる向上は生じなかった。対応するヒトにおける実験(図示せず)において、120μgの量のmRNAが使用された。mRNAの量は、200μgまで増やされ、発現が向上された。マウスにおける5μgと比べて、ヒトにおけるmRNAの200μgという量は、特に、ヒトにおいて約40倍大きい注入部位の大きさによるものであり得る。ヒトの実験は、研究の背景および予想される結果を説明し、同意が得られた後に、健康なボランティアに対して行われた。
時間の経過と上記投与量について、mRNAの翻訳は、一過性に起こり(図3に示すように、mRNAの翻訳は、12時間後に最大値に達し、かつ9日後には検出されない)、結果として制御されている。このため、外来分子(タンパク質)の一様な翻訳を持続するには、(上記外来分子またはmRNAが注入される器官に依存して)およそ毎日、2日ごとにまたは3日ごとにおける繰り返しの注入が適当である。
図6は、ルシフェラーゼ活性に対するCaClの影響を示している。このために、CaClのルシフェラーゼ溶解緩衝液溶液(最終濃度は、図面に与えられている)の連続希釈法が準備され、かつ同じく規定量の組換えルシフェラーゼタンパク質を試料のすべてに対して添加した(最終濃度は、約4.7pM)。この混合物の光の放射は、(ATPおよびルシフェリンの添加の後に)照度計を用いて試験された。それから、ルシフェラーゼ活性に対するCaCl濃度の影響は、以下の式:
%相対的なルシフェラーゼ活性(RLA)=(規定のCaCl濃度を有する試料のRLA−単なる溶解緩衝液のRLA)/(CaClを有していない試料のRLA−単なる溶解緩衝液のRLA)×100%
にしたがって、計算された。比較的に高濃度のCa2+イオンの存在は、ルシフェラーゼの酵素活性を増強することはなかった。
図7は、インビボにおけるmRNAの移入に対するCaClの影響をふたたび示している。種々の濃度を有する、乳酸塩を含むRL注入緩衝液が、同じ量の、Photinus属pyralis種のルシフェラーゼをコードするmRNA(20μg)を有しているが、異なる浸透圧(オスモル)を有しているRNA注入溶液(100μl)を準備するために使用された。上記RNA注入溶液は、BABL/cマウスの耳介に注入された。15時間後に、上記マウスは犠牲にされ、かつ耳の溶解物が調整された。耳ごとに産生されたルシフェラーゼ分子の計算された総量、種々の群の平均値(数字つきの棒)、各群の大きさ(n)および上記試験における検出限界(数字つきの太線)が、示されている。上記試験の結果として、インビボにおけるmRNAの、効率的な移入、およびゆえに続く効率的な翻訳は、170mOsmの最小のイオン濃度を要求することがわかった。
図8A〜Eは、インビボにおける供給されたmRNAを発現する細胞の特徴づけを示している。乳酸塩を含むRL注入緩衝液100μlを含むRNA注入溶液の総量に希釈された、大腸菌β‐ガラクトシダーゼをコードする20μgのmRNAが注入された。注入から14時間後に、マウスは犠牲にされ、マウスの耳が取り外され、かつ横断する凍結切片が調製された。図8Aおよび8C〜Eに示された上記切片は、色によって特徴付けられている。
さらに、(乳酸塩を含むまたはなしの)RL注入緩衝液におけるRNAの導かれた遺伝子発現が示されている。このために、(乳酸塩を含むまたはなしの)RL注入緩衝液において、移入された外因性のRNAを取り込み、かつ翻訳するのがどの型の細胞であるのかが、明確にされた(実施例5、図8A〜E、ならびに同じように図11、12、16および17を参照すればよい)。これにしたがって、本発明に係るmRNAに基づく種痘の範囲内において、免疫応答が、免疫系の明確な標的細胞において、(乳酸塩入りまたは無しの)RL注入緩衝液における外因性のRNAの翻訳によって、どのように誘導されるのかが解析された。
図8Aに示されている実験において、5つの個々の切片のそれぞれが、X‐galを含んでいる溶液を用いて染色された。連続した20μmの厚さの凍結切片において、10個以下のβ‐ガラクトシダーゼ陽性細胞が検出された。(矢印によって示されている)β‐ガラクトシダーゼ陽性細胞と呼んでいる発現の領域は、上記耳の長軸方向および矢状方向に1から2mmの範囲に及び、耳筋の上皮と軟骨との間の狭い層に局在化されていた。
本発明によれば、APCが、移入された上記RNAの直接的な取り込みおよび自己翻訳、あるいは他の細胞によって移入されたRNAの翻訳産物の取り込みによる外因性の抗原を検出(“交差提示”と呼ばれる)する場所について、さらに調べられた。上記細胞の局在、上記細胞の形状および上記細胞のMHCクラスII表現系が原因となって、上記注入部位において外因性のむき出しのmRNAを取り込み、かつ発現する細胞は、主に筋細胞および/または線維芽細胞であるということが推測された(図8A)。この結果は、他の細胞によって移入された抗原の上述の“交差提示”と一致している。このような手法が、同様に、核酸ワクチンによってコードされたタンパク質に対する抗体の形成を説明することができるであろう。本発明によれば、このようにして、移入された上記RNAおよび上記APCを取り込み、かつ発現する筋細胞または真皮細胞において、いわゆる“交差初回免疫”を介して結果的に起こる免疫応答の引き金が、これらの細胞によって活性化されるということの確認が、1度において可能になる。
図8Bにおける棒グラフは、連続する切片におけるβ‐ガラクトシダーゼ陽性細胞の数を示している。棒のそれぞれは、1つの切片を表している。
図8C〜8Eの実験において、5つの個々の切片のそれぞれが、より詳細には、MHCクラスII発現(Alexa546免疫蛍光染色によって検出された緑)およびβ‐ガラクトシダーゼ発現(マジェンタガル染色によって検出されたすみれ色)が、染色された。左手の縦列における画像は、β‐ガラクトシダーゼ陽性細胞をすみれ色=(深く)暗い領域に染色する、単独のマジェンタガル染色を示している。中央および右手の縦列において、マジェンタガル染色(中央および右手の縦列において所定の領域によって示されている)と単独のMHCクラスII染色(オレンジ=中央の縦列における明るい領域)(緑=右手の縦列における明るい領域)との重ね合わせ。見れば分かるように、ほとんどのβ‐ガラクトシダーゼ陽性細胞は、MHCクラスII陰性細胞であることが、はっきりと現れている。
図9A〜Bは、マウスおよびヒトにおけるむき出しのmRNAのインビボにおける移入を示している。ルシフェラーゼをコードしているmRNAが、調整され、かつRL注入緩衝液を含んでいるRL注入溶液に溶解された。検出限界は、この図において数字つきの太線によって示されている。
図9Aに示されている実験において、20μgのmRNAを含んでいる100μlの総量が、マウスの上記耳筋に注入された。注入から14時間後に、マウスは犠牲にされ、その耳の細胞が溶解され、かつその溶解物は、ルシフェラーゼ発現について調べられた。耳ごとのルシフェラーゼ分子の数が計算された(組換えルシフェラーゼが基準として用いられた)。このデータは、各群に対して、少なくとも3回の独立した実験によってもたらされている。
図9Bに示されている実験において、200μlの総量における同じRNA(120μg)が、ヒトの皮膚(ボランティアの足)に注入された。16時間後に、2mmの直径を有する生検材料が、局部麻酔条件下において、つまり、上記注入部位の中央(“RNA”)から、および上記注入部位から離れて(“模擬”)取り出さ(打ち抜か)れた。ルシフェラーゼ活性は、上記注入部位の真ん中においてのみ、検出されてもよい。2つの独立した実験の内の1つが示されている。これらの結果によれば、インビボにおいて、ヒトの皮膚中に対するむき出しのmRNAの直接的な移入が、明らかにされた。したがって、本発明は、ヒトにおいて、mRNAに基づく直接の種痘を効率的に行うことが可能である。
