WO2007125832A1 - ヘリピロンａを用いた一重項酸素消去剤、皮膚老化改善剤、しわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラニン抑制剤、一酸化窒素消去剤、酸化防止剤 - Google Patents

ヘリピロンａを用いた一重項酸素消去剤、皮膚老化改善剤、しわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラニン抑制剤、一酸化窒素消去剤、酸化防止剤 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to Helipyrone A.
  • Non-Patent Document 1 Journal of ethnopharmacology 33 (1991) p51-55
  • helipyrone A represented by (Helipyrone A) has an antibacterial action.
  • Non-Patent Document 1 Journal of ethnopharmacology 33 (1991) p51- 55
  • Non-Patent Document 2 Esahak Ali, et al, Phytochemistry, 1982, 21, 243-244
  • An object of the present invention is to find a new action related to Helipyrone A and to make effective use thereof.
  • the main configuration of the present invention is as follows.
  • Singlet oxygen scavenger containing Helipyrone A represented by the general formula (1), skin aging improver, wrinkle improver, sagging improver, skin moisture content improver, whitening agent, melanin inhibitor, one Nitric oxide scavenger or antioxidant.
  • composition for external use on skin containing any of the agents described in 1.
  • FIG. 7 Graph showing the ability to scavenge nitrogen monoxide by ESR method
  • FIG. 10 Graph showing the ability to suppress increase in Proliferation Cell Nuclear Antigen (PCNA).
  • FIG. 11 Graph showing the ability to suppress oral reclinin.
  • FIG. 12 is a graph showing the ability to suppress keratin 1
  • Helipyrone A is represented by the following general formula (1).
  • Helipyrone A has new effects such as wrinkle suppression effect, skin aging improvement, photoaging, whitening agent, melanin production, antioxidant, singlet oxygen scavenging, nitric oxide scavenging and the like. I found out that there was. Based on these new findings, it can be used as a cosmetic composition, food additive material, and pharmaceutical material.
  • wrinkle-suppressing effect skin aging improvement, photoaging, whitening agent, melanin generation, antioxidant, singlet oxygen elimination can be expected, skin aging improving agent, photoaging inhibitor, whitening agent, melanin It can be used as a production inhibitor, antioxidant, singlet oxygen scavenger, and nitric oxide scavenger.
  • Cosmetics (including quasi-drugs) containing Helipyron A (Helipyr 0ne A) of the present invention include lotions, emulsions, creams, gels as moisturizing cosmetics for the face, hands, feet, and body. And multilayer cosmetics. Further, it can also be used as makeup cosmetics such as lipsticks and foundations, detergents such as facial cleansers, hand-washes and body shampoos, and cosmetics for hair such as shampoos, rinses, treatments and hair restorers.
  • oils such as hydrocarbon oils, ester oils, fatty acids, higher alcohols, silicones, sterols, ceramides, moisturizers such as polyhydric alcohols, sugars, pyrrolidone carboxylic acids, amino acids, betaines, nonionic surfactants, Anionic surfactant, cationic surfactant, amphoteric surfactant, semipolar surfactant, surfactant such as lecithin, polymeric emulsifier, water-soluble polymer, thickener such as dextrin palmitate, inorganic Powders, organic powders, antibacterial agents, bactericides, PH regulators, chelating agents, coloring agents, fragrances, plant extracts, etc.
  • oils such as hydrocarbon oils, ester oils, fatty acids, higher alcohols, silicones, sterols, ceramides
  • moisturizers such as polyhydric alcohols, sugars, pyrrolidone carboxylic acids, amino acids, betaines, nonionic surfactants, Anionic sur
  • Helipyrone A can be used as it is or with various nutritional ingredients added, and it can be used in a desired food. You may do it. For example, after adding suitable auxiliaries such as starch, lactose, maltose, vegetable oil powder, cocoa butter, stearic acid, etc., using conventional means, edible forms such as granules, granules, tablets It can be formed into capsules, pastes, etc. to make health foods, health functional foods, etc.
  • suitable auxiliaries such as starch, lactose, maltose, vegetable oil powder, cocoa butter, stearic acid, etc.
  • various processed foods such as ham, sausage and other processed meat foods, seafood processed foods such as Rikibako, Chikuwa, bread, confectionery, butter, powdered milk, water that can be added to fermented milk products, fruit juice, It may be used by adding to beverages such as milk and soft drinks.
  • the medicament containing Helipyrone A of the present invention is mixed with a solid or liquid non-toxic pharmaceutical carrier suitable for administration methods such as oral administration, transdermal administration, rectal administration, and injection, It can be administered in the form of a conventional pharmaceutical preparation.
  • preparations include solid preparations such as tablets, granules, powders and capsules, liquid preparations such as solutions, suspensions and emulsions, freeze-dried preparations, and the like. It can be prepared by conventional means.
  • non-toxic pharmaceutical carrier examples include glucose, lactose, sucrose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene dalcol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, amino Examples include acids, gelatin, albumin, water, and physiological saline. If necessary, conventional additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifiers, binders, and isotonic agents may be added as appropriate.
  • Non-patent document 2 (Esahak Ali, et al, Phytochemistry, 1982, 21,243-244) discloses the chemical synthesis of helipyrone A.
  • Helipyrone A was evaluated for singlet oxygen scavenging action. The evaluation was carried out by the ESR ⁇ pin trap method using 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol (4-OH TEMP) as a spin trap agent. First of all, to the flat bottom 96-well microplate 40% ( ⁇ / ⁇ ) ⁇ , ⁇ -dimethylformamide aqueous solution of Helipyrone A prepared to a concentration of 0.1 mL, followed by 0.02 mL of distilled water, lOO mM 4-OH TEMP aqueous solution 04 mL, 0. ImM Rose Bengal aqueous solution was mixed with 0.04 mL to obtain a 0.2 mL mixture.
  • 4-OH TEMP 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol
  • This mixed solution was transferred to a flat aqueous solution cell for ESR, and the ESR spectrum was measured. From the ESR ⁇ vector intensity, the singlet oxygen scavenging rate was obtained and plotted against the concentration to obtain the 50% inhibition concentration IC50 value.
  • heliponone A ( ⁇ elipyrone A) scavenges singlet oxygen at a lower concentration than other polyphenol compounds. That is, it has been clarified that Helipyrone A exhibits an excellent singlet oxygen scavenging action.
  • Control DMEM medium containing 0.2% acetonitrile
  • mice mouse, strain: Hos: HRl (hairless mouse), gender: female
  • Air conditioning equipment All fresh
  • Sterile powdered feed MF-1 (Oriental Yeast Co., Ltd.) can be ingested freely, or helipon A in MF-1 can be 0.01% (w / w), 0.05% (w / w), 0.1% (w / w) or antioxidant J8 carotene, which is excellent in effect, was mixed with 0.01% (w / w) and 0.05% (w / w).
  • UV irradiation conditions every other day (every other day) for 10 weeks, using UV lamp, UV-A wave 14J / cm 2 (irradiation time about 1 minute), UV-B wave 20mJ / cm 2 (irradiation time about 50 minutes) ) was applied without restraining stress.
  • Total dose of 10 weeks (35 times) is a UV-A wave 490J / cm 2, UV-B wave 700 mJ / cm 2.
  • the final UV irradiation was performed 24 hours before dissection. Fasting 18 hours before dissection. Before dissection, the skin moisture content was measured using a simple moisture meter (Moisture Checker TM, manufactured by SCARA) using a non-invasive technique.
  • Moisture Checker TM manufactured by SCARA
  • Nembutal anesthesia was performed and the appearance was photographed. A replica of the back of the skin was then collected.
  • liver removal By dissection, liver removal, whole blood collection, back and abdominal skin were collected.
  • Organs were quickly frozen and stored, and whole blood was centrifuged (3,000 G, 20 min, room temperature) to collect plasma and stored frozen.
  • the skin was frozen and stored, except that a fixed area of the back was fixed on the back of the skin and used for tissue staining.
  • the streak is perpendicular to the spinal direction in the resting state, or the streak disappears depending on the extent to which the streak is perceptible and the movement of the individual.
  • a streak perpendicular to the spinal direction is observed, and the streak disappears as the individual moves.
  • a streak is clearly observed with respect to the spine direction, and the streak is permanent without disappearing as the individual moves.
  • a streak is clearly observed in the spine direction, a shadow is observed on the streak, and the streak does not disappear depending on the movement of the individual.
  • the scissor score is MF-1 (control) diet group 2.4 for 10 weeks with UV irradiation, whereas MF-1 diet group 0.1% with 0.1% heliciron A for 10 weeks with UV irradiation.
  • MF-1 diet 0.2% containing 0.05% helipyrone A for 10 weeks after irradiation, and MF-1 diet 0.6% containing 0.01% helipyrone A for 10 weeks after UV irradiation.
  • the generation of soot was significantly suppressed.
  • the MF-1 (control) diet group score after 10 weeks without ultraviolet irradiation is 0.2, and the hepatic iron A diet containing 0.05 to 0. The occurrence of the problem is completely suppressed!
  • helipon A has a significant effect on inhibiting wrinkles.
  • the ⁇ -carotene feeding group which has an antioxidant effect, showed no wrinkle suppression effect.
  • 8-carotene for 10 weeks of UV irradiation was 2.0, and the MF-1 diet score score of
  • 8-carotene for 10 weeks of UV irradiation was 2.0, and the MF-1 diet score score of
  • Fig. 2 shows the results of skin moisture measurement.
  • UV irradiation 10 weeks + MF-1 (control) In the diet group, skin moisture decreased and was in a dry state
  • the skin moisture content was 41.3% and 0.
  • the skin moisture content was 40.2% with 05%, and 38.2% with 0.01%.
  • the skin moisture content was significantly high at around 40%.
  • the skin moisture content of the heliciron A combination diet group was higher than the 35.5% skin moisture content of the MF-1 (control) diet group after 10 weeks without irradiation with ultraviolet rays.
  • the hardness known as an index of skin viscoelasticity is generally known to be that the higher the value, the more skin aging progresses and the skin elasticity decreases.
  • Ultraviolet irradiation 10 weeks + MF-1 (control) diet group showed significant skin hardening (frequency 15.4), whereas UV irradiation 10 weeks + helipyrone
  • Carbonylated protein one of the oxidized proteins, was evaluated using Oxyblot TM (CHEMICON).
