CN102099041B - 反义制剂 - Google Patents

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Abstract

一种室温稳定并极少聚集的液体制剂，其包含一种寡核苷酸和一种水性载体；其中所述寡核苷酸包含Seq ID No.1或者包含一种变体寡核苷酸，所述变体寡核苷酸中不超过3个非连续碱基与Seq ID No.1不同；所述水性载体包含一种防止聚集的化合物，其选自单糖和二糖和/或糖醇。

Description

反义制剂
背景技术
1.发明领域
本发明涉及一种室温储存稳定的寡核苷酸液体制剂。更具体地，本发明涉及硫代磷酸寡核苷酸的稳定制剂，其设计结合Hsp27 mRNA，而Hsp27mRNA也将聚集体形成减至最少。
2.相关领域说明
Hsp-27反义寡核苷酸(ASO)设计结合Hsp27 mRNA以抑制人Hsp27蛋白产生。美国专利7,101,991描述了多种Hsp27 ASO。
在磷酸盐缓冲盐水(PBS)、目标pH 7.4的等渗溶液中配制的OGX-427或Hsp27 ASO Seq.Id.No.1剂量的早期动物研究显示良好的生物效应。但是，在更高浓度的所述ASO下，所述OGX-427制剂在室温和冷冻条件下数天之后都形成非共价聚集，因此不适合临床使用。PBS配制溶液曾经令人满意地用于类似的反义产品(参见涉及凝聚素ASO的美国专利6,900,187)，也曾经期待相似的配制溶液可用于HSP27 ASO。但是如上面解释以及下面显示，HSP27 ASO的PBS溶液不能实际用作临床制剂。
用于注射给药ASO药物产品的液体制剂习惯上冷冻以确保足够的长期稳定性。将寡核苷酸制剂冻干成粉末(冷冻干燥)并在使用之前复原可用于提供具有足够稳定特性的药物产品输送系统。但是，寡核苷酸的液体制剂具有显著的商业利益，尤其是在环境(室温)条件下保持稳定的制剂。
美国专利出版物2003/0119768公开了关于靶向c-myc mRNA的15聚体反义序列，即AACGTTGAGG GGCAT(Seq.ID No.2)的发现。观察到该序列包括4个连续的G残基，进行聚集以形成毒性增大的多聚体。因此所述出版物公开了在使用之前裂解所述多聚体。公开的一种方法为冻干之前加入糖类冷冻保护剂例如甘露醇、蔗糖、葡萄糖、trialose或乳糖。已发现这样在用水复原时减少多聚体形成。但是没有提供关于长期溶液稳定性和避免聚集的信息。
不管其生物学效能如何，经受聚集的ASO可能是公司药物计划的不适宜临床候选物，且不会进一步开发。但是，Hsp27 ASO的体内生物学特性非常适宜，因此做出努力以克服在液体制剂中长时间储存的聚集和稳定性问题。
另外，还应注意ASO药物生产仍然昂贵，其储存的浪费或成本的任何降低可能是另外的利益，并可能使可商业化和不可商业化药物产生差异。
发明内容
在试验发现提供可接受的溶液稳定性并减少具有Seq.ID No.1的ASO非共价聚集的制剂时，发现甘露醇(5％)能够在温度摄氏-20度到摄氏60度范围内保持极低聚集水平24周时间。当使用葡萄糖代替甘露醇时观察到相似的结果。在此时间内总体稳定性良好直至摄氏40度。因此，本发明提供了一种室温稳定并极少聚集的药物产品液体制剂，其包含一种ASO和一种水性载体；其中所述ASO包含Seq ID No.1或者包含一种变体寡核苷酸，所述变体寡核苷酸中不超过3个非连续碱基与Seq ID No.1不同；所述水性载体包含一种防止聚集的化合物，其选自单糖和二糖(例如葡萄糖和乳糖)，以及糖醇(例如甘露醇和山梨糖醇)。在特定的实施方案中，所述ASO由Seq ID No.1或者一种变体组成，所述变体中不超过3个非连续碱基与Seq IDNo.1不同。所述载体也可包含磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。
通过阅读下面本发明特定实施方案的说明并结合附图，本发明的其它方面和特征对本领域技术人员是显而易见的。
附图说明
在说明本发明实施方案的附图中，
图1为扩展HPLC色谱图，其显示磷酸盐缓冲盐水(～70-75mg/mL)中的OGX-427在40℃储存在第0、3、5天的两个峰(左峰为OGX-427寡核苷酸单体，右峰为聚集)，表明聚集随时间增加。
图2为HPLC色谱图，其显示OGX-427寡核苷酸及其聚集(右峰)。从制备的溶液中产生高度聚集的样品(＞50％)，其包含PBS中的200mg/mLOGX-427，并在分析之前在环境条件下老化4天。