図10A〜Dは、乳酸塩を含むRL注入緩衝液における注入された上記mRNAの組み込みおよび移入能を示している。上記組み込みが、フォルムアルデヒドアガロースゲル(1.2%体積あたりの重量)電気泳動を用いて、試験された。このために、Photinus属pyralis種のルシフェラーゼ(luc、1.9kB、図9)または大腸菌β‐ガラクトシダーゼ(lacZ、3.5kB、図10C)のいずれかをコードする1μgのmRNAが分離された。注入緩衝液(ストック溶液)のそれぞれへの希釈前、および注入緩衝液(ストック溶液)のそれぞれへの希釈後における(注入前の)mRNAの組み込みにおいて、差は検出されなかった。これに対して、RNA注入溶液の残余物が、注入シリンジから回収されたとき、(注入後の)上記mRNAの可視的な完全な分解が、検出された。これらの残余物は、上記注入シリンジのマウスまたはヒトとの接触によって、リボヌクレアーゼによって明らかに汚染されている。
注入された上記mRNAの移入能は、10μgのmRNAを用いたBHK21細胞による電気穿孔法によって試験された。10μgの無関係なmRNAまたはmRNAがない(模擬)のいずれかを対照として用いられている。続いて、上記細胞は、溶解され、かつ照度計を用いて上記細胞のルシフェラーゼ活性が調べられた(図10B)、またはX‐galを用いて染色され、かつ光学顕微鏡を用いて上記細胞のルシフェラーゼ活性が調べられた(図10D)。
図11は、細胞レベルにおけるmRNA移入の同定を示している。上記図面は、マウスを観察したものを示している。上記図面において、外側(背側)は、観察者にとって直接に見えている。乳酸塩を含むRL注入緩衝液におけるmRNAは、マウスの上記耳筋に注入された。上記耳の連続する横断切片(1,2,3,4)が、用意された。上記切片は、種々の組(1,2,3,4)が集められ、風乾され、かつ種々の染色操作まで−20℃に保存された。
図12A〜Cは、細胞レベルにおけるmRNAの移入を示している。乳酸塩を含むRL注入緩衝液における、大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼをコードしている5μgのmRNAが、マウスの耳に注入された。注入から15時間後に、上記耳がTissueTekのO.C.T培地に埋め込まれて、60μmの厚さの凍結切片が調製された。上記切片は、X‐galを用いて夜通し染色された。図12Aは、mRNA移入陰性の耳の凍結切片を示している。図12Bは、全体図を示している。図12Cは、mRNA移入陽性の耳の詳細な観察を示している。
図13は、Alexa Fluor 546のマジェンタガル陽性細胞の色との両立性を示している。マジェンタガル陽性細胞におけるAlexa Fluor 546の検出が陽性であるか否かを決定するために、BHK細胞が、eGFP(enhanced green flourescence protein)のmRNAまたはlacZのmRNAの組み合わせを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクト細胞は、以下の組み合わせ:
eGFPのmRNAまたはlacZのmRNAのみを用いた単独トランスフェクション;
個々にトランスフェクトされた細胞(eGFP/lacZ)の混合物;および
2重にトランスフェクトされた細胞(eGFP+lacZ)
が解析された。
上記細胞は、Alexa Fluor 546検出を有する抗eGFPを用いて染色され、つづいて、マジェンタガルを用いて染色された。(lacZを発現している)陽性細胞を染色したマジェンタガルは、広視野の光学顕微鏡によって検出され(上列)、(eGFPを発現している)陽性砂防を染色したAlexa Fluor 546は、蛍光顕微鏡によって検出された(中列)。この2つの結果が、他方の細胞と比較した細胞の局在について正確な結果を得るために、重ね合わせられた(下列)が、上記図面におけるAlexa 546のシグナルは、上記光学顕微鏡の画像を覆っている。上記APCに供給されたmRNAの取り込み、および自己移入が、起こり、かつ免疫応答を引き起こすために十分であることは、除外し得ない。いくつかのAPCにおいて、微かなまたは不完全な、検出不可能な移入が、起こっているかも知れず、かつ(不完全な移入の場合に)外因性の抗原のプロセシングおよび提示をもたらしているかもしれない。
図14A〜Bは、凍結切片のMHCクラスII染色の特異性を示している。乳酸塩を含むRL注入緩衝液の総量100μlにおける、大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼをコードする20μgのmRNAが、注入された。注入から14時間後に、上記マウスは、犠牲にされ、かつその耳が取り除かれた。横断する凍結切片が調製された。上記凍結切片が、まず、抗MHCクラスII抗体(図14A)、またはアイソタイプの対照抗体(図14B)を用いて染色され、Alexa 546を用いて免疫蛍光染色によって検出された。それから、上記凍結切片は、(β‐ガラクトシダーゼ発現について)マジェンタガルを用いて染色された。上記図は、マジェンタガル染色(左手縦列)、MHCクラスII(中の縦列、lacZ陽性細胞の位置が、輪郭によって示されている)および両方の染色の重ね合わせ(右手縦列、上記図において、lacZ陽性細胞が輪郭によって示され、MHCクラスII陽性細胞が明るい領域に相当する)。
図15は、X‐gal色素およびACE色素に陽性である細胞の両立性を示している。X‐galの沈降物が、AEC陽性細胞の検出と両立可能か否かを決定するために、BHK細胞が、eGFPのmRNAおよびlacZのmRNAを用いてコトランスフェクトされた。上記細胞が、ACE(赤:eGFPを発現している陽性細胞)、X‐gal溶液(青緑:lacZを発現している陽性細胞)、およびACEとX‐galとの組み合わせとともに、抗eGFP抗体免疫染色を用いて染色された。染色された上記細胞が、広視野の光学顕微鏡によって解析された。2重陽性細胞は、黒(黒矢印)を呈している。個々の染色が強く、それゆえ黒を呈する傾向にあるとき、染色された個々の陽性の細胞を区別することが困難である。
図16A〜Bは、MHCクラスII陽性およびmRNA移入陽性の細胞の共局在を示している。乳酸塩を含むRL注入緩衝液の総量100μlにおけるβ‐ガラクトシダーゼをコードする20μgのmRNAが注入された。注入から14時間後に、上記マウスが犠牲にされ、かつその耳が取り除かれた。横断する凍結切片が調製され、かつ、まず、抗MHCクラスII抗体(図16A+B)またはこれに対応する対照抗体(図16C)を用いて染色され(Alexa 546を用いて検出された)、それから、(β‐ガラクトシダーゼ発現について)X‐galを用いて染色された。mRNAの移入について陽性である細胞は青緑を呈し、MHCクラスIIについて陽性である細胞は赤を呈し、かつ2重に陽性の細胞は黒を呈する。mRNA陽性細胞は、MHCクラスIIの発現とは独立して、矢印によって示されている。
図17は、mRNAの移入および耳筋の形態を示している。乳酸塩を含むRL注入緩衝液の総量100μlにおける、β‐ガラクトシダーゼをコードする20μgのmRNAが注入された。注入から14時間に、上記マウスが犠牲にされ、かつその耳が取り除かれた。横断する凍結切片が調製され、かつ、まず、(β‐ガラクトシダーゼ発現について)X‐galを用いて染色され、それから、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色された。mRNAの移入について陽性である細胞は、矢印によって示され、柔細胞層の近くに局在化された。
〔実施例〕
‐材料‐
<1.注入緩衝液>
以下の緩衝液を用いた:
2×リン酸緩衝液(PBS)
(PBS=274mMの塩化ナトリウム、5.4mMの塩化カリウム、20mMのリン酸水素2ナトリウム、4mMのリン酸2水素カリウム、20.8℃においてpH7.3)
2×HEPES緩衝液(HBS)
(HBS=300mMの塩化ナトリウム、20mMのHepes、20.8℃においてpH7.3)
1×乳酸塩を含まないRL注入緩衝液
(他の組成および濃度が示されていなかった場合、82.2mMの塩化ナトリウム、4.3mMの塩化カリウム、1.44mMの塩化カルシウム)
1×乳酸塩を含むRL注入緩衝液
