JP5266046B2

JP5266046B2 - ヘリピロンａからなるしわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラニン抑制剤

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Description

本発明は、ヘリピロンＡ（Helipyrone A）に関する。

非特許文献１（Journal of ethnopharmacology 33(1991) p51-55 ）には、一般式（１）で示されるヘリピロンＡ（Helipyrone A）が抗菌作用を有することが開示されている。

Journal of ethnopharmacology 33(1991) p51-55 Esahak Ali, et al., Phytochemistry,1982,21,243-244

本発明の課題は、ヘリピロンＡ（Helipyrone A）に関する新たな作用を見出し、その有効利用を図ることである。

本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）一般式（１）で表されるヘリピロンＡ（Helipyrone A）からなるしわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、あるいはメラニン抑制剤。
一般式（１）

（２）ヘリピロンＡ（Helipyrone A）を有効成分として含有する美白用化粧料。

ヘリピロンＡ（Helipyrone A）に関して、新たに、一重項酸素消去、皮膚老化改善、しわ改善剤、たるみ改善、皮膚水分量改善、美白、メラニン抑制、一酸化窒素消去あるいは酸化防止の作用効果を確認した。これを活用した新規な各種の剤、医薬、食品、化粧品を提供することができる。

シワスコアを示すグラフ皮膚水分量を示すグラフ皮膚硬度を示すグラフカルボニル化タンパク質量（相対値）を示すグラフ皮膚組織中の8-hydroxy 2'-deoxy guanosine量（相対値）を示すグラフ皮膚組織中の過酸化脂質量を示すグラフ ESR法による一酸化窒素消去能を示すグラフ比色法（Ｇｒｉｅｓｓ法）による一酸化窒素消去能を示すグラフ比色法によるperoxynitrite消去能を示すグラフＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）増加抑制能を示すグラフロリクリン抑制能を示すグラフケラチン１抑制能を示すグラフ

ヘリピロンＡ（Helipyrone A）は、次の一般式（１）で表される。

一般式（１）

この、ヘリピロンＡ（Helipyrone A）には、しわ抑制効果、皮膚老化改善、光老化、美白剤、メラニン生成、抗酸化、一重項酸素消去、一酸化窒素消去等の新規な作用があることが知見できた。これらの新規な知見を基に、化粧料組成物、食品添加素材、医薬素材として、利用することができる。
化粧料、食品としては、しわ抑制効果、皮膚老化改善、光老化、美白剤、メラニン生成、抗酸化、一重項酸素消去が期待でき、皮膚老化改善剤、光老化抑制剤、美白剤、メラニン生成抑制剤、抗酸化剤、一重項酸素消去剤、一酸化窒素消去剤として使用することができる。

本発明のヘリピロンＡ（Helipyrone A）を含有する化粧料(医薬部外品を含む)としては、顔用あるいは手、足、身体用の保湿化粧料としてローション、乳液、クリーム、ジェル、多層型化粧料等が挙げられる。また、口紅、ファンデーション等のメイクアップ化粧料、洗顔料、ハンドウォッシュ、ボディシャンプー等の洗浄剤、シャンプー、リンス、トリートメント、育毛剤等の毛髪用化粧料として使用することもできる。

本発明のヘリピロンＡ（Helipyrone A）を含有する化粧料(医薬部外品を含む)には、ヘリピロンＡ（Helipyrone A）以外に、化粧料の組成物として一般的に使用されている素材を用いることができる。例えば、炭化水素油、エステル油、脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、ステロール、セラミド等の油剤、多価アルコール、糖、ピロリドンカルボン酸、アミノ酸、ベタイン等の保湿剤、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、半極性界面活性剤、レシチン等の界面活性剤、高分子乳化剤、水溶性高分子、パルミチン酸デキストリン等の増粘剤、無機粉体、有機粉体、抗菌剤、殺菌剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、着色剤、香料、植物抽出物等を配合することができる。

本発明のヘリピロンＡ（Helipyrone A）を含有する食品としては、ヘリピロンＡ（Helipyrone A）をそのまま、または種々の栄養成分を添加して食品として使用できるし、所望の食品に配合しても良い。例えば、澱粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、カカオ脂末、ステアリン酸などの適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して健康食品、保健機能食品などとすることができる。また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加してもよく、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。
本発明のヘリピロンＡ（Helipyrone A）を含有する医薬としては、経口投与、経皮投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。
上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。

[ヘリピロンＡ（Helipyrone A）の化学合成]
ヘリピロンＡ（Helipyrone A）の化学合成については、非特許文献２（Esahak Ali, et al., Phytochemistry,1982,21,243-244）、に開示されている。
例えば、本発明では、次のように合成した。
４００ｍＬのヘキサン溶媒を用いて、四塩化チタンの存在下で化合物１ジエチルケトン(3-pentanone)１７２ｇと化合物２テトラヒドロ−１，４−オキサジン（terahydro-1,4-oxazine (morpholine) ）１，０００ｇを４℃で３時間で反応させ、蒸留処理で精製し、化合物３（Ｎ−イソプロペニル）−テトラヒドロ−１，４−オキサジン（(N-isopropenyl)- terahydro-1,4-oxazine）５０３．５７ｇ（収率８１．１％）を得た。
２００ｍＬのトルエン溶媒を用いて、化合物３（Ｎ−イソプロペニル）−テトラヒドロ−１，４−オキサジン（(N-isopropenyl)- terahydro-1,4-oxazine）１６７ｇを化合物４エチルマロニルクロライド（ethyl malonyl chloride）８１ｇとメタノール−氷冷（−17℃〜−11℃）条件で反応させ、一般式２で表される化合物５を合成した。

一般式（２）

化合物３と化合物４との反応は２N塩酸添加で終了させ、クロロホルム抽出後に硫酸マグネシウム乾燥処理を行った。その次に反応溶液にトルエン２００ｍＬと２５％塩酸４００ｍＬを順次加えて液−液分配でトルエン層を回収した。トルエン層を０．１Ｎ塩酸４００ｍＬで洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥処理後にトルエンを真空エバポレーターで除去して橙色油状溶液を得た。この溶液にPPA（ポリリン酸）1kgを加え、110℃〜118℃で環化して化合物５を合成した。化合物５は室温に冷却し、クロロホルム抽出で回収し、硫酸マグネシウム乾燥処理後に真空エバポレータ−でクロロホルムを除去した。固形物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝50：１（ｖ／ｖ））で橙色固形の化合物５を４５．７g得た。本反応の収率は１８．３％であった。

