CN101389327A - 使用Helipyrone A的单线态氧淬灭剂、皮肤老化改善剂、皱纹改善剂、松弛改善剂、皮肤含水量改善剂、美白剂、抑制黑素剂、一氧化氮清除剂、抗氧化剂 - Google Patents

使用Helipyrone A的单线态氧淬灭剂、皮肤老化改善剂、皱纹改善剂、松弛改善剂、皮肤含水量改善剂、美白剂、抑制黑素剂、一氧化氮清除剂、抗氧化剂 Download PDF

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Abstract

本发明发现了有关Helipyrone A的新型作用，提供作为其有效利用的含有Helipyrone A的单线态氧淬灭剂、皮肤老化改善剂、皱纹改善剂、松弛改善剂、皮肤含水量改善剂、美白剂、抑制黑素剂、一氧化氮清除剂或抗氧化剂。

Description

使用Helipyrone A的单线态氧淬灭剂、皮肤老化改善剂、皱纹改善剂、松弛改善剂、皮肤含水量改善剂、美白剂、抑制黑素剂、一氧化氮清除剂、抗氧化剂
技术领域
本发明涉及Helipyrone A。
背景技术
非专利文献1[Journal of ethnopharmacology 33(1991)p51-55]中公开了通式(1)所示的Helipyrone A具有抗菌作用。
非专利文献1：Journal of ethnopharmacology 33(1991)p51-55
非专利文献2：Esahak Ali，et al.，Phytochemistry，1982，21，243-244
发明内容
本发明的课题在于发现有关的Helipyrone A的新作用，目的在于其有效利用。
本发明的主要构成如下所示。
1.含有通式(1)所示的Helipyrone A的单线态氧淬灭剂、皮肤老化改善剂、皱纹改善剂、松弛改善剂、皮肤含水量改善剂、美白剂、抑制黑素剂、一氧化氮清除剂或抗氧化剂。
[化2]
Figure A200780006571D00041
通式(1)
2.含有1.中所述的任何一种药剂的口服组合物。
3.含有1.中所述的任何一种药剂的皮肤外用组合物。
4.含有1.中所述的任何一种药剂的食品。
5.含有1.中所述的任何一种药剂的医药。
6.含有1.中所述的任何一种药剂的化妆料。
本发明涉及Helipyrone A，并证明其具有新型的淬灭单线态氧、改善皮肤老化、改善皱纹剂、改善松弛、改善皮肤含水量、美白、抑制黑素、清除一氧化氮或抗氧化的作用效果，本发明还可提供有效利用上述作用的各种新型制剂、医药、食品、化妆品。
附图说明
图1表示皱纹分数
图2表示皮肤含水量
图3表示皮肤硬度
图4表示羰基蛋白的量(相对值)
图5表示皮肤组织中8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy 2′-deoxy guanosine)的量(相对值)
图6表示皮肤组织中的过氧化脂质量
图7表示通过ESR法测定的清除一氧化氮的能力
图8表示通过比色法(Griess法)测定的清除一氧化氮的能力
图9表示通过比色法测定的清除过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)的能力
图10表示增殖细胞核抗原[Proliferation Cell Nuclear Antigen(PCNA)]的增加抑制能力
图11表示兜甲蛋白的抑制能力
图12表示角蛋白1的抑制能力
具体实施方式
Helipyrone A如以下通式(1)所示。
[化3]
Figure A200780006571D00051
通式(1)
认识到此Helipyrone A具有抑制皱纹效果、改善皮肤老化、光老化、美白剂、黑素、抗氧化、淬灭单线态氧、清除一氧化氮等的新作用。基于此新认识，Helipyrone A可作为化妆料组合物、食品添加材料、医药材料使用。
作为化妆料、食品时，可期待其具有抑制皱纹效果、改善皮肤老化、光老化、美白剂、黑素、抗氧化、单线态氧淬灭作用，可作为皮肤老化改善剂、光老化抑制剂、美白剂、黑素生成抑制剂、抗氧化剂、单线态氧淬灭剂、一氧化氮清除剂使用。
本发明的含有Helipyrone A的化妆料(包括医药保健品)，可为用于面部或用于手、脚、身体的保湿化妆料，可为化妆水、乳液、霜剂、发胶、多层型化妆料等。此外，还可作为口红、粉底霜等的化妆用化妆料、洗面奶、洗手液、浴液等的洗涤剂、洗发水、护发素、锔油膏(treatment)、生发精等用于头发的化妆料。
本发明的含有Helipyrone A的化妆料(包括医药部外品)中，除可使用Helipyrone A以外，还可使用作为化妆料的组合物一般可使用的材料。例如，可配合烃油、酯油、脂肪酸、高级醇、硅胶、固醇、神经酰胺等的油剂，多元醇、糖、吡咯烷酮羧酸、氨基酸、甜菜碱等的保湿剂，非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性表面活性剂、卵磷脂等的表面活性剂，高分子乳化剂、水溶性高分子、糊精棕榈酸酯等的增稠剂，无机粉体、有机粉体、抗菌剂、杀菌剂、pH调节剂、螯合剂、着色剂、香料、植物提取物等。
本发明的含有Helipyrone A的食品，可将Helipyrone A直接或添加各种营养成分作为食品使用，也可配合在所需的食品中。例如，可在添加淀粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、可可脂末、硬脂酸等适合的辅助剂后，使用常用的方法，制成适合食用的形态例如颗粒状、粒状、片剂、胶囊、糊状等作为健康食品、保健功能食品等。也可添加到各种食品例如火腿、香肠等的肉食加工食品中，鱼糕、圆筒状鱼糕等的水产加工食品中，面包、点心、黄油、奶粉、发酵乳制品中，还可添加到水、果汁、牛乳、清凉饮料等的饮料中使用。
本发明的含有Helipyrone A的医药，可与适合经口给药、经皮给药、直肠内给药、注射等给药方法的固体或液体的医药用无毒性载体混合，以常用的医药制剂的形态给药。
此种制剂，例如可为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等的固形剂，溶液剂、悬浮剂、乳剂等的液剂，冷冻干燥制剂等，这些制剂可通过制剂上的常用方法制备。
上述医药用无毒性载体，例如可为葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理盐水等。此外，根据需要，还可适当添加稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗调节剂等的常用的添加剂。
[Helipyrone A的化学合成]