(他の組成および濃度が示されていなかった場合、102.7mMの塩化ナトリウム、5.4mMの塩化カリウム、1.8mMの塩化カルシウム、20mMの乳酸ナトリウム)
1×乳酸塩を含み、塩化ナトリウムを含まないRL注入緩衝液
(他の組成および濃度が示されていなかった場合、4.3mMの塩化カリウム、1.44mMの塩化カルシウム、22.4mMの乳酸ナトリウム)
1×乳酸塩を含み、塩化カリウムを含まないRL注入緩衝液
(他の組成および濃度が示されていなかった場合、82.2mMの塩化ナトリウム、1.44mMの塩化カルシウム、22.4mMの乳酸ナトリウム)
1×乳酸塩を含み、塩化カルシウムを含まないRL注入緩衝液
(他の組成および濃度が示されていなかった場合、82.2mMの塩化ナトリウム、4.3mMの塩化カリウム、22.4mMの乳酸ナトリウム)。
2×PBS、および、2×HBSを用いたとき、全ての成分を水に溶かして、pHを調節した。それからジエチルピロカルボネートを(DEPC、シグマ、シュネルドルフ、ドイツ)、濃度が0.1%(v/v)になるように添加した。緩衝液を37℃で1時間以上インキュベートして、それから緩衝液をオートクレーブした。
1×乳酸塩を含むRL注入緩衝液を、それ自身、4つの異なる塩(塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および、乳酸ナトリウム)の20×保存液(ストック溶液)から調製した。同様に、1×注入緩衝液を、3つの異なる塩(塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウム)の20×保存液から調製した。さらに別の実施例では、塩化ナトリウム、塩化カリウム、または、塩化カルシウムを、より低くなった浸透圧を補整することなく、除いた。乳酸塩を含み、NaCl、KCl、またはCaClを含まないこれらのRL注入緩衝液も、20×保存液から調製した。乳酸ナトリウムのラセミ化合物溶液(フルカ(Fluka)、シュネルドルフ、ドイツ)を除く、これらの各成分を、2×PBSおよび2×HBSについて記載されているように、DEPCを用いて処理してから、オートクレーブした。
全ての緩衝液および緩衝液の成分のリボヌクレアーゼ活性を、1μgのmRNAを1×緩衝液において37℃で2時間以上インキュベートすることによって検査した。ホルムアルデヒド‐アガロースゲル電気泳動によるmRNAの分析において、分解が観察されなかった緩衝液を用いた。
<2.マウス>
全ての動物実験を、制度的指針および大綱的指針にしたがって実施した。8〜15週齢の雌のBALB/cマウスを、チャールス・リバー(スルズフェルド、ドイツ)から入手した。
皮内に注入する前に、マウスを麻酔して、イソプロパノールを用いて耳の筋肉を処理した。mRNAの取り込みと翻訳とを分析するために、特定期間の後、マウスを犠牲にして、耳を切除した。それから、煩わしい毛を除去するためにこの耳をカミソリの刃を用いて剃った。
<3.ヒト>
健康な男性の志願者を用いて人体実験を実施した。この志願者は、この調査の背景および起こりうる結果の説明を受け、同意した。
〔実施例1:核酸の調製〕
‐mRNA‐
「キャップされた」mRNAを、インビトロでのT7RNAポリメラーゼ(T7‐オプチmRNAキット(T7-Opti mRNA kits) 、キュアバック(CureVac) 、テュービンゲン、ドイツ)を用いた「ラン‐オフ」転写により調製した。
このmRNA(受入番号(Acc.)U02445からクローン化された大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼ(lacZ)、または、受入番号U47295からクローン化されたホタル(Photinus pyralis) のルシフェラーゼ(luc)のどちらか)のコード配列を、その3’末端においてアルファ‐グロブリンの非翻訳領域および人工ポリA末端部に隣接させた。マウスの実験では、上記mRNAをフェノール/クロロホルム/イソアミル・アルコールを用いて抽出して、塩化リチウムを用いて沈殿した。それから、mRNAを水に再懸濁して、260nmにおける分光分析によって収率を測定した。最後に、酢酸アンモニウムを用いてmRNAを沈殿して、水に滅菌状態で再懸濁した。
‐pDNA‐
エンドトキシンフリーのpCMV‐lucDNAを、エンドフリー・プラスミド・マキシ・キット(EndFree Plasmid Maxi Kit(キアゲン、ヒルデン、ドイツ))を用いて調製した。酢酸アンモニウムを用いてpDNAを沈殿して、最終的に、水に滅菌状態で再懸濁した。pGL3(受入番号U47295)のXbaI‐HindIII断片を、pCMV‐HB‐S(受入番号A44171)のNsiI‐HindIIIより消化されたプラスミドに挿入することによって、pCMV‐lucプラスミドを改変した。なお、上記XbaIおよびNsiIの部位は、クレノー断片を用いて平滑末端化されていた。pDNAのレポーター遺伝子は、CMVプロモーターの制御下であった。
‐保存溶液‐
保存溶液を、滅菌水においてmRNAまたはDNAを希釈することによって調製した。そして、260nm、280nm、および、320nmにおける分光分析によって濃度と純度とを測定した。
‐品質管理‐
全ての核酸試料では、分光分析によって濃度を測定し、ホルムアルデヒド‐アガロース電気泳動によりmRNAの品位を、または、制限消化およびTBE‐アガロース電気泳動によりDNAの品位を検査した(図10)。品位に加えて、全ての核酸試料の翻訳能力をBHK21細胞の電気穿孔法により分析した。このために、10μgの核酸を含む200μlのPBSが入った0.4cmのキュベットにおいて、300Vおよび150μFで、100〜300万個の細胞を電気穿孔した。トランスフェクトされた細胞における、電気穿孔後の8〜24時間のタンパク質発現を、適切な検出方法(X‐gal染色または発光の検出)によって解析した(図10)。インビボでの実験では、BHK21細胞においてタンパク質発現を示し、且つ、ゲル電気泳動において品位が適切である核酸試料だけが、注入された。
〔実施例2:RNA注入溶液の調製〕
HBSおよびPBSでは、mRNAを1×濃縮緩衝液に希釈した。乳酸塩を含有するか、または、含有しないRL注入緩衝液、および、乳酸塩を含有するRL注入緩衝液の(Ca2+、K、およびNaの1つが欠乏している)各変形物では、mRNAを0.8×濃縮緩衝液に希釈した。なお、これらのRL注入緩衝液の組成および濃度は、‐材料‐の<1.注入緩衝液>を参照のこと。別の方法が示されない限り、マウスの耳1つ当たりに、20μgのmRNAを含む100μlの注入緩衝液を用いた。mRNAの2次構造を取り除くために、RNA注入溶液を5分間80℃で加熱した。それから、このRNA注入溶液をさらに5分間氷上に置いた。最後に、RNA注入溶液をSub‐Q(ベクトン・ディッキンソン、ハイデルブルグ、ドイツ)注射器の中に吸引した。別々の注射器を、各注入に用いた。プラスミドDNA(pDNA)を1×濃縮PBSに希釈した。
〔実施例3:エキソビボでのルシフェラーゼ活性の検出〕
エキソビボでのルシフェラーゼ活性を検出するために、組織の溶解物を調製した。このために、乳棒と乳鉢とを用いて液体窒素下において組織を粉砕して、残存する「塊」を800μlの溶解緩衝液中において均一化した。上記溶解緩衝液の組成は、25mMのTris HCl、2mMのEDTA、10%(w/v)のグリセリン、1%(w/v)のTritonX‐100、ならびに、添加されたての2mMのDTTおよび1mMのPMSFである。小型遠心分離機にて4℃で10分間、13000rpmで遠心することによって、ホモジュネートの上清を得た。この溶解物の110μlのアリコートを−80℃で保存した。
ルシフェラーゼ活性を測定するために、アリコートを氷上にて解凍して、50μlの溶解物における光の放射を、ルミノメーター(LB9507、ベルトールド、バート・ヴィルトバート、ドイツ)を用いて15秒間測定した。測定の前に、ルミノメーターによって、300μlの緩衝液Aおよび100μlの緩衝液Bが溶解物に自動的に添加された。上記緩衝液Aの組成は、25mMのグリシル・グリシン、15mMの硫酸マグネシウム、ならびに、添加されたての5mMのATPであり、pHは7.8である。上記緩衝液Bの組成は、水に溶けた250μMのルシフェリンである。
