ES2604538T3 - Solución de inyección para ARN - Google Patents
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Abstract
Utilización de ARNm y un tampón de inyección acuoso, que contiene una sal de sodio, una sal de calcio y una sal de potasio, para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades cancerosas y tumorales, alergias, enfermedades autoinmunes, infecciones virales y/o bacterianas, para la vacunación, en particular la vacunación antiviral, o para la terapia genética, conteniendo el medicamento una solución de inyección de ARNm para aumentar la transferencia de ARNm a un organismo huésped y/o la traducción de ARNm en un organismo huésped, y administrándose la solución de inyección de ARNm vía intradérmica, intraepitelial, intraperitoneal o intranodal.
Description
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los codones para Ala pueden ser modificados de GCU o GCA a GCC o GCG; los codones para Gly pueden ser modificados de GGU o GGA a GGC o GGG.
En algunos casos no es posible eliminar los nucleótidos A o U del codón, pero sí es posible reducir el contenido de A y U utilizando codones que tienen una menor proporción de nucleótidos A y/o U. Como ejemplos se mencionan:
los codones para Leu pueden ser modificados de UUA, UUG, CUU o CUA a CUC o CUG; los codones para Ser pueden ser modificados de UCU o UCA o AGU a UCC, UCG o AGC; el codón para Tyr puede ser modificado de UAU a UAC; el codón para Cys puede ser modificado de UGU a UGC; el codón para His puede ser modificado de CAU a CAC; el codón para Gln puede ser modificado de CAA a CAG; los codones para Ile pueden ser modificados de AUU o AUA a AUC; los codones para Thr pueden ser modificados de ACU o ACA a ACC o ACG; el codón para Asn puede ser modificado de AAU a AAC; el codón para Lys puede ser modificado de AAA a AAG; los codones para Val pueden ser modificados de GUU o GUA a GUC o GUG; el codón para Asp puede ser modificado de GAU a GAC; el codón para Glu puede ser modificado de GAA a GAG; el codón de parada UAA puede ser modificado a UAG o UGA.
Las sustituciones arriba indicadas se pueden utilizar de forma individual y también en todas las combinaciones posibles para aumentar el contenido de G/C del ARNm modificado con respecto al del ARNm natural (de la secuencia original). Por ejemplo, preferentemente se utilizan combinaciones de combinaciones de las posibilidades de sustitución arriba indicadas:
sustitución de todos los codones codificadores de Thr en la secuencia original (ARNm natural) a ACC (o ACG) y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Ser a UCC (o UCG o AGC);
sustitución de todos los codones codificadores de Ile en la secuencia original a AUC, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Lys a AAG y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Tyr a UAC;
sustitución de todos los codones codificadores de Val en la secuencia original a GUC (o GUG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Glu a GAG, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Ala a GCC (o GCG) y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Arg a CGC (o CGG);
sustitución de todos los codones codificadores de Val en la secuencia original a GUC (o GUG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Glu a GAG, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Ala a GCC (o GCG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Gly a GGC (o GGG) y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Asn a AAC;
sustitución de todos los codones codificadores de Val en la secuencia original a GUC (o GUG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Phe a UUC, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Cys a UGC, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Leu a CUG (o CUC), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Gln a CAG y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Pro a CCC (o CCG);
etc.
En caso de una modificación del contenido de G/C de la región del ARNm modificado codificadora de la proteína, éste se aumenta al menos en un 7% de puntos, preferentemente al menos en un 15% de puntos, de forma especialmente preferente al menos en un 20% de puntos y de forma particularmente preferente al menos en un 30% de puntos, con respecto al contenido de G/C de la región codificada del ARNm natural codificador de la proteína. En este contexto es especialmente preferente aumentar el contenido de G/C del ARNm modificado, en particular en la región codificadora de la proteína, al máximo en comparación con la secuencia natural.
También es preferible un aumento del contenido de A/U en el entorno del sitio de unión de ribosomas del ARNm modificado en comparación con el contenido de A/U en el entorno del sitio de unión de ribosomas del ARNm natural correspondiente. Esta modificación aumenta la eficiencia de la unión de ribosomas al ARNm. Una unión eficaz de los ribosomas al sitio de unión de ribosomas (secuencia de Kozak: GCCGCCACCAUGG, el AUG constituye el codón de iniciación) produce a su vez una traducción eficiente del ARNm. El aumento consiste en
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la introducción de al menos una unidad de A/U adicional, normalmente al menos 3 en la región del sitio de unión, es decir -20 a +20 desde A del codón de iniciación AUG.
Una modificación también preferente se refiere a un ARNm en el que la región codificadora y/o la región 5' y/o 3' no traducida del ARNm modificado están cambiadas con respecto al ARNm natural de modo que no contienen ningún elemento de secuencia desestabilizador, y la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm modificado preferentemente no cambia con respecto al ARNm natural. Como es sabido, por ejemplo en las secuencias de ARNm eucariotas aparecen elementos de secuencia desestabilizadores (ESD) que se unen a proteínas de señal y regulan la degradación enzimática del ARNm in vivo. Por tanto, para una mayor estabilización del ARNm modificado según la invención, en la región codificadora de la proteína se pueden realizar en caso dado uno o más de este tipo de cambios con respecto a la región correspondiente del ARNm natural, de modo que ésta no contenga ningún o esencialmente ningún elemento de secuencia desestabilizador. Con este tipo de cambios, de acuerdo con la invención también se pueden eliminar del ARNm ESD presentes en las regiones no traducidas (3'-URT y/o 5'-URT).
Este tipo de secuencias desestabilizadoras son, por ejemplo, secuencias ricas en AU ("AURES"), presentes en secciones 3'-UTR de numerosos ARNm inestables (Caput y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 a 1674) y motivos de secuencia reconocidos por endonucleasas (por ejemplo Binder y col., EMBO J. 1994, 13: 1969 a 1980).