  • the membrane after transfer is blocked at room temperature for 30 minutes in 5% skim at 4 ° C in PBS () containing milk, washed with PBS (), and reacted with anti-DNPH antibody at 4 ° C overnight. After washing, anti-mouse IgG with piotin I adapted it. After washing, the PVDF film was exposed using a fluorescence detection kit (ECL PLUS), and the image was transferred with a medical automatic developing device. The results are shown in Fig. 4.
  • the relative mass of carbonyl tan tank mass was 259.4, compared with 10 weeks of UV irradiation + helipyrone A combination.
  • the relative value of the carbolated protein is 25.3 with 0.05% helipyrone AO.
  • the relative value of the carboylated protein is 35.6, 0.
  • the relative value of the carbolated protein with the content of 01% was 57.7, which was suppressed by the ability to produce carboylated protein SlZlO to lZ5.
  • the relative value of the carboylated protein in the MF-1 (control) diet group after 10 weeks without UV irradiation was 23.7, and the carborui koji protein in the hepirone AO. 1% diet group The relative value of the amount was about 25.7. Therefore, helipyrone A remarkably suppresses the production of carbonyl protein associated with ultraviolet irradiation.
  • the ⁇ -strength ten-fed group which has an anti-oxidant effect, was not very effective in suppressing the formation of carbonylated proteins.
  • UV-irradiated 10-week carbo-Louis MF-1 diet containing 0.05% carotene containing 0.05% Relative protein content is 153.1, UV-irradiated 10 weeks
  • 8-carotene is 0.01%
  • the relative value of carboylated protein in the MF-1 diet group was 190.7.
  • the reaction was performed at room temperature for 3 minutes and 30 seconds using DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride: manufactured by DAKO) as a coloring reagent. After washing with water, dehydration and encapsulation were performed based on known methods. The staining of the skin tissue was observed under a microscope, the image was captured using Adobe Photoshop, and the stained area within a certain area in the image was numerically input using NIH Imaging. The results are shown in FIG.
  • DAB 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride: manufactured by DAKO
  • the relative value of 8-OH dG in the UV irradiation 10 weeks + MF-1 (control) diet group was 5.89, whereas the UV irradiation 10 weeks + MF-1 diet containing helipyrone A
  • the relative value of 8-OH dG in the combination of Helipilon AO. 1% is 0.87, in the case of 0.05%, and the relative value of 8-OH dG is in the range of 0.91 and 0.01%.
  • the relative value of OH dG was 1.10, and the production of 8-OH dG was suppressed to 15Z100-19Z100.
  • the ⁇ -strength mouth-feeding group which has an antioxidant effect, did not show the effect of suppressing the production of 8-OH dG.
  • the relative value of 8-OH dG in the MF-1 diet group containing 0.05% of j8—Strengthen Ten for 10 weeks after UV irradiation is 5.2, and
  • the relative value of 8-OH dG in the MF-1 diet group was 6.3.
  • TBARS thiobarbituric acid reaction product, nmol / g wet weight
  • TBARS thiobarbituric acid reaction product, nmol / g wet weight
  • TBA thiobarbituric acid Z acetate buffer
  • the amount of lipid peroxide in the MF-1 diet group containing 0.05% of 8-8 tens of tens of UV irradiation for 10 weeks was 46.9 nmolZmg, and MF- containing 0.01% of j8-carotene for 10 weeks of UV irradiation.
  • the amount of lipid peroxide in one group was 51. InmolZmg.
  • the spin trapping agent was prepared by mixing N-methyl-D glucamine dithio rubamate (hereinafter referred to as MG D and ⁇ ⁇ . Purchased from Labotech Co., Ltd.) and aqueous iron (II) sulfate (MGD) — Fe 2 + Complex was used. This complex reacts with nitric oxide (MGD) -Fe 2+ -NO
  • the ESR ⁇ vector intensity is generated by forming a complex of the above, it is possible to eliminate nitrogen monoxide by measuring the ESR ⁇ vector at each concentration of the nitric oxide scavenger. Was measured.
  • Nitric oxide is released from SNAP by reaction at 25 ° C for 10 minutes, and (MGD) — Fe 2+ — NO
  • helipyrone A has a concentration-dependent increase in nitrogen monoxide removal rate S in a concentration range of 25 ⁇ to 200 / ⁇ M (32.4% at 25 / ⁇ ⁇ , 52.6 at %, 100 / ⁇ 63 63.6%, 200 ⁇
  • Micromax 80.1 0/0 with Micromax, relative IC50 concentration 51.
  • Micromax Tsutano only (1) catechin ⁇ or 50 Micromax, each 100 Micromax in nitric erasure rate 5.6%, 11.7% At 250 / ⁇ 31, the nitrogen monoxide removal rate was 31.4% and 500 ⁇ M-C47.4%.
  • IC50 concentration was calculated as ⁇ .
  • Equipment JEOL JES TE200, X-band ESR equipment (100KHz, manufactured by JEOL Ltd.) Equipment condition settings:
  • Microwave ⁇ Bupa ⁇ (.microwave power): 4mW ⁇
  • Modulation amplitude 0.lmT
  • gain 500
  • NOC-5 developed as a mono-acid-nitrogen donor, is stable in alkaline solutions, but is an unstable compound that generates mono-acid-nitrogen under neutral and acidic conditions (at 25 ° C, pH 7.4) With a half-life of 25 minutes).
  • a calibration curve was prepared for the absorbance power of the sample set in the concentration range of the sodium nitrite solution 0 to LOO / zM instead of the NOC-5 solution, and the nitrite ion concentration in the solution was determined. It is possible to determine the concentration of nitric acid and nitrogen in which both nitrite ion concentration and NOC-5 solution force are generated. The strength of nitric oxide scavenging ability was compared at the concentration (IC50, ⁇ ) at which 50% was erased in this test system.
  • nitric oxide is formed as nitrite ion from 100 ⁇ NOC-5 solution To do. At this time, a decrease in absorbance due to the addition of the test substance, that is, nitric oxide scavenging activity was observed.
  • Helipyrone A showed a nitric oxide scavenging ability in a concentration-dependent range from 50 ⁇ to 400 ⁇ , and the IC50 concentration was 36.7 ⁇ .
  • IC50 concentrations of catechin, maltol, and ⁇ -tamarinic acid were 190.. ⁇ , 94. ⁇ , and 187.4 ⁇ .
  • the excellent nitric oxide scavenging ability of Helipyrone ⁇ was confirmed.
  • the hepyrone A of the present invention eliminates acid-nitrogen, and is considered to be useful as a vasculature, nervous system, and immune system drug.
  • Helipilon A eliminates excess nitric oxide present in the body and produces a normal concentration of nitric oxide.
  • it has the function of preventing the generation of excessive nitrogen monoxide and nitrogen in the living body. That is, in this specification, the helicone A monoacid-nitrogen scavenging ability is not meant to completely erase all the monoacid-nitrogen present in the living body. This refers to a substance that is adjusted so that the amount of nitrogen is eliminated and the amount is appropriate for maintaining the living body.
  • the peroxynitrite scavenging ability of helipyrone A is determined by the Griess method using NO / NO AssayKit— CII (C
  • a calibration curve was prepared from the absorbance of the specimen set in the concentration range of the sodium nitrate solution 0 to LOO / zM instead of the SIN-1 solution, and the nitrate ion concentration in the solution was determined. From this nitrate ion concentration, the concentration of Peroxynitrite that generated SIN-1 solution force can be determined.
  • Peroxynitrite scavenging ability was compared with the concentration (IC50, / z M) at which 50% was erased in this test system.
  • Peroxynitrite is generated by the reaction of nitric oxide and superoxide-one in vivo, and causes strong oxidative action, biological damage, and inflammation.
  • Hepyrone A which exhibits peroxynitrite scavenging activity, is an anti-oxidative agent that suppresses inflammation in the body and protects biological components.
  • test substance solution 100 / zL was added to a flat bottom 96-well plate, 10 L of 600 units / ml mushroom-derived tyrosinase solution was added, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 10 minutes. Then, add 100 L of 6 mM L-DOPA (L- ⁇ - (3,4-dihydroxyphenol) alanine) solution that has been warmed to 30 ° C in advance, and add it at 30 ° C for 40 minutes. Incubated with shaking.
  • L-DOPA L- ⁇ - (3,4-dihydroxyphenol) alanine
  • test substance solvent lOOmM succinate buffer (pH 5.5) containing 1% acetonitrile was used, and as the solvent for tyrosinase and L-DOPA, 100 mM succinate buffer (pH 5.5) was used. After shaking, the absorbance was measured at a wavelength of 475, which is an indicator of the amount of melanin.
  • Control (C) when no test substance is added and absorb this absorbance with C and L-DOPA.
  • Tyrosinase activity inhibition rate% 100 ⁇ 1 one (S — SB) / (C one CB) ⁇
  • mice When mice were fed hepyrone A, the expression of the gene encoding tyrosinase was measured in mouse skin.
  • Air conditioning equipment All fresh Lighting time: 12 hours automatic lighting
  • Powdered sterilized feed MF-1 (Oriental Yeast Industry Co., Ltd.) was freely ingested, and MF-1 was mixed with 0.1% by weight of helipyrone A separately.
  • test subject Ad libitized as a powder diet. Fasted for 18 hours before dissection
  • Water supply Free use of sterilized tap water
  • RNA samples for gene expression analysis were extracted.
  • the dorsal skin was finely pulverized in the presence of liquid nitrogen and dispensed into a 1.5 ml Ebbendorf tube every tens of mg of wet weight.
  • Total RNA extraction was performed using RNase easy mini kit (QIAGEN) and following the normal protocol.
  • cDNA was synthesized from the extracted total RNA using the “SUPERSCRIPT choice system for cDN A synthesis” (trade name, manufactured by Invitrogen), and this cDNA was converted into a saddle shape “: Bio Array High Yield”.
  • Piotin-labeled cRNA was synthesized in vitro using RNA Transcript Labeling Kit J (trade name, manufactured by Enzo Diagnostics), and this cRNA was fragmented and then DNA microarray (trade name “GeneChipMouse”).
  • Hybridization with Expression Array 430AJ (Affymetrix)) and “Noise Hybridization Oven” (trade name, Affymetrix), reaction with R-phycoerythrin-streptavidin and washing After operation at “Fluidics station” (trade name, manufactured by Affymetrix), fluorescence intensity was measured with “Gene Array Scanner” (trade name, manufactured by Affymetrix), and the expression level of related genes was analyzed. .
  • the detection sensitivity of the DNA microarray is 1: 100,000, which is measured by adding a labeled transcript derived from a mouse cDNA clone to a mouse total RNA sample and detecting it.