全ての測定において組み換えルシフェラーゼタンパク質の段階希釈を用いて、標準化を行った(QuantiLum (登録商標)、プロメガ、マディソン、米国)。この標準を用いて、ルシフェラーゼ分子の量を個々の測定について計算した。各溶解物に関するルシフェラーゼ活性を2つの異なる日に2回測定して、ルシフェラーゼ活性の平均値を計算した。ルシフェラーゼ分子の量に関する変動係数(n=4)は、検出限界を超えるルシフェラーゼ活性を有する全ての溶解物において10%を下回った。この検出限界(全ての図に番号付きの太線で示される)を、溶解緩衝液のみ測定の平均値と当該平均値の標準偏差の3倍の値とを加えた値を用いて計算した(n=80)。
〔実施例4:インビボでの生物発光の検出〕
生きている動物におけるルシフェラーゼの注入物を検出するため、核酸注入後に特定の時間においてマウスを麻酔した。マウスを3つの異なる群に分割した。マウスの群Iでは、100μlのRL注入溶液を左耳に注入して、ルシフェラーゼをコードするmRNAを20μg含む100μlのRL注入緩衝液を左耳に注入した。群IIでは、ルシフェラーゼをコードするmRNAを20μg含む100μlのRL注入緩衝液を左耳および右耳のそれぞれに注入した。マウスの群IIIでは、100μlのRL注入緩衝液を右耳に注入して、ルシフェラーゼをコードするmRNAを20μg含む100μlのRL注入緩衝液を左耳に注入した。それから、フィルター滅菌された20mg/mlのルシフェリン(シンケム(Synchem) 、カッセル、ドイツ)のPBS(フィルター滅菌済み)を200μl、マウスの腹腔内に注入した。ルシフェリンの注入から5分後に、マウスの光の放出を20分間集めた。このために、マウスを暗い箱の中の予め37℃に加熱されたプレートに配置した。なお、左側が群Iであり、中央が群IIであり、右側が群IIIである。上記箱には、エクオリア・マクロイメージングカメラ(浜松、日本)が備えられていた。光の放出は擬似カラーイメージにて示され、このイメージに普通の光の下でのマウスのグレースケールイメージが重ね合わされた。ルシフェラーゼをコードするmRNAを20μg含有する、(i)乳酸塩を含むRL注入緩衝液、または、(ii)乳酸塩を含み、塩化ナトリウムを含まないRL注入緩衝液、(iii)乳酸塩を含み、塩化カリウムを含まないRL緩衝液、および、(iv)乳酸塩を含み、塩化カルシウムを含まないRL緩衝液、を用いて同じ実験を同じように行った。
〔実施例5:β‐ガラクトシダーゼの活性、および、組織の微細構造〕
毛が剃られたマウスの耳を切り裂き、ティッシュ‐テック(Tissue-Tek(登録商標))O.C.T(登録商標)コンパウンド(サクラ社(Sakura)、ズーテルヴァウデ(Zoeterwuode) 、オランダ)を含む溶媒に包埋して、−80℃で保存した。これらのブロックに由来する、20の厚さ20μmの横断面の連続凍結切片を、スパーフロストプラス標本保持器(SperFrost (登録商標)plus specimen holder、ランゲンブリンク(Langenbrinck)、エメンディンゲン、ドイツ)に、1組のうちの2つの切片間の垂直距離が約100μmになるように5組配置した。それから、上記切片を空気乾燥して、染色するまで−20℃で保存した。移送されたmRNA(大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼ)が取り込まれて、翻訳される領域を1次スクリーニングするために、X‐galと一緒に1組の切片を染色した。このために、上記標本保持器を室温に曝して、ImmEdge(登録商標)ペン(ベクター(Vektor)、バーリンゲーム、米国)を用いて輪郭を描いた。それから2%ホルマリンを含むPBSに15分間浸すことにより、切片を固定した。PBS中に標本保持器を2分間浸すことを3回繰り返して、標本保持器を洗浄した。その後、湿度室において、一晩37℃で、X‐gal染色溶液とインキュベートすることにより染色した。ここで、X‐gal染色溶液の組成は、添加されたての1mg/mlのX‐gal、5mMのフェリシアン化カリウム、5mMのフェロシアン化カリウム、1mMの塩化マグネシウム、15mMの塩化ナトリウム、60mMのリン酸1水素2ナトリウム、および、40mMのリン酸2水素ナトリウムである。上記標本保持器の2分間の洗浄を2回行い、ハイドロ‐マトリックス(Hydro-Matrix(登録商標)、マイクロ‐テック‐ラボ(Micro-Tech-Lab)、グラーツ、オーストリア、水で2倍に希釈)溶媒を用いて上記標本保持器を処理することによって、染色を終了させた。
組織形態の情報を得るために、X‐gal染色とヘマトキシリン‐エオシン染色とを組み合わせて、もう1つ別の組の切片を染色した。このために、X‐gal染色の後に、PBS中に切片を2分間浸すことを3回繰り返して、切片を洗浄した。さらに再蒸留水により5分間洗浄した。それからマイヤーズ・ヘイマラウム(Mayers haemalaum、メルク、ダルムシュタット、ドイツ)中に2秒間浸して、染色した。流水の水道水により10分間染色を発達させた後に、0.1%のエオシンY(シグマ、シュネルドルフ、ドイツ)を含有する水に10分間浸して、対染色を行った。再蒸留水により短時間洗浄することによって、染色を停止させた。その後、アルコール濃度を増加させて(80%エタノール2分間、95%エタノール2分間、100%エタノール2分間、100%キシレン5分間)脱水した。最終的に、ロチ‐ヒストキット(Roti(登録商標)-Histokitt、ロス(Roth)、カルルスルーエ、ドイツ)溶媒を用いて、乾燥した切片を処理した。
mRNAがトランスフェクトされた標的細胞が抗原提示細胞であるかどうかを決定するために、APCによって発現されるMHCのクラスIIの分子と、β‐ガラクトシダーゼの発現に関連するmRNAの移送との2重染色を行った。MHCのクラスIIの分子について、免疫組織化学的検出および免疫蛍光的検出の両方を行った。両方の検出のプロトコールにおいて、全3工程の間に、PBS中に組織を2分間浸すことを3回繰り返して、組織を洗浄した。免疫組織化学的手法では、1%のホルマリン(フルカ)を含むPBSに浸して、切片を固定した。それから、純粋なアセトン中で30秒間インキュベーションすることによって、脂質を除去した。その後、直ちに4%のヤギの血液(ベクターラボラトリー(Vektor laboratories Inc.)、バーリンゲーム、カリフォルニア州)および50μg/mlのアビジンD(ベクターラボラトリー、バーリンゲーム、カリフォルニア州)を含むPBSに室温で30分間浸すことにより、ブロッキングを行った。50μg/mlのビオチン(アプリケム(AppliChem) 、ダルムシュタット、ドイツ)に浸すことにより、残存するビオチン結合部位をブロックすると同時に、モノクローナル抗体2G9(ベクトン・ディッキンソン、ハイデルベルグ、ドイツ)に浸すか、または、適切なアイソタイプの対照抗体(ラットのIgG2a、R35‐95、ベクトン・ディッキンソン、ハイデルベルグ、ドイツ)に浸すことにより、MHCのクラスIIの分子の染色を行った。なお、各場合では、抗体を1μg/mlにPBSにより希釈した。その後、ビオチン化されたヤギ/抗ラットIgG(3μg/ml、ベクター(vector))および2%のマウス血清(CCPro 、ノイシュタット、ドイツ)を含むPBS中で、30分間室温で切片をインキュベートした。それから、ABC複合体(PBS中において、試薬Aと試薬Bとの比が1:100である。ベクターラボラトリー、バーリンゲーム、カリフォルニア州)を室温で30分間添加した。新しく調製したばかりの3‐アミノ‐9‐エチルカルバゾール(AEC、シグマ)基質溶液を用いて検出することによって、MHCのクラスIIの分子の染色を達成した。なお、AEC基質溶液の組成は、0.5mg/mlのAEC、0.015%の過酸化水素、50mMの酢酸ナトリムであり、pHは5.5である。また、上記AEC基質溶液は、0.45μmのフィルターを通してろ過された。その後、水に5分間浸すことを2回繰り返し、さらに、PBSに5分間浸すことを3回繰り返して、洗浄した。これらの洗浄により、基質反応を停止させた。それから、上述したようなX‐gal染色を行った。
