KR101545660B1 - 안티센스 제제 - Google Patents

Abstract

실온에서 안정한 최소 응집 액체 제제는 서열번호 1을 포함하거나, 또는 서열번호 1과 3개 이하의 비-연속적 염기(non-sequential base)가 상이한 변이체 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 및 모노사카라이드와 디사카라이드 및/또는 당 알코올로 구성된 군으로부터 선택된 응집-방지 화합물을 포함하는 수성 담체를 포함한다.

Description

안티센스 제제{Antisense formulation}

본 발명은 실온 보관-안정 올리고뉴클레오티드 액체 제제(room temperature storage-stable oligonucleotide liquid formulation)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 응집체 형성을 최소화하는 Hsp27 mRNA에 결합하도록 설계된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 안정한 제제에 관한 것이다.

Hsp-27 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)는 인간 Hsp27 단백질의 생성을 억제하기 위해 Hsp27 mRNA에 결합하도록 설계된다. 미국특허 제7,101,991호는 다양한 Hsp27 ASO를 개시한다.

인산염 완충 염수(phosphate buffered saline, PBS), 7.4의 표적 pH의 등장액 중에 제제화된 OGX-427, 또는 서열번호 1의 Hsp27 ASO의 초기 동물 연구 투여량은 우수한 생물학적 효과를 보였다. 그러나, ASO의 보다 높은 농도에서, OGX-427 제제는 주변 온도 및 냉장 조건 모두에서 수일 후에 비-공유결합성 응집체를 형성했고, 그 결과 임상적 용도를 위해 부적절했다. PBS 제제 용액은 유사한 안티센스 산물에 대해 만족스럽게 작용했고(클러스테린 ASO에 대한 미국특허 제6,900,187호 참조) 유사한 제제 용액이 HSP27 ASO에 대해 사용될 수 있을 것으로 예상되었다. 그러나, 앞서 설명되고 하기에서 입증되는 바와 같이, HSP27 ASO의 PBS 용액은 임상적 제제로서 실용적이지 않았다.

ASO 약물 제품의 주사 투여를 위한 액체 제제는 적합한 장기적 안정성을 보장하기 위해 통상적으로 냉장되었다. 사용 직전에 재구성되는, 올리고뉴클레오티드 제제의 분말로의 동결 건조(동결-건조)는 적합한 안정성 프로파일을 갖는 약물 제품 전달 시스템을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 올리고뉴클레오티드의 액체 제제는 상당한 상업적 잇점을 가지며, 특히, 주변(실온) 조건 하에 안정하게 유지되는 제제는 상당한 잇점을 갖는다.

미국특허출원 공개 2003/0119768은 c-myc mRNA를 표적화하는 15-머 안티센스 서열, 즉, AACGTTGAGG GGCAT (서열번호 2)에 관한 관찰을 개시한다. 연속된 4개의 G 잔기를 포함하는 이 서열은 응집되어 증가된 독성을 갖는 다량체(multimer)를 형성하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 상기 공개문헌은 사용 전 다량체의 파괴를 개시했다. 개시된 하나의 방법은 동결건조 전 만니톨, 수크로오스 글루코오스, 트리할로오스(trialose) 또는 락토오스와 같은 사카라이드 동결보호제(cryoprotectant)의 첨가이다. 이것은 물에 의한 재구성 시 다량체 형성을 감소시키는 것으로 확인되었다. 그러나, 장기적인 용액 안정성 및 응집의 회피에 관한 정보는 없었다.

응집될 수 있는 ASO는 생물학적 효능과 관계없이, 회사의 약물 파이프라인에 대해 불리한 임상적 후보이고, 더 개발되지 않을 것이다. 그러나, 인 비보에서 Hsp27 ASO의 생물학적 특징은 매우 유리해서 연장된 기간 동안 액체 제제로 보관될 때 응집 및 안정성의 문제를 극복하기 위한 노력이 이루어졌다.