  • RNA derived from mouse skin used in this study 22,690 genes were detected and used for analysis of gene expression increase / decrease.
  • tyrosinase is encoded by ProbelD: 1448821-at, and the ratio of gene expression intensity was determined from the fluorescence intensity.
  • test group [0066] The combinations of the test group and the control group are as follows.
  • Test group MF containing 0.1% helipyrone A-1 meal 10 weeks (16 weeks old)
  • Control group MF—one meal 10 weeks (16 weeks of age)
  • Probe Set ID is an identification number unique to GeneChip Expression Array manufactured by Affymetrix.
  • PCNA Proliferation Cell Nuclear Antigen
  • the paraffin-embedded mouse skin tissue is subjected to deparaffinization according to a standard method.
  • Antigen activation was performed in a 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) for 5 minutes in a microwave treatment. After cooling to room temperature, the reaction was carried out with 0.3% hydrogen peroxide-containing methanol at room temperature for 20 minutes to inhibit endogenous peroxidase. Washed with water, washed with 10 mM PBS (—), washed with rabbit 75% lOmMPBS (—) for 5 minutes, blocked, and after blocking, the rabbit antibody serum was removed and the primary antibody (PC10: DAKO made) ) Was diluted 500 times, and the antibody was reacted by microwave treatment for 20 minutes.
  • PC10: DAKO made primary antibody
  • PCNA did not increase in the skin tissue of mice ingested helipyrone A.
  • PCNA is known as DNA acid cleavage and proliferative skin disease, and is known to increase in expression as a biomarker of psoriasis.
  • Heliponone A feeding returned to normal levels by DNA antioxidant and UV damage mitigation.
  • Mouth liclin was measured using immunohistochemical techniques.
  • deparaffinization is performed in accordance with the standard method.
  • Antigen activation is microwave treatment in 0.01M citrate buffer (pH 6.0) for 5 minutes. Carried out. After cooling to room temperature, it was reacted with 0.3% hydrogen peroxide-hydrogen-containing methanol at room temperature for 20 minutes to inhibit endogenous peroxidase.
  • the plate was washed twice with lOmMPBS (-), added with ABC reagent (manufactured by Yoji 13 ⁇ 4 ⁇ 3 ; ⁇ 6 & 5 & ⁇ 1), and allowed to react by microwave treatment for 5 minutes.
  • the reaction was performed at room temperature for 4 minutes and 30 seconds using DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride: manufactured by DAKO) as a coloring reagent.
  • DAB 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride: manufactured by DAKO
  • cell nuclei and whole tissue images were stained with hematoxylin, washed with water, and then dehydrated and sealed according to a known method. The staining of the skin tissue was observed under a microscope.
  • the nucleus of the epidermal cells develops mainly due to increased caloric increase of oral liclin.
  • the image was captured using Adobe Photoshop, and the stained area within a certain area in the image was numerically entered using NIH Imaging. The measured samples are shown in Table 6 and the results are shown in Figure 11.
  • a mean value S.D. was determined for the numerical value of each group.
  • the significant difference test between the two groups was performed with the student's t-test (significance level p ⁇ 0.05) after correcting the average value of each group with the UV (—) group as the reference value 1.
  • Mouth liclin in the skin thread and weaves of mice ingested helipyrone A increased. Mouth liclin is known as a marker for the terminal skin irritation. Ingestion of helipyrone A suppresses the aging phenomenon of the skin, and the effect of maintaining normal skin irritation was observed.
  • Keratin 1 was measured using an immunohistochemical technique.
  • deparaffinization is performed in accordance with the standard method.
  • Antigen activation is microwave treatment in 0.01 M citrate buffer ( ⁇ 6.0) for 5 minutes. Carried out. After cooling to room temperature, it was reacted with 0.3% hydrogen peroxide-hydrogen-containing methanol at room temperature for 20 minutes to inhibit endogenous peroxidase. Wash with water, wash with 10 mM PBS (—), block with goat serum 75-fold lOmMPBS (—) for 5 minutes and block.
  • the reaction was carried out at room temperature for 3 minutes and 30 seconds using DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrotalide: manufactured by DAKO) as a coloring reagent. Thereafter, cell nuclei and whole tissue were stained with hematoxylin, washed with water, and then dehydrated and encapsulated according to a known method. The staining of the skin tissue was observed under a microscope. In specimens with 10 weeks of UV irradiation, keratin 1 increases, and the nucleus of the epidermal cells develops mainly. Images were captured using Adobe Photo shop, and the number of stained areas within a certain area in the image was numerically entered using NIH Imaging. The measured samples are shown in Table 7, and the results are shown in FIG.
  • the mean value SD was determined.
  • the significance test between the two groups was performed using student's t-test (significance level p ⁇ 0.05) after correcting the average value of each group with the UV (-) group as the reference value of 1. gave.