同様の染色のプロトコールを用いて、免疫蛍光的検出を行った。アセトン工程の後に、ブロッキング緩衝液(1%のウシ血清アルブミンを含むPBS)中に室温で50分間切片を浸して、切片をブロックした。その後、ブロッキング緩衝液を用いて1μg/mlに希釈された1次抗体(2G9またはアイソタイプの対照抗体)に切片を浸して、40分間インキュベートした。それから、ブロッキング緩衝液を用いて希釈されたアレクサ・フルオロ・546ヤギ/抗ラットIgG(1:400、モルキュラー・プローブ(Molecular Probes)、ライデン、オランダ)に切片を浸して、室温で40分間インキュベートした。最終的に、マゼンタ‐gal染色を行った。このため、染色溶液中のX‐galを0.1mg/mlのマゼンタ‐gal(ペクラボ(Peqlab)、エアランゲン、ドイツ)に変更した。
アキシオカム(Axiocam) HRcカメラおよびアキシオビジョン(Axiovision)4.0ソフトウェアを備える、ツァィス(オーバーコッヘン、ドイツ)アキシオプラン(Zeiss Axioplan)2顕微鏡を用いて切片を分析した。写真の色およびコントラストを、直線的に調整した。
〔実施例6:ヒトにおけるRNAの移送および翻訳〕
健康な男性の志願者により、この実験が実施された。注入部位の毛を剃り、殺菌を行い、RnaseZap(アンビオン、オースチン、米国)溶液を用いて処理した。それから、120μgのmRNAを含む0.8×RL注入緩衝液を、1バッチにおいて全容積の200μlで、注入した。さらに同様のバッチにおいて、RL注入緩衝液に替わって、(i)乳酸塩を含み、塩化ナトリウムを含まないRL注入緩衝液、(ii)乳酸塩を含み、塩化カリウムを含まないRL注入緩衝液、および、(iii)乳酸塩を含み、塩化カルシウムを含まないRL注入緩衝液を用いた。
注入から15時間後、直径4mmの検査用生体組織を局所麻酔下において摘出(打ち抜いた)した。この検査用生体組織を液体窒素下においてショックフリーズして、実施例3のようにして調製した。磨り潰された検査用生体組織を、600μlの溶解緩衝液に再懸濁した。
‐統計的評価‐
2つの異なる群の平均値を、いわゆる「ノンパラメトリックなマンホイットニーの順位和検定」により比較した。0.05よりも小さいp値は、有意差としてみなされ、図に示されている。
〔実施例7:実施された様々な染色処理に対するコメント〕
細胞種に特異的な染色と、mRNAの移送の検出とを同時に可能にする組織学的な処理を用いて、インビボにおいてmRNAを取り込み、且つ、発現する細胞種を同定した。
mRNAの移送を、蛍光プローブを用いて検出することができなかったので、大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼをコードするmRNAが、様々な藍色の染料(X‐galまたはマゼンタ‐gal)と組み合わせて用いられる、処理が実施された。
‐1.β‐ガラクトシダーゼ検出システムの特殊機能‐
マウスの耳の薄い切片を調製して、全ての細胞が藍色染色処理において単一層に存在していることを確かめた。(i)マウスの耳の筋肉の形態(約0.5mm〜約1mmの厚みの薄層)、(ii)凍結切片のみを用いることができること(パラフィン切片の調製に必須であるいくつかの工程の間にβ‐ガラクトシダーゼは、加熱により不活性化される)、および、(iii)切片とできるだけ多くの高品質なサブ切片とが必要とされることに注意すると、これらの切片の調製は、非常に困難であることが判明した。それにもかかわらず、20μmの厚みを有する良質のいくつかの組の切片を、調製することができた。2つの異なる染料を用いてβ‐ガラクトシダーゼの活性を検出した。陽性細胞が青緑に染色されるX‐galの方が、陽性細胞が紫に染色されるマゼンタ‐galよりも良好なコントラストを示す結果になった。しかしながら、これと同時に、(例えば毛包によって引き起こされる)バックグラウンドの非特異的な染色が、X‐gal染色では非常に目立った。それでもなお、mRNAの移送の明確な区別が可能であった。マゼンタ‐gal染色では、バックグラウンドの非特異的な染色は、目立たなかった。
‐2.組み合わされた藍色染色および免疫染色における必要事項‐
mRNAの移送の染色(藍色染料)と細胞特異的なマーカーの染色(特異的抗体)の組み合わせは、固定剤および組み合わされた染色の手順(藍色染色は37℃で14時間のインキュベートを含む)に関するいくつかの適応を要求する。第1にアセトンを用いて固定を行い、その後抗体染色を行った場合に、MHCII分子に対する抗体染色の最良の結果が得られた。これに反して、第1にホルムアルデヒドとグルタルジアルデヒドとの混合物を用いて固定を行い、その後藍色染色を行った場合に、β‐ガラクトシダーゼの活性に対する最良の結果が得られた。これらの様々な事情を考慮して、次の処理を選択した。すなわち、グルタルジアルデヒドを用いずに、ホルムアルデヒドを用いて固定を行い、抗体染色を行った。グルタルアルデヒドにより組織の自己蛍光が劇的に増加するので、グルタルアルデヒドが、藍色染色の質に対して僅かな効果をもしも有しているときは、グルタルアルデヒドを除外する必要があった。次のいくつかの理由から、ホルムアルデヒドを用いる固定を用いた:
1.アセトンを用いた固定よりも、組織の形態がより良好に保護される、
2.メリハリがあり、且つ、強い藍色染色には、ホルムアルデヒドを用いる固定が要求される、そして、
3.それにもかからわらず、抗MHCII抗体の染色の質は、ホルムアルデヒドを用いても許容できる。
その後、純粋なアセトン中で短時間インキュベートすることにより、脂質および脂肪を除去した。これにより、水溶性の溶媒を用いて、(泡が少ないか、または、ない)良好な品質を実現することができる。最後に、抗体染色が第1に実施されたときに、良質の抗体染色が唯一達成される。ホルムアルデヒドを用いる固定の染色手順は、藍色染色の質に対して僅かな影響だけを有していた。
‐3.組み合わされた藍色染色および免疫染色における染料の適合性‐
2つの異なる染色の組み合わせには、2つのプロトコールの様々な工程の適合性だけでなく、検出に用いられるプローブの適合性も要求される。原理上は、免疫染色に沈殿性の染料(酵素プローブ)、または、蛍光染料(標識されたプローブ)を用いることが可能である。藍色染色と沈殿性の染料とを組み合わせるために、X‐galとAECとを用いた。そのような染色では、2重に陽性を示す細胞は、黒色にみえた(図15 8)。これでは、個々の陽性細胞を強度によって区別することは困難である。そのため、蛍光染料のアレクサ・フルオロ(Alexa Fluor) 546とマゼンタ‐galとの組み合わせが好ましい。次の2つの理由から、X‐galに替えてマゼンタ‐galを用いることが好ましい:
1.(染料が飽和量で添加されたときであっても)マゼンタ‐galの染色強度は非常に弱かった、
2.マゼンタ‐galの陽性細胞の色は、アレクサ・フルオロ546の蛍光染料の発光波長とより良好に調和した。
この2つの要因より、アレクサ・フルオロ546の蛍光シグナルの消光が、最小になる。この染料の組み合わせにより、少なくとも藍色染色があまりに強くなかったときに、両方のシグナルを実際に検出することができた(図13)。このことは、切片におけるmRNAの移送の陽性細胞に関する場合であった。
〔参考文献の一覧表〕
1.Ulmer J. B., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 2001, 4:192-197
2.J. A. Wolffら, Science 247, 1465-1468 (1990).