この化合物５について1N塩酸の存在下でホルムアルデヒドを重合反応することで化合物６ヘリピロンＡ（Helipyrone A）を化学合成した。化合物５の４５．７gをエタノール４６０ｍＬに溶解し、濃塩酸２．５ｍＬの存在下でホルムアルデヒド（37％）２４７．８１ｇを７９℃で還流反応させ、結晶が析出した。この結晶をエタノール３００ｍＬで洗浄し、白色結晶としてヘリピロンＡ（Helipyrone A）を３４．０１ｇ得た。本反応の収率は７１．６％であった。

得られたヘリピロンＡ（Helipyrone A）の物性値を以下に示す。
外観：白色結晶
NMRスペクトル(400 MHz, 溶媒；CDCl₃)
^１H-NMR
δ＝a 1.231、b 1.969、c 2.554、d 3.616、e 11.199
¹³C NMR（400 MHz、溶媒；CDCl₃）
δ＝I→169.335（t） H→168.499(m), G→160.160(m), F→108.709(ｍ), E→101.592(t), D→24.368(qt), C→19.176(t), B→11.689(qt), A→9.476(q)

分子量：320.341g/mol（質量分析）
分子式：C₁₇H₂₀O₆ （質量分析）
融点：218−220℃

[抗酸化能評価]
ヘリピロンＡ（Helipyrone A）について、一重項酸素消去作用の評価を行った。評価法は、2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol（4-OH TEMP）をスピントラップ剤としたＥＳＲスピントラップ法により測定した。まず、市販の平底９６穴マイクロプレートに任意の濃度に調製したヘリピロンＡ（Helipyrone A）の4０％（ｖ／ｖ）N,N-ジメチルホルムアミド水溶液０．１ｍＬを、続いて蒸留水０．０２ｍLを、１００ｍＭの4-OH TEMP水溶液０．０4ｍＬ，０．１ｍＭのローズベンガル水溶液０．０４ｍＬと混合し、０．２ｍＬの混合液とした。これに光増感反応の光源としてマイクロプレートの背面より極大波長５３０nmの発光ダイオード（緑色LED）を２０分間照射して一重項酸素を発生させた。この混合液をＥＳＲ用扁平水溶液セルに移し、ＥＳＲスペクトルを測定した。ＥＳＲスペクトル強度から、一重項酸素消去率を求め、これを濃度に対してプロットし、５０％抑制濃度ＩＣ50値を求めた。また、比較として、既存のポリフェノール化合物（シリビン、３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール、（−）−カテキン、（−）−エピカテキンガレート、ケルセチン、ロズマリン酸、カルノシン酸、カフェー酸、コウジ酸、β−カロテン）のＩＣ50値を同時に求めた。その結果を表１に示す。

この結果から明らかなように、他のポリフェノール化合物と比較して、ヘリピロンＡ（Helipyrone A）はより低濃度で一重項酸素を消去することが認められた。すなわち、ヘリピロンＡ（Helipyrone A）は、優れた一重項酸素消去作用を示すことが明らかとなった。

[メラニン生成抑制試験]
市販の6ウェルプレートにそれぞれマウスB16メラノーマ細胞を５％CO₂、37℃の条件下で培養液10％FBS（ウシ胎児血清）を含むDMEMを用いてコンフルエントまで培養した。メラニン生成刺激剤である100ｎMαMSHを添加し、同時に０．０００１％のヘリピロンＡを添加して７２時間引き続き培養した。溶媒条件は10％FBS含有DMEM培地であるが、ヘリピロンＡの溶解度を考慮し、０．２％アセトニトリルを全てのウェルに含有させた。培養終了後、細胞画分を回収し、０．１N NaOHアルカリ処理でメラニン色素を溶解させ、４０５ｎｍの吸光度（ABS）を測定した。

メラニン生成抑制率を
メラニン生成抑制率[%]＝100×{1 − (ABS[Sample])／(ABS[Control])}
Control：0.2％アセトニトリル含有DMEM培地
Sample：0.2%アセトニトリル含有0.0001％ヘリピロンA添加（DMEM培地）
の式で算出した。

その結果、ヘリピロンＡを０．０００１％添加したときは２２．１％±８．４(S.D.)メラニン生成が抑制された。

［紫外線照射によるシワの抑制試験］
ヘアレスマウスに微弱な紫外線を長期間継続して皮膚老化の現象をしわ・たるみを形成する動物モデルを実施し、その時にヘリピロンＡを混餌投与した時の影響を解析した。

I．実験動物
・種・系統・性別
種：マウス、系統：Hos:HR1（ヘアレスマウス）、性別：雌
・飼育開始週齢
5週齢より飼育、同時に混餌投与を開始した。

II．飼育環境
設定温湿度：24±１℃、相対湿度55±5％
空調設備：オールフレッシュ方式
照明時間：12時間自動点灯・消灯方式
飼育設備：プラスチック製ケージ 5匹/ケージ
飼料：粉末滅菌飼料 MF-1（オリエンタル酵母工業(株)）を自由摂取、もしくはMF-１にヘリピロンＡをそれぞれ0.01％(w/w)、0.05％(w/w)、0.1％（w/w）あるいは抗酸化効果に優れているβカロテンを0.01％(w/w)、0.05％(w/w)混合した。

III．試験スケジュール
紫外線照射条件：隔日（一日おき）に１０週間、紫外線ランプを用いて、UV-A波14J/cm²（照射時間約１分）、UV-B波20mJ/cm²（照射時間約５０分）を拘束ストレスをかけずに照射した。１０週間（３５回）の全照射量はUV-A波490J/cm²、UV-B波700mJ/cm²である。
紫外線照射を継続した群については、解剖24時間前に最終の紫外線照射を実施した。解剖18時間前より絶食を行った。解剖前に非侵襲的手法により皮膚水分量を簡易水分計（Moisture Checker^TM、スカラ製）を用いて測定した。
ネンブタール麻酔を行い、外観を写真撮影した。そして皮膚背部のレプリカを採取した。
解剖により、肝臓摘出、全血回収、背部及び腹部の皮膚を回収した。
臓器は素早く凍結保存し、全血は遠心分離（3,000G, 20min, 室温）を行ってplasma（血漿）を回収して冷凍保存した。皮膚は背部の一定面積をブアン固定して組織染色用に用いた他は冷凍保存した。