  • Keratin 1 did not increase in the dermis and weaves of mice ingested helipiron A. Keratin 1 is known as a marker for terminal skin irritation. Ingestion of helipyrone A suppresses the skin aging phenomenon, and the effect of maintaining normal skin separation was observed.
  • the following ingredients were mixed and filled into a capsule base mixed with gelatin and glycerin to obtain a soft capsule.
  • the following components (1) to (10) are heated and dissolved at 80 ° C to form an oil phase.
  • Ingredients (11) to (13) are dissolved by heating at 70 ° C to form an aqueous phase.
  • the aqueous phase was gradually added to the oil phase to emulsify, cooled to 40 ° C with stirring, and further cooled to 30 ° C with stirring to obtain a cream.

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Abstract

　ヘリピロンＡ（Helipyrone　A）に関する新たな作用を見出し、その有効利用であるヘリピロンＡ（Helipyrone A）を含有する一重項酸素消去剤、皮膚老化改善剤、しわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラニン抑制剤、一酸化窒素消去剤あるいは酸化防止剤を提供する。

Description

ヘリピロン Aを用いた一重項酸素消去剤、皮膚老化改善剤、しわ改善剤、 たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラニン抑制剤、一酸化窒素消去 剤、酸化防止剤
技術分野
[0001] 本発明は、ヘリピロン A (Helipyrone A)に関する。
背景技術 明
[0002] 非特許文献 1 (Journal of ethnopharmacology 33(1991) p51- 55 ) には、一般式（1) 田
で示されるヘリピロン A (Helipyrone A)が抗菌作用を有することが開示されている。
[0003] 非特許文献 1： Journal of ethnopharmacology 33(1991) p51- 55
非特許文献 2 : Esahak Ali, et al, Phytochemistry , 1982 , 21 , 243-244
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の課題は、ヘリピロン A (Helipyrone A)に関する新たな作用を見出し、その 有効利用を図ることである。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明の主な構成は、次のとおりである。
1.一般式（1)で表される Helipyrone Aを含有する一重項酸素消去剤、皮膚老化改 善剤、しわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラニン抑制剤、一 酸化窒素消去剤あるいは酸化防止剤。
[化 2]
Figure imgf000003_0001
一般式 (1) 2. 1.に記載されたいずれかの剤を含有する経口用組成物。
3. 1.に記載されたいずれかの剤を含有する皮膚外用組成物。
4. 1.に記載されたいずれかの剤を含有する含有する食品。
5. 1.に記載されたいずれかの剤を含有する含有する医薬。
6. 1.に記載されたいずれかの剤を含有する含有する化粧料。 発明の効果
[0006] ヘリピロン A(Helipyrone A)に関して、新たに、一重項酸素消去、皮膚老化改善、 しわ改善剤、たるみ改善、皮膚水分量改善、美白、メラニン抑制、一酸化窒素消去あ るいは酸ィ匕防止の作用効果を確認した。これを活用した新規な各種の剤、医薬、食 品、化粧品を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]シヮスコアを示すグラフ
[図 2]皮膚水分量を示すグラフ
[図 3]皮膚硬度を示すグラフ
[図 4]カルボ二ルイ匕タンパク質量 (相対値)を示すグラフ
[図 5]皮膚組織中の 8- hydroxy 2'- deoxy guanosine量（相対値）を示すグラフ
[図 6]皮膚組織中の過酸ィ匕脂質量を示すグラフ
[図 7]ESR法による一酸ィ匕窒素消去能を示すグラフ
[図 8]比色法 (Griess法）による一酸ィ匕窒素消去能を示すグラフ
[図 9]比色法による peroxynitrite消去能を示すグラフ
[図 10]Proliferation Cell Nuclear Antigen (PCNA)増加抑制能を示すグラフ [図 11]口リクリン抑制能を示すグラフ
[図 12]ケラチン 1抑制能を示すグラフ
発明を実施するための最良の形態
[0008] ヘリピロン A(Helipyrone A)は、次の一般式（1)で表される。
[0009] [化 3]
Figure imgf000005_0001
一般式 (1)
[0010] この、ヘリピロン A(Helipyrone A)には、しわ抑制効果、皮膚老化改善、光老化、美 白剤、メラニン生成、抗酸化、一重項酸素消去、一酸化窒素消去等の新規な作用が あることが知見できた。これらの新規な知見を基に、化粧料組成物、食品添加素材、 医薬素材として、禾 IJ用することができる。
化粧料、食品としては、しわ抑制効果、皮膚老化改善、光老化、美白剤、メラニン生 成、抗酸化、一重項酸素消去が期待でき、皮膚老化改善剤、光老化抑制剤、美白 剤、メラニン生成抑制剤、抗酸化剤、一重項酸素消去剤、一酸化窒素消去剤として 使用することができる。
[0011] 本発明のヘリピロン A(Helipyr0ne A)を含有する化粧料 (医薬部外品を含む)として は、顔用あるいは手、足、身体用の保湿化粧料としてローション、乳液、クリーム、ジェ ル、多層型化粧料等が挙げられる。また、口紅、ファンデーション等のメイクアップィ匕 粧料、洗顔料、ハンドゥォッシュ、ボディシャンプー等の洗浄剤、シャンプー、リンス、 トリートメント、育毛剤等の毛髪用化粧料として使用することもできる。
[0012] 本発明のヘリピロン A(Helipyr0ne A)を含有する化粧料 (医薬部外品を含む)には
、ヘリピロン A(Helipyrone A)以外に、化粧料の組成物として一般的に使用されてい る素材を用いることができる。例えば、炭化水素油、エステル油、脂肪酸、高級アルコ ール、シリコーン、ステロール、セラミド等の油剤、多価アルコール、糖、ピロリドンカル ボン酸、アミノ酸、ベタイン等の保湿剤、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、 陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、半極性界面活性剤、レシチン等の界面活 性剤、高分子乳化剤、水溶性高分子、パルミチン酸デキストリン等の増粘剤、無機粉 体、有機粉体、抗菌剤、殺菌剤、 PH調整剤、キレート剤、着色剤、香料、植物抽出 物等を配合することができる。 [0013] 本発明のヘリピロン A (Helipyrone A)を含有する食品としては、ヘリピロン A (Helip yrone A)をそのまま、または種々の栄養成分を添加して食品として使用できるし、所 望の食品に配合しても良い。例えば、澱粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、カカオ脂 末、ステアリン酸などの適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適し た形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して健康食品 、保健機能食品などとすることができる。また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ などの食肉加工食品、力まぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、 粉乳、発酵乳製品に添加してもよぐ水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加し て使用してもよい。
本発明のヘリピロン A (Helipyrone A)を含有する医薬としては、経口投与、経皮投 与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体 と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、 溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は 製剤上の常套手段により調製することができる。
上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マン 二トール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレンダルコール、ヒドロキシェチル デンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ァミノ 酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、 安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加する ことちでさる。
[0014] [ヘリピロン A (Helipyrone A)の化学合成]
ヘリピロン A (Helipyrone A)の化学合成については、非特許文献 2 (Esahak Ali, et al, Phytochemistry,1982, 21,243-244) ,に開示されている。
例えば、本発明では、次のように合成した。
400mLのへキサン溶媒を用いて、四塩化チタンの存在下で化合物 1 ジェチルケ トン (3- pentanone)172gと化合物 2 テトラヒドロー 1, 4 ォキサジン（terahydro- 1,4- o xazine (morpholine) ) 1, OOOgを 4°Cで 3時間で反応させ、蒸留処理で精製し、化合 物 3 (N—イソプロべ-ル）一テトラヒドロ一 1, 4—ォキサジン（(N- isopropenyl)- tera hydro- 1 ,4- oxazine) 503. 57g (収率 81. 1 %)を得た。
200mLのトルエン溶媒を用いて、化合物 3 (N—イソプロべ-ル）ーテトラヒドロー 1, 4 ォキサジン（(N- isopropenyl)- terahydro- 1,4- oxazine) 167gをィ匕合物 4 ェチ ルマロ-ルクロライド（ethyl malonyl chloride) 8 lgとメタノール一氷冷（一17°C〜一 11 °C)条件で反応させ、一般式 2で表される化合物 5を合成した。
[0015] [ィ匕 4]
Figure imgf000007_0001
一般式 (2)