También es preferente un ARNm modificado que presenta una estructura 5'-caperuza para la estabilización. Estructuras de caperuza a utilizar según la invención son, por ejemplo, m7G(5’)ppp (5’(A,G(5’)ppp(5’)A y G(5’)ppp(5’)G.
Además, es preferible que el ARNm modificado tenga una cola de poli(A), preferentemente de al menos 25 nucleótidos, de forma especialmente preferente al menos 50 nucleótidos, de forma todavía más preferente al menos 70 nucleótidos, de forma particularmente preferente al menos 100 nucleótidos y de forma totalmente preferente al menos 200 nucleótidos.
También preferentemente, el ARNm modificado presenta al menos un IRES y/o al menos una secuencia de estabilización 5' y/o 3'. De acuerdo con la invención, en el ARNm modificado se pueden introducir uno o más, así llamados, IRES (en inglés "internal ribosomal entry side" -lado de entrada ribosómico interno). De este modo, un IRES puede actuar como único sitio de unión de ribosomas, pero también puede servir para proporcionar un ARNm que codifica varias proteínas, péptidos o polipéptidos que deben ser traducidos independientemente entre sí por los ribosomas ("ARNm multicistrónico"). Ejemplos de secuencias IRES a utilizar según la invención son aquellas de picornavirus (por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFV), poliovirus (PV), virus de la encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de leucoma murino (MLV), virus de inmunodeficiencia en simios (VIS) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).
También preferentemente, un ARNm modificado presenta al menos una secuencia de estabilización 5' y/o 3'. Estas secuencias de estabilización en las regiones 5' y/o 3' no traducidas producen un aumento de la vida media del ARNm en el citosol. Estas secuencias de estabilización pueden tener un 100% de homología de secuencia con las secuencias naturales presentes en virus, bacterias y eucariotas, pero también pueden ser de naturaleza parcial o totalmente sintética. Como ejemplo de secuencias estabilizadoras que se pueden utilizar en la presente invención se pueden mencionar las secuencias no traducidas (UTR) del gen de la globina, por ejemplo de Homo sapiens o Xenopus laevis. Otro ejemplo de secuencia de estabilización tiene la fórmula general (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC, que está incluida en el 3’-UTR del ARNm muy estable que codifica globina, (I)-colágeno, 15-lipoxigenasa o tirosina-hidroxilasa (véase Holcik y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Evidentemente, estas secuencias de estabilización se pueden utilizar de forma individual o en combinación entre sí, y también en combinación con otras secuencias de estabilización conocidas por los especialistas.
En una forma de realización preferente de la presente invención, el ARNm modificado presenta al menos un análogo de nucleótidos naturales. Este o estos análogos sirven para una mayor estabilización del ARNm modificado, basándose esto en el hecho de que las enzimas que degradan el ARN y que están presentes en las células reconocen como sustrato preferentemente nucleótidos naturales. Por tanto, mediante la introducción de análogos de nucleótido en el ARNm se dificulta la degradación del ARNm, pudiendo influir la introducción de estos análogos, en particular en la región codificadora del ARNm, en la eficiencia de traducción de forma positiva o negativa. En una enumeración de ningún modo definitiva, como ejemplos de análogos de nucleótidos a utilizar según la invención se pueden emplear fosforamidatos, fosforotionatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-desazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. Los especialistas conocen la preparación de análogos de este tipo, por ejemplo de las patentes US 4.373.071, US 4.401.796, US 4.415.732, US 4.458.066, US 4.500.707, US 4.668.777, US 4.973.679, US 5.047.524, US 5.132.418, US 5.153.319, US 5.262.530 y
En otra forma de realización preferente de la presente invención, el ARNm modificado además presenta una secuencia codificadora de un péptido señal. Esta secuencia codificadora de un péptido señal preferentemente 5 tiene una longitud de 30 a 300 bases, que codifican de 10 a 100 aminoácidos. De forma especialmente preferente, la secuencia codificadora de un péptido señal tiene una longitud de 15 a 60 bases, que codifican de 15 a 60 aminoácidos. Por ejemplo, para la modificación de los ARNm utilizados según la invención se pueden utilizar las siguientes secuencias indicadas en la Tabla 1. También están incluidas aquellas secuencias indicadas en la Tabla 1 que presentan 1-20, preferentemente 1-10 y de forma especialmente preferente 1-5
10 intercambios de base por A, T, C o G en comparación con una de las secuencias indicadas en la Tabla 1.
Tabla 1: Ejemplos de secuencias de péptidos señal: secuencias de aminoácidos codificadas por el primer exón de genes de MHC clase I o MHC clase II, y glicoproteína mielina oligodendrocitos.