关于Helipyrone A的化学合成已在非专利文献2(Esahak Ali，et al.，Phytochemistry，1982，21，243-244)中公开。
例如，本发明如下合成。
使用400mL己烷溶剂，在四氯化钛的存在下，使172g化合物1二乙基酮[3-戊酮(3-pentanone)]与1,000g化合物2四氢-1，4-噁嗪(吗啉)[tetrahydro-1，4-oxazine(morpholine)]在4℃下反应3小时，用蒸馏处理精制，得到503.57g化合物3(N-异丙烯酯)-四氢-1，4-噁嗪((N-isopropenyl)-tetrahydro-1，4-oxazine)(收率81.1％)。
使用200mL甲苯溶剂，使167g化合物3(N-异丙烯酯)-四氢-1，4-噁嗪[(N-isopropenyl)-tetrahydro-1，4-oxazine)]与81g化合物4乙基丙二酰氯(ethyl malonyl chloride)在甲醇冰冷却(-17℃～-11℃)条件下反应，合成通式2所表示的化合物5。
[化4]
Figure A200780006571D00071
通式(2)
用2N盐酸使化合物3与化合物4的反应终止，在氯仿提取后进行硫酸镁干燥处理。然后，在反应溶液中依次加入200mL甲苯和400mL 25％盐酸，通过液-液分配回收甲苯层。将甲苯层用400mL 0.1N盐酸洗涤，硫酸镁干燥处理后，将甲苯用真空蒸发器除去，得到橙色油状溶液。在此溶液中加入1kg PPA(聚磷酸)，110℃～118℃下环化合成化合物5。化合物5在室温下冷却，用氯仿提取回收，在硫酸镁干燥处理后用真空蒸发器除去氯仿。将固形物用硅胶柱色谱法[氯仿:甲醇＝50:1(v/v)]获得45.7g橙色固体化合物5。本反应的收率为18.3％。
通过使此化合物5在1N盐酸的存在下与甲醛聚合反应，化学合成化合物6 Helipyrone A。将45.7g化合物5溶解于460mL乙醇中，在2.5mL浓盐酸存在下，使其与247.81g甲醛(37％)在79℃下进行回流反应，析出结晶。将此结晶用300mL乙醇洗涤，获得34.01g Helipyrone A白色结晶。本反应的收率为71.6％。
所得到的Helipyrone A的物性值如下所示。
外观：白色结晶
NMR光谱(400MHz，溶剂；CDCl3)
1H-NMR
δ＝a1.231、b1.969、c2.554、d3.616、e11.199
13CNMR(400MHz、溶剂；CDCl3)
δ＝I→169.335(t)H→168.499(m)，G→160.160(m)，F→108.709(m)，E→101.592(t)，D→24.368(qt)，C→19.176(t)，B→11.689(qt)，A→9.476(q)
[化5]
Figure A200780006571D00091
[化6]
Figure A200780006571D00092
分子量：320.341g/mol(质谱分析)
分子式：C17H20O6(质谱分析)
熔点：218-220℃
[抗氧化能力评价]
对Helipyrone A进行单线态氧淬灭作用的评价。评价方法为，将2，2，6，6-四甲基-4-哌啶醇(2，2，6，6-tetramethyl-4-piperidinol)(4-OH TEMP)作为自旋捕捉剂通过ESR自旋捕捉法测定。在市售的平底96孔微孔板中，混合0.1mL以任意浓度配制的Helipyrone A的40％(v/v)N，N-二甲基甲酰胺水溶液、0.02mL蒸馏水、0.04mL100mM的4-OH TEMP水溶液、和0.04mL0.1mM的玫瑰红水溶液，制成0.2mL的混合液。作为光敏反应的光源，从微孔板的背面对混合液用最大波长530nm的发光二极管(绿色LED)照射20分钟，以产生单线态氧。将此混合液移入ESR用扁平水溶液样品管中，测定ESR光谱。由ESR光谱强度求出单线态氧淬灭率，将其对应浓度制图，求出半数抑制浓度IC50值。此外，作为比较，同时求出已有的多酚化合物[水飞蓟宾、3，4-二羟基苯基乙醇、(-)-儿茶素、(-)-表儿茶素没食子酸酯、槲皮酮、迷迭香酸、鼠尾草酸、咖啡酸、曲酸、β-胡萝卜素]的IC50值。其结果如表1所示。
由上述结果可证实，与其他多酚化合物相比，Helipyrone A可以更低浓度淬灭单线态氧。即可说明Helipyrone A显示出优异的单线态氧淬灭作用。
表1
 
样品 单线态氧半数抑制浓度(μM)
Helipyrone A 51.52
水飞蓟宾 195.51
3，4—二羟基苯基乙醇 184.86
(—)—儿茶素 184.89
(—)—表儿茶素没食子酸酯 111.40
槲皮酮 119.67
迷迭香酸 107.06
鼠尾草酸 131.95
咖啡酸 278.15
曲酸 83.15
β—胡萝卜素 436.40
[黑素生成抑制试验]
在市售的6孔培养板中，分别使小鼠B16黑色素瘤细胞在5％CO2、37℃条件下使用培养液即含有10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养到细胞汇合。添加黑素生成刺激剂100nMα MSH，同时添加0.0001％HelipyroneA，继续培养72小时。溶剂条件为含有10％FBS的DMEM培养基，但考虑到Helipyrone A的溶解度，使全部的孔中含有0.2％乙腈。培养终止后，回收细胞组分，用0.1N NaOH碱处理使黑素色素溶解，测定405nm的吸光度(ABS)。
黑素生成抑制率用下式计算
黑素生成抑制率[％]＝100×{1-(ABS[Sample])/(ABS[Control])}
对照(Control)：含有0.2％乙腈的DMEM培养基
样品(Sample)：含有0.2％乙腈、添加0.0001％Helipyrone A(DMEM培养基)
其结果，添加0.0001％ Helipyrone A时，22.1％±8.4(S.D.)的黑素生成受到抑制。
[由紫外线照射形成的皱纹的抑制试验]
对无毛小鼠长时间持续实施微弱的紫外线照射，因此形成皮肤老化现象的皱纹·松弛。用该无毛小鼠为动物模型，分析此时将Helipyrone A混料给药时的影响。
I.实验动物
·种·系统·性别
种：小鼠，系统：Hos：HR1(无毛小鼠)，性别：雌性
·饲养开始的周龄
从5周龄开始饲养，同时开始混料给药
II.饲养环境
设定温湿度：24±1℃，相对湿度55±5％
空调设备：全空气方式(all fresh)
照明时间：12小时自动开灯·关灯的方式
饲养设备：塑料制笼5只/笼
饲料：自由摄取粉末灭菌饲料MF-1[Oriental酵母工业株式会社
(Oriental Yeast Co.，Ltd)]，或在MF-1中分别以0.01％(w/w)、0.05％(w/w)、0.1％(w/w)混合Helipyrone A或以0.01％(w/w)、0.05％(w/w)混合抗氧化效果优异的β胡萝卜素。