图3为无缓冲5％葡萄糖水性制剂中25mg/mL的OGX-427在40℃在第0、3、5天的扩展HPLC色谱图(无缓冲5％甘露醇制剂产生实质相同的结果，参见表1)；
图4为CaptisolTM制剂中25mg/mL的OGX-427在40℃在第0、3、5天的扩展HPLC色谱图；显示聚集形成增加。
图5为5种制剂在储存温度60℃的4周中的OGX-427主峰面积百分比纯度(～25mg/mL)的绘图表示，5种制剂即：5％甘露醇(V1)、5％甘露醇在10mM Tris缓冲液pH 7.4中(V2)、5％甘露醇在10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4中(V3)、5％葡萄糖(V4)、5％葡萄糖在10mM Tris缓冲液pH 7.4中(V5)；
图6为5％甘露醇和10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4制剂(V3)在温度-20、2-8、25、40和60℃在24周中稳定性(以OGX-427浓度显示)的绘图表示；
图7为5％甘露醇和10mM Tris缓冲液pH 7.4制剂(V2)在温度-20、2-8、25、40和60℃在24周中稳定性的绘图表示；以及
图8为玻璃瓶中的对应稳定性样品(V1-V5)在12周时间点的照片。OGX-427在浓度～25mg/mL的整体降解效果可简单看作溶液的暗化。瓶19＝5％甘露醇在10mM磷酸盐缓冲液中或V3；瓶18＝5％甘露醇在10mM Tris缓冲液中或V2；瓶17＝5％甘露醇或V1；瓶16＝5％葡萄糖在10mM Tris缓冲液中或V5；以及瓶15＝5％葡萄糖或V4。
详细说明
在典型的寡核苷酸化合物中，磷酸盐基团共价连接相互邻近的核苷以形成线性聚合化合物。在寡核苷酸结构中，磷酸盐基团涉及形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常键或主链为3’到5’磷酸二酯键。OGX-427为抑制热休克蛋白27(Hsp27)表达的靶向ASO治疗剂。OGX-427药物物质或活性药物成分(API)为具有硫代磷酸核苷酸间键的合成寡核苷酸，其通常分类为4-12-4 MOE gapmer寡核苷酸(gapmer讨论参见IsisPharmaceuticals专利EP 0618925，通过引用结合到本文中，OGX-427详细信息参见美国专利7,101,991)。
OGX-427(Hsp27 ASO Seq.Id.No.1)可表示为：
5’-GGGA MeCGMeCGGMeCGMeCTMeCGG Me U Me CA Me U-3’
其中下划线标记的核苷(G、A、 Me C、和 Me U)表示核糖核苷鸟苷、腺苷、5-甲基胞苷和5-甲基尿苷的2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)修饰；其中G、MeC、和T代表脱氧核糖核苷2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧-5-甲基胞苷、和2’-脱氧胸苷；并且其中核苷酸间键为硫代磷酸二酯(钠盐)。
OGX-427的CAS登记号(CAS#)为915443-09-3，CAS索引名为“DNA，d(P-硫代)([2’-O-(2-甲氧基乙基)]rG-[2’-O-(2-甲氧基乙基)]rG(-{2’-O-(2-甲氧基乙基)]rG-[2’-O-(2-甲氧基乙基)]rA-m5rC-G-m5rC-G-G-m5rC-G-m5rC-T-m5rC-G-G-2’-O-(2-甲氧基乙基)]m5rU-{2’-O-(2-甲氧基乙基)]m5rC-[2’-O-(2-甲氧基乙基)]rA-[2’-O-(2-甲氧基乙基)]m5rU)，十九钠盐”。
本发明致力于OGX-427制剂以及与OGX-427实质相同的反义治疗剂制剂。因此，所述制剂由Seq.ID No.1组成，或者本发明制剂中的ASO由该序列的寡核苷酸变体组成，所述变体中不超过3个非连续碱基相对于Seq.IDNo.1变化，其保留抑制Hsp27表达的能力。所述ASO也可通过加入末端碱基而比Seq.ID No.1或上述变体长，而仍然是寡核苷酸(长度小于100碱基)并保留抑制Hsp27表达的能力。这种较长的寡核苷酸据说包含Seq.ID No.1或该序列的寡核苷酸变体，其中不超过3个非连续碱基相对于Seq.ID No.1变化。
OGX-427的具体序列提示聚集受长度仅20的寡核苷酸序列中鸟苷核糖核苷(G)数量影响的可能性。在OGX-427中有9个鸟苷残基；其数量几乎占该序列的50％。虽然申请人无意受限于任何具体的聚集机制，聚集可能是由于强Watson-Crick互补碱基作用或者由于高级结构形成。