- Nombre de la secuencia señal
- Secuencia (secuencia de péptidos y nucleótidos)
- HLA-B*07022
- MLVMAPRTVLLLLSAALALTETWAG Secuencia de ARN (enriquecida con GC)
- HLA-A*3202
- MAVMAPRTLLLLLLGALALTQTWAG Secuencia de ARN (enriquecida con GC)
- HLA-A*01011
- MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAG
- HLA-A*0102
- MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAG
- HLA-A*0201
- MAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG
- HLA-A*0301
- MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAG
- HLA-A*1101
- MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAG
- HLA-B*070201
- MLVMAPRTVLLLLSAALALTETWAG
- HLA-B*2702
- MRVTAPRTLLLLLWGAVALTETWAG
- HLA-Cw*010201
- MRVMAPRTULLLSGALALTETWACS
- Nombre de la secuencia señal
- Secuencia (secuencia de péptidos y nucleótidos)
- HLA-Cw*02021
- MRVMAPRTLLLLLSGALALTETWACS
- HLA-E*0101
- MVDGTLLLLSSEALALTQTWAGSHS
- HLA-DRB1
- MVCLKLPGGSCMTALTVTLMVLSSPLALA
- HLA-DRA1
- MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA
- HLA-DR4
- MVCLKFPGGSCMAALTVTLMVLSSPLALA
- Glicoproteína mielina oligodendrocitos
- MACLWSFSWPSCFLSLLLLLLLQLSCSYA
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Los especialistas están familiarizados con diferentes procedimientos para realizar las modificaciones anteriormente descritas. Por ejemplo, para la sustitución de codones en el ARNm modificado utilizado según la invención en caso de regiones codificadores cortas, el ARNm completo se puede sintetizar químicamente empleando técnicas estándar. Preferentemente se utilizan sustituciones, adiciones o eliminaciones de bases utilizando una matriz de ADN para producir el ARNm modificado con ayuda de técnicas de la mutagénesis dirigida usual (véase, por ejemplo, Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª Edición, Cold Spring Harbor, NY, 2001). En un procedimiento de este tipo, para la producción del ARNm se transcribe in vivo una molécula de ADN correspondiente. Esta matriz de ADN dispone de un promotor adecuado, por ejemplo un promotor T7 o SP6, para la transcripción in vivo, al que le siguen la secuencia de nucleótidos deseada para el ARNm a producir y una señal de terminación para la transcripción in vitro. La molécula de ADN que constituye la matriz del constructo de ARN a producir se puede preparar mediante reproducción fermentativa y aislamiento subsiguiente como parte de un plásmido replicable en bacterias. Por ejemplo, utilizando oligonucleótidos de ADN sintéticos cortos que presentan transiciones monocatenarias cortas en los puntos de corte producidos, o mediante genes producidos por síntesis química, es posible clonar la secuencia de nucleótidos deseada en un plásmido adecuado por métodos miológicos moleculares conocidos por los especialistas (véase Maniatis y col., supra). Después, la molécula de ADN se recorta del plásmido, en el que puede estar presente en una sola o en varias copias, mediante digestión con endonucleasas de restricción.
Las modificaciones del ARNm arriba descritas pueden estar presentes en el sentido de la invención de forma individual o en combinaciones entre sí. También es posible combinar una o más modificaciones con la complejación del ARNm arriba descrita.
La invención tiene por objetivo aumentar la transferencia de ARNm y/o de la traducción de ARNm en un organismo huésped. Por organismo huésped en el sentido de la invención se entiende cualquier organismo a cuyas células o tejidos se puede realizar una transferencia de ARNm, seguida por la traducción del mismo. Un organismo huésped en el sentido de la invención es en particular un mamífero seleccionado entre el grupo consistente en ratones, ratas, cerdos, vacas, caballos, perros, gatos, monos y en particular humanos.
Con la presente invención se demuestra que el ARNm codificador de luciferasa diluido en el tampón de inyección RL (con o sin lactato) utilizado según la invención da como resultado una tasa de traducción considerablemente más alta que el ARNm diluido en tampones estándar utilizados tradicionalmente para el ARN, como HBS o PBS (véase la Figura 1). Además, se demuestra que la eficiencia de la transferencia y la
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traducción de ARNm inyectado depende en gran medida de la presencia de iones calcio. En ensayos comparativos correspondientes con/sin iones calcio en el tampón de inyección RL (con o sin lactato) se comprobó que la ausencia de calcio reduce significativamente la eficiencia de la transferencia de ARNm a un nivel comparable con el de los tampones estándar PBS y HBS (véase la Figura 2).
Por tanto, se constató en primer lugar que un tampón de inyección RL (con o sin lactato) utilizado según la invención aumenta considerablemente la transferencia de ARNm, y en segundo lugar que esta transferencia de ARNm mejorada se aumenta todavía más mediante un tampón de inyección RL (con o sin lactato) utilizado según la invención con una alta concentración de calcio, de hasta 100 mM.
El tampón de inyección utilizado según la invención se emplea en combinación con ARNm en una solución de inyección de ARN. Así, otro objeto de la invención es una solución de inyección de ARN que incluye ARNm y un tampón de inyección que contiene cloruro de sodio (NaCl) al menos 50 mM, cloruro de calcio (CaCl2) al menos 0,01 mM y cloruro de potasio (KCl) al menos 3 mM, para la utilización según la reivindicación 11 con el fin de aumentar la transferencia de ARNm y/o la traducción de ARNm en células. Preferentemente se utiliza una solución de inyección de ARN según la invención donde el tampón de inyección contiene cloruro de sodio (NaCl) al menos entre 50 mM y 800 mM, preferentemente al menos entre 60 mM y 500 mM, de forma especialmente preferente al menos entre 70 mM y 250 mM y de forma particularmente preferente entre 60 mM y 110 mM, cloruro de calcio (CaCl2) al menos entre 0,01 mM y 100 mM, preferentemente al menos entre 0,5 mM y 80 mM y de forma especialmente preferente al menos entre 1,5 mM y 40 mM, y cloruro de potasio (KCl) al menos entre 3 mM y 500 mM, preferentemente al menos entre 4 mM y 300 mM, y de forma especialmente preferente al menos entre 5 mM y 200 mM.
Preferentemente, el tampón de inyección de la solución de inyección de ARN según la invención contiene además lactato. Preferiblemente, dicho tampón de inyección de la solución de inyección de ARN según la invención contiene lactato al menos 15 mM. Es especialmente preferente una solución de inyección de ARN según la invención en la que el tampón de inyección contiene lactato entre 15 mM y 500 mM, preferiblemente entre 15 mM y 200 mM, y de forma particularmente preferente entre 15 mM y 100 mM.