III.试验日程
紫外线照射条件：使用紫外线灯，隔日(间隔一日)、无束缚应激地照射UV-A波14J/cm2(照射时间约1分钟)、UV-B波20mJ/cm2(照射时间约50分钟)10星期。10星期(35次)的总照射量为UV-A波490J/cm2、UV-B波700mJ/cm2。
对于持续照射紫外线的组，在解剖前24小时实施最后的紫外线照射，从解剖前18小时开始绝食。在解剖前通过非侵袭的方法使用简易型水分计测定皮肤含水量(Moisture CheckerTM、Scalar制)。
进行戊巴比妥钠麻醉，对外观进行拍照摄影。然后取皮肤背部的复制品。解剖摘出肝脏，回收全血，回收背部及腹部的皮肤。
迅速冷冻保存脏器，离心分离(3,000G，20min，室温)全血，回收血浆(plasma)冷冻保存。皮肤是将背部的一定面积进行Bouin固定，除用于组织染色外，还进行冷冻保存。
对于外观上的皮肤状态，着眼于颈部松弛(Sagging)、背部皱纹(Wrinkle)的形成状况，根据Bissett DL等的定义([Photochem Photobiol.(1987)Vol.46，No.3，pp367-pp78]进行评分。即根据下述定义进行数值化，将判断困难的检体作为中间值评为0.5。将皱纹分数的数据制图，如图1所示。
分数0
完全没有皱纹。
静止状态下未看出相对于脊椎方向的垂直线条，稍微看出一些时，其线条也随个体运动消失。
分数1
明显看出有轻微的皱纹产生。
可看出相对于脊椎方向的垂直线条，其线条随个体运动消失。
分数2
明显看出有中等程度的皱纹产生。
可明显看出相对于脊椎方向的线条，且其线条不随个体运动消失，为永久性。
分数3
明显看出有深皱纹产生。
可明显看出相对于脊椎方向的线条，可看出其线条的影子，且其线条不随个体运动消失，为永久性。
皱纹分数，紫外线照射10星期的MF-1(对照)食组为2.4，相对于此，紫外线照射10星期的配合0.1％ Helipyrone A的MF-1食组为0.1，紫外线照射10星期的配合0.05％ Helipyrone A的MF-1食组为0.2，紫外线照射10星期的配合0.01％ Helipyrone A的MF-1食组为0.6，其皱纹生成显著得到了抑制。不经过紫外线照射而经过10星期的MF-1(对照)食组的皱纹分数为0.2，通过摄取将Helipyrone A以0.05～0.1配合的食物，可使由紫外线照射引起的皱纹完全得到抑制。
从皮肤所观察的结果，证实Helipyrone A有显著的抑制皱纹效果。Helipyrone A向小鼠的给药，小鼠一日的摄食量为4g，使用体表面积换算式y＝(3√x)2换算为对人的给药量时，自由摄取0.1％的混食时，约相当于520mg/日/60kg体重，自由摄取0.01％的混食时，约相当于52mg/日/60kg体重，作为食品时，为不需勉强即可摄取的量。
此外，具有抗氧化作用的β-胡萝卜素摄食组不显示皱纹抑制效果。
紫外线照射10星期、配合0.05％β-胡萝卜素的MF-1食组的皱纹分数为2.0，紫外线照射10星期、配合0.01％β-胡萝卜素的MF-1食组的皱纹分数为2.3。
[紫外线照射所引起的皮肤干燥的抑制]
解剖之前通过非侵袭的方法使用简易型水分计(Moisture CheckerTM、Scalar制)测定皮肤含水量，每只测定5次，比较各组的平均测定值。皮肤含水量的测定结果如图2所示。
紫外线照射10星期+MF-1(对照)食组的皮肤含水量降低而呈干燥状态(皮肤含水量为31.4％)，相对于此，紫外线照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食组中配合0.1％ Helipyrone A的皮肤含水量为41.3％，配合0.05％的皮肤含水量为40.2％，配合0.01％的皮肤含水量为38.2％，保持了40％左右显著高的皮肤含水量。与不经紫外线照射而经过10星期的MF-1(对照)食组中的皮肤含水量35.5％相比，Helipyrone A配合食组的皮肤含水量显示出非常高的值。
[紫外线照射所引起的皮肤硬化的抑制]
使用弹簧型硬度计(JIS C形)皮肤粘弹性测定装置(Vesmeter：E-100S/WaveCyber制)，对从背部的尾根向颈部2cm、腰椎右侧0.5cm处测定3次，求出平均硬度。皮肤硬度的测定结果如图3所示。
作为皮肤粘弹性的指标而已知的硬度，一般已知其数值越高皮肤老化越严重，皮肤的弹性越低。
紫外线照射10星期+MF-1(对照)食组中皮肤硬化非常显著(度数15.4)，相对于此，紫外线照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食组中配合0.1％ Helipyrone A的硬度的度数为8.1，配合0.05％的硬度的度数为9.1，配合0.01％的硬度的度数为9.1，与不经过紫外线照射而经过10星期的MF-1(对照)食组中硬度的度数7.2相比，硬化被抑制到了硬化稍微增加的程度。
[紫外线照射所引起的皮肤组织中羰基蛋白生成的抑制]
氧化蛋白质之一的羰基蛋白使用OxyblotTM(CHEMICON公司)评价。具体方法如下。秤量湿重约200mg的小鼠皮肤，4℃下加入含有蛋白酶抑制剂混合物(Protease inhibitor cocktail)的裂解缓冲液(Lisys buffer)(pH＝7.4)0.2ml进行均质，12,000g×20分钟离心，使用经过滤器过滤其上清后的部分，将蛋白浓度根据Bradford方法测定。对各个蛋白样品20μg，使羰基与DNPH反应。蛋白质通过SDS-PAGE分离，使用蛋白质转印装置转印到PVDF膜上。转印后的膜在常温下30分钟，在含有5％脱脂奶的PBS(-)溶液中封闭，将脱脂奶用PBS(-)洗涤后，与抗DNPH抗体在4℃下反应过夜，洗涤后，与生物素化抗小鼠IgG反应1小时。洗涤后，用荧光检测试剂盒(ECL PLUS)使PVDF膜感光，用医疗用自动显像装置转印图像。结果如图4所示。
其结果，紫外线照射10星期+MF-1(对照)食组中羰基蛋白的量的相对值为259.4，相对于此，紫外线照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食组中配合0.1％ Helipyrone A的羰基蛋白的量的相对值为25.3，配合0.05％的羰基蛋白的量的相对值为35.6，配合0.01％的羰基蛋白的量的相对值为57.7，羰基蛋白的生成被抑制到1/10～1/5。不经过紫外线照射而经过了10星期的MF-1(对照)食组中羰基蛋白的量的相对值为23.7，与0.1％ Helipyrone A配合食组的羰基蛋白的量的相对值25.7为同等程度。因此，Helipyrone A显著抑制紫外线照射所引起的羰基蛋白的生成。