[0016] 化合物 3と化合物 4との反応は 2N塩酸添加で終了させ、クロ口ホルム抽出後に硫酸 マグネシウム乾燥処理を行った。その次に反応溶液にトルエン 200mLと 25%塩酸 4 OOmLを順次加えて液 液分配でトルエン層を回収した。トルエン層を 0. 1N塩酸 4 OOmLで洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥処理後にトルエンを真空エバポレーターで 除去して橙色油状溶液を得た。この溶液に PPA (ポリリン酸） lkgをカロえ、 110°C〜118 °Cで環化して化合物 5を合成した。化合物 5は室温に冷却し、クロ口ホルム抽出で回 収し、硫酸マグネシウム乾燥処理後に真空エバポレータ でクロ口ホルムを除去した 。固形物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロ口ホルム：メタノール =50 : 1 (vZv) )で橙 色固形の化合物 5を 45. 7g得た。本反応の収率は 18. 3%であった。
[0017] この化合物 5について 1N塩酸の存在下でホルムアルデヒドを重合反応することで化 合物 6 ヘリピロン A(Helipyrone A)を化学合成した。化合物 5の 45. 7gをエタノー ル 460mLに溶解し、濃塩酸 2. 5mLの存在下でホルムアルデヒド（37%) 247. 81g を 79°Cで還流反応させ、結晶が析出した。この結晶をエタノール 300mLで洗浄し、 白色結晶としてヘリピロン A(Helipyrone A)を 34. Olg得た。本反応の収率は 71. 6 %であった。
[0018] 得られたヘリピロン A(Helipyrone A)の物性値を以下に示す。
外観：白色結晶
NMR ^ベクトル (400 MHz,溶媒； CDC1 )
3
1H-NMR
δ =a 1.231 b 1.969 c 2.554 d 3.616 e 11.199
13C NMR(400 MHzゝ溶媒； CDC1 )
3
δ =I→169.335 (t) H→168.499(m), G→160.160(m), F→108.709(m), E→101.59 2(t), D→24.368(qt), C→19.176(t), B→11.689(qt), A→9.476(q)
[化 5]
e
Figure imgf000008_0001
化 6]
Figure imgf000008_0002
分子量： 320.341g/mol (質量分析）
分子式: C H O (質量分析）
17 20 6
融点： 218— 220°C
[0019] [抗酸化能評価]
ヘリピロン A(Helipyrone A)について、一重項酸素消去作用の評価を行った。評 価法は、 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol (4-OH TEMP)をスピントラップ剤とした E SR^ピントラップ法により測定した。まず、巿販の平底 96穴マイクロプレートに任意の 濃度に調製したヘリピロン A (Helipyrone A)の 40% (ν/ν) Ν,Ν-ジメチルホルムアミ ド水溶液 0. lmLを、続いて蒸留水 0. 02mLを、 lOOmMの 4- OH TEMP水溶液 0. 04mL, 0. ImMのローズベンガル水溶液 0. 04mLと混合し、 0. 2mLの混合液とし た。これに光増感反応の光源としてマイクロプレートの背面より極大波長 530nmの発 光ダイオード (緑色 LED)を 20分間照射して一重項酸素を発生させた。この混合液を ESR用扁平水溶液セルに移し、 ESRスペクトルを測定した。 ESR ^ベクトル強度から 、一重項酸素消去率を求め、これを濃度に対してプロットし、 50%抑制濃度 IC50値 を求めた。また、比較として、既存のポリフエノールイ匕合物（シリビン、 3, 4ージヒドロキ シフエ-ルエタノール、（一）一カテキン、（一）一ェピカテキンガレート、ケルセチン、 ロズマリン酸、カルノシン酸、カフェ一酸、コウジ酸、 β—カロテン）の IC50値を同時に 求めた。その結果を表 1に示す。
[0020] この結果から明らかなように、他のポリフエノール化合物と比較して、ヘリピロン A (Η elipyrone A)はより低濃度で一重項酸素を消去することが認められた。すなわち、へ リピロン A (Helipyrone A)は、優れた一重項酸素消去作用を示すことが明らかとなつ た。
[0021] [表 1]
Figure imgf000009_0001
[メラニン生成抑制試験]
市販の 6ゥエルプレートにそれぞれマウス B16メラノーマ細胞を 5%CO 件
2、 37°Cの条 下で培養液 10%FBS (ゥシ胎児血清）を含む DMEMを用いてコンフルェントまで培養 した。メラニン生成刺激剤である lOOnM a MSHを添カ卩し、同時に 0. 0001%のへリピ ロン Aを添加して 72時間引き続き培養した。溶媒条件は 10%FBS含有 DMEM培地で あるが、ヘリピロン Aの溶解度を考慮し、 0. 2%ァセトニトリルを全てのゥエルに含有さ せた。培養終了後、細胞画分を回収し、 0. IN NaOHアルカリ処理でメラニン色素を 溶解させ、 405nmの吸光度 (ABS)を測定した。
[0023] メラニン生成抑制率を
メラニン生成抑制率 [%] = 100 X{1— (ABS[Sample])/(ABS[Control])}
Control： 0.2%ァセトニトリル含有 DMEM培地
Sample : 0.2%ァセトニトリル含有 0.0001%ヘリピロン A添カ卩（DMEM培地） の式で算出した。
[0024] その結果、ヘリピロン Aを 0. 0001%添加したときは 22. 1% ±8. 4(S.D.)メラニン生 成が抑制された。
[0025] [紫外線照射によるシヮの抑制試験]
ヘアレスマウスに微弱な紫外線を長期間継続して皮膚老化の現象をしわ'たるみを 形成する動物モデルを実施し、その時にヘリピロン Aを混餌投与した時の影響を解 祈した。
[0026] I.実験動物
-種，系統，性別
種：マウス、系統： Hos:HRl (ヘアレスマウス）、性別：雌
•飼育開始週齢
5週齢より飼育、同時に混餌投与を開始した。
[0027] II.飼育環境
設定温湿度: 24± 1°C、相対湿度 55±5%
空調設備：オールフレッシュ方式
照明時間： 12時間自動点灯 ·消灯方式
飼育設備:プラスチック製ケージ 5匹/ケージ
飼 料:粉末滅菌飼料 MF-1 (オリエンタル酵母工業 (株))を自由摂取、もしくは MF- 1にヘリピロン Aをそれぞれ 0.01%(w/w)、 0.05%(w/w)、 0.1% (w/w)あるいは抗酸化 効果に優れている j8カロテンを 0.01%(w/w)、 0.05%(w/w)混合した。
[0028] III.試験スケジュール
紫外線照射条件：隔日（一日おき）に 10週間、紫外線ランプを用いて、 UV-A波 14J /cm2 (照射時間約 1分）、 UV-B波 20mJ/cm2 (照射時間約 50分)を拘束ストレスをかけ ずに照射した。 10週間（35回）の全照射量は UV-A波 490J/cm2、 UV-B波 700mJ/cm2 である。
紫外線照射を継続した群については、解剖 24時間前に最終の紫外線照射を実施 した。解剖 18時間前より絶食を行った。解剖前に非侵襲的手法により皮膚水分量を 簡易水分計 (Moisture Checker™,スカラ製)を用いて測定した。
ネンブタール麻酔を行い、外観を写真撮影した。そして皮膚背部のレプリカを採取 した。
解剖により、肝臓摘出、全血回収、背部及び腹部の皮膚を回収した。
臓器は素早く凍結保存し、全血は遠心分離 (3,000G, 20min,室温）を行って plasma (血漿)を回収して冷凍保存した。皮膚は背部の一定面積をブアン固定して組織染 色用に用いた他は冷凍保存した。
[0029] 外観上の皮膚状態を頸部のたるみ (Sagging)、背部のしわ (Wrinkle)の形成状況に 着目して Bissett DL等らの定義（Photochem Photobiol. (1987) Vol.46, No.3,pp367- pp78)に従いスコア化した。すなわち、下記に示す定義に従い数値ィ匕し、判断の困難 な検体は中間値として 0. 5を付した。シヮスコアのデータをグラフ化して図 1に示す。
[0030] ·スコア 0
シヮの発生が全く認められない。
静止状態で脊椎方向に対して垂直な線条が認められないか、わずかに認められ る程度、そして個体の運動に応じてその線条は消失する。
•スコア 1
軽微なシヮの発生が明確に認められる。
脊椎方向に対して垂直な線条が認められる、そして個体の運動に応じてその線 条は消失する。
•スコア 2 中程度のシヮの発生が明確に認められる。
脊椎方向に対して明確に線条が認められる、そして個体の運動に応じてその線 条は消失せずに永続的である。
•スコア 3
深いシヮの発生が明確に認められる。
脊椎方向に対して明確に線条が認められ、その線条に対して影が認められる、そ して個体の運動に応じてその線条は消失せずに永続的である。
[0031] シヮスコアは紫外線照射 10週間の MF-1 (コントロール)食群 2. 4なのに対して、紫 外線照射 10週間のヘリピロン Aを 0. 1%配合した MF-1食群 0. 1、紫外線照射 10週 間のヘリピロン Aを 0. 05%配合した MF-1食群 0. 2、紫外線照射 10週間のヘリピロ ン Aを 0. 01%配合した MF-1食群 0. 6であり、シヮの生成が顕著に抑制された。紫 外線を照射せずに 10週間経過した MF-1 (コントロール)食群のシヮスコアは 0. 2で あり、ヘリピロン Aを 0. 05-0. 1配合食を摂取することにより紫外線照射によるシヮ の発生が完全に抑制されて!、る。
皮膚所見の結果から、ヘリピロン Aの顕著なシヮ抑制効果が認められる。ヘリピロン Aのマウスへの投与は、マウス一日の摂食量 4g、体表面積換算式 y= (3 X) 2を用い てヒトへの投与量に換算すると 0.1%の混餌自由摂取で約 520mgZ日 Z60kg体重 、 0.01%の混餌自由摂取で約 52mgZ日 Z60kg体重に相当し、食品として無理な く摂取することが可能な量である。
また、抗酸化作用を有する β—カロテン摂食群はしわ抑制効果を示さな力つた。 紫外線照射 10週間の |8—カロテンを 0. 05%配合した MF-1食群のシヮスコアは 2 . 0、紫外線照射 10週間の |8—カロテンを 0. 01%配合した MF-1食群シヮスコアは 2 . 3であった。
[0032] [紫外線照射に伴う皮膚の乾燥の抑制]
解剖直前に非侵襲的手法により皮膚水分量を簡易水分計 (Moisture Checker™, スカラ製)を用いて測定し、一匹につき 5回測定した平均の測定値について各群で比 較した。皮膚水分量の測定結果を図 2に示す。
[0033] 紫外線照射 10週間 +MF-1 (コントロール)食群では皮膚水分量が低下して乾燥状 態 (皮膚水分量 31. 4%)になっているのに対し、紫外線照射 10週間 +ヘリピロン A 配合の MF-1食群ではヘリピロン AO. 1%配合で皮膚水分量 41. 3%、 0. 05%配合 で皮膚水分量 40. 2%、 0. 01%配合で皮膚水分量 38. 2%であり、 40%前後と有 意に高い皮膚水分量を保持していた。ヘリピロン A配合食群の皮膚水分量は、紫外 線を照射せずに 10週間経過した MF-1 (コントロール)食群の皮膚水分量 35. 5%よ りも高い値を示した。
[0034] [紫外線照射に伴う皮膚の硬化の抑制]
スプリング式硬さ計 (JIS C形)皮膚粘弾性測定装置 (Vesmeter:E— 100SZゥェ イブサイバー製)を用いて、背部の尾付け根より首に向かい 2cm、腰椎から右側に 0. 5cm部位を 3回測定して硬度の平均を求めた。皮膚硬度の測定結果を図 3に示す。
[0035] 皮膚粘弾性の指標として知られる硬度は、その数値が高!、ほど皮膚老化が進行し 皮膚の弾力性が低下して 、ることが一般的に知られて 、る。
紫外線照射 10週間 +MF-1 (コントロール)食群では皮膚の硬化が顕著 (度数 15. 4)になっているのに対し、紫外線照射 10週間 +ヘリピロン A配合の MF-1食群では ヘリピロン AO. 1%配合で硬度の度数 8. 1、 0. 05%配合で硬度の度数 9. 1、 0. 01 %配合で硬度の度数 9. 1であり、紫外線を照射せずに 10週間経過した MF-1 (コント ロール)食群の硬度の度数 7. 2と比べて少し硬化が進む程度に硬化が抑制されてい た。