外観上の皮膚状態を頚部のたるみ（Sagging）、背部のしわ（Wrinkle）の形成状況に着目してBissett DL等らの定義（Photochem Photobiol. (1987) Vol.46, No.3,pp367-pp78）に従いスコア化した。すなわち、下記に示す定義に従い数値化し、判断の困難な検体は中間値として０．５を付した。シワスコアのデータをグラフ化して図１に示す。

・スコア０
シワの発生が全く認められない。
静止状態で脊椎方向に対して垂直な線条が認められないか、わずかに認められる程度、そして個体の運動に応じてその線条は消失する。
・スコア1
軽微なシワの発生が明確に認められる。
脊椎方向に対して垂直な線条が認められる、そして個体の運動に応じてその線条は消失する。
・スコア２
中程度のシワの発生が明確に認められる。
脊椎方向に対して明確に線条が認められる、そして個体の運動に応じてその線条は消失せずに永続的である。
・スコア３
深いシワの発生が明確に認められる。
脊椎方向に対して明確に線条が認められ、その線条に対して影が認められる、そして個体の運動に応じてその線条は消失せずに永続的である。

シワスコアは紫外線照射１０週間のMF-1（コントロール）食群２．４なのに対して、紫外線照射１０週間のヘリピロンＡを０．１％配合したMF-1食群０．１、紫外線照射１０週間のヘリピロンＡを０．０５％配合したMF-1食群０．２、紫外線照射１０週間のヘリピロンＡを０．０１％配合したMF-1食群０．６であり、シワの生成が顕著に抑制された。紫外線を照射せずに１０週間経過したMF-1（コントロール）食群のシワスコアは０．２であり、ヘリピロンＡを０．０５〜０．１配合食を摂取することにより紫外線照射によるシワの発生が完全に抑制されている。
皮膚所見の結果から、ヘリピロンＡの顕著なシワ抑制効果が認められる。ヘリピロンＡのマウスへの投与は、マウス一日の摂食量４ｇ、体表面積換算式ｙ=（３√x）２を用いてヒトへの投与量に換算すると０.１％の混餌自由摂取で約５２０ｍｇ／日／６０ｋｇ体重、０.０１％の混餌自由摂取で約５２ｍｇ／日／６０ｋｇ体重に相当し、食品として無理なく摂取することが可能な量である。
また、抗酸化作用を有するβ−カロテン摂食群はしわ抑制効果を示さなかった。
紫外線照射１０週間のβ−カロテンを０．０５％配合したMF-1食群のシワスコアは２．０、紫外線照射１０週間のβ−カロテンを０．０１％配合したMF-1食群シワスコアは２．３であった。

［紫外線照射に伴う皮膚の乾燥の抑制］
解剖直前に非侵襲的手法により皮膚水分量を簡易水分計（Moisture Checker^TM、スカラ製）を用いて測定し、一匹につき5回測定した平均の測定値について各群で比較した。皮膚水分量の測定結果を図２に示す。

紫外線照射１０週間＋MF-1（コントロール）食群では皮膚水分量が低下して乾燥状態（皮膚水分量３１．４％）になっているのに対し、紫外線照射１０週間＋ヘリピロンＡ配合のMF-1食群ではヘリピロンＡ０．１％配合で皮膚水分量４１．３％、０．０５％配合で皮膚水分量４０．２％、０．０１％配合で皮膚水分量３８．２％であり、４０％前後と有意に高い皮膚水分量を保持していた。ヘリピロンＡ配合食群の皮膚水分量は、紫外線を照射せずに１０週間経過したMF-1（コントロール）食群の皮膚水分量３５．５％よりも高い値を示した。

［紫外線照射に伴う皮膚の硬化の抑制］
スプリング式硬さ計（JIS C 形）皮膚粘弾性測定装置（Ｖｅｓｍｅｔｅｒ:Ｅ−１００Ｓ／ウエイブサイバー製）を用いて、背部の尾付け根より首に向かい２ｃｍ、腰椎から右側に０.５ｃｍ部位を３回測定して硬度の平均を求めた。皮膚硬度の測定結果を図３に示す。

皮膚粘弾性の指標として知られる硬度は、その数値が高いほど皮膚老化が進行し皮膚の弾力性が低下していることが一般的に知られている。
紫外線照射１０週間＋MF-1（コントロール）食群では皮膚の硬化が顕著（度数１５．４）になっているのに対し、紫外線照射１０週間＋ヘリピロンＡ配合のMF-1食群ではヘリピロンＡ０．１％配合で硬度の度数８．１、０．０５％配合で硬度の度数９．１、０．０１％配合で硬度の度数９．１であり、紫外線を照射せずに１０週間経過したMF-1（コントロール）食群の硬度の度数７．２と比べて少し硬化が進む程度に硬化が抑制されていた。

［紫外線照射に伴う皮膚組織中のカルボニル化タンパク質の生成の抑制］
酸化タンパク質の一つであるカルボニル化タンパク質は、Oxyblot^TM（CHEMICON社）を用いて評価した。具体的な方法は以下の通りである。マウス皮膚を湿重量約200mg秤量し、４℃にてProtease inhibitor cocktailを含むLisys buffer（pH=7.4）0.2mlを加えてホモジナイズし、12,000ｇ×20分間遠心し、その上清をフィルターろ過したものを用いて、タンパク濃度をBradfordの方法に従って測定した。それぞれのタンパク試料20μgについてカルボニル基をDNPH化した。蛋白質をSDS-PAGEにより分離し、蛋白質転写装置を用いてPVDF膜に転写した。転写後の膜は常温下30分5％スキム4℃でミルクを含むPBS（−）溶液中でブロッキングし、スキムミルクをPBS（−）で洗浄後、抗DNPH抗体と４℃で一晩反応させ、洗浄後、ビオチン化抗マウスIgGと１時間反応させた。洗浄後、蛍光検出キット（ECL PLUS）を用いてPVDF膜を感光し、医療用自動現像装置にて画像を転写した。結果を図４に示す。