La preparación de la solución de inyección de ARN puede realizarse de acuerdo con cualquier procedimiento del estado actual de la técnica. Preferentemente, el ARNm del tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL se diluyen con lactato. También es posible disponer primero el ARNm como ARNm seco (por ejemplo liofilizado) y añadir después el tampón de inyección de ARN o el tampón de inyección RL con lactato, opcionalmente bajo con un aumento de temperatura, agitación, ultrasonido, etc. para acelerar la disolución. Las relaciones de concentración correspondientes se deben elegir en función de las respectivas condiciones previas (organismo huésped, en particular mamífero, al que se le inyecta la solución de inyección de ARN, estado de salud, edad, etc. del organismo huésped, etc.).
El ARNm de la solución de inyección de ARN según la invención preferentemente es ARNm desnudo.
Tal como se ha descrito, la solución de inyección de ARN según la invención se puede utilizar en particular para aumentar la transferencia de ARN a un organismo huésped y la traducción de ARN en dicho organismo huésped.
Por consiguiente, otro objeto (no reivindicado) es la utilización de la solución de inyección de ARN anteriormente descrita para aumentar la transferencia de ARN a un organismo huésped y/o la traducción de ARN en dicho organismo huésped.
También se investigó la dosificación (en cuanto a la cantidad y la duración en particular para aplicaciones clínicas) del ARNm a transferir en el tampón de inyección RL (con o sin lactato). Estas investigaciones dieron como resultado un aumento de la expresión de luciferasa con cantidades crecientes de ARNm hasta 0,1 µg (en 100 µl de volumen de inyección) en ratones y hasta 3 mg (en 150 µl de volumen de inyección) en humanos. La traducción de ARNm tiene lugar de forma transitoria y se regula de forma consecuente, de modo que para una expresión uniforme y persistente de la molécula extraña (proteína) se debería llevar a cabo una repetición de la inyección, dependiendo de diversos factores, como la molécula extraña a expresar y el efecto buscado, el organismo que recibe la inyección y el estado (de salud) del mismo, etc., aproximadamente cada tres días, pero también cada dos días o también a diario. La cantidad de ARNm puede oscilar, también en función de diferentes factores, entre otros los factores arriba mencionados, entre 0,01 µg y 1,000 µg, preferentemente entre 1 µg y 800 µg, de forma igualmente preferente entre 2 µg y 500 µg, de forma especialmente preferente entre 5 µg y 100 µg, de forma particularmente preferente entre 10 µg y 90 µg y de forma totalmente preferente entre 20 µg y 80 µg en 100 µl de volumen de inyección. De forma especialmente preferente, la cantidad de ARNm es de 60 µg en 100 µl de volumen de inyección.
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Algunas utilizaciones según la invención del ARNm y del tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL con lactato o de la solución de inyección de ARN consisten en la utilización para el tratamiento y/o la profilaxis o para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades cancerosas o tumorales, por ejemplo melanoma, como melanoma maligno, melanoma de piel, carcinoma, como carcinoma de colon, carcinoma de pulmón, como carcinoma de pulmón de células pequeñas, adenocarcinoma, carcinoma de próstata, carcinoma de esófago, carcinoma de mama, carcinoma de riñón, sarcoma, mieloma, leucemia, en particular AML (leucemia mieloide aguda), glioma, linfomas y blastomas, alergias, enfermedades autoinmunes, como esclerosis múltiple, infecciones virales y/o bacterianas.
La presente invención también incluye la utilización tanto del ARNm y el tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL con lactato como de la solución de inyección de ARN, entre otras cosas, para la terapia genética y la vacunación, por ejemplo para la vacunación antiviral o tumoral, o para la prevención de las enfermedades arriba mencionadas.
En el sentido de la presente invención, una "terapia genética" significa especialmente restablecer una función que falta del cuerpo o de la célula mediante la introducción de un gen funcional en las células enfermas, o inhibir una función perjudicial mediante una información genética correspondiente. Por ejemplo, en caso de falta de un gen supresor tumoral, por ejemplo p53, o si éste solo es expresado en cantidades pequeñas, se puede introducir en forma de su ARNm en la célula, insertar en el ADN y así generar la proteína expresada originalmente de forma deficiente de nuevo en cantidades fisiológicamente relevantes. Ejemplos de genes supresores tumorales en el sentido de la presente invención son p53 TP53, RB1, APC, WT1, NF1, NF2, VHL, BRCA1, BRCA2, DCC, MEN 1, MEN 2, PTCH, p57/KIP2, MSH2, MLH1, FMS1, FMS2, MET, p16/INK4a/CDKN2, CDK4, RET, EXT1, EXT2, EXT3, PTEN/MMAC1, ATM, BLM, XPB, XPD, XPA, XPG, FACC, FACA, SMAD4/DPC4, p14Art(p19Art), DPC4, E-CAD, LKB1/STK1, TSC2, PMS1, PMS2, MSH6, TGF- Tipo II R, BAX, -CAT, MADR2/SMAD2, CDX2, MKK4, PP2R1B, MCC, etc.