추가적으로, ASO 치료제는 제조하기에 비싸고 그들의 폐기물이나 보관 비용의 감소는 부가 혜택이고 상업화가능한 약물과 상업화가 불가능한 약물 간의 차이가 될 수 있다.

서열번호 1을 갖는 ASO의 허용가능한 용액 안정성을 제공하고 비-공유결합성 응집을 감소시키는 제제를 찾기 위한 테스트에서, 만니톨 (5%)은 24주의 기간 동안 -20℃ 내지 60℃ 범위의 온도에서 매우 낮은 응집 수준을 유지할 수 있는 것으로 확인되었다. 만니톨 대신 덱스트로오스가 사용된 경우 유사한 결과가 관찰되었다. 이 기간 동안 전반적 안정성이 40℃까지 우수했다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1을 포함하거나, 또는 서열번호 1과 3개 이하의 비-연속적(nonsequential) 염기가 상이한 것인 변이체 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ASO, 및 덱스트로오스 및 락토오스와 같은 모노 및 디사카라이드 및 만니톨 및 소르비톨과 같은 당 알코올로부터 선택된 응집-방지(aggregation-preventing) 화합물을 포함하는 수성 담체를 포함하는, 실온에서 안정한 최소 응집 약물 제품 액체 제제(room temperature stable and minimal aggregate drug product liquid formulation)에 관한 것이다. 특정한 구체예에서, 상기 ASO는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 3개 이하의 비연속적 염기가 상이한 변이체로 구성된다. 상기 담체는 또한 포스페이트 완충액 또는 트리스(Tris) 완충액을 포함할 수 있다.

첨부된 도면과 함께 본 발명의 특정한 구체예의 하기 설명을 검토하면 본 발명의 다른 양태 및 특징들이 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다.

통상적인 올리고뉴클레오티드 화합물에서, 포스페이트 기는 직선형 중합체 화합물을 형성하기 위해 상호 간에 인접한 뉴클레오시드에 공유결합에 의해 결합된다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트 기는 올리고뉴클레오티드의 인터뉴클레오티드(internucleotide) 백본을 형성하는 것으로 지칭된다. RNA 및 DNA의 정상적인 결합 또는 백본은 3'에서 5'으로의 포스포디에스테르 결합(3' to 5' phosphodiester linkage)이다.

OGX-427은 열 충격 단백질 27(Hsp27)의 발현을 억제하는 표적화된 ASO 치료제이다. OGX-427 약물 물질 또는 활성 약제학적 성분(active pharmaceutical ingredient, API)은 통상적으로 4-12-4 MOE 갭머(gapmer) 올리고뉴클레오티드로 분류된 포스포로티올화 인터뉴클레오티드 결합을 갖는 합성 올리고뉴크레오티드이다(갭머의 검토를 위해, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Isis Pharmaceuticals 특허 EP 0618925를 참조하고, OGX-427에 대한 구체적인 정보를 위해 미국특허 제7,101,991호를 참조한다).

OGX-427 (Hsp27 ASO 서열번호 1)은 하기와 같이 표시될 수 있다:

상기에서, 밑줄친 뉴클레오시드

는 리보뉴클레오시드 구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 5-메틸유리딘의 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형을 나타내고; 상기 G, ^MeC, 및 T는 데옥시리보뉴클레오시드 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시-5-메틸시티딘, 및 2'-데옥시티미딘을 나타내며, 뉴클레오티드간 결합(internucleotide linkage)은 포스포로티오에이트 디에스테르(소디움 염)이다.

OGX-427의 CAS 등록 번호(CAS#)는 915443-09-3이고 CAS Index 명칭은 "DNA, d(P-티오)([2'-O-(2-메톡시에틸)]rG-[2'-O-(2-메톡시에틸)]rG(-{2'-O-(2-메톡시에틸)]rG-[2'-O-(2-메톡시에틸)]rA-m5rC-G-m5rC-G-G-m5rC-G-m5rC-T-m5rC-G-G-2'-O-(2-메톡시에틸)]m5rU-{2'-O-(2-메톡시에틸)]m5rC-[2'-O-(2-메톡시에틸)]rA-[2'-O-(2-메톡시에틸)]m5rU), 노나데카소디움 염이다.