具有抗氧化作用的β-胡萝卜素摄食组基本没有抑制羰基蛋白生成的效果。
紫外线照射10星期、配合0.05％ β-胡萝卜素的MF-1食组的羰基蛋白的量的相对值为153.1，紫外线照射10星期、配合0.01％ β-胡萝卜素的MF-1食组的羰基蛋白的量的相对值为190.7。
[紫外线照射所引起的皮肤组织中8-羟基鸟苷(8-Hydroxy-2′-deoxyguanosine(8-OHdG))的生成抑制]
8-OH dG使用免疫组织化学的方法测定。解剖动物时，取皮肤组织背部尾根开始向颈部2cm、腰椎右侧0.5cm处的皮肤1cm2，进行Bouin固定及石蜡包埋以保存皮肤组织。制备3μm厚的切片，脱石蜡、亲水化可根据公知方法实施。抗原赋活在0.01M柠檬酸缓冲液(pH＝6.0)中实施5分钟微波处理。冷却到室温后，在常温下在含有0.3％过氧化氢的甲醇中反应20分钟，以抑制内源性过氧化物酶。水洗，10mMPBS(-)洗涤后，用兔血清75倍10mMPBS(-)稀释溶液实施5分钟微波处理进行封闭，清除血清，将5μg/ml第一抗体(N45.1：NIKKEN SEIL Co.，Ltd制)通过20分钟微波处理使抗体反应。用10mMPBS(-)洗涤2次，将生物素化第二抗体(生物素化兔免疫球蛋白M；DAKO制)稀释300倍后用微波处理5分钟使抗体反应。用10mMPBS(-)洗涤2次，使ABC试剂(ABC-HRP；Vectastain制)通过5分钟微波处理进行反应。显色试剂使用DAB(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐：DAKO制)，在常温下反应3分30秒。水洗后，根据公知方法进行脱水、封闭处理。在显微镜下观察皮肤组织的染色状况，使用AdobePhotoshop导入图像，将图像中一定面积中的染色处用NIH Imaging数值化。结果如图5所示。
其结果，紫外线照射10星期+MF-1(对照)食组中8-OH dG的相对值为5.89，相对于此，紫外线照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食组中配合0.1％ Helipyrone A的8-OH dG量的相对值为0.87，配合0.05％的8-OH dG量的相对值为0.91，配合0.01％的8-OH dG的相对值为1.10，8-OHdG量的生成被抑制到15/100～19/100。与不经过紫外线照射而经过10星期的MF-1(对照)食组的8-OH dG量的相对值1.00相比，紫外线照射0.05％Helipyrone A配合食组、0.1％配合食组的8-OH dG量的相对值为更低的值。因此，Helipyrone A显著抑制了紫外线照射所引起的8-OH dG的生成。
此外，具有抗氧化作用的β-胡萝卜素摄食组未显示8-OH dG的生成抑制效果。
紫外线照射10星期、配合0.05％β-胡萝卜素的MF-1食组的8-OH dG量的相对值为5.2，紫外线照射10星期、配合0.01％β-胡萝卜素的MF-1食组的8-OH dG量的相对值为6.3。
[紫外线照射所引起的皮肤组织中过氧化脂质的生成抑制]
将皮肤组织中的TBARS[硫代巴比妥酸反应生成物、nmol/g湿重(wetweight)]用荧光分析测定。秤量湿重约200mg的各组织，用1ml1.15％KCl均质后，依次添加4ml 1/12N硫酸、0.5ml10％钨磷酸，进行3,000rpm10min离心分离。除去上清的夹杂物，添加TBA试剂(硫代巴比妥酸/醋酸缓冲液)，在沸腾水浴中加热反应1小时。为进行TBARS的定量，用另外加入1，1，3，3-四乙氧基丙烷的样品进行TBA反应，制成标准曲线。结果如图6所示。
加热反应结束后，冰冷却到室温，加入5ml正丁醇，搅拌后用3,000rpm10min的条件离心分离，回收上层的正丁醇层，用于荧光分析(Ex 515nm、Em553nm)。荧光强度计使用HITACHI F-2000。
其结果，紫外线照射10星期+MF-1(对照)食组中的组织中过氧化脂质量为50.8nmol/mg，相对于此，紫外线照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食组中配合0.1％ HelipyroneA的组织中过氧化脂质量为30.9nmol/mg，配合0.05％的组织中过氧化脂质量为33.7nmol/mg，配合0.01％的组织中过氧化脂质量为44.8nmol/mg，过氧化脂质的生成被抑制到6/10～9/10。紫外线照射10星期+Helipyrone A 0.1％配合食组及0.05％配合食组的过氧化脂质量，与不经过紫外线照射而经过10星期的MF-1(对照)食组中的组织中过氧化脂质量30.2nmol/mg为同等程度。因此，HelipyroneA显著抑制了紫外线照射所引起的过氧化脂质的生成。
具有抗氧化作用的β-胡萝卜素摄食组基本没有过氧化脂质的生成抑制效果。
紫外线照射10星期、配合0.05％β-胡萝卜素的MF-1食组的过氧化脂质量为46.9nmol/mg，紫外线照射10星期、配合0.01％β-胡萝卜素的MF-1食组的过氧化脂质量为51.1nmol/mg。
[用ESR法测定一氧化氮清除能力的评价]
相对于100μM的SNAP[S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine)同仁化学制]，比较Helipyrone A和作为抗氧化剂而已知的(-)儿茶素(Sigma制)的一氧化氮清除能力。
自旋捕捉剂中，使用混合N-甲基-D-葡萄糖胺-二硫代氨基甲酸盐(N—methyl_D—Glucosamine Diflliocarbammte)[以下称MGD。从Labotec株式会社(Labotec Co.，Ltd)购入]和硫酸鉄(II)水溶液后制备的(MGD)2-Fe2+复合物。因此复合物通过与一氧化氮反应形成(MGD)2-Fe2+-NO的复合物而产生ESR光谱强度，所以通过测定一氧化氮清除剂在各浓度下的ESR光谱来测定一氧化氮的清除能力。
将50mM硫酸鉄(II)·2水合物溶剂：蒸馏水100μL(最终浓度5mM)、50mM MGD溶剂PBS(pH7.4)100μL(最终浓度5mM)、被测物质溶剂：10％乙腈100μL、100mM磷酸缓冲液699μL、100mM SNAP溶剂0.1M氢氧化钠1μL(最终浓度100μM)依次加入到1.5ml容量的微型离心管(eppendorf tube)中，从SNAP添加时开始，25℃下进行搅拌反应10分钟，
在25℃下10分钟的反应中从SNAP释放出一氧化氮，由(MGD)2-Fe2+-NO的信号强度比＝1:1:1的3个峰构成。根据此信号强度因被测物质不同而增减了多少来评价一氧化氮清除能力。具体地说，以不添加被测物质的对照的信号强度(C)为标准，从添加被测物质时的信号强度(S)通过下式求出一氧化氮清除率，如图7所示。