その結果、紫外線照射１０週間＋MF-1（コントロール）食群ではカルボニル化タンパク質量の相対値は２５９．４であるのに対し、紫外線照射１０週間＋ヘリピロンＡ配合のMF-1食群ではヘリピロンＡ０．１％配合でカルボニル化タンパク質量の相対値は２５．３、０．０５％配合でカルボニル化タンパク質量の相対値は３５．６、０．０１％配合でカルボニル化タンパク質量の相対値は５７．７であり、カルボニル化タンパク質の生成が１／１０〜１／５に抑制された。紫外線を照射せずに１０週間経過したMF-1（コントロール）食群のカルボニル化タンパク質量の相対値は２３．７であり、ヘリピロンＡ０．１％配合食群のカルボニル化タンパク質量の相対値は２５．７と同程度であった。従って、ヘリピロンＡは紫外線照射に伴うカルボニル化タンパク質の生成を顕著に抑制している。
抗酸化作用を有するβ−カロテン摂食群はカルボニル化タンパク質の生成抑制効果はあまり認められなかった。
紫外線照射１０週間のβ−カロテンを０．０５％配合したMF-1食群のカルボニル化タンパク質量の相対値は１５３．１、紫外線照射１０週間のβ−カロテンを０．０１％配合したMF-1食群のカルボニル化タンパク質量の相対値は１９０．７であった。

［紫外線照射に伴う皮膚組織中の8-hｙdroxy-2’-guanosine（8-OH dG）の生成の抑制］
8-OH dGは免疫組織化学的手法を用いて測定した。動物の解剖時に皮膚組織背部の尾付け根より首に向かい2cm、腰椎から右側に0.5cm部位の皮膚1cm^２を切り取り、ブアン固定、及びパラフィン包埋して皮膚組織を保存した。３μｍ厚の切片を適宜作製し、脱パラフィン、親水化は公知の方法に基づいて実施した。抗原賦活化は0.01Mクエン酸緩衝液（pH=6.0）中でマイクロウェーブ処理５分を実施した。室温まで冷却後、常温下0.3％過酸化水素含有メタノールで２０分反応させて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。水洗、10mMPBS(-)洗浄後、ウサギ血清75倍10mMPBS(-)希釈溶液で5分間マイクロウェーブ処理を実施してブロッキング、血清を落として１次抗体（Ｎ４５．１：日研ザイル(株)製）を５μｇ／ｍｌで20分間マイクロウェーブ処理により抗体を反応させた。10mMPBS(-)で2回洗浄し、ビオチン化二次抗体（ビオチン化ウサギ免疫グロブリンＭ；ＤＡＫＯ製）を300倍希釈したものを5分間マイクロウェーブ処理で抗体を反応させた。10mMPBS(-)で２回洗浄し、ABC試薬（ABC-HRP；Vectastain製）を5分間マイクロウェーブ処理により反応させた。発色試薬としてDAB（３,３-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド：DAKO製）を用いて3分30秒常温下で反応させた。水洗後、公知の方法に基づいて脱水、封入処理を行った。顕微鏡下で皮膚組織の染色状況を観察し、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて画像を取り込み、画像中の一定面積中の染色箇所をＮＩＨＩｍａｇｉｎｇにて数値化した。結果を図５に示す。

その結果、紫外線照射１０週間＋MF-1（コントロール）食群では8-OH dGの相対値は５．８９であるのに対し、紫外線照射１０週間＋ヘリピロンＡ配合のMF-1食群ではヘリピロンＡ０．１％配合で8-OH dG量の相対値は０．８７、０．０５％配合で8-OH dG量の相対値は０．９１、０．０１％配合で8-OH dGの相対値は１．１０であり、8-OH dG量の生成が１５／１００〜１９／１００に抑制された。紫外線を照射せずに１０週間経過したMF-1（コントロール）食群の8-OH dG量の相対値１．００と比べて、紫外線照射ヘリピロンＡ０．０５％配合食群、０．１％配合食群の8-OH dG量の相対値はさらに低い値である。従って、ヘリピロンＡは紫外線照射に伴う8-OH dGの生成を顕著に抑制している。
また、抗酸化作用を有するβ−カロテン摂食群は8-OH dGの生成抑制効果を示さなかった。
紫外線照射１０週間のβ−カロテンを０．０５％配合したMF-1食群の8-OH dG量の相対値は５．２、紫外線照射１０週間のβ−カロテンを０．０１％配合したMF-1食群の8-OH dG量の相対値は６．３であった。

［紫外線照射に伴う皮膚組織中の過酸化脂質の生成の抑制］
皮膚組織におけるTBARS（チオバルビツール酸反応生成物、nmol/g wet weight）を蛍光分析にて測定した。各組織の湿重量約200mgを秤量し、1.15％KCl1mlでホモジネート後、1/12N硫酸４ml、10％タングステンリン酸0.5mlを順次添加し、3,000rpm 10min遠心分離を行った。上清の夾雑物を除去し、TBA試薬（チオバルビツール酸／酢酸緩衝液）を添加し、沸騰湯浴中で1時間加熱反応した。TBARSの定量用に別途1,1,3,3-テトラエトキシプロパンを加えた試料でTBA反応を行い、検量線を作成した。結果を図６に示す。

加熱反応終了後、氷冷で室温に戻し、n-ブタノールを5ml加えて攪拌後に3,000rpm 10minの条件で遠心分離し、上層のn-ブタノール層を回収して、蛍光分析(Ex 515nm、Em 553nm)に供した。蛍光強度計はHITACHI F-2000を用いた。

その結果、紫外線照射１０週間＋MF-1（コントロール）食群では組織中の過酸化脂質量が５０．８ｎｍｏｌ／ｍｇであるのに対し、紫外線照射１０週間＋ヘリピロンＡ配合のMF-1食群ではヘリピロンＡ０．１％配合で組織中の過酸化脂質量が３０．９ｎｍｏｌ／ｍｇ、０．０５％配合で組織中の過酸化脂質量が３３．７ｎｍｏｌ／ｍｇ、０．０１％配合で組織中の過酸化脂質量が４４．８ｎｍｏｌ／ｍｇであり、過酸化脂質の生成が６／１０〜９／１０に抑制された。紫外線照射１０週間＋ヘリピロンＡ０．１％配合食群及び０．０５％配合食群の過酸化脂質量は紫外線を照射せずに１０週間経過したMF-1（コントロール）食群の組織中の過酸化脂質量３０．２ｎｍｏｌ／ｍｇと同程度である。従って、ヘリピロンＡは紫外線照射に伴う過酸化脂質の生成を顕著に抑制している。
また、抗酸化作用を有するβ−カロテン摂食群の過酸化脂質の生成抑制効果は殆どなかった。
紫外線照射１０週間のβ−カロテンを０．０５％配合したMF-1食群の過酸化脂質量は４６．９ｎｍｏｌ／ｍｇ、紫外線照射１０週間のβ−カロテンを０．０１％配合したMF-1食群の過酸化脂質量は５１．１ｎｍｏｌ／ｍｇであった。