본 발명은 OGX-427의 제제 및 OGX-427과 실질적으로 동일한 안티센스 치료제의 제제에 적용된다. 따라서, 그들은 서열번호 1로 구성되거나, 또는 본 발명의 제제 중의 ASO는 Hsp27의 발현을 억제하는 능력을 유지하는 서열번호 1 대비 3개 이하의 비-연속적 염기가 변화된 것인 이 서열의 올리고뉴클레오티드 변형체로 구성된다. ASO는 또한 올리고뉴클레오티드이고(길이가 100개 미만의 염기로 구성됨) Hsp27의 발현을 억제할 수 있는 능력을 유지하면서, 말단 염기의 첨가를 통해 서열번호 1, 또는 전술된 변형체보다 더 길 수 있다. 그와 같이 더 긴 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 1 대비 3개 이하의 비-연속적 염기가 변화된 것인 이 서열의 올리고뉴클레오티드 변형체를 포함한다.

OGX-427의 특정한 서열은 응집이 단지 20의 올리고뉴클레오티드 서열 중 구아노신 리보뉴클레오시드(G)의 갯수에 의해 영향받을 가능성을 시사했다. OGX-427에 9개의 구아노신 잔기가 존재한다; 서열의 약 50%를 포함하는 갯수이다. 응집은 강력한 와트슨-크릭 상보성 염기 상호작용 또는 보다 높은 차수의 구조(higher-order structure)의 형성에서 기인될 수 있으나, 응집에 대한 특정한 메카니즘에 한정되는 것은 출원인의 의도가 아니다.

전술된 바와 같이, OGX-427을 위한 제제의 최초 선택은 pH 7.4의 PBS 용액이었다. 보다 높은 농도에서, HPLC 크로마토그램에서 추가적인 피크가 용액에서 관찰되었다; 이 피크는 이후에 비-공유결합성 응집체로 확인되었다.

일화적인 과거 정보는 응집 문제의 가능성을 갖는 안티센스는 본질적으로 개발되지 않아서, 선행 문헌에 응집 및 불량한 안정성의 문제를 해결하는 방법에 대한 교시는 없다는 것을 시사한다.

따라서, 출원인은 다수의 실험적 요건, 즉, OGX-427의 요구되는 용해도 및 안정성 및 OGX-427 제품과 정맥내(IV) 투여의 적합성(compatibility)을 달성하기 위한 잠재적 부형제를 선택했다.

PBS 중의 OGX-427은 OGX-427의 응집에 영향을 미칠 수 있는 것으로 가정된 조건 및 다양한 종류의 부형제의 모니터링에서 대조군으로 작용하였다. 염화나트륨 또는 기타 염의 존재 하에 형성된 비-공유결합성 응집체의 파괴는 제제 설계를 보조할 수 있었다. 마찬가지로, 사이클로덱스트린은 약물을 캡슐화할 수 있었고, 이는 OGX-427 응집체의 형성을 방지할 수 있다. 유기 공용매(cosolvent)의 도입은 응집을 가져올 수 있는 수소-결합 형성을 파괴할 수 있다. 이 범주 내에서, DMSO는 응집체 형성을 역전시킬 수 있는 것으로 OncoGenex에 의해 구체적으로 공지되었다. 단순 당(simple sugar)을 포함하는 제제는 또한 응집을 억제하기 위해 수소 결합 상호작용을 변형시킬 수 있다. 상이한 종류의 부형제의 스크리닝에서, 표 1에 표시된 바와 같이, Hsp27 ASO 서열번호 1의 응집을 방지하는 능력의 측면에서 이 제제들 간에 유의성 있는 차이가 관찰되었다.