一氧化氮清除率＝(1-S/C)×100(％)
其结果，Helipyrone A在25μM～200μM的范围内一氧化氮清除率的提高为浓度依赖性(25Mm 32.4％，50μM时为52.6％，100μM时为63.6％，200μM时为80.1％)，IC50浓度为51.4μM，相对于此，(-)儿茶素在50μM、100μM时一氧化氮清除率分别不超过5.6％、11.7％，250μM时为31.4％，500μM时为47.4％的一氧化氮清除率。IC50浓度计算为547μM。
此次使用的机器及机器的条件设定如下所示。
机器：JEOL JES TE200、X-band ESR装置(100KHz、日本电子公司制)
机器的条件设定：
中心磁场(center field)：335.0±5.0mT、
微波功率(microwave power)：4mW、
调幅(modulation amplitude)：0.1mT、
增益(gain)：500、
时间常数(time constant)：0.1秒、
扫描时间(scanning time)：1分钟
[用比色法(Griess法)测定的一氧化氮清除能力]
溶液中存在的一氧化氮在水溶液中极不稳定，所以，除ESR法以外，通过
测定一氧化氮的氧化物亚硝酸离子，间接评价一氧化氮量。对已知的抗氧化物质(-)儿茶素、麦芽酚、p-香豆酸进行评价，与Helipyrone A比较。通过Griess法的测定，使用NO2/NO3 AssayKit-CII(Colorimetric)(同仁化学制)。
作为一氧化氮发生剂，使用NOC-5(1-羟基-2-氧代-3-(3-氨基丙基)-3-异丙
基-1-三氮烯)(同仁化学公司制)，到使用之前，在0.1N氢氧化钠碱溶液中-20℃下冷冻保存。用Kit中的缓冲液(pH＝7.6，以下“缓冲液”)稀释10000倍，通过调整到100μM的浓度，使其产生一氧化氮。作为一氧化氮供体开发的NOC-5在碱溶液中稳定，但在中性及酸性条件下是生成一氧化氮的不稳定的化合物(25度、pH7.4条件下，半衰期为25分钟)。
在市售的平底96孔培养板中，添加被测物质溶剂：含有1％乙腈的缓冲液(pH＝7.6)40μL，使被测物质的浓度改变。其后，添加缓冲液(pH＝7.6)20μL，添加100μM的NOC-5溶液40μL，25℃下反应2小时。反应终止后，添加Kit中的Griess试剂A50μL，放置5分钟，然后将Griess试剂B以每50μL单位添加，放置10分钟进行显色反应。用multiplate reader测定540nm的吸光度。将添加各被测物质浓度的吸光度作为S540，不含被测物质的对照的吸光度作为C540，不含被测物质及NOC-5的空白的吸光度作为B540，用下式计算一氧化氮清除率(％)，如表2、图8所示。
一氧化氮清除率(％)＝100×(1-(S540-B540)/(C540-B540)
代替NOC-5溶液，用亚硝酸钠溶液0～100μM的浓度区域设定的检体的吸光度制作标准曲线，求出溶液中的亚硝酸离子浓度。由此亚硝酸离子浓度，可求出由NOC-5溶液产生的一氧化氮浓度。一氧化氮清除能力的强弱，在本试验系统中用半数清除浓度(IC50、μM)比较。
从100μM的NOC-5溶液中，47.0μM的一氧化氮作为亚硝酸离子生成。此时，可看出由于添加被测物质而使吸光度降低，即可看出一氧化氮的清除活性。
表2
Figure A200780006571D00201
可看出Helipyrone A在50μM～400μM的范围内一氧化氮的清除能力具有浓度依赖性，IC50浓度为36.7μM。另一方面，(-)儿茶素、麦芽酚、p-香豆酸的IC50浓度为190.0μM、94.0μM、187.4μM。证明HelipyroneA具有优异的一氧化氮清除能力。
由以上结果可知，本发明的Helipyrone A可清除一氧化氮，作为血管系统、神经系统、免疫系统的药剂有效。此Helipyrone A清除生物体内存在的过量的一氧化氮，具有使一氧化氮达到正常浓度的作用、及在预测到一氧化氮过量发生时预先给药从而防止生物体内过量一氧化氮发生的作用。即本说明书中Helipyrone A的一氧化氮清除能力不是将生物体内存在的所有的一氧化氮完全清除，而是清除生物体内存在的过量的一氧化氮，调节到维持生物体的适合的量。
[用比色法测定的过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)清除能力]
Helipyrone A的过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)清除能力通过Griess法使用NO2/NO3AssayKit-CII(Colorimetric)(同仁化学制)测定。
对已知的抗氧化物质(-)儿茶素、麦芽酚、p-香豆酸进行评价，与Helipyrone A比较。
在市售的平底96孔培养板中添加被测物质溶剂：含有1％乙腈的缓冲液(pH＝7.6)40μL，使被测物质的浓度改变。其后，在各个孔中，添加Kit中的还原酶10μL、及辅酶10μL。
作为过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)发生剂，添加40μLSIN-1(3-(4-Morpholinyl)sydnonimin，hydrochlolide)50μM，37℃下反应2小时。反应终止后，添加50μL Kit中的Griess试剂A，放置5分钟，然后将Griess试剂B以每50μL单位添加，放置10分钟进行显色反应。用Multiplate Reader测定540nm的吸光度。将被测物质的吸光度作为S540，不含被测物质的对照的吸光度作为C540，不含被测物质及SIN-1的空白的吸光度作为B540，用下式计算过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)清除率(％)，如表3、图9所示。
过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)清除率(％)
＝100×(1-(S540-B540)/C540-B540)
标准曲线，代替SIN-1溶液，用硝酸钠溶液0～100μM的浓度区域设定的检体的吸光度制作，求出溶液中的硝酸离子浓度。由此硝酸离子浓度可求出SIN-1溶液产生的过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)浓度。
过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)清除能力的强弱，用本试验系统半数清除浓度(IC50、μM)进行比较。