Una vacunación en el sentido de la invención significa la introducción de información genética en forma de ARNm en un organismo, en particular en una o más células o tejidos de dicho organismo. El ARNm así administrado se traduce en el organismo en la molécula diana (por ejemplo péptido, polipéptido, proteína), es decir, la molécula diana codificada por el ARNm se expresa y provoca una respuesta inmunitaria. Ya es sabido que las células presentadoras de antígenos (APC) tienen un papel clave obligatorio durante la provocación de una respuesta inmunitaria, ya que representan el único tipo de célula que al ser activada dispara todas las señales necesarias para la iniciación de la proliferación de inmunocitos específicos de antígeno. Una vacunación en el sentido de la presente invención puede tener lugar, por ejemplo, utilizando ARNm codificador de un antígeno, pudiendo tratarse de antígenos tumorales en caso de una vacunación tumoral o de un antígeno extraño en caso de una vacuna contra agentes patógenos extraños. Antígenos tumorales de acuerdo con la presente invención son, por ejemplo, antígenos tumorales definidos de células T, por ejemplo antígenos de "cáncer testicular", por ejemplo MAGE, RAGE, NY-ESO-1, antígenos de diferenciación, por ejemplo MART-1/Melan-A, tirosinasa, gp100, PSA, CD20, genes mutados de epítopo antigénico, por ejemplo CDK4, caspasa8 o antígenos oncofetales, por ejemplo CEA, AF. Otros antígenos tumorales son, por ejemplo, los antígenos tumorales CD5 y CAMPATH-1 (CDw52) que aparecen en linfomas de células B, antígenos CD20 que aparecen en linfomas de células B no Hodkin, los antígenos tumorales que aparecen en caso de tumores sólidos, en particular en caso de tumores epiteliales (mama, intestino y pulmón), CEA (antígeno carcinoembriogénico), mucina, CA-125, así como FAP-a, tenascina y metaloproteinasa, que aparecen adicionalmente en caso de tumores glioblastomas. Otros antígenos tumorales son, por ejemplo, los antígenos tumorales que aparecen en caso de tumores de pulmón, mama, cabeza y cuello, y también en caso de tumores de células T y células B, EGF (factor de crecimiento epidérmico), p185HER2 y el receptor IL-2, o el antígeno tumoral SV40, etc.
También es posible utilizar un ARNm que codifique varios de estos antígenos. De este modo se puede combatir eficazmente un melanoma, carcinoma, AML o glioma, ya que una combinación de diferentes antígenos específicos del tumor correspondiente presenta un espectro de acción extremadamente amplio. El ARNm utilizado según la invención también puede codificar una proteína inmunogénica. Dicha proteína inmunogénica puede facilitar la reactivación de una respuesta inmunitaria. Esta reactivación se basa en el conocimiento de que prácticamente cada organismo dispone de las llamadas "memorias de respuestas inmunitarias" contra determinadas moléculas extrañas, por ejemplo proteínas, en particular proteínas virales, antígenos. Esto significa que un organismo ya ha sido infectado con una molécula extraña de este tipo en un momento anterior, y que a causa de esta infección ya se ha provocado una respuesta inmunitaria contra dicha molécula extraña, por ejemplo una proteína viral, permanece en la "memoria" del sistema inmunitario, es decir que éste la almacena en memoria. En caso de una nueva infección con la misma molécula extraña, dicha respuesta inmunitaria se reactiva. De acuerdo con la invención, dicha reactivación de la respuesta inmunitaria puede tener lugar mediante la vacunación con un ARNm que contiene al menos una región codificadora de al menos una proteína inmunogénica. Es preferible un ARNm que codifique tanto uno o más antígenos como una o más proteínas inmunogénicas.
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Preferentemente, proteínas inmunogénicas en el sentido de la invención son proteínas estructurales virales, en particular proteínas de matriz, proteínas de cápside y proteínas superficiales de la membrana lipídica. Otros ejemplos de estas proteínas virales son proteínas de adenovirus, rinovirus, virus corona, retrovirus. En este contexto son especialmente preferentes el antígeno superficial de la hepatitis B ("Hepatitis B Surface Antigen", en adelante designado como "antígeno HBS") y proteínas de matriz de la gripe, en particular la proteína de matriz de la gripe M1.
También se describe (no se reivindica) la utilización de ARN y del tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL con lactato arriba descritos, así como del tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL con lactato arriba descritos, o de la solución de inyección de ARN arriba descrita, para aumentar la transferencia de ARN y/o la traducción de ARN en procedimientos in vitro, por ejemplo para análisis de expresión genética o para procedimientos de cribado in vitro, por ejemplo por HTS (High Throughput Screening -cribado de alto rendimiento).
De acuerdo con la invención, la utilización de una solución de inyección de ARN tiene lugar en un procedimiento para aumentar la transferencia de ARNm y/o la traducción de ARNm de ARN en un organismo huésped, para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades cancerosas o tumorales, por ejemplo melanoma, como melanoma maligno, melanoma de piel, carcinoma, como carcinoma de colon, carcinoma de pulmón, como carcinoma de pulmón de células pequeñas, adenocarcinoma, carcinoma de próstata, carcinoma de esófago, carcinoma de mama, carcinoma de riñón, sarcoma, mieloma, leucemia, en particular AML (leucemia mieloide aguda), glioma, linfomas y blastomas, alergias, enfermedades autoinmunes, como esclerosis múltiple, infecciones virales y/o bacterianas, y para la terapia genética y/o vacunación, en caso dado para la vacunación antiviral, o para la prevención de las enfermedades arriba mencionadas. El procedimiento incluye los siguientes pasos:
a) preparar una solución de inyección de ARN de la presente invención y b) administrar la solución de inyección de ARN del paso a) en un organismo huésped.
La preparación de la solución de inyección del paso a) puede realizarse como se describe más arriba, es decir, de acuerdo con cualquier procedimiento del estado actual de la técnica, preferentemente por dilución del ARNm en el tampón de inyección RL o en el tampón de inyección RL con lactato. Las relaciones de concentración correspondientes también se deben elegir aquí en función de las condiciones previas arriba descritas (por ejemplo organismo huésped, en particular mamífero, al que se le inyecta la solución de inyección de ARN, estado de salud, edad, etc. del organismo huésped, etc.). La administración de la solución de inyección de ARN puede realizarse por ejemplo con una jeringuilla para inyecciones (por ejemplo Sub-Q, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). La solución de inyección de ARN se administra según la invención vía intradérmica, intraepitelial, intraperitoneal o intranodal (por ejemplo en los ganglios linfáticos).
El organismo huésped del procedimiento según la invención preferentemente es un mamífero seleccionado entre el grupo consistente en ratones, ratas, cerdos, vacas, caballos, perros, gatos, monos y en particular humanos.