如上所述，配制OGX-427的初选为pH 7.4的PBS溶液。在更高浓度下，溶液中观察到HPLC色谱中的附加峰；该峰后来确定为非共价聚集。
传闻历史信息提示，具有潜在聚集问题的反义化合物基本还未开发，从而本领域未留下如何解决聚集和低稳定性问题的教导。
因此申请人选择可能的赋形剂以达到多种实验要求：必需的OGX-427可溶性和稳定性，以及OGX-427产品与静脉(IV)给药的相容性。
OGX-427在PBS中在监测条件和多种赋形剂类型中作为对照，假定赋形剂可能影响OGX-427聚集。在氯化钠或其它盐存在下破坏形成的非共价聚集可帮助制剂设计。类似地，环式糊精可封装药物，可能防止OGX-427聚集体形成。引入有机共溶剂可能破坏氢键结合现象，否则聚集形成。在此类别中，通过OncoGenex明确知道DMSO帮助逆转聚集形成。包含单糖的制剂也可改变氢键结合作用以抑制聚集。筛选不同类型的赋形剂时已发现这些制剂之间在防止Hsp27 ASO Seq.Id.No.1聚集的能力方面差异显著，如表1所示。
虽然通常糖/糖醇在有限选择中看起来是有希望的实验成果，可能作为此类赋形剂的代表。进一步的开发产生了多种原始制剂，包括包含甘露醇和葡萄糖的制剂，其经定期制备并研究聚集形成与总体稳定性长达24周。所述研究的结果获得了选择的制剂甚至在高达40℃储存数周的情况下的稳定性的显著证据。该结果显示一种可能的长期室温储存的OGX-427液体制剂。
基于推断一般反义寡核苷酸观察的结果，相关化合物(“硫代磷酸寡核苷酸”)，尤其是GC含量高的化合物，例如超过50％，更具体地超过65％，通过使用甘露醇、葡萄糖或者其它糖或糖醇，以及可选的合适的缓冲液，例如本发明中的磷酸盐缓冲液，可在液体制剂中在室温下稳定。
所述组合物优选地用于一种方法，其中反义物在液体制剂中与糖或糖醇配制，并保持在液体状态超过6小时的时间，可选地超过12小时或18小时，在所述时间之后所述液体制剂用作治疗组合物。
材料与方法
设备
HPLC系统为Shimadzu LC-10，带有UV检测和自动取样器；以及DeltaPakTM HPLC柱
Figure GSB00000878726500051
化学药品
标准缓冲液、糖和溶剂例如D-甘露醇、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、四丁基硫酸氢铵、乙腈、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、酒石酸、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯(20)、去水山梨糖醇单油酸酯、磷酸盐缓冲液、PEG-300、PEG-400以及二甲基乙酰胺，购自Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Spectrum Chemicals(Gardena，California)，VWR(West Chester，PA，或JT Baker(Phillipsburg，NJ)。
OGX-427由合同生产商为申请人生产。
聚合物例如CremphorTM EL聚乙氧基化蓖麻油、PoloxamerTM 407α-氢-ω-羟基聚(氧乙烯)、聚(氧丙烯)b聚(氧乙烯)a嵌段共聚物、聚乙二醇-聚丙二醇、以及丙二醇，购自BASF(Florsham Park，NJ)。
CaptisolTM，一种环式糊精，为CyDex(Lenexa，KS)的产品。
方法
Hsp27 ASO Seq.Id.No.1为每次分析制备为标准物，其在无菌水中的浓度为250μg/mL Hsp27 ASO Seq.Id.No.1，置于25mL容量瓶。该溶液作为起始溶液用于25-250μg/mL的稀释物以建立5点线性曲线。每个校准点注入HPLC一次。
RP-HPLC方法
研究中产生的样品在柱温度50℃通过反相(RP)-HPLC方法分析，使用流动相“A”20mM四丁基硫酸氢铵和20mM Tris碱pH 7.8；流动相“B”乙腈；以及流动相“C”水。流速为0.35mL/min。用水稀释样品至合适的浓度，转移至HPLC瓶，在注入之前保持在冷却的自动取样器中。注入量为10μL，在260nm通过UV吸收检测。
使用如上所述的HPLC方法评估Hsp27 ASO的稳定性和聚集形成，并计算该化合物在正常和聚集峰的百分比，或者记录为浓度mg/mL。