3.H. L. Robinson, L. A. Hunt, R. G. Webster, Vaccine 11, 957-960 (1993).
4.J. B. Ulmerら, Science 259, 1745-1749 (1993).
5.J. A. Wolffら, Science 247, 1465-1468 (1990).
6.D. Boczkowski, S. K. Nair, D. Snyder, E. Gilboa, J.Exp.Med 184, 465-472 (1996).
7.J. P. Carralotら, Cell Mol. Life Sci. (2004).
8.R. M. Conryら, Cancer Res. 55, 1397-1400 (1995).
9.R. D. Granstein, W. Ding, H. Ozawa, J Invest Dermatol 114, 632-636 (2000).
10.I. Hoerr, R. Obst, H. G. Rammensee, G. Jung, Eur. J Immunol. 30, 1-7 (2000).
11.J. Donnelly, K. Berry, J. B. Ulmer, Int J Parasitol. 33, 457-467 (2003).
12.D. M. Klinmanら, Springer Semin. lmmunopathol. 19, 245-256 (1997).
13.P. Forg, P. von Hoegen, W. Dalemans, V. Schirrmacher, Gene Ther. 5, 789-797 (1998).
mRNA用の異なる注入緩衝液:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と、HEPES緩衝生理食塩水(HBS)と、乳酸塩を含むRL注入緩衝液(RL)と、の比較を示している。 上記mRNAの取り込み効率に対する、(カルシウムまたはカリウムの有無、および乳酸塩の有無の)上記RL注入緩衝液におけるカルシウム(‐CaCl)、カリウム(‐KCl)またはナトリウム乳酸塩(‐NaLa)の非存在の影響を示している。 インビボにおけるmRNAの翻訳の動態を直接に示している。本発明に係る乳酸塩を含むRLにおけるRNA、およびPBSの標準的な緩衝液におけるDNAを用いた並行的な動態実験が行われ、かつ比較された。注入から10日間後における、(乳酸塩を含むRL注入緩衝液における)mRNAの翻訳が記録され、かつ図表に示されている。 インビボにおけるmRNAの翻訳の動態を直接に示している。本発明に係る乳酸塩を含むRLにおけるRNA、およびPBSの標準的な緩衝液におけるDNAを用いた並行的な動態実験が行われ、かつ比較された。注入から10日間後における、(PBSにおける)pDNAが記録され、かつ図表に示されている。 ルシフェラーゼ発現に対するmRNAの異なる量の効果を示している。 ルシフェラーゼ活性に対するCaClの影響を示している。 インビボにおけるmRNAの移入に対するCaClの影響をふたたび示している。 A〜Eは、インビボにおける供給されたmRNAを発現する細胞の特徴づけを示している。 マウスおよびヒトにおけるむき出しのmRNAのインビボにおける移入を示している。 マウスおよびヒトにおけるむき出しのmRNAのインビボにおける移入を示している。 A〜Dは、乳酸塩を含むRL注入緩衝液における注入された上記mRNAの組み込みおよび移入能を示している。 細胞レベルにおけるmRNA移入の同定を示している。 A〜Cは、細胞レベルにおけるmRNAの移入を示している。 Alexa Fluor 546のマジェンタガル陽性細胞の色との両立性を示している。 A〜Bは、凍結切片のMHCクラスII染色の特異性を示している。 X‐gal色素およびACE色素に陽性である細胞の両立性を示している。 A〜Bは、MHCクラスII陽性およびmRNA移入陽性の細胞の共局在を示している。 mRNAの移入および耳筋の形態を示している。

Claims (15)

  1. 宿主生物内のmRNA翻訳を増加させるために皮内投与または皮下投与されるRNA注入溶液を調製する際の、mRNA、及び水性溶液の利用であって、
    上記水性溶液は、60mMから500mMまでの塩化ナトリウム(NaCl)、0.01mMから80mMまでの塩化カルシウム(CaCl)、及び必要に応じて4mMから300mMまでの塩化カリウム(KCl)を含有する、利用。
  2. 請求項1に記載の利用であって、
    上記水性溶液は、15mMから200mMまでの乳酸塩を含有する、利用。
  3. 請求項1または2に記載の利用であって、
    上記水性溶液は、HEPES、Tris/HCl,Na(K) HPO /Na(K)HPO 等の緩衝系を含有しない、利用。
  4. 請求項1〜3の何れか1項に記載の利用であって、
    上記水性溶液は、単糖類、二糖類、または多糖類を含有しない、利用。
  5. 請求項1〜4の何れか1項に記載の利用であって、
    mRNAは、むき出しのmRNA、またはポリ陽イオンと複合体と成すmRNAである、利用。
  6. 請求項5に記載の利用であって、
    mRNAは、プロタミンと複合体を成す、利用。
  7. 請求項5または6に記載の利用であって、
    mRNAは、少なくとも1つの天然または非天然の改変を有する、利用。
  8. 請求項7に記載の利用であって、
    上記改変は、
    コードされるアミノ酸配列を変えずに、mRNAのコード領域のG/C含量を増加させること、
    少なくとも1つのリボヌクレオチドアナログを導入すること、
    WT配列における非安定化配列を除去すること、または、
    リボソーム結合部位の領域のA/U含量を増加させること、からなる群から選択される、利用。
  9. 請求項1〜8の何れか1項にて定義された、mRNA、及び水性溶液を含有する、宿主生物内のmRNA発現を増加させるための皮内投与または皮下投与されるRNA注入溶液。
  10. 請求項9に記載のRNA注入溶液であって、
    mRNAは、むき出しのmRNAである、RNA注入溶液。
  11. インビトロまたはエキソビボにおいて、細胞内におけるmRNAのmRNA翻訳を増加させる方法であって、上記方法は、次の工程、
    a.請求項9または10に記載のmRNA注入溶液を調製、及び
    b.工程a.のmRNA注入溶液の、細胞への投与、
    を含む、方法。
  12. 請求項11に記載の方法であって、
    上記細胞は、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、およびヒトからなる群より選ばれる哺乳類の細胞である、方法。
  13. 請求項12に記載の方法であって、
    上記哺乳類は、ヒトである、方法。
  14. 細胞のインビトロトランスフェクション方法であって、
    請求項9または10に記載の注入溶液が、必要に応じてエレクトロポレーションにより、細胞に投与される、方法。
  15. 請求項14に記載の方法であって、
    上記細胞が、実験細胞または患者の細胞である、方法。
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EP (3) EP3583953B1 (ja)
JP (1) JP5295760B2 (ja)
CN (1) CN101203245B (ja)
AU (1) AU2006249093B2 (ja)
DE (1) DE102005023170A1 (ja)
ES (1) ES2604538T5 (ja)
RU (1) RU2418593C2 (ja)
WO (1) WO2006122828A2 (ja)

Families Citing this family (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005023170A1 (de) 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimierte Formulierung für mRNA
LT2578685T (lt) 2005-08-23 2019-06-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rnr, apimančios modifikuotus nukleozidus ir jų panaudojimo būdai
AU2007280690C1 (en) 2006-07-31 2012-08-23 Curevac Gmbh Nucleic acid of formula (I): GIXmGn, or (II): CIXmCn, in particular as an immune-stimulating agent/adjuvant
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
WO2009046738A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating lung cancer, particularly of non-small lung cancers (nsclc)
WO2009046739A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
KR101545660B1 (ko) * 2008-07-18 2015-08-20 온코제넥스 테크놀로지즈 아이엔씨. 안티센스 제제
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
US20110053829A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
EP2548958B1 (en) * 2010-03-15 2017-11-22 Yamaguchi University Agent for improving gene transfer efficiency to mammalian cells
CA2801523C (en) 2010-07-30 2021-08-03 Curevac Gmbh Complexation of nucleic acids with disulfide-crosslinked cationic components for transfection and immunostimulation
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
CN101961343A (zh) * 2010-09-15 2011-02-02 河南辅仁怀庆堂制药有限公司 注射用核糖核酸及其生产方法
HUE058896T2 (hu) 2010-10-01 2022-09-28 Modernatx Inc N1-metil-pszeudo-uracilt tartalmazó ribonukleinsavak és azok felhasználásai
AU2011358150B2 (en) * 2010-12-16 2016-11-03 Sprna Gmbh Pharmaceutical composition consisting of RNA having alkali metal as counter ion and formulated with dications
WO2012089225A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of mhc class i restricted antigen presentation
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
CN102174513B (zh) * 2011-02-17 2013-09-18 杨俊海 一种哺乳动物核糖核酸小分子复合物及其应用
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RU2648950C2 (ru) 2011-10-03 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
KR102186497B1 (ko) 2012-03-27 2020-12-04 큐어백 아게 인공 핵산 분자
AU2013242404B2 (en) 2012-03-27 2018-08-30 CureVac SE Artificial nucleic acid molecules for improved protein or peptide expression
BR112014023898A2 (pt) 2012-03-27 2017-07-11 Curevac Gmbh moléculas de ácido nucleico artificiais compreendendo 5''utr top
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243951A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013151666A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9512456B2 (en) 2012-08-14 2016-12-06 Modernatx, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of RNA
EP2922554B1 (en) 2012-11-26 2022-02-23 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
US9974845B2 (en) 2013-02-22 2018-05-22 Curevac Ag Combination of vaccination and inhibition of the PD-1 pathway
EP3292873B1 (en) 2013-02-22 2019-05-01 CureVac AG Combination of vaccination and inhibition of the pd-1 pathway
US20160032316A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
JP6625521B2 (ja) 2013-05-15 2020-01-08 リボカイン,エルエルシー 環状rnaの細胞内翻訳
SG11201510746WA (en) 2013-08-21 2016-03-30 Curevac Ag Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
SG11201510747RA (en) 2013-08-21 2016-03-30 Curevac Ag Method for increasing expression of rna-encoded proteins
CA2915730A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Karl-Josef Kallen A combination rsv/influenza a vaccine
CN105517569A (zh) 2013-08-21 2016-04-20 库瑞瓦格股份公司 狂犬病疫苗