일반적으로 당/당 알코올은 유망한 것으로 보였으나, 실험적 노력은 이 종류의 부형제의 가능성 있는 대표적인 것으로서 좁혀진 선택에 집중되었다. 추가적인 개발은 제조되고 응집체 형성 및 일반적인 안정성에 대해 24주까지 정기적으로 연구된 만니톨과 덱스트로오스를 포함한 원형 제제(prototype formulation)를 포함한 여러 원형 제제를 가져왔다. 이 연구들로부터의 결과는 선택된 제제가 수주 동안 40℃에서의 보관에서도 안정성을 갖는다는 탁월한 증거를 보였다. 결과는 OGX-427을 위한 잠재적인 장기 실온 보관 액체 제제를 나타냈다.

관찰결과를 일반적인 안티센스 올리고뉴클레오티드까지 확장(extrapolate)하는 결과에 근거하여, 관련된 화합물("포스포르티오에이트 올리고뉴클레오티드"), 특히 높은 GC 함량, 예를 들면, 50%를 초과한 GC 함량, 보다 구체적으로 65%를 초과한 GC 함량을 갖는 화합물은 만니톨, 덱스트로오스, 또는 기타 당 또는 당 알코올, 및 선택적으로, 본 발명에서와 같이 포스페이트 완충액과 같은 적합한 완충액을 이용하는 것에 의해 액체 제제 중에서 실온에서 안정하게 유지될 수 있다.

그와 같은 조성물은 바람직하게는 안티센스가 당 또는 당 알코올과 함께 액체 제제로 제제화되고, 6시간을 초과하는 시간 동안, 선택적으로 12시간 또는 18 시간을 초과하는 시간 동안 액체 상태로 유지되고, 그 후, 상기 액체 제제가 치료 조성물로 이용되는 것인 방법에서 이용될 수 있다.

본 발명의 구체예를 예시하는 도면에서,
도 1은 40℃에서 보관 0일차, 3일차, 및 5일차에 포스페이트 완충 염수(-70-75 mg/mL) 중의 OGX-427에 대한 2개의 피크(좌측 피크는 OGX-427 올리고뉴클레오티드 단량체이고, 우측 피크는 응집체이다)를 보여주는 확장(expanded) HPLC 크로마토그램이고, 시간의 경과에 따른 응집체의 증가를 보여준다;
도 2는 OGX-427 올리고뉴클레오티드 및 그의 응집체(우측 피크)를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. 높은 정도로 응집된 시료(>50%)는 PBS 중에 200 mg/mL OGX-427을 포함하도록 제조된 용액으로부터 생성되고, 분석 전 주변 온도에서 4일 숙성되었다;
도 3은 완충액을 포함하지 않는 5% 덱스트로오스 수성 제제 중에서 0일차, 3일차, 및 5일차에 40℃에서 25 mg/mL의 OGX-427의 확장 HPLC 크로마토그램이다(완충제를 포함하지 않는 5% 만니톨 제제는 실질적으로 동일한 결과를 보임, 표 1 참조);
도 4는 0일차, 3일차 및 5일차에 40℃에서 Captisol™ 제제 중 25mg/mL의 OGX-427의 확장 HPLC 크로마토그램이고; 응집체 형성의 증가를 보여준다;
도 5는 5개의 제제, 즉, 5% 만니톨 (V1), 10 mM 트리스 완충액 pH 7.4 중 5% 만니톨 (V2), 10 mM 소디움 포스페이트 완충액 pH 7.4 중 5% 만니톨(V3), 5% 덱스트로오스 (V4), 및 10 mM 트리스 완충액 pH 7.4 중 5% 덱스트로오스 (V5)에 대한 60℃의 보관 온도에서 4주 동안의 OGX-427 주요 피크 면적(main peak area)% 순도(~25 mg/mL)의 그래프 표현이다;
도 6은 24주 동안 -20, 2-8, 25, 40 및 60℃의 온도에서 5% 만니톨 및 10 mM 소디움 포스페이트 완충액 pH 7.4 제제(V3)의 안정성(OGX-427 농도로 표시됨)의 그래프 표현이다;
도 7은 24주 동안 -20℃, 2-8℃, 25℃, 40℃ 및 60℃의 온도에서 5% 만니톨 및 10 mM 트리스 완충액 pH 7.4 제제(V2)의 안정성의 그래프 표현이다; 및
도 8은 유리 바이알 중에서 12주 시점에 해당하는 안정성 시료(V1-V5)의 사진이다. ~25 mg/mL의 농도에서 OGX-427의 일반화된 분해의 효과가 용액의 착색(darkening)으로 용이하게 관찰될 수 있다. 바이알 19 = 10 mM 포스페이트 완충액 중 5% 만니톨 또는 V3; 바이알 18 = 10 mM 트리스 완충액 중 5% 만니톨 또는 V2, 바이알 17 = 5% 만니톨 또는 V1; 바이알 16 = 10 mM 트리스 완충액 중 5% 덱스트로오스 또는 V5; 및 바이알 15 = 5% 덱스트로오스 또는 V4.