[ESR法での一酸化窒素消去能の評価]
100μMのSNAP（S−ニトロソ−N−アセチル−D,L−ペニシルアミン、同仁化学製）に対する、ヘリピロンAと酸化防止剤として既知の(−)カテキン（Sigma製）の一酸化窒素消去能を比較した。
スピントラップ剤には、N−メチル−D−グルカミン−ジチオカルバメート（以下、ＭＧＤという。ラボテック（株）から購入）と硫酸鉄（II）水溶液とを混合して調製した（ＭＧＤ）₂−Ｆｅ²⁺複合体を用いた。この複合体は一酸化窒素と反応して（ＭＧＤ）₂−Ｆｅ²⁺−ＮＯの複合体を形成することでＥＳＲスペクトル強度を発生することから、一酸化窒素消去剤のそれぞれの濃度におけるＥＳＲスペクトルを測定することで一酸化窒素の消去能を測定した。

50mM 硫酸鉄（II）・2水和物溶媒：蒸留水 100μＬ（最終濃度5ｍＭ）、50mM MGD 溶媒 PBS(pH 7.4) 100μＬ（最終濃度5ｍＭ）、被検物質溶媒：１０％アセトニトリル１００μL、１００ｍMリン酸緩衝液６９９μL、１００ｍＭ SNAP 溶媒 0.1M水酸化ナトリウム１μL （最終濃度100μＭ）、を順次１．５ｍｌ容エッペンチューブに加え、SNAP添加時から１０分間２５℃で攪拌反応した。
１０分間２５℃の反応でSNAPから一酸化窒素が放出され、（ＭＧＤ）₂−Ｆｅ²⁺−ＮＯのシグナル強度比＝１：１：１の３つのピークで構成されていた。このシグナル強度が被験物質によりどれだけ増減するかで一酸化窒素消去能を評価した。具体的には、被験物質を添加しないコントロールのシグナル強度（Ｃ）を基準として、被験物質を添加したときのシグナル強度（Ｓ）から次式により一酸化窒素消去率を求め、図７に示す。

一酸化窒素消去率＝（１−Ｓ／Ｃ）×１００（％）

その結果、ヘリピロンAは２５μM〜２００μMの範囲で濃度依存的に一酸化窒素消去率が向上し（２５μＭで３２．４％、５０μＭで５２．６％、１００μＭで６３．６％、２００μＭで８０．１％）、IC５０濃度５１．４μMだったのに対し、（−）カテキンは５０μM、１００μＭでは一酸化窒素消去率がそれぞれ５．６％、１１．７％にすぎず、２５０μＭで３１．４％、５００μMで４７．４％の一酸化窒素消去率であった。IC５０濃度は５４７μMと計算された。

今回使用した機器および機器の条件設定を以下に示す。
機器：ＪＥＯＬＪＥＳ TE２００、Ｘ−ｂａｎｄＥＳＲ装置（１００ＫＨｚ、日本電子社製）
機器の条件設定：
センターフィールド（center field）：３３５．０±５．０ｍＴ、
マイクロウェーブパワー（microwave power）：４ｍＷ、
モジュレーションアンプリチュード（modulation amplitude）：０．１ｍＴ、
ゲイン（gain）：５００、
タイムコンスタント（time constant）：０．１秒、
スキャンニングタイム（scanning time）：１分

[比色法（Ｇｒｉｅｓｓ法）での一酸化窒素消去能]
溶液中に存在する一酸化窒素は水溶液中で極めて不安定であるため、ESR法の他に、一酸化窒素の酸化物である亜硝酸イオンを測定することで一酸化窒素量を間接的に評価した。既知の抗酸化物質である（−）カテキン、マルトール、ｐ−クマリン酸についても評価し、ヘリピロンＡと比較した。Griess法による測定は、NO₂／NO₃ＡｓｓａｙＫｉｔ−ＣII（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）（同仁化学製）を用いた。
一酸化窒素発生剤として、ＮＯＣ−５（１−ヒドロキシ−２−オキソ−３−（３−アミノプロピル）−３−イソプロピル−１−トリアゼン）（同仁化学社製）を用い、使用直前まで０．１N水酸化ナトリウムのアルカリ溶液で−２０℃冷凍保存した。Ｋｉｔ中の緩衝液（ｐH=７．６、以下「緩衝液」）によって１００００倍希釈して１００μMの濃度に調整することで一酸化窒素を発生させた。一酸化窒素供与体として開発されたＮＯＣ−５はアルカリ溶液中では安定だが、中性および酸性条件下では一酸化窒素を生成する不安定な化合物（２５度、ｐＨ７．４条件下で半減期２５分）である。

市販の平底９６ウェルプレートに被験物質溶媒：１％アセトニトリルを含む緩衝液（ｐＨ＝７．６）４０μＬを被験物質の濃度を変化させて添加した。その後、緩衝液（ｐＨ＝７．６）を２０μＬ添加し、１００μＭのＮＯＣ−５溶液40μＬを添加して2時間25℃で反応させた。反応終了後、Ｋｉｔ中のＧｒｉｅｓｓ試薬Ａを５０μＬ添加して５分放置し、続けてＧｒｉｅｓｓ試薬Ｂを５０μＬずつ添加して１０分放置して呈色反応を行った。マルチプレートリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。各被験物質の添加濃度における吸光度をＳ_５４０、被験物質を含まないコントロールの吸光度をＣ_５４０、被験物質およびＮＯＣ−５を含まないブランクの吸光度をＢ_５４０として以下の式で一酸化窒素消去率（％）を算出し、表２、図８に示す。

一酸化窒素消去率（％）＝１００×（１−（Ｓ_５４０−Ｂ_５４０）／（Ｃ_５４０−Ｂ_５４０）

検量線はＮＯＣ−５溶液の代わりに亜硝酸ナトリウム溶液０〜１００μＭの濃度域で設定した検体の吸光度から作成し、溶液中の亜硝酸イオン濃度を求めた。この亜硝酸イオン濃度からＮＯＣ−５溶液から発生した一酸化窒素濃度を求める事が出来る。
一酸化窒素消去能の強さは、本試験系で５０％消去する濃度（ＩＣ５０、μＭ）で比較した。