En un aspecto no reivindicado, la solución de inyección preparada se puede utilizar para la transfección in vitro de células con ARN, en particular ARNm. Esta transfección in vitro puede ser adecuada para su uso en laboratorio o puede formar parte de una terapia genética ex vivo, es decir, una toma de células de un paciente, una transfección ex vivo de ARN contenido en una solución de inyección y retrasplante subsiguiente en un paciente. La transfección se puede llevar a cabo con ayuda de un procedimiento de electroporación, en caso dado aplicando también impulsos de tensión con una intensidad de campo de como máximo 2 a 10 kVcm-1 y duraciones de impulso de 10 a 200 µs y una densidad de corriente de al menos 2 Acm-2. No obstante, si no es necesario para la transfección también se pueden utilizar duraciones de impulso más largos, de 1 a 100 ms. Si la solución de inyección se utiliza para trabajos de laboratorio, se pueden someter a transfección con ARN todas las líneas celulares de laboratorio imaginables. Para la terapia genética ex vivo entran en consideración numerosos tipos de células para la transfección, en particular células sanguíneas humanas primarias, células sanguíneas progenitoras pluripotentes, pero también fibroblastos, neuronas, células endoteliales o células musculares. Esta enumeración se da a modo de ejemplo y no tiene ningún carácter limitativo.
Las siguientes figuras y ejemplos sirven para aclarar e ilustrar adicionalmente la presente invención, sin limitar ésta a los mismos.
Figuras
En los experimentos mostrados en las Figuras 1 a 5 se inyectó un volumen de 100 µl del tampón indicado en cada caso (las composiciones de los tampones se indican más adelante bajo el punto Materiales, 1. Tampón de Inyección), que contenía ARNm (Figura 4, ADNp en 100 µl de PBS) que codifica luciferasa de Photinus
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Las Figuras 14 A-B muestran la especificidad de tinciones de criosecciones con MHC clase II. En este caso se inyectaron 20 µg de ARNm codificador de -galactosidasa de Escherichia coli en un volumen total de 100 µl de tampón de inyección RL con lactato. Catorce horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y se les extirparon las orejas. Se prepararon criosecciones transversales. Las criosecciones se tiñeron primero con un anticuerpo anti-MHC clase II (Figura 14A) o con el anticuerpo de control de isotipo correspondiente (Figura 14B) y se detectaron con tinción inmunofluorescente con Alexa 546. Después, las criosecciones se tiñeron con Magenta-gal (para expresión de -galactosidasa). Las ilustraciones muestran tinciones con magenta-gal (columna izquierda), tinciones con MHC clase II (columna media, la posición de células positivas en lacZ están indicadas con rebordes) y una superposición de las dos tinciones (columna derecha, las células positivas en lacZ están indicadas mediante rebordes, las áreas claras de la ilustración representan las células positivas en MHC clase II).
La Figura 15 representa la compatibilidad de células positivas en colorante X-gal y colorante AEC. Con el fin de determinar si el precipitado X-gal es compatible con la detección de células positivas en AEC, unas células BHK se sometieron a cotransfección con ARNm de eGFP y con ARNm de lacZ. Las células se tiñeron con una inmunotinción anti-eGFP con AEC (rojo: células positivas, expresan eGFP), con una solución de X-gal (verde azulado: células positivas, expresan lacZ) o con una combinación de AEC y X-gal. Las células teñidas se analizaron con microscopía óptica amplia. Las células doblemente positivas aparecen en negro (flechas negras). La diferenciación de células positivas con tinción individual (flechas verdes y rojas) resulta difícil si la tinción individual experimenta una fuerte precipitación y por ello aparece más bien en negro.
Las Figuras 16 A-B muestran la colocalización de células positivas en MHC clase II y células positivas en transferencia de ARNm. En este caso se inyectaron 20 µg de ARNm codificador de -galactosidasa en un volumen total de 100 µl de tampón de inyección RL con lactato. Catorce horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y se les extirparon las orejas. Se prepararon criosecciones transversales, que se tiñeron en primer lugar con un anticuerpo anti-MHC clase II (Figura 16A+B) o con el anticuerpo de control de isotipo correspondiente (Figura 16C) (detectado con tinción Alexa 546), y después con X-gal (para la expresión de -galactosidasa). Las células positivas en transferencia de ARNm aparecen en color azul verdoso; las células positivas en MHC clase II aparecen en rojo; y las células doblemente positivas aparecen en negro. Las células positivas en transferencia de ARNm se indican mediante una flecha independientemente de la expresión de MHC clase II.
La Figura 17 muestra la transferencia de ARNm y la morfología del pabellón auditivo. En este caso se inyectaron 20 µg de ARNm codificador de -galactosidasa en un volumen total de 100 µl de tampón de inyección RL con lactato. Catorce horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y se les extirparon las orejas. Se prepararon criosecciones transversales, que se tiñeron en primer lugar con X-gal (para la expresión de galactosidasa), y después con hematotoxilina y eosina. Las células positivas en transferencia de ARNm están indicadas mediante flechas y están establecidas cerca de la capa de células parenquimatosas.
Ejemplos
Materiales
1. Tampón de inyección
Se utilizaron los siguientes tampones:
-2x solución salina tampón de fosfato (PBS)
(PBS cloruro de sodio 274 mM, cloruro de potasio 5,4 mM, disodiohidrogeno-fosfato 20 mM, dihidrógeno
fosfato de potasio 4 mM, pH 7,3 a 20,8ºC);
-2x solución salina tamponada con HEPES (HBS) (HBS: cloruro de sodio 300 mM, Hepes 20 mM, pH 7,4 a 20,8ºC); y
-1x tampón de inyección RL (sin lactato)
(cloruro de sodio 82,2 mM, cloruro de potasio 4,3 mM, cloruro de calcio 1,44 mM, si no se ha indicado otra
composición y concentración).