[0036] [紫外線照射に伴う皮膚組織中のカルボ-ルイ匕タンパク質の生成の抑制]
酸化タンパク質の一つであるカルボ-ル化タンパク質は、 Oxyblot™ (CHEMICON 社)を用いて評価した。具体的な方法は以下の通りである。マウス皮膚を湿重量約 20 Omg秤量し、 4°Cにて Protease inhibitor cocktailを含む Lisys buffer (pH=7.4) 0.2mlを 加えてホモジナイズし、 12,000g X 20分間遠心し、その上清をフィルターろ過したもの を用いて、タンパク濃度を Bradfordの方法に従って測定した。それぞれのタンパク試 料 20 μ gについてカルボ-ル基を DNPH化した。蛋白質を SDS-PAGEにより分離し、 蛋白質転写装置を用いて PVDF膜に転写した。転写後の膜は常温下 30分 5%スキム 4°Cでミルクを含む PBS ( )溶液中でブロッキングし、スキムミルクを PBS ( )で洗浄 後、抗 DNPH抗体と 4°Cで一晩反応させ、洗浄後、ピオチンィ匕抗マウス IgGと 1時間反 応させた。洗浄後、蛍光検出キット (ECL PLUS)を用いて PVDF膜を感光し、医療用 自動現像装置にて画像を転写した。結果を図 4に示す。
[0037] その結果、紫外線照射 10週間 +MF-1 (コントロール)食群ではカルボ二ルイ匕タン ノ ク質量の相対値は 259. 4であるのに対し、紫外線照射 10週間 +ヘリピロン A配合 の MF-1食群ではヘリピロン AO. 1%配合でカルボ-ル化タンパク質量の相対値は 2 5. 3、 0. 05%配合でカルボ-ル化タンパク質量の相対値は 35. 6、 0. 01%配合で カルボ-ル化タンパク質量の相対値は 57. 7であり、カルボ-ル化タンパク質の生成 力 SlZlO〜lZ5に抑制された。紫外線を照射せずに 10週間経過した MF-1 (コント ロール）食群のカルボ-ル化タンパク質量の相対値は 23. 7であり、ヘリピロン AO. 1 %配合食群のカルボ二ルイ匕タンパク質量の相対値は 25. 7と同程度であった。従つ て、ヘリピロン Aは紫外線照射に伴うカルボ二ルイ匕タンパク質の生成を顕著に抑制し ている。
抗酸化作用を有する β一力口テン摂食群はカルボニル化タンパク質の生成抑制効 果はあまり認められな力つた。
紫外線照射 10週間の |8—カロテンを 0. 05%配合した MF-1食群のカルボ-ルイ匕 タンパク質量の相対値は 153. 1、紫外線照射 10週間の |8—カロテンを 0. 01%配 合した MF-1食群のカルボ-ル化タンパク質量の相対値は 190. 7であった。
[0038] [紫外線照射に伴う皮膚組織中の 8- hydroxy- 2，- guanosine (8- OH dG)の生成の抑 制]
8-OH dGは免疫組織ィ匕学的手法を用いて測定した。動物の解剖時に皮膚組織背 部の尾付け根より首に向かい 2cm、腰椎力も右側に 0.5cm部位の皮膚 lcm2を切り取り 、ブアン固定、及びパラフィン包埋して皮膚組織を保存した。 3 m厚の切片を適宜 作製し、脱パラフィン、親水化は公知の方法に基づいて実施した。抗原賦活化は 0.0 1Mクェン酸緩衝液 (pH=6.0)中でマイクロウエーブ処理 5分を実施した。室温まで冷 却後、常温下 0.3%過酸ィ匕水素含有メタノールで 20分反応させて内因性ペルォキシ ダーゼを阻害した。水洗、 lOmMPBS (-)洗浄後、ゥサギ血清 75倍 lOmMPBS (-)希釈溶 液で 5分間マイクロウェーブ処理を実施してブロッキング、血清を落として 1次抗体 (N 45. 1：日研ザイル (株)製）を 5 μ gZmlで 20分間マイクロウエーブ処理により抗体を 反応させた。 lOmMPBS (-)で 2回洗浄し、ピオチン化二次抗体 (ピオチン化ゥサギ免疫 グロブリン M； DAKO製）を 300倍希釈したものを 5分間マイクロウエーブ処理で抗体 を反応させた。 lOmMPBS (-)で 2回洗浄し、 ABC試薬（ABC- HRP;Vectastain製）を 5 分間マイクロウエーブ処理により反応させた。発色試薬として DAB (3,3-ジァミノベン ジジンテトラヒドロクロライド： DAKO製)を用いて 3分 30秒常温下で反応させた。水洗 後、公知の方法に基づいて脱水、封入処理を行った。顕微鏡下で皮膚組織の染色 状況を観察し、 Adobe Photoshopを用いて画像を取り込み、画像中の一定面積中 の染色箇所を NIH Imagingにて数値ィ匕した。結果を図 5に示す。
[0039] その結果、紫外線照射 10週間 +MF-1 (コントロール)食群では 8-OH dGの相対値 は 5. 89であるのに対し、紫外線照射 10週間 +ヘリピロン A配合の MF-1食群ではへ リピロン AO. 1%配合で 8- OH dG量の相対値は 0. 87、 0. 05%配合で 8- OH dG量 の相対値は 0. 91、 0. 01%配合で 8- OH dGの相対値は 1. 10であり、 8- OH dG量 の生成が 15Z100〜19Z100に抑制された。紫外線を照射せずに 10週間経過し た MF- 1 (コントロール)食群の 8- OH dG量の相対値 1. 00と比べて、紫外線照射ヘリ ピロン A0. 05%配合食群、 0. 1%配合食群の 8-OH dG量の相対値はさらに低い値 である。従って、ヘリピロン Aは紫外線照射に伴う 8-OH dGの生成を顕著に抑制して いる。
また、抗酸化作用を有する β一力口テン摂食群は 8-OH dGの生成抑制効果を示さ なかった。
紫外線照射 10週間の j8—力口テンを 0. 05%配合した MF-1食群の 8-OH dG量の 相対値は 5. 2、紫外線照射 10週間の |8—カロテンを 0. 01%配合した MF-1食群の 8-OH dG量の相対値は 6. 3であった。
[0040] [紫外線照射に伴う皮膚組織中の過酸化脂質の生成の抑制]
皮膚組織における TBARS (チォバルビツール酸反応生成物、 nmol/g wet weight) を蛍光分析にて測定した。各組織の湿重量約 200mgを秤量し、 1.15%KCllmlでホモ ジネート後、 1/12N硫酸 4ml、 10%タングステンリン酸 0.5mlを順次添カ卩し、 3,000rpm 1 Omin遠心分離を行った。上清の夾雑物を除去し、 TBA試薬 (チォバルビツール酸 Z 酢酸緩衝液)を添加し、沸騰湯浴中で 1時間加熱反応した。 TBARSの定量用に別途 1,1, 3,3-テトラエトキシプロパンを加えた試料で TBA反応を行い、検量線を作成した。 結果を図 6に示す。
[0041] 加熱反応終了後、氷冷で室温に戻し、 n-ブタノールを 5mlカ卩えて攪拌後に 3, OOOrp m lOminの条件で遠心分離し、上層の n-ブタノール層を回収して、蛍光分析 (Ex 515 nm、 Em 553nm)に供した。蛍光強度計は HITACHI F-2000を用いた。
[0042] その結果、紫外線照射 10週間 +MF-1 (コントロール)食群では組織中の過酸ィ匕脂 質量が 50. 8nmolZmgであるのに対し、紫外線照射 10週間 +ヘリピロン A配合の MF-1食群ではヘリピロン AO. 1%配合で組織中の過酸化脂質量が 30. 9nmol/m g、 0. 05%配合で組織中の過酸ィ匕脂質量が 33. 7nmolZmg、 0. 01%配合で組 織中の過酸化脂質量が 44. 8nmolZmgであり、過酸化脂質の生成が 6ZlO〜9Z 10に抑制された。紫外線照射 10週間 +ヘリピロン AO. 1%配合食群及び 0. 05% 配合食群の過酸ィ匕脂質量は紫外線を照射せずに 10週間経過した MF-1 (コントロー ル)食群の組織中の過酸化脂質量 30. 2nmolZmgと同程度である。従って、ヘリピ ロン Aは紫外線照射に伴う過酸ィ匕脂質の生成を顕著に抑制している。
また、抗酸化作用を有する β一力口テン摂食群の過酸ィ匕脂質の生成抑制効果は 殆どなかった。
紫外線照射 10週間の |8—力口テンを 0. 05%配合した MF-1食群の過酸化脂質量 は 46. 9nmolZmg、紫外線照射 10週間の j8—カロテンを 0. 01%配合した MF- 1 食群の過酸化脂質量は 51. InmolZmgであった。
[0043] [ESR法での一酸化窒素消去能の評価]
100 μ Μの SNAP(S 二トロソ— Ν ァセチルー D,L ぺ-シルァミン、同仁化学製） に対する、ヘリピロン Aと酸ィ匕防止剤として既知の (一)カテキン (Sigma製)の一酸化窒 素消去能を比較した。
スピントラップ剤には、 N—メチルー D グルカミン ジチォ力ルバメート（以下、 MG Dと ヽぅ。ラボテック (株)から購入)と硫酸鉄 (II)水溶液とを混合して調製した (MGD) — Fe2+複合体を用いた。この複合体は一酸化窒素と反応して (MGD) -Fe2+-NO
2 2
の複合体を形成することで ESR ^ベクトル強度を発生することから、一酸化窒素消去 剤のそれぞれの濃度における ESR ^ベクトルを測定することで一酸ィ匕窒素の消去能 を測定した。
[0044] 5(^\1硫酸鉄（11) ' 2水和物 溶媒:蒸留水 100 iu L (最終濃度5mM)、50mM M GD 溶媒 PBS(pH 7.4) 100 (最終濃度 5mM)、被検物質 溶媒： 10%ァセト 二 HJノレ 100 し、 lOOmMジン酸緩衝液 699 し、 lOOmM SNAP 溶媒 0.1M水酸 化ナトリウム ： L (最終濃度 100 M)、を順次 1. 5ml容エツペンチユーブに加え 、 SNAP添加時から 10分間 25°Cで攪拌反応した。
10分間 25°Cの反応で SNAPから一酸化窒素が放出され、（MGD) — Fe2+— NOの
2
シグナル強度比 = 1： 1： 1の 3つのピークで構成されていた。このシグナル強度が被 験物質によりどれだけ増減するかで一酸化窒素消去能を評価した。具体的には、被 験物質を添加しな 、コントロールのシグナル強度 (C)を基準として、被験物質を添加 したときのシグナル強度（S)から次式により一酸ィ匕窒素消去率を求め、図 7に示す。 一酸ィ匕窒素消去率 = ( 1— SZC) X 100 (%)
[0045] その結果、ヘリピロン Aは 25 Μ〜200 /ζ Mの範囲で濃度依存的に一酸ィ匕窒素消 去率力 S向上し（25 /ζ Μで 32. 4%、 で 52. 6%、 100 /ζ Μで 63. 6%、 200 μ
Μで 80. 10/0)、 IC50濃度 51. 4 Μ つたのに対し、（一）カテキン ίま 50 Μ、 100 Μでは一酸化窒素消去率がそれぞれ 5. 6%、 11. 7%にすぎず、 250 /ζ Μで 31 . 4%、 500 μ M-C47. 4%の一酸ィ匕窒素消去率であった。 IC50濃度は Μと計 算された。
[0046] 今回使用した機器および機器の条件設定を以下に示す。
機器: JEOL JES TE200、 X—band ESR装置（100KHz、 日本電子社製） 機器の条件設定：
センターフィールド（center field) : 335. 0 ± 5. OmT、
マイクロゥェ ~~ブパヮ ~~ (.microwave power) : 4mW、
モジュレーションアンプリチユード（modulation amplitude) : 0. lmT、 ゲイン（gain)： 500、
タイムコンスタント（time constant) : 0. 1秒、
スキャン-ングタイム (scanning time)： 1分
[0047] [比色法 (Griess法)での一酸化窒素消去能] 溶液中に存在する一酸ィ匕窒素は水溶液中で極めて不安定であるため、 ESR法の他 に、一酸ィヒ窒素の酸ィヒ物である亜硝酸イオンを測定することで一酸ィヒ窒素量を間接 的に評価した。既知の抗酸ィ匕物質である（-)カテキン、マルトール、 p クマリン酸に ついても評価し、ヘリピロン Aと比較した。 Griess法による測定は、 NO /NO AssayK
2 3 it-CII (Colorimetric) (同仁化学製）を用 、た。