１００μＭのＮＯＣ−５溶液から４７．０μＭの一酸化窒素が亜硝酸イオンとして生成する。この時、被験物質添加による吸光度の低下、すなわち、一酸化窒素の消去活性が認められた。

ヘリピロンAは５０μM〜４００μMの範囲で濃度依存的に一酸化窒素の消去能が認められ、IC５０濃度は３６．７μMだった。一方、（−）カテキン、マルトール、ｐ−クマリン酸のIC５０濃度は１９０．０μM、９４．０μＭ、１８７．４μＭであった。ヘリピロンＡの優れた一酸化窒素消去能が確認された。

以上の結果から、本発明のヘリピロンＡが一酸化窒素を消去することが明らかになり、血管系、神経系、免疫系の薬剤として有用であると考えられる。このヘリピロンＡは生体内に存在する過剰な一酸化窒素を消去し、正常な一酸化窒素濃度にする作用および一酸化窒素が過剰に発生することが予測される場合にあらかじめ投与し生体内に過剰な一酸化窒素が発生することを防止する作用を有している。すなわち、本明細書においてヘリピロンAの一酸化窒素消去能とは、生体内に存在するすべての一酸化窒素を完全に消去するものをいうのではなく、生体内にある過剰な一酸化窒素を消去し生体の維持に適切な量になるように調節するものをいう。

[比色法でのperoxynitrite消去能]
ヘリピロンＡのperoxynitrite消去能はGriess法により、NO₂／NO₃ＡｓｓａｙＫｉｔ−ＣII（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）（同仁化学製）を用いて測定した。

既知の抗酸化物質である（−）カテキン、マルトール、ｐ−クマリン酸についても評価し、ヘリピロンＡと比較した。
市販の平底９６ウェルプレートに被験物質溶媒：１％アセトニトリルを含む緩衝液（ｐＨ＝７．６）４０μＬを被験物質の濃度を変化させて添加した。その後、それぞれのウェルにＫｉｔ中の還元酵素１０μＬ、及び補酵素１０μＬを添加した。
Peroxynitrite発生剤としてSIN-1（３−（４−モルフォキニル）シドノニミン１塩化物）50μMを４０μＬ添加して３７℃２時間反応させた。反応終了後、Ｋｉｔ中のＧｒｉｅｓｓ試薬Ａを５０μＬ添加して５分放置し、続けてＧｒｉｅｓｓ試薬Ｂを５０μＬずつ添加して１０分放置して呈色反応を行った。マルチプレートリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。被験物質の吸光度をＳ_５４０、被験物質を含まないコントロールの吸光度をＣ_５４０、被験物質およびＳＩＮ−１を含まないブランクの吸光度をＢ_５４０として以下の式でＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ消去率（％）を算出し、表３、図９に示す。

Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ消去率（％）＝１００×（１−（Ｓ_５４０−Ｂ_５４０）／Ｃ_５４０−Ｂ_５４０）

検量線はＳＩＮ−１溶液の代わりに硝酸ナトリウム溶液０〜１００μＭの濃度域で設定した検体の吸光度から作成し、溶液中の硝酸イオン濃度を求めた。この硝酸イオン濃度からＳＩＮ−１溶液から発生したＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ濃度を求める事が出来る。
Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ消去能の強さは、本試験系で５０％消去する濃度（ＩＣ５０、μＭ）で比較した。

その結果、コントロールでは50μMのSIN-1からＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅが8.18μM発生し、そのＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅを５０％消去するＩＣ５０濃度について、ヘリピロンＡは２４．０４μＭに対し、マルトール３１．８４μＭ、ｐ−クマリン酸３１．４９μＭ、（−）カテキン７０５．６μＭとなり、ヘリピロンＡが優れたＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ消去能を示した。

Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅは生体内で一酸化窒素とスーパーオキシドアニオンとの反応で発生し、強力な酸化作用および生体損傷、炎症を引き起こす。Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ消去活性を示すヘリピロンＡは、酸化防止剤であり生体における炎症を抑制し、生体成分を保護する機能を発揮する。

[チロシナーゼ活性阻害作用の測定]
平底９６ウェルプレートに被験物質溶液１００μＬを添加し、６００ units/mlのマッシュルーム由来チロシナーゼ溶液10μＬを加え、30 ℃で10分間インキュベートした。その後、あらかじめ30 ℃に暖めておいた6 mMのL-DOPA（Ｌ−β−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アラニン）溶液１００μＬを添加し、30 ℃で40分間振とうしながらインキュベートした。被験物質の溶媒は１％アセトニトリル含有１００ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用い、チロシナーゼ、L-DOPAの溶媒は100 mMコハク酸緩衝液(pH 5.5)を用いた。振とう後、メラニン量の指標である475 nmの波長で吸光度測定し、この値をS₄₇₅とした。被験物質無添加の場合をコントロール(C)、この吸光度をC₄₇₅、L-DOPA無添加の場合をサンプルブランク(SB)、この吸光度をSB₄₇₅、サンプルとL-DOPA無添加の場合をコントロールブランク(CB)、この吸光度をCB₄₇₅とし、式2によりチロシナーゼ阻害率を算出した。ポジティブコントロールとしてアルブチン（東京化成工業(株)製）を用いた。

チロシナーゼ活性阻害率％＝１００×｛１−（Ｓ_４７５−ＳＢ_４７５）／（Ｃ_４７５−ＣＢ_４７５）｝

この結果、添加濃度１ｍＭにおけるヘリピロンＡとアルブチンのチロシナーゼ阻害率は、ヘリピロンＡでは３６．３４％であったのに対し、アルブチンは２５．７７％であったことから、ヘリピロンＡはアルブチンよりも優れたチロシナーゼ阻害活性を有し、ヘリピロンＡが美白作用を示すことがわかる。

[マウス皮膚におけるチロシナーゼ遺伝子発現解析]
マウスにヘリピロンＡを摂食させた時、チロシナーゼをコードする遺伝子の発現をマウス皮膚で測定した。
Ｉ．実験動物
Ｉ−１．種・系統・性別：種：マウス、系統：Hos:HR1（ヘアレスマウス）、性別：雌
Ｉ−２．飼育開始週齢：5週齢（1週間飼育後6週齢から紫外線照射試験を開始した）
Ｉ−３．微生物グレード：SPF
Ｉ−４．ブリーダー：清水実験材料株式会社