재료 및 방법

장치

HPLC System은 UV 검출 및 오토샘플러(autosampler)가 장착된 Shimadzu LC-10; 및 Delta Pak™ HPLC 컬럼(C18 5㎛ 300Å 2.1 x150 mm)이었다.

화학물질

D-만니톨, 덱스트로오스, 트리스 히드록시메틸아미노메탄(Tris), 인산, 제1인산나트륨, 제2인산나트륨, 테트라부틸암모늄 히드로겐 술페이트, 아세토니트릴, 소르비톨, 락토오스, 수크로오스, 타르타르산, 폴리소르베이트 80 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트, 포스페이트 완충액, PEG-300, PEG-400 및 디메틸-아세트아미드와 같은 표준 완충액, 당 및 용매를 Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Spectrum Chemicals (Gardena, California), VWR (West Chester, PA), 또는 JT Baker (Phillipsburg, NJ)로부터 수득하였다.

계약 제조업체가 출원인을 위해 OGX-427를 제조하였다.

Cremphor™ EL 폴리에톡실화 피마자유, Poloxamer™ 407 알파-히드로-오메가-히드록시폴리(옥시에틸렌), 폴리(옥시프로필렌)b 폴리(옥시에틸렌)a 블록 공중합체, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜과 같은 중합체를 BASF (Florsham Park, NJ)로부터 수득하였다.

사이클로덱스트린인 Captisol™은 CyDex (Lenexa, KS)의 제품이었다.

방법

Hsp27 ASO 서열번호 1을 25 mL 용량 플라스크에 담긴 멸균 수 중 250 ㎍/mL Hsp27 ASO 서열번호 1의 농도에서 분석의 각 경우를 위한 표준으로 제조하였다. 5-포인트 선형 곡선을 작성하기 위해 25 내지 250 ㎍/mL의 희석을 위한 출발 용액으로 작용하였다. 각 보정 점(calibration point)을 HPLC로 1회 주입하였다.

RP-HPLC 방법

본 연구에서 생성된 시료를 5O℃의 컬럼 온도에서 20 mM 테트라부틸암모늄 히드로겐 술페이트와 20 mM 트리스 염기 pH 7.8의 이동상 "A"; 아세토니트릴의 이동상 "B"; 및 물의 이동상 "C"를 이용하여 역상(RP)-HPLC 방법에 의해 분석하였다. 유속은 0.35 mL/분이었다. 시료를 적합한 농도까지 물로 희석하고 HPLC 바이알로 옮기고 주입 전에 냉각된 오토샘플러에서 유지시켰다. 주입 용량은 10 ㎕였고 검출은 260 nm에서 UV 흡수에 의해 수행하였다.

Hsp27 ASO 안정성 및 응집체 형성을 전술된 HPLC 방법을 이용하여 평가하고, 정규 피크 및 응집된(aggregated) 피크에서 화합물의 비율(percentage)로 계산하거나 또는 농도 mg/mL로 기록하였다.

실시예 1

부형제 스크리닝 연구

정맥내(IV) 투여를 위한 액체 및/또는 동결건조 제제의 가능성을 평가하기 위해 지지성(proponent) 부형제를 선택하였다. OGX-427의 최초의 PBS 제제가 대조군으로 작용했다(~75 mg/mL).