一酸化窒素発生剤として、 NOC - 5 (1 -ヒドロキシ 2 ォキソ 3— (3 アミノプ 口ピル）—3—イソプロピル— 1—トリァゼン）（同仁ィ匕学社製)を用い、使用直前まで 0 . 1N水酸ィ匕ナトリウムのアルカリ溶液で— 20°C冷凍保存した。 Kit中の緩衝液 (pH= 7. 6、以下「緩衝液」）によって 10000倍希釈して 100 /z Mの濃度に調整することで 一酸化窒素を発生させた。一酸ィ匕窒素供与体として開発された NOC— 5はアルカリ 溶液中では安定だが、中性および酸性条件下では一酸ィ匕窒素を生成する不安定な 化合物（25度、 pH7. 4条件下で半減期 25分)である。
[0048] 市販の平底 96ゥエルプレートに被験物質 溶媒： 1%ァセトニトリルを含む緩衝液（ pH = 7. 6) 40 Lを被験物質の濃度を変化させて添加した。その後、緩衝液 (pH = 7. 6)を 20 L添加し、 100 Mの NOC— 5溶液 40 Lを添カ卩して 2時間 25°Cで反 応させた。反応終了後、 Kit中の Griess試薬 Aを 50 L添カ卩して 5分放置し、続けて Griess試薬 Bを 50 Lずつ添カ卩して 10分放置して呈色反応を行った。マルチプレ 一トリーダーで 540nmの吸光度を測定した。各被験物質の添加濃度における吸光 度を S 、被験物質を含まないコントロールの吸光度を C 、被験物質および NOC
540 540
5を含まな 、ブランクの吸光度を B として以下の式で一酸化窒素消去率（％)を
540
算出し、表 2、図 8に示す。
ー酸化窒素消去率（％) = 100 （1ー B ) / (C B )
540 540 540 540
[0049] 検量線は NOC— 5溶液の代わりに亜硝酸ナトリウム溶液 0〜： LOO /z Mの濃度域で 設定した検体の吸光度力 作成し、溶液中の亜硝酸イオン濃度を求めた。この亜硝 酸イオン濃度力も NOC - 5溶液力も発生した一酸ィ匕窒素濃度を求める事が出来る。 一酸化窒素消去能の強さは、本試験系で 50%消去する濃度 (IC50、 μ Μ)で比較 した。
[0050] 100 μ Μの NOC— 5溶液から 47. 0 μ Μの一酸化窒素が亜硝酸イオンとして生成 する。この時、被験物質添加による吸光度の低下、すなわち、一酸化窒素の消去活 性が認められた。
[0051] [表 2]
Figure imgf000019_0001
[0052] ヘリピロン Aは 50 μ Μ〜400 μ Μの範囲で濃度依存的に一酸化窒素の消去能が認 められ、 IC50濃度は 36. 7 Μだった。一方、（一）カテキン、マルトール、 ρ—タマリ ン酸の IC50濃度は 190. Ο Μ、 94. Ο Μ、 187. 4 Μであった。ヘリピロン Αの 優れた一酸化窒素消去能が確認された。
[0053] 以上の結果から、本発明のヘリピロン Aがー酸ィ匕窒素を消去することが明らかにな り、血管系、神経系、免疫系の薬剤として有用であると考えられる。このヘリピロン Aは 生体内に存在する過剰な一酸化窒素を消去し、正常な一酸化窒素濃度にする作用 および一酸ィ匕窒素が過剰に発生することが予測される場合にあら力じめ投与し生体 内に過剰な一酸ィ匕窒素が発生することを防止する作用を有している。すなわち、本 明細書においてヘリピロン Aの一酸ィ匕窒素消去能とは、生体内に存在するすべての 一酸ィ匕窒素を完全に消去するものをいうのではなぐ生体内にある過剰な一酸ィ匕窒 素を消去し生体の維持に適切な量になるように調節するものをいう。
[0054] [比色法での peroxynitrite消去能]
ヘリピロン Aの peroxynitrite消去能は Griess法により、 NO /NO AssayKit— CII (C
2 3
olorimetric) (同仁ィ匕学製)を用いて測定した。
[0055] 既知の抗酸化物質である（一）カテキン、マルトール、 p クマリン酸についても評価 し、ヘリピロン Aと比較した。
市販の平底 96ゥエルプレートに被験物質 溶媒： 1%ァセトニトリルを含む緩衝液（ pH = 7. 6) 40 Lを被験物質の濃度を変化させて添加した。その後、それぞれのゥ エルに Kit中の還元酵素 10 L、及び補酵素 10 Lを添カ卩した。
Peroxynitrite発生剤として SIN-1 (3—（4 モルフォキ -ル）シドノ-ミン 1塩化物） 50 μ Mを 40 μ L添カ卩して 37°C2時間反応させた。反応終了後、 Kit中の Griess試薬 A を 50 L添カ卩して 5分放置し、続けて Griess試薬 Bを 50 Lずつ添カ卩して 10分放置 して呈色反応を行った。マルチプレートリーダーで 540nmの吸光度を測定した。被 験物質の吸光度を S 、被験物質を含まないコントロールの吸光度を C 、被験物
540 540 質および SIN— 1を含まないブランクの吸光度を B として以下の式で Peroxynitrit
540
e消去率(％)を算出し、表 3、図 9に示す。
Peroxynitrite消去率（％) = 100 X ( 1—（S — B ) /C B )
540 540 540 540
[0056] 検量線は SIN— 1溶液の代わりに硝酸ナトリウム溶液 0〜： LOO /z Mの濃度域で設定 した検体の吸光度カゝら作成し、溶液中の硝酸イオン濃度を求めた。この硝酸イオン 濃度から SIN— 1溶液力も発生した Peroxynitrite濃度を求める事が出来る。
Peroxynitrite消去能の強さは、本試験系で 50%消去する濃度（IC50、 /z M)で比 較した。
[0057] その結果、コントロールでは 50 μ Μの SIN- 1から Peroxynitriteが 8.18 μ Μ発生し、 その Peroxynitriteを 50%消去する IC50濃度について、ヘリピロン Aは 24. 04 Μ に対し、マルトール 31. 84 M、 p—クマリン酸 31. 49 、（―）カテキン 705. 6 μ Μとなり、ヘリピロン Αが優れた Peroxynitrite消去能を示した。
[0058] [表 3]
Figure imgf000020_0001
[0059] Peroxynitriteは生体内で一酸化窒素とスーパーォキシドア-オンとの反応で発 生し、強力な酸化作用および生体損傷、炎症を引き起こす。 Peroxynitrite消去活 性を示すヘリピロン Aは、酸ィ匕防止剤であり生体における炎症を抑制し、生体成分を 保護する機能を発揮する。
[0060] [チロシナーゼ活性阻害作用の測定] 平底 96ゥエルプレートに被験物質溶液 100 /z Lを添カ卩し、 600 units/mlのマッシュ ルーム由来チロシナーゼ溶液 10 Lを加え、 30 °Cで 10分間インキュベートした。その 後、あらかじめ 30 °Cに暖めておいた 6 mMの L-DOPA (L— β - (3, 4—ジヒドロキシ フエ-ル）ァラニン)溶液 100 Lを添カ卩し、 30 °Cで 40分間振とうしながらインキュべ ートした。被験物質の溶媒は 1%ァセトニトリル含有 lOOmMコハク酸緩衝液 (pH5. 5)を用い、チロシナーゼ、 L-DOPAの溶媒は 100 mMコハク酸緩衝液 (pH 5.5)を用い た。振とう後、メラニン量の指標である 475應の波長で吸光度測定し、この値を S と
475 した。被験物質無添加の場合をコントロール (C)、この吸光度を C 、 L-DOPA無添カロ
475
の場合をサンプルブランク (SB)、この吸光度を SB 、サンプルと L-DOPA無添力卩の場
475
合をコントロールブランク (CB)、この吸光度を CB とし、式 2によりチロシナーゼ阻害
475
率を算出した。ポジティブコントロールとしてアルブチン (東京化成工業 (株)製)を用 いた。
チロシナーゼ活性阻害率％ = 100 { 1一（S — SB ) / (C 一 CB ) }
475 475 475 475
[0061] この結果、添加濃度 ImMにおけるヘリピロン Aとアルブチンのチロシナーゼ阻害率 は、ヘリピロン Aでは 36. 34%であったのに対し、アルブチンは 25. 77%であったこ とから、ヘリピロン Aはアルブチンよりも優れたチロシナーゼ阻害活性を有し、ヘリピロ ン Aが美白作用を示すことがわかる。
[0062] [マウス皮膚におけるチロシナーゼ遺伝子発現解析]
マウスにヘリピロン Aを摂食させた時、チロシナーゼをコードする遺伝子の発現をマ ウス皮膚で測定した。
I.実験動物
I— 1.種 ·系統 ·性別：種：マウス、系統： Hos:HRl (ヘアレスマウス）、性別：雌
1- 2.飼育開始週齢 : 5週齢 (1週間飼育後 6週齢から紫外線照射試験を開始した） 1- 3.微生物グレード： SPF
1-4.ブリーダー:清水実験材料株式会社
II.飼育環境
設定温湿度: 24± 1°C、相対湿度 55±5%
空調設備：オールフレッシュ方式 照明時間： 12時間自動点灯 ·消灯方式
飼育設備:プラスチック製ケージ 5匹/ケージ
飼 料:粉末滅菌飼料 MF— 1 (オリエンタル酵母工業 (株)）を自由摂取、 MF— 1に ヘリピロン Aを 0. 1重量％混合した飼料も別途調製した。
試験対象物の投与:粉末混餌として自由摂取させた。解剖 18時間前から絶食させた 給水：滅菌済の水道水を自由摂取
[0063] IV- 3 解剖
解剖 18時間前力 絶食させた個体の体重測定、皮膚水分量を測定後、ネンブター ル麻酔 (40mg/kg)腹腔内投与により麻酔を導入した。
腹部を切開し、心臓よりへノ^ン採血を行った。次に臓器について肉眼的観察を行 つた後に肝臓、後頭部力 臀部における背部全体の皮膚を摘出した。背部皮膚に関 しては、皮膚組織背側の尾付け根より首に向かい 2cm、腰椎力 右側に 0.5cm部位 の皮膚 lcm2を切り取り、ブアン固定、及びパラフィン包埋して皮膚組織を保存した。 その他の背部皮膚は素早くアルミホイルに入れ液体窒素にて急速に凍結し 80°C で長期保存した。
[0064] [遺伝子発現解析に関する試験]
各群 2匹の背部皮膚を選択して、遺伝子発現解析用 Total RNAサンプルを抽出し た。背部皮膚を液体窒素存在下で細切粉砕し、湿重量数十 mg毎に 1. 5ml容エツべ ンドルフチューブに分注した。 Total RNA抽出は RNase easy mini kit (QIAGEN製)を 用いて、通常のプロトコールに従った。
[0065] 抽出した Total RNAについて Affymetrix社推奨のプロトコールに則った処理を 行った後、 DNAマイクロアレイ法により皮膚組織における発現パターンを調べた。具 体的には、抽出した total RNAから、「SUPERSCRIPT choice system for cDN A synthesis] (商品名、 Invitrogen社製）を用いて cDNAを合成し、この cDNAを 铸型にして「： Bio Array High Yield RNA Transcript Labeling KitJ (商品名、 E nzo Diagnostics社製）を用いてピオチン標識した cRNAを試験管内で合成した。 そして、この cRNAを断片化した後、 DNAマイクロアレイ（商品名「GeneChipMouse Expression Array 430AJ (Affymetrix社製））と「ノヽイブリダィゼーシヨンオーブン」（ 商品名、 Affymetrix社製）にてハイブリダィゼーシヨンを行い、 R—フィコエリスリン一 ストレプトアビジンとの反応及び洗浄操作を「Fluidics station] (商品名、 Affymetr ix社製）で行った後、蛍光強度を「Gene Array Scanner」（商品名、 Affymetrix 社製)で測定し、関連遺伝子の発現量の解析を行った。なお、上記 DNAマイクロア レイの検出感度は 1 : 100, 000であり、これはマウス total RNAサンプル中にマウス c DNAクローン由来の標識済み転写産物を添加し検出することにより測定している。本 試験で用いたマウス皮膚由来 total RNAについて 22, 690遺伝子が検出され、遺伝 子発現の増減の解析に用いた。その中でチロシナーゼは ProbelD : 1448821— at でコードされ、その蛍光強度から遺伝子発現強度の比率を求めた。