ＩＩ．飼育環境
設定温湿度：24±１℃、相対湿度55±5％
空調設備：オールフレッシュ方式
照明時間：12時間自動点灯・消灯方式
飼育設備：プラスチック製ケージ 5匹/ケージ
飼料：粉末滅菌飼料ＭＦ−1（オリエンタル酵母工業（株））を自由摂取、ＭＦ−１にヘリピロンＡを０．１重量％混合した飼料も別途調製した。
試験対象物の投与：粉末混餌として自由摂取させた。解剖18時間前から絶食させた。
給水：滅菌済の水道水を自由摂取

ＩＶ−３解剖
解剖18時間前から絶食させた個体の体重測定、皮膚水分量を測定後、ネンブタール麻酔（40mg/kg）腹腔内投与により麻酔を導入した。
腹部を切開し、心臓よりヘパリン採血を行った。次に臓器について肉眼的観察を行った後に肝臓、後頭部から臀部における背部全体の皮膚を摘出した。背部皮膚に関しては、皮膚組織背側の尾付け根より首に向かい２ｃｍ、腰椎から右側に０.５ｃｍ部位の皮膚１ｃｍ^２を切り取り、ブアン固定、及びパラフィン包埋して皮膚組織を保存した。その他の背部皮膚は素早くアルミホイルに入れ液体窒素にて急速に凍結し−８０℃で長期保存した。

[遺伝子発現解析に関する試験]
各群２匹の背部皮膚を選択して、遺伝子発現解析用Total RNAサンプルを抽出した。背部皮膚を液体窒素存在下で細切粉砕し、湿重量数十mg毎に１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに分注した。Total RNA抽出はRNase easy mini kit (QIAGEN製)を用いて、通常のプロトコールに従った。

抽出したＴｏｔａｌＲＮＡについてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社推奨のプロトコールに則った処理を行った後、ＤＮＡマイクロアレイ法により皮膚組織における発現パターンを調べた。具体的には、抽出したｔｏｔａｌＲＮＡから、「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴｃｈｏｉｃｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型にして「ＢｉｏＡｒｒａｙＨｉｇｈＹｉｅｌｄＲＮＡＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ」（商品名、ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いてビオチン標識したｃＲＮＡを試験管内で合成した。そして、このｃＲＮＡを断片化した後、ＤＮＡマイクロアレイ（商品名「ＧｅｎｅＣｈｉｐMouse Expression Array 430A」（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製））と「ハイブリダイゼーションオーブン」（商品名、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてハイブリダイゼーションを行い、Ｒ−フィコエリスリン−ストレプトアビジンとの反応及び洗浄操作を「Ｆｌｕｉｄｉｃｓｓｔａｔｉｏｎ」（商品名、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）で行った後、蛍光強度を「ＧｅｎｅＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ」（商品名、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）で測定し、関連遺伝子の発現量の解析を行った。なお、上記ＤＮＡマイクロアレイの検出感度は１：１００，０００であり、これはマウスtotal RNAサンプル中にマウスｃDNAクローン由来の標識済み転写産物を添加し検出することにより測定している。本試験で用いたマウス皮膚由来total RNAについて２２，６９０遺伝子が検出され、遺伝子発現の増減の解析に用いた。その中でチロシナーゼはＰｒｏｂｅＩＤ：１４４８８２１＿atでコードされ、その蛍光強度から遺伝子発現強度の比率を求めた。

試験群と対照群の組み合わせは以下のとおりである。
試験群：０．１％ヘリピロンＡ含有ＭＦ−１食１０週間飼育（１６週齢）
対照群：ＭＦ−１食１0週間（１6週齢）

なお、表４中の「ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．」は、各遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩの核酸配列データベース）における識別番号であり、Probe Set IDはAffymetrix社製ＧｅｎｅＣｈｉｐ Expression Array固有の識別番号である。
この表４から、マウス皮膚組織におけるチロシナーゼの遺伝子発現がヘリピロンＡによって抑制され、チロシナーゼの皮膚における過剰発現が抑制され、チロシナーゼによるメラニン形成がヘリピロンＡによって抑制されることがわかった。

[皮膚組織中ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎの測定]
ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）は、免疫組織化学的手法を用いて測定した。

パラフィン包埋済みのマウス皮膚組織について、脱パラフィン処理を定法に従い、抗原賦活化は０．０１Ｍクエン酸緩衝液（pＨ６．０）中でマイクロウェーブ処理５分を実施した。室温まで冷却後、常温下０.３％過酸化水素含有メタノールで２０分反応させて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。水洗、１０ｍＭ PBS（−）洗浄後、ウサギ血清７５倍１０ｍＭＰＢＳ（―）希釈溶液で５分間マイクロウェーブ処理を実施してブロッキング、ブロッキング終了後にウサギ血清を落として１次抗体（ＰＣ１０：ＤＡＫＯ製）を５００倍希釈したものを添加して２０分間マイクロウェーブ処理により抗体を反応させた。１０ｍＭＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ビオチン化二次抗体（ビオチン化ウサギ免疫グロブリンＭ；ＤＡＫＯ製）を３００倍希釈したものを添加し５分間マイクロウェーブ処理で抗体を反応させた。１０ｍＭＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＡＢＣ試薬（ＡＢＣ−ＨＲＰ；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ製）を添加し５分間マイクロウェーブ処理により反応させた。発色試薬としてＤＡＢ（３,３-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド：ＤＡＫＯ製）を用いて３分３０秒常温下で反応させた。水洗後、公知の方法に基づいて脱水、封入処理を行った。顕微鏡下で皮膚組織の染色状況を観察した。紫外線照射１０週間の検体は、ＰＣＮＡの増加により、表皮細胞の主に細胞核が発色するので、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて画像を取り込み、画像中の一定面積中の染色箇所をＮＩＨＩｍａｇｉｎｇにて数値化した。

各群の数値について平均値±S.D.を求めた。２群間の有意差検定はUV（−）群を基準値１として各群の平均値を補正後、student’s t-test(有意水準ｐ＜0.05)で実施した。測定したサンプルを表５に示し、結果を図１０に示す。