제제가 주변 온도보다 4O℃에서 및 보다 높은 농도에서 보다 빠르게 응집된다는 사전 관찰에 근거하여 "가속화 조건(accelerated condition)"을 시뮬레이션하기 위해 제제를 4O℃에서 및 75 mg/mL의 농도에서 숙성(age)시켰다.

150 mg/mL 스톡 용액을 제조한 후, 분량(aliquot)을 연구를 위한 표적 농도의 두배까지 제조된 비히클로 1:1 희석시켰다. 최종 용액은 ~75 mg/mL OGX-427의 표적 농도 및 부형제를 포함했다. 각 시료를 1.5 mL 튜브 내에 제조하고 튜브를 닫고 시료를 혼합하기 위해 짧게 볼텍싱(vortex)시켰다. 제조 후에, 연구를 위해 시료를 40℃ 챔버로 옮겼다. 모든 비히클(공용매 기반 비히클 제외)을 OGX-427 용액의 제조에서 사용하기 전에 여과시켰다. 모든 연구 시료를 스톡 용액의 제조 완료 후 약 60분 내에 제조하였다.

HPLC 시료 제조.

OGX-427 용액을 물로 1000-배 희석하여 HPLC 주입을 위한 750 ㎍/mL 시료를 수득하였다.

제조시(T=0) 및 40℃에서의 보관 5일 차(T=5)에 시료에 대해 기록된 정보가 표 1에 표시된다. 3일차 또는 T=3의 결과는 표시되지 않으나 T=5 데이터와 동일한 경향을 따른다. 도 3, 4a 및 4b는 덱스트로오스, PBS, 및 10% Captisol™ 제제에 대한 결과를 반영한다.

표 1. 40℃에서 보관된, 다양한 부형제 중 75 mg/mL 농도에서 0일차(T=0) 및 5일차(T=5)의 Hsp27 ASO 서열번호 1(OGX-427) 응집

5일 동안 및 가속화된 테스트 조건 하에서 관찰된 일부 부형제의 성능에 명확한 차이가 있었다. OGX-427 응집의 양을 감소시키거나 또는 응집을 방지하는데 있어서, 즉, OGX-427을 단량체로 유지하는데 있어서 최초의 PBS 제제보다 현저하게 우수한 일부 제제는 5% 덱스트로오스 및 5% 만니톨 및 수크로오스, 락토오스 및 소르비톨과 같은 관련된 부형제를 포함했다.

유기 공용매가 수소 결합 형성 및 후속 응집체 형성을 방해할 것으로 예상될 수 있었으나, 그들의 전반적 거동은 응집체 형성을 방지하는데 기여하지 않았기 때문에, 초기 스크리닝 후에 유기 공용매에 대해 추가적인 테스트를 수행하지 않았다.

실시예 2

액체 원형 제제(Liquid Prototype Formulation)

인산나트륨 또는 트리스 완충액 또는 미완충(unbuffered) 조건과 조합된, 덱스트로오스 또는 만니톨에 중점을 둔 추가적인 실험을 수행하였다.

25 mg/mL로 제제화된 OGX-427를 포함하는 5개의 액체 원형 제제를 온도 및 시간에 대해 연구하였다: 5% 만니톨 (V1), 5% 만니톨 및 10 mM 트리스 완충액, pH 7.4 (V2), 5% 만니톨 및 10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4 (V3), 5% 덱스트로오스 (V4), 및 5% 덱스트로오스 및 10 mM 트리스 완충액, pH 7.4 (V5).