[0066] 試験群と対照群の組み合わせは以下のとおりである。
試験群 : 0. 1 %ヘリピロン A含有 MF— 1食 10週間飼育（ 16週齢）
対照群: MF— 1食 10週間（16週齢）
[0067] [表 4]
Figure imgf000023_0001
[0068] なお、表 4中の「Accession No.」は、各遺伝子の GenBank(NCBIの核酸配列 データベース）における識別番号であり、 Probe Set IDは Affymetrix社製 GeneChip Expression Array固有の識別番号である。
この表 4から、マウス皮膚組織におけるチロシナーゼの遺伝子発現がヘリピロン Aに よって抑制され、チロシナーゼの皮膚における過剰発現が抑制され、チロシナーゼ によるメラニン形成がヘリピロン Aによって抑制されることがわかった。
[0069] [皮膚組織中 Proliferation Cell Nuclear Antigenの測定]
Proliferation Cell Nuclear Antigen (PCNA)は、免疫組織化学的手法を用 いて測定した。
[0070] パラフィン包埋済みのマウス皮膚組織にっ 、て、脱パラフィン処理を定法に従!、、 抗原賦活化は 0. 01Mクェン酸緩衝液 (pH6. 0)中でマイクロウエーブ処理 5分を実 施した。室温まで冷却後、常温下 0.3%過酸ィ匕水素含有メタノールで 20分反応させ て内因性ペルォキシダーゼを阻害した。水洗、 10mM PBS (—）洗浄後、ゥサギ血 清 75倍 lOmMPBS (—)希釈溶液で 5分間マイクロウエーブ処理を実施してブロッキ ング、ブロッキング終了後にゥサギ血清を落として 1次抗体 (PC10： DAKO製)を 50 0倍希釈したものを添加して 20分間マイクロウエーブ処理により抗体を反応させた。 1 OmMPBS (—）で 2回洗浄し、ピオチン化二次抗体 (ピオチン化ゥサギ免疫グロプリ ン M； DAKO製）を 300倍希釈したものを添カ卩し 5分間マイクロウエーブ処理で抗体 を反応させた。 1 OmMPBS (—）で 2回洗浄し、 ABC試薬（ABC—HRP ;Vectastai n製)を添加し 5分間マイクロウェーブ処理により反応させた。発色試薬として DAB (3 ,3-ジァミノべンジジンテトラヒドロクロライド： DAKO製）を用いて 3分 30秒常温下で 反応させた。水洗後、公知の方法に基づいて脱水、封入処理を行った。顕微鏡下で 皮膚組織の染色状況を観察した。紫外線照射 10週間の検体は、 PCNAの増加によ り、表皮細胞の主に細胞核が発色するので、 Adobe Photoshopを用いて画像を取 り込み、画像中の一定面積中の染色箇所を NIH Imagingにて数値ィ匕した。
[0071] 各群の数値について平均値士 S.D.を求めた。 2群間の有意差検定は UV (—）群を 基準値 1として各群の平均値を補正後、 student' s t-test (有意水準 p< 0.05)で実施し た。測定したサンプルを表 5に示し、結果を図 10に示す。
[0072] ヘリピロン Aを摂取したマウスの皮膚組織において PCNAは増加しなかった。 PCN Aは DNAの酸ィ匕ゃ切断、及び増殖性皮膚疾患として知られて 、る乾癬のバイオマー カーとして発現上昇が知られており、本試験におけるマウス皮膚への紫外線照射で 発現上昇する PCNAをヘリピロン A摂食が DNAの酸化防止作用、紫外線障害の緩 和作用によって正常レベルに戻った。
[0073] [表 5]
1 紫外練未照射 コントロール食
2 紫外練照射 コントロール食
3 紫外線照射 ヘリピロン AO. 1 %混餌
4 紫外線照射 ヘリピロン AO. 05%混餌
5 紫外練照射 ヘリピロン AO. 01 %混餌
6 紫外線照射 βカロテン 0. 05%混餌
7 紫外線照射 βカロテン 0. 01 %混餌 [0074] [皮膚組織中 口リクリンの測定]
口リクリンは、免疫組織化学的手法を用いて測定した。
[0075] パラフィン包埋済みのマウス皮膚組織にっ 、て、脱パラフィン処理を定法に従!、、抗 原賦活化は 0. 01Mクェン酸緩衝液 (pH6. 0)中でマイクロウェーブ処理 5分を実施 した。室温まで冷却後、常温下 0.3%過酸ィ匕水素含有メタノールで 20分反応させて 内因性ペルォキシダーゼを阻害した。水洗、 10mM PBS (—）洗浄後、ャギ血清 75 倍 lOmMPBS (—)希釈溶液で 5分間マイクロウエーブ処理を実施してブロッキングし 、ブロッキング終了後にャギ血清を落として 1次抗体（Loricrin Polyclonal Antib ody, Purified： Sigma製）を 500倍希釈したものを添カ卩して 20分間マイクロウエーブ 処理により抗体を反応させた。 lOmMPBS (—）で 2回洗浄し、ピオチン化二次抗体（ ピオチンィ匕ャギ免疫グロブリン M； DAKO製)を 300倍希釈したものを添加し 5分間 マイクロウェーブ処理で抗体を反応させた。 lOmMPBS (―)で 2回洗浄し、 ABC試 薬(八 じー1¾^3 ; ¥6 &5 &^1製）を添カ卩し 5分間マイクロウエーブ処理により反応さ せた。発色試薬として DAB (3,3-ジァミノべンジジンテトラヒドロクロライド: DAKO製） を用いて 4分 30秒常温下で反応させた。その後、へマトキシリンで細胞核や組織全 体像を染色処理し、水洗後、公知の方法に基づいて脱水、封入処理を行った。顕微 鏡下で皮膚組織の染色状況を観察した。紫外線照射 10週間の検体は口リクリンの増 カロにより、表皮細胞の主に細胞核が発色する。 Adobe Photoshopを用いて画像を 取り込み、画像中の一定面積中の染色箇所を NIH Imagingにて数値ィ匕した。測定 したサンプルを表 6に示し、結果を図 11に示す。
[0076] 各群の数値について平均値士 S.D.を求めた。 2群間の有意差検定は UV (—）群を 基準値 1として各群の平均値を補正後、 student' s t-test (有意水準 p< 0.05)で実施し た。
ヘリピロン A摂取したマウスの皮膚糸且織において口リクリンは増加しな力つた。口リクリ ンは皮膚の終末分ィ匕のマーカーとして知られており、ヘリピロン A摂取により皮膚の 老化現象が抑制され、正常な皮膚の分ィ匕状態を保つ作用が認められた。
[0077] [表 6] 1 紫外線未照射 コントロール食
2 紫外線照射 コントロール食
3 紫外線照射 ヘリピロン AO. 1 %混餌
4 紫外線照射 ヘリピロン AO. 05%混餌
5 紫外線照射 ヘリピロン AO. 01 %混餌
6 紫外線照射 βカロテン 0. 05%混餌
7 紫外線照射 βカロテン 0. 01 %混餌
[0078] [皮膚組織中 ケラチン 1の測定]
ケラチン 1は、免疫組織化学的手法を用いて測定した。
[0079] パラフィン包埋済みのマウス皮膚組織にっ 、て、脱パラフィン処理を定法に従!、、抗 原賦活化は 0. 01Mクェン酸緩衝液 (ρΗ6. 0)中でマイクロウェーブ処理 5分を実施 した。室温まで冷却後、常温下 0.3%過酸ィ匕水素含有メタノールで 20分反応させて 内因性ペルォキシダーゼを阻害した。水洗、 10mM PBS (—）洗浄後、ャギ血清 75 倍 lOmMPBS (—)希釈溶液で 5分間マイクロウエーブ処理を実施してブロッキング、 ブロッキング終了後にャギ血清を落として 1次抗体（Mouse Keratinl (AF109) Po lyclonalAntibody, Purified： COVANCE製）を 500倍希釈したものを添カ卩し 20 分間マイクロウェーブ処理により抗体を反応させた。 lOmMPBS (―)で 2回洗浄し、 ピオチン化二次抗体 (ピオチン化ャギ免疫グロブリン M； DAKO製)を 300倍希釈し たものを添カ卩し 5分間マイクロウエーブ処理で抗体を反応させた。 lOmMPBS (―)で 2回洗浄し、 ABC試薬 (ABC— HRP ;Vectastain製）を添カ卩し 5分間マイクロウエー ブ処理により反応させた。発色試薬として DAB (3, 3-ジァミノべンジジンテトラヒドロタ 口ライド: DAKO製)を用いて 3分 30秒常温下で反応させた。その後、へマトキシリン で細胞核や組織全体像を染色処理し、水洗後、公知の方法に基づいて脱水、封入 処理を行った。顕微鏡下で皮膚組織の染色状況を観察した。紫外線照射 10週間の 検体はケラチン 1の増加により、表皮細胞の主に細胞核が発色する。 Adobe Photo shopを用いて画像を取り込み、画像中の一定面積中の染色箇所を NIH Imaging にて数値ィ匕した。測定したサンプルを表 7に示し、結果を図 12に示す。
[0080] 各群の数値について平均値士 S.D.を求めた。 2群間の有意差検定は UV (—）群を 基準値を 1として各群の平均値を補正後、 student' s t-test (有意水準 p< 0.05)で実 施した。
[0081] ヘリピロン A摂取したマウスの皮膚糸且織においてケラチン 1は増加しな力つた。ケラ チン 1は皮膚の終末分ィ匕のマーカーとして知られており、ヘリピロン A摂取により皮膚 の老化現象が抑制され、正常な皮膚の分ィ匕状態を保つ作用が認められた。
[0082] [表 7]
Figure imgf000027_0001
[0083] 処方例を以下に示す。
[0084] [処方例 1 カプセル剤]
下記成分を混合し、ゼラチンおよびグリセリンを混合したカプセル基剤中に充填し、 軟カプセルを得た。
(組成） （配合量; mg)
ヘリピロン A 70
卜コ卜リエノー Jレ 30
ミツロウ 1 0
ぷどう種子オイル 1 1 0
[0085] [処方例 2 錠剤]
下記成分を混合 打錠し、錠剤を得た。
(組成) (配合量 mg)
ヘリピロン A フ 5
セルロース 40
デンプン 20
ショ糖脂肪酸エステル 2
[0086] [処方例 3 錠剤]
下記成分を混合 打錠し、錠剤を得た。
(組成） (配合量 mg)
ヘリピロン A 75
セルロース 40
デンプン 20
ショ糖脂肪酸エステル 2
[0087] [処方例 4 ジュ (組成） （配合;質量％)
加糖ブドウ糖液糖 5.00
クェン酸 10.40
L-ァスコ Jレビン gき 0.20
香料 0.02
色素 0. 10
へ1 Jピロン A 0.05
水 84.33
[処方例 5 クリーム]
下記成分（ 1)〜（ 10)を 80°Cに加熱溶解し油相とする。成分（ 11)〜（ 13)を 70°C に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら 40°Cまで 冷却し、さらに 30°Cまで攪拌冷却してクリームを得た。
(1)ステアリルアルコール
(2)ステアリン酸
(3)水添ラノリン
(4)スクヮラン
(5)ォク于ルドデカノール 量量余 o o o o n c C 9 o o-
(6) P0E(25)セチルアルコールエーテル
(7)モノステアリン酸グリセリン
(8)ヘリピロン A
(9)防腐剤
(10)香料
(11) 1, 3プチレングリコール
(12) PEG 1500
(13)精製水

Claims

請求の範囲 一般式（1)で表されるヘリピロン A (Helipyrone A)を含有する一重項酸素消去剤、 皮膚老化改善剤、しわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラ二 ン抑制剤、一酸化窒素消去剤あるいは酸化防止剤。
[化 1]
Figure imgf000029_0001
一般式 (1)
[2] 請求項 1に .記載された!ヽずれかの剤を含有する経口用組成物。
[3] 請求項 1に .記載されたいずれかの剤を含有する皮膚外用組成物。
[4] 請求項 1に記載された!、ずれかの剤を含有する食品。
[5] 請求項 1に記載された!ヽずれかの剤を含有する医薬。
[6] 請求項 1に記載された!ヽずれかの剤を含有する化粧料。
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