实施例1
赋形剂筛选研究
选择支持的赋形剂以提供静脉(IV)给药液体和/或冻干制剂的可能性。OGX-427的初始PBS制剂作为对照(～75mg/mL)。
制剂在40℃和浓度75mg/mL下老化以模拟“加速条件”，依据是早前观察在40℃比在室温和更高浓度下聚集更快。
制备150mg/mL储存溶液之后，使用制备的载体1∶1稀释等分样品至研究目标浓度的2倍。最终溶液包含目标浓度～75mg/mL的OGX-427和赋形剂。每份样品在1.5mL管中制备，然后盖上管并短暂涡旋以混合样品。制备之后，样品移至用于研究的40℃房间。所有赋形剂(除了基于共溶剂的赋形剂)在用于OGX-427溶液制备之前过滤。所有研究样品在储存溶液完成约60分钟之内制备。
HPLC样品制备
OGX-427溶液在水中稀释1000倍以获得750μg/mL样品用于注入HPLC。
样品在制备(T＝0)和在40℃储存5(T＝5)天时记录的信息如表1所示。第3天或T＝3的结果未显示但与T＝5的数据趋势相同。图3、4a和4b反映了葡萄糖、PBS、和10％ CaptisolTM制剂的结果。
表1：在40℃和浓度75mg/mL下储存，Hsp27 ASO Seq.Id.No.1(OGX-427)在多种赋形剂中在时间(T)＝0和5天的聚集
Figure GSB00000878726500071
在5天时间内在加速的试验条件下观察到某些赋形剂的表现完全不同。有些在减少或防止OGX-427聚集量即保持OGX-427为单体方面明显优于初始PBS制剂，包括5％葡萄糖和5％甘露醇，以及相关赋形剂，例如蔗糖、乳糖和山梨糖醇。
在初筛之后没有进行有机共溶剂的进一步试验，因为其总体性质不能帮助防止聚集形成，尽管曾预期其可能干扰氢键结合以及随后的聚集形成。
实施例2
液体原始制剂
进行了进一步实验，专注于葡萄糖或甘露醇，结合磷酸钠或Tris缓冲液或者不缓冲。
针对温度和时间点研究了OGX-427配制成25mg/mL的5种液体原始制剂：5％甘露醇(V1)、5％甘露醇和10mM Tris缓冲液pH 7.4(V2)、5％甘露醇和10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4(V3)、5％葡萄糖(V4)、以及5％葡萄糖和10mM Tris缓冲液pH 7.4(V5)。
基于在-20℃、5℃、25℃以至40℃下的纯度结果，所有这些原始溶液保持相对稳定长达4周。同样，所述溶液的pH和摩尔渗透压浓度保持稳定。所有制剂在60℃表现出严重降解(如图8所示)；但是原始V1、V4和V5表现不如V2和V3好(图5)；到2周时间点时，肉眼可观察到在60℃储存的制剂的变色和微粒。数据表明这3种制剂在更严苛的条件下显现出一级降解。因此，虽然葡萄糖(缓冲或不缓冲)在5天聚集试验中显示某些前景，但其在极高温度(60℃)储存时不如缓冲的甘露醇。对于长达24周时间点的条件，这些缓冲的甘露醇原始制剂V2和V3对于所有储存条件均表现澄清、无色、并且无可见颗粒。虽然在V2(表2)和V3(表3)的百分比聚集结果中观察到某些差异，但观察到的聚集量保持在低水平(在某些条件下由于可逆性可能更低)。
表2：甘露醇-Tris缓冲液的百分比聚集结果(24周)
Figure GSB00000878726500091
表3：甘露醇-磷酸盐缓冲液的百分比聚集结果(24周)
Figure GSB00000878726500092
与需要冷藏的典型寡核苷酸液体制剂比较，所述甘露醇-磷酸盐缓冲溶液甚至在加速的老化条件(高达40℃)下仍然提供良好的稳定性。另一个令人感兴趣的观察是Tris缓冲液表现不如磷酸钠缓冲液好(参见图6和7，显示每种制剂在24周时间内的多种温度条件，以及图5，显示在较短的时间(4周)内的所有5种原始制剂)。
如图6所示，V3制剂(25mg/mL OGX-427在5％甘露醇和10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4中)的纯度在高达并包括40℃储存的整个研究过程中保持良好，表明该制剂将OGX-427保持为纯寡核苷酸。制剂在60℃储存到2周时间点时发现OGX-427浓度降低。但是即使在此温度，分析显示在60℃下的纯度降低反映了单体降解而不是聚集形成。