모든 이와 같은 원형 용액은 최대 4주 동안 -20℃, 5℃, 25℃ 및 심지어 40℃에서 순도 결과에 근거하여 비교적 안정하게 유지되었다. 마찬가지로, 용액의 pH 및 삼투몰농도(osmolality)가 안정하게 유지되었다. 모든 제제는 (도 8에 도시된 바와 같이) 60℃에서 유의성 있는 분해를 보였다; 그러나, 원형 V1, V4 및 V5는 V2 및 V3만큼 우수한 성능을 보이지 않았다(도 5); 2주차 시점에서 알 수 있는 바와 같이, 60℃에서 보관된 제제에서 육안으로 탈색 및 입자들을 관찰할 수 있었다. 데이터는 이 3개의 제제가 보다 가혹한(harsher) 조건에서 1차 분해(first-order) 분해를 보였다는 것을 나타냈다. 따라서, (완충 또는 미완충) 덱스트로오스가 5일 응집 테스트에서 일부 유망성을 보였으나, 매우 높은 온도(6O℃)에서 보관된 경우, 완충된 만니톨보다 열등했다. 24주차 까지의 조건 동안, 이 완충된 만니톨 원형 제제 V2 및 V3은 모든 보관 조건에서 투명하고, 무색이고, 가시적인 입자를 보이지 않았다. V2(표 2) 및 V3(표 3)에 대한 % 응집체 결과에서 일부 변동성이 관찰되었으나, 관찰된 응집의 양은 낮은 수준에서 유지되었다(또한 특정 조건 하에 가역성 때문에 더 낮을 수 있음).

표 2: 만니톨-트리스 완충액에 대한 % 응집체(24 주)

표 3: 만니톨-포스페이트 완충액에 대한 % 응집체(24 주)

가속화 노화 조건(최대 40℃) 하에서도 만니톨-포스페이트 완충 용액은 냉장을 요하는 올리고뉴클레오티드의 통상적인 액체 제제 대비 우수한 안정성을 제공했다. 또 다른 흥미로운 관찰은 트리스 완충액은 인산나트륨 완충액만큼 우수하지 않았다는 것이었다(각 제제에 대해 24주 동안 다양한 온도 조건을 보여주는 도 6과 7, 및 보다 짧은 기간 동안(4주)에 대한 모든 5개의 원형을 보여주는 도 5를 참조한다).

도 6에 도시된 바와 같이, V3 제제(5% 만니톨 및 10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4 중 25 mg/mL OGX-427)의 순도는 40℃를 포함한 보관을 위한 연구 내내 잘 유지되었고, 이는 상기 제제가 OGX-427을 순수한 올리고뉴클레오티드로 유지한다는 것을 나타낸다. OGX-427 농도의 감소가 2주차까지 60℃에서 보관된 제제에서 관찰되었다. 그러나, 그 온도에서도, 분석은 60℃에서 순도의 손실은 응집체 형성보다는 단량체 분해를 반영한다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명의 제제의 일부 구체예에서, ASO는 만니톨을 포함하는 수성 담체 중에 제제화된다. 만니톨의 양은 원하는 보관 기간 동안 안정성을 제공하기에 충분한 양, 예를 들면, 1 내지 10 중량%이어야 한다. 바람직한 제제에서, 담체는 생체적합(biocompatible) pH, 예를 들면, 7.1 내지 7.5에서 완충된다. 특정한 적합한 완충액, 포스페이트 완충액, pH 7.4 또는 트리스 완충액 pH 7.4을 포함한다. 이 제제들은 냉장 조건 하에서 및 또한 실온에서 연장된 기간 동안 안정하다. 다른 구체예에서, 본 발명의 제제에서, ASO는 덱스트로오스를 포함하는 수성 담체 중에 제제화된다. 덱스트로오스의 양은 원하는 보관 기간 동안 안정성을 제공하기에 충분한 양, 예를 들면, 1 내지 10 중량%이어야 한다. 바람직한 제제에서, 담체는 생체적합 pH, 예를 들면, 7.1 내지 7.5에서 완충된다. 특정한 적합한 완충액은 포스페이트 완충액, pH 7.4 또는 트리스 완충액 pH 7.4를 포함한다. 이 제제들은 냉장 조건 하에서, 및 또한 실온에서 모두 연장된 보관 기간 동안 액체 용액으로서 안정하다.