-1x tampón de inyección RL con lactato
(cloruro de sodio 102,7 mM, cloruro de potasio 5,4 mM, cloruro de calcio 1,8 mM, lactato de sodio 20 mM,
si no se ha indicado otra composición y concentración).
-1x tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de sodio
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(cloruro de potasio 4,3 mM, cloruro de calcio 1,44 mM, lactato de sodio 22,4 mM, si no se ha indicado otra composición y concentración).
-1x tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de potasio
(cloruro de sodio 82,2 mM, cloruro de calcio 22,4 mM, lactato de sodio 22,4 mM, si no se ha indicado otra
composición y concentración).
-1x tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de calcio
(cloruro de sodio 82,2 mM, cloruro de potasio 4,3 mM, lactato de sodio 22,4 mM, si no se ha indicado otra
composición y concentración).
Con 2x PBS y 2x HBS, todos los componentes se disolvieron en agua y se ajustó el pH. Después se añadió pirocarbonato de dietilo (DEPC, Sigma, Schnelldorf, Alemania) hasta una concentración del 0,1% (v/v). Los tampones se incubaron durante una hora a 37ºC. A continuación, los tampones se trataron en autoclave.
El 1x tampón de inyección RL con lactato se preparó a partir de 20x una solución madre de las cuatro sales diferentes (cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y lactato de sodio). El 1x tampón de inyección RL también se preparó a partir de 20x una solución madre de las tres sales diferentes (cloruro de sodio, cloruro de potasio y cloruro de calcio). En otros experimentos se suprimió el cloruro de sodio, el cloruro de potasio o el cloruro de calcio, sin compensar la baja osmolaridad. Estos tampones de inyección RL con lactato y sin NaCl, KCl o CaCl2 también se prepararon a partir de 20x una solución madre. A excepción de la solución de lactato de sodio-racemato (Fluka, Schnelldorf, Alemania), cada uno de estos componentes se trató con DEPC y se sometió a autoclave, tal como se ha descrito para 2x PBS y 2x HBS.
Todos los tampones y componentes de tampones se analizaron en cuanto a la actividad de ribonucleasa incubando 1 µg de ARNm en 1x tampón durante más de dos horas a 37ºC. En el análisis del ARNm por electroforesis en gel de formaldehído-agarosa se utilizaron tampones donde no se observó degradación.
2. Ratones
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales y nacionales. Se utilizaron ratones BALB/c hembra con una edad de 8 -15 semanas de Charles River (Sulzfeld, Alemania).
Antes de la inyección intradérmica, los ratones fueron anestesiados y el pabellón auditivo se trató con isopropanol. Con el fin de analizar la absorción y traducción de ARNm, después de un tiempo determinado los ratones fueron sacrificados y se les extirparon las orejas, que se rasuraron con una cuchilla de afeitar para eliminar pelos molestos.
3. Humanos
Los experimentos con humanos se llevaron a cabo con hombres sanos voluntarios que fueron informados sobre el trasfondo y las posibles consecuencias de las investigaciones y que dieron su consentimiento.
Ejemplo 1: Preparación de los ácidos nucleicos
ARNm
Se preparó ARNm "capped" (con caperuza) mediante transcripción "run-off" in vitro con ARN polimerasa (T7-Opti mRNA kits, CureVac, Tübingen, Alemania).
La secuencia codificada de este ARNm (bien -galactosidasa de Escherichia coli [lacZ] clonada a partir de Acc. U02445, bien luciferasa de Photinus pyralis [luc], clonada a partir de Acc. U47295) se flanqueó en sus extremos 3' con una región no traducida de alfa-globina y una cola de poli A sintética (n = 70). Para los experimentos con ratones, el ARNm se extrajo con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se precipitó con cloruro de litio. A continuación, el ARNm se resuspendió en agua y el rendimiento se determinó por espectrometría a 260 nm. Finalmente, el ARNm se precipitó con acetato de amonio y se resuspendió de forma estéril en agua.
ADNp
Se preparó ADN de pCMV-luc libre de endotoxinas con el EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADNp se precipitó con acetato de amonio y finalmente se resuspendió de forma estéril en agua. El plásmido pCMV-luc se modificó mediante inserción de un fragmento Xba I-(embotado con fragmento de Klenow) Hind III de pGL3 (Acc. U47295) en el plásmido Nsi I-(embotado con fragmento de Klenow) digerido con Hind III de pCMV-HB-S (Acc. A44171). El gen indicador del ADNp estaba bajo el control del promotor CMV.
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cabo una incubación durante 40 minutos a temperatura ambiente con Alexa Fluor 546 IgG de cabra/antirrata (1:400; Molecular Probes, Leiden, Holanda) en tampón de bloqueo. Por último, se llevó a cabo una tinción con magenta-gal. Para ello, el X-gal de la solución de tinción se sustituyó por 0,1 mg/ml de magenta-gal (Peqlab, Erlangen, Alemania).
Las secciones se analizaron con un microscopio Axioplan 2 de Zeiss (Oberkochen, Alemania), equipado con una cámara Axiocam HRc y el software Axiovision 4.0. Los colores y el contraste de las fotografías se ajustaron de forma lineal.
Ejemplo 6: Transferencia y traducción de ARN en humanos
Este experimento se llevó a cabo con hombres sanos voluntarios. Los sitios de inyección se rasuraron, se desinfectaron y se trataron con RNaseZap (Ambion, Austin, USA). Después, en una carga se inyectaron 120 µg de ARNm en 0,8x tampón de inyección RL en un volumen total de 200 µl. En otras cargas análogas, en lugar de tampón de inyección RL se inyectaron: -tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de sodio; -tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de potasio; y -tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de calcio.