WO2015034928A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EA201690675A1 (ru) 2013-10-03 2016-08-31 Модерна Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности
CA2925021A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Curevac Ag Modified rna with decreased immunostimulatory properties
WO2015101416A1 (en) 2013-12-30 2015-07-09 Curevac Gmbh Methods for rna analysis
BR112016014462A2 (pt) 2013-12-30 2017-10-24 Curevac Ag moléculas de ácido nucleico artificiais
US11254951B2 (en) 2014-12-30 2022-02-22 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
CA2927254C (en) 2013-12-30 2023-10-24 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
ES2754239T3 (es) 2014-03-12 2020-04-16 Curevac Ag Combinación de vacunación y agonistas de OX40
CA2936286A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Curevac Ag Polymeric carrier cargo complex for use as an immunostimulating agent or as an adjuvant
PT3134131T (pt) 2014-04-23 2022-03-24 Modernatx Inc Vacinas de ácidos nucleicos
JP6748579B2 (ja) 2014-06-10 2020-09-02 キュアバック リアル エステート ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Rna生成を強化する方法及び手段
US10626400B2 (en) 2014-07-04 2020-04-21 Biontech Ag Stabilised formulations of RNA
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3169334B1 (en) * 2014-07-16 2021-04-28 Ethris GmbH Rna for use in the treatment of ligament or tendon lesions
WO2016068228A1 (ja) * 2014-10-29 2016-05-06 株式会社高研 薬剤徐放担体及び薬剤徐放方法
EP4241784A3 (en) 2014-12-12 2023-11-15 CureVac SE Artificial nucleic acid molecules for improved protein expression
BR112017014090A2 (ja) * 2014-12-29 2018-03-06 Bonac Corporation The constituent which contains a nucleic acid molecule stably
WO2016165825A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Curevac Ag Method for producing rna compositions
EP3283125B1 (en) 2015-04-17 2021-12-29 CureVac Real Estate GmbH Lyophilization of rna
MX2017013321A (es) 2015-04-22 2018-07-06 Curevac Ag Composicion que contiene arn para tratamiento de enfermedades tumorales.
EP3289101B1 (en) 2015-04-30 2021-06-23 CureVac AG Immobilized poly(n)polymerase
EP3294885B1 (en) 2015-05-08 2020-07-01 CureVac Real Estate GmbH Method for producing rna
US11559570B2 (en) 2015-05-15 2023-01-24 CureVac SE Prime-boost regimens involving administration of at least one mRNA construct
US10517827B2 (en) 2015-05-20 2019-12-31 Curevac Ag Dry powder composition comprising long-chain RNA
CN107530448A (zh) 2015-05-20 2018-01-02 库瑞瓦格股份公司 包含长链rna的干粉组合物
WO2016193226A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Curevac Ag Method for adding cap structures to rna using immobilized enzymes
EP3744843A1 (en) 2015-05-29 2020-12-02 CureVac Real Estate GmbH A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration
US10501768B2 (en) 2015-07-13 2019-12-10 Curevac Ag Method of producing RNA from circular DNA and corresponding template DNA
LT3350157T (lt) 2015-09-17 2022-02-25 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
JP6990176B2 (ja) 2015-10-05 2022-02-03 モデルナティエックス インコーポレイテッド メッセンジャーリボ核酸薬物の治療投与のための方法
US11225682B2 (en) 2015-10-12 2022-01-18 Curevac Ag Automated method for isolation, selection and/or detection of microorganisms or cells comprised in a solution
WO2017066789A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs with modified sugar
WO2017066791A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Sugar substituted mrna cap analogs
CA3001014A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs and methods of mrna capping
EP3362461B1 (en) 2015-10-16 2022-03-16 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs with modified phosphate linkage
WO2017066782A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Hydrophobic mrna cap analogs
EP3373965A1 (en) 2015-11-09 2018-09-19 CureVac AG Rotavirus vaccines
AU2016375021B2 (en) 2015-12-22 2022-02-03 CureVac SE Method for producing RNA molecule compositions
AU2016377681B2 (en) 2015-12-22 2021-05-13 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
US11248223B2 (en) 2015-12-23 2022-02-15 Curevac Ag Method of RNA in vitro transcription using a buffer containing a dicarboxylic acid or tricarboxylic acid or a salt thereof
SG11201806340YA (en) 2016-02-17 2018-09-27 Curevac Ag Zika virus vaccine
EP3423595A1 (en) 2016-03-03 2019-01-09 CureVac AG Rna analysis by total hydrolysis
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
US11596699B2 (en) 2016-04-29 2023-03-07 CureVac SE RNA encoding an antibody
EP3452493A1 (en) 2016-05-04 2019-03-13 CureVac AG Nucleic acid molecules and uses thereof
WO2017191274A2 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Curevac Ag Rna encoding a therapeutic protein
KR20190029576A (ko) 2016-06-09 2019-03-20 큐어백 아게 핵산 카고용 하이브리드 담체
JP2019525901A (ja) 2016-06-14 2019-09-12 モデルナティエックス インコーポレイテッドModernaTX,Inc. 脂質ナノ粒子の安定化製剤
WO2018089540A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018096179A1 (en) 2016-11-28 2018-05-31 Curevac Ag Method for purifying rna
CN110177544A (zh) 2016-11-29 2019-08-27 普尔泰克健康有限公司 用于递送治疗剂的外泌体
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
CN110582304A (zh) 2016-12-08 2019-12-17 库尔维科公司 用于治疗或预防肝脏疾病的rna
EP3558355A2 (en) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Henipavirus vaccine
WO2018115527A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Mers coronavirus vaccine
EP3558354A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Lassa virus vaccine
PE20200735A1 (es) 2017-02-28 2020-07-23 Sanofi Sa Arn terapeutico
RS63953B1 (sr) 2017-03-15 2023-02-28 Modernatx Inc Jedinjenje i kompozicije za intracelularnu isporuku terapeutskih sredstava
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
EP3601576A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 CureVac AG Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
WO2018191657A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
US20210198200A1 (en) 2017-06-14 2021-07-01 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
CN111328287A (zh) 2017-07-04 2020-06-23 库瑞瓦格股份公司 新型核酸分子
US20200362382A1 (en) 2017-08-18 2020-11-19 Modernatx, Inc. Methods of preparing modified rna
EP3673069A1 (en) 2017-08-22 2020-07-01 CureVac AG Bunyavirales vaccine
AU2018326799A1 (en) 2017-08-31 2020-02-27 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
WO2019092153A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Curevac Ag Rna sequence adaptation
EP3723796A1 (en) 2017-12-13 2020-10-21 CureVac AG Flavivirus vaccine
WO2019122371A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Curevac Ag Linear double stranded dna coupled to a single support or a tag and methods for producing said linear double stranded dna
EP3773702A2 (en) 2018-04-05 2021-02-17 CureVac AG Novel yellow fever nucleic acid molecules for vaccination
CN112292395A (zh) 2018-04-17 2021-01-29 库瑞瓦格股份公司 用于疫苗接种的新型rsv rna分子和组合物
WO2019241315A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
EP3813874A1 (en) 2018-06-27 2021-05-05 CureVac AG Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination
JP7410135B2 (ja) 2018-09-19 2024-01-09 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療薬の細胞内送達のための化合物及び組成物
US20210378980A1 (en) 2018-09-20 2021-12-09 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
AU2019410737A1 (en) 2018-12-21 2021-06-10 CureVac SE RNA for malaria vaccines
WO2020160430A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Modernatx, Inc. Vortex mixers and associated methods, systems, and apparatuses thereof
CN113939282A (zh) 2019-01-31 2022-01-14 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米颗粒的方法
WO2020163654A1 (en) * 2019-02-06 2020-08-13 Paul Leo Mcgrane Biologically modified vascular grafts for improved bypass surgery outcomes
WO2020161342A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Curevac Ag Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophtalmic diseases
EP3986452A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 CureVac AG Rotavirus mrna vaccine
US11576966B2 (en) 2020-02-04 2023-02-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
US11241493B2 (en) 2020-02-04 2022-02-08 Curevac Ag Coronavirus vaccine
BR112022014627A2 (pt) 2020-02-04 2022-09-27 Curevac Ag Vacina contra coronavírus
WO2021204179A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Nucleic acid vaccines for coronavirus
CA3178455A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid nanoparticle composition
EP3993828A1 (en) 2020-05-29 2022-05-11 CureVac AG Nucleic acid based combination vaccines
WO2022002040A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
US20230272052A1 (en) 2020-07-31 2023-08-31 CureVac SE Nucleic acid encoded antibody mixtures
JP2023537887A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 スージョウ・アボジェン・バイオサイエンシズ・カンパニー・リミテッド 脂質化合物及び脂質ナノ粒子組成物
CA3205569A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 CureVac SE Rna vaccine against sars-cov-2 variants
WO2022137133A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Rna vaccine against sars-cov-2 variants
WO2022152109A2 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
WO2022152141A2 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Polymer conjugated lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
WO2022162027A2 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Curevac Ag Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
EP4334446A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 CureVac SE Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression
KR20240013087A (ko) 2021-05-24 2024-01-30 쑤저우 아보젠 바이오사이언시스 컴퍼니 리미티드 지질 화합물 및 지질 나노입자 조성물
WO2023044343A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Acyclic lipids and methods of use thereof
CA3232386A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and methods of use thereof
CN116064598B (zh) 2021-10-08 2024-03-12 苏州艾博生物科技有限公司 冠状病毒的核酸疫苗
AU2022358824A1 (en) 2021-10-08 2024-04-11 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
AR127312A1 (es) 2021-10-08 2024-01-10 Suzhou Abogen Biosciences Co Ltd Compuestos lipídicos ycomposiciones de nanopartículas lipídicas
WO2023064612A2 (en) 2021-10-15 2023-04-20 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of viral antigens and related methods
WO2023116804A1 (zh) 2021-12-23 2023-06-29 苏州艾博生物科技有限公司 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
WO2023122752A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Constrained lipids and methods of use thereof
WO2023196931A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and lipid nanoparticles (lnp) for the delivery of nucleic acids or peptides for use in vaccinating against infectious agents
WO2024037578A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Composition of lipid nanoparticles
DE202023106198U1 (de) 2022-10-28 2024-03-21 CureVac SE Impfstoff auf Nukleinsäurebasis

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4373071A (en) 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4401796A (en) 1981-04-30 1983-08-30 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US5153319A (en) 1986-03-31 1992-10-06 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5766903A (en) 1995-08-23 1998-06-16 University Technology Corporation Circular RNA and uses thereof
US6627616B2 (en) * 1995-12-13 2003-09-30 Mirus Corporation Intravascular delivery of non-viral nucleic acid
US20020165183A1 (en) * 1999-11-29 2002-11-07 Hans Herweijer Methods for genetic immunization
US6379966B2 (en) * 1999-02-26 2002-04-30 Mirus Corporation Intravascular delivery of non-viral nucleic acid
US20030143204A1 (en) * 2001-07-27 2003-07-31 Lewis David L. Inhibition of RNA function by delivery of inhibitors to animal cells
US20030083272A1 (en) 1997-09-19 2003-05-01 Lahive & Cockfield, Llp Sense mrna therapy
AU750106B2 (en) * 1997-10-07 2002-07-11 University Of Maryland Biotechnology Institute Method for introducing and expressing RNA in animal cells
US6383811B2 (en) * 1997-12-30 2002-05-07 Mirus Corporation Polyampholytes for delivering polyions to a cell
US20040106567A1 (en) * 1999-09-07 2004-06-03 Hagstrom James E. Intravascular delivery of non-viral nucleic acid
ATE289630T1 (de) 1999-09-09 2005-03-15 Curevac Gmbh Transfer von mrnas unter verwendung von polykationischen verbindungen
US20020132788A1 (en) * 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
WO2002086134A2 (de) * 2001-04-23 2002-10-31 Amaxa Gmbh Pufferlössung für die elektroporation und verfahren umfassend die verwendung derselben
EP1800697B1 (de) * 2001-06-05 2010-04-14 CureVac GmbH Stabilisierte mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt für die Gentherapie
DE10162480A1 (de) * 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
WO2004063331A2 (en) * 2003-01-03 2004-07-29 Gencia Corporation SiRNA MEDIATED POST-TRANSRIPTIONAL GENE SILENCING OF GENES INVOLVED IN ALOPECIA
US20040167090A1 (en) * 2003-02-21 2004-08-26 Monahan Sean D. Covalent modification of RNA for in vitro and in vivo delivery
CA2520406A1 (en) * 2003-03-27 2004-10-14 Emory University Cxcr4 antagonists and methods of their use
BRPI0418384A (pt) * 2003-05-30 2007-06-26 Arc Pharmaceuticals Inc composições farmacêuticas e métodos referentes à inibição de adesões fibrosas utilizando diversos agentes
EP1636385A4 (en) * 2003-06-24 2010-06-02 Mirus Bio Corp INHIBITION OF GENE FUNCTION BY IN VIVO DISTRIBUTION OF GENE EXPRESSION INHIBITORS BASED ON POLYNUCLEOTIDES IN MAMMALIAN CELLS
DE10335833A1 (de) * 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
DE102004035227A1 (de) 2004-07-21 2006-02-16 Curevac Gmbh mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
DE102004042546A1 (de) * 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
WO2006037038A1 (en) 2004-09-27 2006-04-06 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Optimized vaccines to provide protection against ebola and other viruses
DE102005023170A1 (de) 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimierte Formulierung für mRNA
WO2010037408A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof

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