SEQUENCE LISTING <110> ONCOGENEX TECHNOLOGIES INC. Hayes, Thomas Krilla, Nicole Nixon, Lori <120> ANTISENSE FORMULATION <130> ongx_p_001WO <150> US 61/082,155 <151> 2008-07-18 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense for HSP27 <400> 1 gggacgcggc gctcggucau 20

Claims (23)

1. 인 비보 주사를 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제제화하는 방법으로서,
   (a) 제1 성분인 안티센스 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 성분과 별개인, 제2 성분인 당 또는 당 알코올을 수득하는 단계로서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 65% 이상의 GC 함량을 갖고, 상기 당 또는 당 알코올은 덱스트로오스, 만니톨, 소르비톨, 또는 수크로오스인 것인 단계;
   (b) 액체 수성 담체 중에 상기 제1 성분과 상기 제2 성분을 조합하여, 액체 안티센스 제제를 형성하고, 상기 액체 안티센스 제제를 6시간을 초과하는 기간 동안 액체 상태로 유지시키고, 그 후, 상기 액체 안티센스 제제를 인 비보 주사용 치료 조성물로 이용하는 것인 단계를 포함하고,
   상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 또는 하기와 같은 변형을 갖는 서열번호 1로 구성되는 것인 방법:
   5'- GGGA ^MeCG^MeCGG^MeCG^MeCT^MeCGG ^MeU^MeCA^MeU -3'
   상기에서, 이탤릭체로 기재된 뉴클레오시드(G, A, ^MeC, 및 ^MeU)는 리보뉴클레오시드 구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 5-메틸유리딘의 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형을 나타내고; 상기 G, ^MeC, 및 T는 데옥시리보뉴클레오시드 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시-5-메틸시티딘, 및 2'-데옥시티미딘을 나타내며, 인터뉴클레오티드 결합(internucleotide linkage)은 포스포로티오에이트 디에스테르(소디움 염)이다.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 청구항 1에 있어서, 상기 액체 수성 담체는 포스페이트 완충액을 더 포함하는 것인 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 액체 수성 담체는 트리스(Tris) 완충액을 더 포함하는 것인 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 청구항 1에 있어서, 상기 당 또는 당 알코올은 만니톨인 것인 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 만니톨은 상기 수성 담체 중에 5 중량%의 양으로 존재하는 것인 방법.
11. 삭제
12. 삭제
13. (a) 서열번호 1을 포함하거나, 또는 서열번호 1과 3개 이하의 비-연속적 염기(non-sequential base)가 상이한 변이체 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및
    (b) 덱스트로오스, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 및 수크로오스로 구성된 군으로부터 선택된 응집-방지 화합물을 포함하는 수성 담체를 포함하고,
    상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 또는 하기와 같은 변형을 갖는 서열번호 1로 구성되는 것인 실온 보관-안정 액체 제제:
    5'- GGGA ^MeCG^MeCGG^MeCG^MeCT^MeCGG ^MeU^MeCA^MeU -3'
    상기에서, 이탤릭체로 기재된 뉴클레오시드(G, A, ^MeC, 및 ^MeU)는 리보뉴클레오시드 구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 5-메틸유리딘의 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형을 나타내고; 상기 G, ^MeC, 및 T는 데옥시리보뉴클레오시드 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시-5-메틸시티딘, 및 2'-데옥시티미딘을 나타내며, 인터뉴클레오티드 결합(internucleotide linkage)은 포스포로티오에이트 디에스테르(소디움 염)이다.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 수성 담체는 포스페이트 완충액을 더 포함하는 것인 제제.
15. 청구항 13에 있어서, 상기 수성 담체는 트리스(Tris) 완충액을 더 포함하는 것인 제제.
16. 삭제
17. 청구항 13에 있어서, 상기 응집-방지 화합물은 만니톨인 것인 제제.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 만니톨은 상기 수성 담체 중에 5 중량%의 양으로 존재하는 것인 제제.
19. 청구항 13에 있어서, 상기 응집-방지 화합물은 덱스트로오스인 것인 제제.
20. 청구항 19에 있어서, 상기 덱스트로오스는 상기 수성 담체 중에 5 중량%의 양으로 존재하는 것인 제제.
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제

Images