ヘリピロンＡを摂取したマウスの皮膚組織においてＰＣＮＡは増加しなかった。ＰＣＮＡはDNAの酸化や切断、及び増殖性皮膚疾患として知られている乾癬のバイオマーカーとして発現上昇が知られており、本試験におけるマウス皮膚への紫外線照射で発現上昇するＰＣＮＡをヘリピロンＡ摂食がＤＮＡの酸化防止作用、紫外線障害の緩和作用によって正常レベルに戻った。

[皮膚組織中ロリクリンの測定]
ロリクリンは、免疫組織化学的手法を用いて測定した。

パラフィン包埋済みのマウス皮膚組織について、脱パラフィン処理を定法に従い、抗原賦活化は０．０１Ｍクエン酸緩衝液（pＨ６．０）中でマイクロウェーブ処理５分を実施した。室温まで冷却後、常温下０.３％過酸化水素含有メタノールで２０分反応させて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。水洗、１０ｍＭ PBS（−）洗浄後、ヤギ血清７５倍１０ｍＭＰＢＳ（―）希釈溶液で５分間マイクロウェーブ処理を実施してブロッキングし、ブロッキング終了後にヤギ血清を落として１次抗体（ＬｏｒｉｃｒｉｎＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ，Ｐｕｒｉｆｉｅｄ：Ｓｉｇｍａ製）を５００倍希釈したものを添加して２０分間マイクロウェーブ処理により抗体を反応させた。１０ｍＭＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ビオチン化二次抗体（ビオチン化ヤギ免疫グロブリンＭ；ＤＡＫＯ製）を３００倍希釈したものを添加し５分間マイクロウェーブ処理で抗体を反応させた。１０ｍＭＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＡＢＣ試薬（ＡＢＣ−ＨＲＰ；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ製）を添加し５分間マイクロウェーブ処理により反応させた。発色試薬としてＤＡＢ（３,３-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド：ＤＡＫＯ製）を用いて４分３０秒常温下で反応させた。その後、ヘマトキシリンで細胞核や組織全体像を染色処理し、水洗後、公知の方法に基づいて脱水、封入処理を行った。顕微鏡下で皮膚組織の染色状況を観察した。紫外線照射１０週間の検体はロリクリンの増加により、表皮細胞の主に細胞核が発色する。ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて画像を取り込み、画像中の一定面積中の染色箇所をＮＩＨＩｍａｇｉｎｇにて数値化した。測定したサンプルを表６に示し、結果を図１１に示す。

各群の数値について平均値±S.D.を求めた。２群間の有意差検定はUV（−）群を基準値１として各群の平均値を補正後、student’s t-test(有意水準ｐ＜0.05)で実施した。
ヘリピロンＡ摂取したマウスの皮膚組織においてロリクリンは増加しなかった。ロリクリンは皮膚の終末分化のマーカーとして知られており、ヘリピロンＡ摂取により皮膚の老化現象が抑制され、正常な皮膚の分化状態を保つ作用が認められた。

[皮膚組織中ケラチン１の測定]
ケラチン１は、免疫組織化学的手法を用いて測定した。

パラフィン包埋済みのマウス皮膚組織について、脱パラフィン処理を定法に従い、抗原賦活化は０．０１Ｍクエン酸緩衝液（pＨ６．０）中でマイクロウェーブ処理５分を実施した。室温まで冷却後、常温下０.３％過酸化水素含有メタノールで２０分反応させて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。水洗、１０ｍＭ PBS（−）洗浄後、ヤギ血清７５倍１０ｍＭＰＢＳ（―）希釈溶液で５分間マイクロウェーブ処理を実施してブロッキング、ブロッキング終了後にヤギ血清を落として１次抗体（ＭｏｕｓｅＫｅｒａｔｉｎ１（ＡＦ１０９）ＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ，Ｐｕｒｉｆｉｅｄ：ＣＯＶＡＮＣＥ製）を５００倍希釈したものを添加し２０分間マイクロウェーブ処理により抗体を反応させた。１０ｍＭＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ビオチン化二次抗体（ビオチン化ヤギ免疫グロブリンＭ；ＤＡＫＯ製）を３００倍希釈したものを添加し５分間マイクロウェーブ処理で抗体を反応させた。１０ｍＭＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＡＢＣ試薬（ＡＢＣ−ＨＲＰ；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ製）を添加し５分間マイクロウェーブ処理により反応させた。発色試薬としてＤＡＢ（３,３-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド：ＤＡＫＯ製）を用いて３分３０秒常温下で反応させた。その後、ヘマトキシリンで細胞核や組織全体像を染色処理し、水洗後、公知の方法に基づいて脱水、封入処理を行った。顕微鏡下で皮膚組織の染色状況を観察した。紫外線照射１０週間の検体はケラチン１の増加により、表皮細胞の主に細胞核が発色する。ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて画像を取り込み、画像中の一定面積中の染色箇所をＮＩＨＩｍａｇｉｎｇにて数値化した。測定したサンプルを表７に示し、結果を図１２に示す。

各群の数値について平均値±S.D.を求めた。２群間の有意差検定はUV（−）群を基準値を１として各群の平均値を補正後、student’s t-test(有意水準ｐ＜0.05)で実施した。

ヘリピロンＡ摂取したマウスの皮膚組織においてケラチン１は増加しなかった。ケラチン１は皮膚の終末分化のマーカーとして知られており、ヘリピロンＡ摂取により皮膚の老化現象が抑制され、正常な皮膚の分化状態を保つ作用が認められた。

処方例を以下に示す。

[処方例１カプセル剤]
下記成分を混合し、ゼラチンおよびグリセリンを混合したカプセル基剤中に充填し、軟カプセルを得た。

[処方例２錠剤]
下記成分を混合、打錠し、錠剤を得た。

[処方例３錠剤]
下記成分を混合、打錠し、錠剤を得た。

[処方例４ジュース]

[処方例５クリーム]
下記成分（１）〜（１０）を８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（１１）〜（１３）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら４０℃まで冷却し、さらに３０℃まで攪拌冷却してクリームを得た。

Claims

一般式（１）で表されるヘリピロンＡ（Helipyrone A）からなるしわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、あるいはメラニン抑制剤。
一般式（１）
ヘリピロンＡ（Helipyrone A）を有効成分として含有する美白用化粧料。