其结果，对照中，由50μM的SIN-1产生8.18μM过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)，清除50％该过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)的IC50浓度，Helipyrone A为24.04μM，麦芽酚为31.84μM，p-香豆酸为31.49μM，(-)儿茶素为705.6μM，Helipyrone A显示出优异的过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)清除能力。
表3
Figure A200780006571D00221
过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)是在生物体内一氧化氮与超氧阴离子的反应中产生的，可引起强氧化作用及生物体损伤、炎症。显示过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite)清除活性的Helipyrone A是抗氧化剂，发挥抑制生物体的炎症，保护生物体成分的功能。
[酪氨酸酶活性抑制作用的测定]
在平底96孔培养板中添加被测物质溶液100μL，加入600units/ml的来自蘑菇的酪氨酸酶溶液10μL，30℃下培养10分钟。然后，加入预先在30℃下加温的6mML-DOPA(L-β-(3，4-二羟基苯基)丙氨酸)溶液100μL，30℃下振荡40分钟，同时进行培养。被测物质的溶剂使用含有1％乙腈的100mM琥珀酸缓冲液(pH5.5)，酪氨酸酶、L-DOPA的溶剂使用100mM琥珀酸缓冲液(pH5.5)。振荡后，作为黑素量的指标在475nm波长下测定吸光度，将该值作为S475。将不添加被测物质时作为对照(C)，将该吸光度作为C475，将不添加L-DOPA时作为样品空白(SB)，将该吸光度作为SB475，将不添加样品和L-DOPA时作为对照空白(CB)，将该吸光度作为CB475，通过式2计算出酪氨酸酶抑制率。阳性对照使用熊果苷[東京化成工业株式会社制]。
酪氨酸酶活性抑制率％＝100×{1-(S475-SB475)/(C475-CB475)}
其结果，添加浓度为1mM时Helipyrone A和熊果苷的酪氨酸酶抑制率，Helipyrone A为36.34％，熊果苷为25.77％，所以，Helipyrone A具有比熊果苷优异的抑制酪氨酸酶活性，Helipyrone A显示美白作用。
[小鼠皮肤中的酪氨酸酶基因的表达分析]
让小鼠摄食Helipyrone A时，编码酪氨酸酶的基因的表达用小鼠皮肤测定。
I.实验动物
I-1.种·系统·性别：种：小鼠，系统：Hos：HR1(无毛小鼠)，性别：雌性
I-2.饲养开始周龄：5周龄(饲养1星期后，从6周龄开始进行紫外线照射试验)
I-3.微生物等级：SPF
I-4.饲养者：清水实验材料株式会社
II.饲养环境
设定温湿度：24±1℃，相对湿度55±5％
空调设备：全空气方式
照明时间：12小时自动开灯·关灯方式
饲养设备：塑料制笼5只/笼
饲料：自由摄取粉末灭菌饲料MF-1[Oriental酵母工业株式会社
(Oriental Yeast Co.，Ltd)]，另外制备在MF-1中混合0.1重量％Helipyrone A的饲料。
试验对象物的给药：使其自由摄取粉末混料。解剖前18小时开始绝食。
给水：自由摄取灭菌后的自来水
IV-3解剖
对从解剖前18小时开始绝食的个体进行体重测定、皮肤含水量测定后，通
过戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)腹腔内给药导入麻醉。
切开腹部，从心脏进行肝素采血。然后，对脏器进行肉眼观察后，摘出肝脏、从后头部到臀部的背部全部皮肤。关于背部皮肤，是切取皮肤组织背侧尾根开始到颈部2cm、腰椎右侧0.5cm处的皮肤1cm2，进行Bouin固定及石蜡包埋，以保存皮肤组织。其他的背部皮肤迅速放入铝箔，用液氮急速冷冻，-80℃下长期保存。
[关于基因表达分析的试验]
选择各组2只的背部皮肤，提取基因表达分析用Total RNA样品。将背部皮肤在液氮存在下细切粉碎，分别将湿重每数十mg注入1.5ml容量微型离心管中。Total RNA提取使用RNase easy mini kit(QIAGEN制)，根据通常的使用说明进行。
提取的Total RNA使用Affymetrix公司推荐的使用说明处理后，通过DNA微阵列法分析皮肤组织中的表达模式。具体地说，从提取的total RNA中，使用“SUPERSCRIPT choice system for cDNA synthesis”(商品名，Invitrogen公司制)合成cDNA，以此cDNA为模板，使用“Bio Array HighYield RNA Transcript Labeling Kit”(商品名，Enzo Diagnostics公司制)，在试管内合成生物素标记的cRNA。且将此cRNA切成片段后，用DNA微阵列[商品名“GeneChipMouse Expression Array 430A”(Affymetrix公司制)]和“杂交炉”(商品名，Affymetrix公司制)进行杂交，将与R-藻红蛋白链霉亲和素(R-phycoerythrin streptavidin)的反应及洗涤操作使用“全自动洗涤工作站(Fluidics station)”(商品名、Affymetrix公司制)进行后，用“基因芯片扫描仪(Gene Array Scanner)”(商品名、Affymetrix公司制)测定荧光强度，进行相关基因表达量的分析。且上述DNA微阵列的检测灵敏度为1:100,000，其可通过在小鼠total RNA样品中添加检测来自小鼠cDNA克隆的标记后转印产物进行测定。对于本试验中使用的来自小鼠皮肤的total RNA，检测出22，690基因，用于基因表达增減的分析。其中，酪氨酸酶用ProbeID：1448821_at编码，由其荧光强度求出基因表达强度的比率。
试验组和对照组的组合如下所示。
试验组：含有0.1％Helipyrone A的MF-1食10星期饲养(16周龄)
对照组：MF-1食10星期(16周龄)
表4
 
探针 登录号(人) 登录号(小鼠) 对照食 Helipyrone A摄食 比率(HelipyroneA摄食/对照食)       
1448821_at NM_000372 NM_011661 1276.9 479.75 0.37575