Quince horas después de la inyección se realizaron biopsias con un diámetro de 4 mm (troqueladas) bajo anestesia local. Las biopsias se sometieron a congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido y se prepararon tal como se describe más arriba (Ejemplo 3). Las biopsias molidas se resuspendieron en 600 µl de tampón de lisis.
Evaluación estadística
Los valores medios de dos grupos diferentes se compararon con el llamado "nonparametric Mann-Whitney rank sum test" (prueba de suma de rangos de Mann-Whitney no paramétrica). Un valor p < 0,05 se consideró como diferencia significativa y se representa en los diagramas.
Ejemplo 7: Observaciones con respecto a los diferentes procedimientos de tinción realizados
Para identificar el tipo de célula que absorbe y expresa el ARNm in vivo se utilizó un procedimiento histológico que posibilita la detección de la transferencia de ARNm junto con una tinción específica de tipo de célula.
Dado que la transferencia de ARNm no se pudo detectar con sondas fluorescentes, se llevó a cabo un procedimiento en el que se utilizó el ARNm codificador de -galactosidasa de Escherichia coli en combinación con diferentes colorantes índigo (X-gal o magenta-gal).
- 1.
- Características especiales del sistema de detección de -galactosidasa
Con el fin de asegurar que todas las células se encontraban en una sola capa para el procedimiento de tinción con índigo, se prepararon secciones finas de la oreja de ratón. La preparación de estas secciones resultó muy difícil teniendo en cuenta la morfología del pabellón auditivo de los ratones (una capa fina con un grosor de aproximadamente 0,5-1 mm), el hecho de que sólo se pueden utilizar criosecciones (la -galactosidasa se inactiva por calor durante algunos pasos necesarios para preparar secciones de parafina), y el requisito de secciones y a ser posible numerosas subsecciones de alta calidad. No obstante, fue posible preparar varios grupos de secciones de buena calidad con un espesor de 20 µm. Se utilizaron dos colorantes diferentes para detectar la actividad de -galactosidasa. En el caso del X-gal (las células positivas se teñían de verde azulado) se obtuvieron resultados con un mejor contraste que con magenta-gal (las células positivas se teñían de violeta). Sin embargo, en el caso de la tinción con X-gal se podían observar al mismo tiempo fuertes coloraciones de fondo no específicas, por ejemplo provocadas por folículos pilosos. No obstante, existía una diferencia clara con respecto a la transferencia de ARNm. En el caso del magenta-gal no se observó ninguna coloración de fondo no específica.
- 2.
- Requisitos para una tinción con índigo y una inmunotinción combinadas
La combinación de una tinción de transferencia de ARNm (colorante índigo) y una tinción marcadora específica de células (anticuerpo específico) requirió varias adaptaciones en relación con el agente fijador y el orden de las tinciones combinadas (la tinción con índigo incluyó 14 horas de incubación a 37ºC). Los mejores resultados para la tinción con anticuerpos (contra moléculas MHC II) se obtuvieron realizando primero una fijación con acetona y la tinción con anticuerpos. En cambio, los mejores resultados para la actividad de -galactosidasa se obtuvieron realizando primero una fijación con una mezcla de formaldehído y glutaraldehído y la tinción con índigo. Teniendo en cuenta estos hechos se eligió el siguiente procedimiento: fijación con formaldehído, pero
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sin glutaraldehído y la tinción con anticuerpos. El glutaraldehído tuvo que omitirse porque aumenta drásticamente la autofluorescencia del tejido, mientras que solo tenía un ligero efecto, si es que tenía alguno, en la calidad de la tinción con índigo. La fijación con formaldehído se utilizó por varios motivos:
- 1.
- la morfología del tejido se protegía mejor de este modo que con acetona;
- 2.
- una tinción nítida y fuerte requiere una fijación con formaldehído; y
- 3.
- no obstante, la calidad de la tinción con anticuerpos anti MHC II era aceptable con formaldehído.
Con el fin de eliminar lípidos y grasas se llevó a cabo una breve incubación en acetona pura. Esto posibilitó una mayor calidad (pocas o ninguna burbuja de aire) con el medio hidrosoluble utilizado. Por último, sólo se obtuvieron tinciones con anticuerpos de buena calidad cuando dicha tinción se realizó en primer lugar. El orden de tinción (fijación con formaldehído) solo tuvo un ligero efecto en la calidad de la tinción con índigo.
3. Compatibilidad de colorantes en las tinciones con índigo e inmunotinciones combinadas
La combinación de dos tinciones diferentes no sólo requería la compatibilidad de los diferentes pasos de los dos protocolos, sino también la compatibilidad de las sondas utilizadas para la detección. En principio es posible realizar una inmunotinción con colorantes precipitantes (sonda enzimática) o con colorantes fluorescentes (sonda marcada). Con el fin de combinar la tinción con índigo con un colorante precipitante se utilizan X-gal y AEC. En esta tinción, las células doblemente positivas aparecen en negro (Figura 15). En este contexto puede resultar difícil la diferenciación de células positivas individuales con una tinción intensa. Por ello era preferible la combinación de magenta-gal con el colorante fluorescente Alexa Fluor 546. La utilización de magenta-gal en lugar de X-gal era preferible por dos motivos:
- 1.
- la intensidad de la tinción con magenta-gal era generalmente más débil (incluso cuando el colorante se añadía en cantidades saturadas);
- 2.
- el color de las células positivas en magenta-gal coincidía más con la longitud de onda de emisión del colorante fluorescente Alexa Fluor 546.
Los dos factores reducen al mínimo la extinción de la señal fluorescente de Alexa Fluor 546. Esta combinación de colorantes posibilitaba realmente la detección de las dos señales (Figura 13), al menos cuando la tinción con índigo no era demasiado fuerte (esto ocurría generalmente en el caso de las células positivas en transferencia de ARNm en las secciones).
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