因此，在本发明制剂的一些实施方案中，ASO在包含甘露醇的水性载体中配制。甘露醇的量应为足以在所需储存期提供稳定性的量，例如以重量计1到10％。在优选的制剂中所述载体在生物相容的pH下缓冲，例如7.1到7.5。特别合适的缓冲液包括磷酸盐缓冲液pH 7.4或Tris缓冲液pH 7.4。这些制剂在冷藏条件下和室温下都在长期储存期间稳定。在其它实施方案中，在本发明的制剂中，ASO在包含葡萄糖的水性载体中配制。葡萄糖的量应为足以在所需储存期提供稳定性的量，例如以重量计1到10％。在优选的制剂中所述载体在生物相容的pH下缓冲，例如7.1到7.5。特别合适的缓冲液包括磷酸盐缓冲液pH 7.4或Tris缓冲液pH 7.4。这些制剂在冷藏条件下和室温下都在长期储存中稳定为液体溶液。
Figure IPA00001306953900011

Claims (19)

1.一种室温稳定并极少聚集的液体制剂，其包含
(a)寡核苷酸，其包含Seq ID No.1或者包含变体寡核苷酸，所述变体寡核苷酸中不超过3个非连续碱基与Seq ID No.1不同，以及
(b)水性载体，其包含防止聚集的化合物，所述化合物选自单糖和二糖和/或甘露糖和山梨糖醇，
其中所述寡核苷酸是硫代磷酸寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述载体进一步包含磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的制剂，其中所述载体进一步包含Tris缓冲液。
4.根据权利要求1、2或3中任一权利要求所述的制剂，其中所述反义寡核苷酸由Seq ID No.1或变体寡核苷酸组成，所述变体寡核苷酸中不超过3个非连续碱基与Seq ID No.1不同。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中所述寡核苷酸由具有如下修饰的Seq IDNo.1组成：
5’-GGGA MeCGMeCGGMeCGMeCTMeCGG Me U Me CA Me U-3’
其中下划线标记的核苷(G、A、 Me C、和 Me U)表示核糖核苷鸟苷、腺苷、5-甲基胞苷和5-甲基尿苷的2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)修饰；其中G、MeC和T代表脱氧核糖核苷2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧-5-甲基胞苷和2’-脱氧胸苷；并且其中核苷酸间键为硫代磷酸二酯键。
6.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的制剂，其中所述防止聚集的化合物为甘露醇。
7.根据权利要求4所述的制剂，其中所述防止聚集的化合物为甘露醇。
8.根据权利要求5所述的制剂，其中所述防止聚集的化合物为甘露醇。
9.根据权利要求6所述的制剂，其中所述甘露醇在所述水性载体中的含量以重量计为5％。
10.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的制剂，其中所述防止聚集的化合物为葡萄糖。
11.根据权利要求4所述的制剂，其中所述防止聚集的化合物为葡萄糖。
12.根据权利要求5所述的制剂，其中所述防止聚集的化合物为葡萄糖。
13.根据权利要求10所述的制剂，其中所述葡萄糖在所述水性载体中的含量以重量计为5％。
14.一种配制用于体内注射的反义寡核苷酸的方法，其包含将所述反义物在液体制剂中与单糖或二糖或甘露糖或山梨糖醇混合，并将所述制剂保持在液体状态超过6小时的时间，在所述时间之后所述液体制剂用作体内注射的治疗组合物，其中所述寡核苷酸具有50％或更高的GC含量，并且其中所述寡核苷酸是硫代磷酸寡核苷酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中将所述制剂保持在液体状态超过12小时的时间。
16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述制剂保持在液体状态超过18小时的时间。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述反义物根据权利要求1到13中任一权利要求配制。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述反义物具有65％或更高的GC含量。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述反义物具有75％或更高的GC含量。
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