表4中的“登录号”是各基因基因库(GenBank)(NCBI的核酸序列数据库)中的识别编号，探针组序列号(Probe Set ID)是Affymetrix公司制GeneChip Expression Array固有的识别编号。
由表4可知，小鼠皮肤组织中酪氨酸酶的基因表达被Helipyrone A抑制，酪氨酸酶在皮肤中的超表达被抑制，酪氨酸酶引起的黑素形成被Helipyrone A抑制。
[皮肤组织中增殖细胞核抗原(Proliferation Cell Nuclear Antigen)的测定]
增殖细胞核抗原(Proliferation CellNuclear Antigen)(PCNA)使用免疫组织化学的方法测定。
石蜡包埋后的小鼠皮肤组织中，根据常规方法进行脱石蜡处理，抗原赋活是在0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)中实施5分钟微波处理。冷却到室温后，常温下在含有0.3％过氧化氢的甲醇中反应20分钟，以抑制内源性过氧化物酶。水洗，10mM PBS(-)洗涤后，用兔血清75倍10mMPBS(—)稀释溶液实施5分钟微波处理进行封闭，封闭结束后，清除兔血清，添加将第一抗体(PC10：DAKO制)稀释500倍后的物质，通过20分钟微波处理使抗体反应。用10mMPBS(-)洗涤2次，添加将生物素化第二抗体(生物素化兔免疫球蛋白M；DAKO制)稀释300倍后的物质，微波处理5分钟使抗体反应。用10mMPBS(-)洗涤2次，添加ABC试剂(ABC-HRP；Vectastain制)，通过微波处理5分钟进行反应。使用显色试剂DAB(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐：DAKO制)，在常温下反应3分30秒。水洗后，根据公知方法进行脱水、封闭处理。在显微镜下观察皮肤组织的染色状况。紫外线照射10星期的检体，由于PCNA的增加表皮细胞中主要是细胞核部分显色，使用Adobe Photoshop导入图像，将图像中一定面积中的染色处用NIHImaging进行数值化。
求出各组数值的平均值±S.D.。2组间的显著性差异检验以UV(-)组为标准值1，对各组平均值进行补正后，实施student t检验(student’s t-test)(显著水平p<0.05)。测定的样品如表5所示，结果如图10所示。
摄取Helipyrone A的小鼠的皮肤组织中PCNA未增加。已知PCNA作为因DNA的氧化、切割及增殖性皮肤病而为人所知干癣的生物标记物而表达上升，本试验中，由于Helipyrone A摄食对DNA的抗氧化作用、紫外线损伤的缓和作用，而使紫外线照射小鼠皮肤时表达上升的PCNA恢复到正常水平。
表5
 
1 紫外线未照射 对照食
2 紫外线照射 对照食
3 紫外线照射 Helipyrone A 0.1％混料
4 紫外线照射 Helipyrone A 0.05％混料
5 紫外线照射 Helipyrone A 0.01％混料
6 紫外线照射 β—胡萝卜素0.05％混料
7 紫外线照射 β—胡萝卜素0.01％混料
[皮肤组织中兜甲蛋白的测定]
兜甲蛋白使用免疫组织化学的手法测定。
石蜡包埋后的小鼠皮肤组织根据常规方法进行脱石蜡处理，抗原赋活在0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)中实施5分钟微波处理。冷却到室温后，常温下在含有0.3％过氧化氢的甲醇中反应20分钟，以抑制内源性过氧化物酶。水洗，10mM PBS(-)洗涤后，用山羊血清75倍10mMPBS(—)稀释溶液实施5分钟微波处理进行封闭，封闭结束后，清除山羊血清，添加将第一抗体[兜甲蛋白多克隆抗体，纯品(Loricrin Polyclonal Antibody，Purified)：Sigma制]稀释500倍的物质，通过20分钟微波处理使抗体反应。用10mMPBS(-)洗涤2次，添加将生物素化第二抗体(生物素化山羊免疫球蛋白M；DAKO制)稀释300倍的物质，微波处理5分钟使抗体反应。用10mMPBS(-)洗涤2次，添加ABC试剂(ABC-HRP；Vectastain制)，通过5分钟微波处理进行反应。显色试剂使用DAB(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐：DAKO制)，常温下反应4分30秒。之后，用苏木素对细胞核、组织全体像进行染色处理，水洗后，根据公知方法进行脱水、封闭处理。在显微镜下观察皮肤组织的染色状况。紫外线照射10星期的检体由于兜甲蛋白增加，表皮细胞中主要是细胞核部分显色。使用Adobe Photoshop导入图像，将图像中一定面积中的染色处用MH Imaging数值化。测定的样品如表6所示，结果如图11所示。
求出各组数值的平均值±S.D.。2组间的显著性差异检验以UV(-)组为标准值1，对各组平均值进行补正后，实施student t检验(student’s t-test)(显著水平p<0.05)。
摄取Helipyrone A的小鼠皮肤组织，兜甲蛋白未增加。兜甲蛋白作为皮肤终末分化的标记物而为人所知，通过Helipyrone A摄取，证明其具有抑制皮肤的老化现象，保持正常的皮肤分化状态的作用。
表6
 
1 紫外线未照射 对照食
2 紫外线照射 对照食
3 紫外线照射 Helipyrone A 0.1％混料
4 紫外线照射 Helipyrone A 0.05％混料
5 紫外线照射 Helipyrone A 0.01％混料
6 紫外线照射 β—胡萝卜素0.05％混料
7 紫外线照射 β—胡萝卜素0.01％混料
[皮肤组织中角蛋白1的测定]
角蛋白1使用免疫组织化学的方法测定。
石蜡包埋后的小鼠皮肤组织根据常规方法进行脱石蜡处理，抗原赋活在0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)中实施5分钟微波处理。冷却到室温后，常温下在含有0.3％过氧化氢的甲醇中反应20分钟，以抑制内源性过氧化物酶。水洗，10mM PBS(-)洗涤后，用山羊血清75倍10mMPBS(—)稀释溶液实施5分钟微波处理进行封闭，封闭结束后，清除山羊血清，添加将第一抗体[小鼠角蛋白1(AF109)多克隆抗体，纯品：(MouseKeratinl(AF109)PolyclonalAntibody，Purified)：COVANCE制]稀释500倍的物质通过20分钟微波处理使抗体反应。用10mMPBS(-)洗涤2次，添加将生物素化第二抗体(生物素化山羊免疫球蛋白M；DAKO制)稀释300倍的物质，微波处理5分钟使抗体反应。用10mMPBS(-)洗涤2次，添加ABC试剂(ABC-HRP；Vectastain制)，通过微波处理5分钟使其反应。显色试剂使用DAB(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐：DAKO制)，常温下反应3分30秒。然后，用苏木素对细胞核、组织全体像进行染色处理，水洗后，根据公知方法进行脱水、封闭处理。在显微镜下观察皮肤组织的染色状况。紫外线照射10星期的检体由于角蛋白1的增加，其表皮细胞主要是细胞核显色。使用Adobe Photoshop导入图像，将图像中一定面积中的染色处用NIH Imaging数值化。测定的样品如表7，结果如图12所示。
求出各组数值的平均值±S.D.。2组间的显著性差异检验以UV(-)组为标准值1，对各组的平均值进行补正后，实施student t检验(student’s t-test)(显著水平p<0.05)。
摄取Helipyrone A的小鼠的皮肤组织中角蛋白1未增加。角蛋白1作为皮肤的终末分化的标记物而为人所知，通过摄取Helipyrone A，可抑制皮肤的老化现象，具有保持正常皮肤分化状态的作用。
表7
 
1 紫外线未照射 对照食
2 紫外线照射 对照食
3 紫外线照射 Helipyrone A 0.1％混料
4 紫外线照射 Helipyrone A 0.05％混料
5 紫外线照射 Helipyrone A 0.01％混料
6 紫外线照射 β—胡萝卜素0.05％混料
7 紫外线照射 β—胡萝卜素0.01％混料
处方例以下所示。
[处方例1胶囊剂]
混合下述成分，充填到混合明胶及甘油的胶囊基质中。获得软胶囊。
(组成)                                (配合量；mg)
Helipyrone A                           70
生育三烯酚                             30
蜂蜡                                   10
葡萄籽油                               110
[处方例2片剂]
混合下述成分，压片，制成片剂。
(组成)                                    (配合量；mg)
Helipyrone A                                       75
纤维素                                             40
淀粉                                               20
蔗糖脂肪酸酯                                       2
[处方例3片剂]
混合下述成分，压片，制成片剂。
(组成)                                   (配合量；mg)
Helipyrone A                                      75
纤维素                                            40
淀粉                                              20
蔗糖脂肪酸酯                                      2
[处方例4果汁]
(组成)                                   (配合量；质量％)
果糖葡萄糖液糖                                    5.00
柠檬酸                                            10.40
L—抗坏血酸                                       0.20
香料                                              0.02
色素                                              0.10
Helipyrone A                                      0.05
水                                                84.33
[处方例5霜剂]
将下述成分(1)～(10)在80℃下加热溶解成油相。将成分(11)～(13)在70℃加热溶解成水相。在油相中缓缓加入水相乳化，搅拌的同时冷却到40℃，进一步搅拌冷却到30℃，获得霜剂。
(1)硬脂醇                                      6.0
(2)硬脂酸                                      2.0
(3)氢化羊毛脂                                  4.0
(4)角鲨烷                                      9.0
(5)辛基十二烷醇                                10.0
(6)POE(25)十六醇醚                             3.0
(7)单硬脂酸甘油酯                              2.0
(8)Helipyrone A                                 0.9
(9)防腐剂                                      适量
(10)香料                                       适量
(11)1，3丁二醇                                 6.0
(12)PEG 1500                                   4.0
(13)精制水                                     剩余

Claims (6)

1.含有通式(1)表示的Helipyrone A的单线态氧淬灭剂、皮肤老化改善剂、皱纹改善剂、松弛改善剂、皮肤含水量改善剂、美白剂、抑制黑素剂、一氧化氮清除剂或抗氧化剂。
[化1]
Figure A200780006571C00021
通式(1)
2.口服组合物，其含有权利要求1中所述的任何一种药剂。
3.皮肤外用组合物，其含有权利要求1中所述的任何一种药剂。
4.食品，其含有权利要求1中所述的任何一种药剂。
5.医药，其含有权利要求1中所述的任何一种药剂。
6.化妆料，其含有权利要求1中所述的任何一种药剂。
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