JP6738590B2 - サイトグロビンを含有することを特徴とする皮膚外用剤 - Google Patents

Description

本発明は、美白効果、抗しわ効果及びメラノーマ治療効果に優れた新規な皮膚外用剤に関する。

一般に、シミ、ソバカス、日焼け等に見られる皮膚の色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線の刺激により、皮膚内に存在するメラニン色素生成細胞（メラノサイト）がメラニン色素を過剰に生成し、これが皮膚内に沈着することが原因と考えられている。このような色素沈着を防ぐ方法の一つに、メラニンの過剰な生成を抑制する方法が知られている。そして従来から、メラニンの過剰な生成を抑制する色素沈着の治療には、アルブチン、ハイドロキノン、エラグ酸、コウジ酸及びこれらの誘導体等が用いられてきた。

しかしながら、これらの成分を含有した皮膚外用剤には種々の問題点が残されており、実用性の面で問題があった。例えば、ハイドロキノンは発疹、かぶれ等安全性に問題があった。

そのため、更に優れた美白効果を示すと共に、皮膚に対する高い安全性を併せ持つ成分が求められていた。

ヒアルロン酸は結合組織に広く分布する高分子多糖体として知られており、真皮中でゲル状の形態を呈し、肌の弾力を維持している。従って、ヒアルロン酸の変質や減少が皮膚老化の原因として重要であると考えられている。また、ヒアルロン酸は高分子であるため、それを含有した化粧料を皮膚に直接塗布しても吸収されにくいという問題があった。そこで線維芽細胞を活性化することで細胞自らのヒアルロン酸の合成を促進させることができる皮膚外用剤が模索されてきた（特許文献１）。また従来、レチノイン酸（ビタミンＡ）にヒアルロン酸合成促進効果が知られているが、強い皮膚刺激性や皮膚の肥厚等の副作用を有するため、一般的な医薬品、医薬部外品、化粧品における有効成分として用いることは困難である。このようなことから、安全性が高く、ヒアルロン酸合成促進効果を有する有効成分の開発が望まれていた。

メラノーマ（悪性黒色腫）は、メラノサイトが癌化して生じる悪性腫瘍である。早期のうちから転移を生じやすく、化学療法や放射線療法にも抵抗性を持つことからも悪性度の高い腫瘍として知られている（非特許文献１、２）。したがって、新療法の開発が心待ちにされている。

サイトグロビン（Ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ）は別名ＳＴＡＰ（ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ‐ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれる、鉄とＩＸ型プロトポルフィリンから成るヘムを含有するタンパク質であり、哺乳類で４つ存在するグロビン（ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン）のうちの一つである。また、ミオグロビンと相同性の高いヘム蛋白であり、酸素や一酸化炭素と結合することが知られている（非特許文献３）。また、サイトグロビンは肝臓を含む内臓の線維芽細胞に発現し、臓器線維化とともに発現増強することや、サイトグロビンを過剰発現させると細胞が酸化ストレスから保護されることが明らかになってきている（特許文献２、３）。

サイトグロビンの公知文献としては、癌等の治療、診断、創薬等に有用なスクリーニングツール（特許文献２、３）等が知られているが、これらは、サイトグロビン遺伝子の機能が欠損しているモデル動物を用いるものであり、サイトグロビンタンパク質を用いたものではない。

皮膚におけるサイトグロビンの機能は不明であり、サイトグロビンのメラノサイトにおけるメラニン生成抑制効果、線維芽細胞におけるヒアルロン酸合成促進効果及びメラノーマにおける増殖抑制効果については検討されていなかった。

特開２００７−１９２４号公報 特開２０１０−０５１２７７号公報 特開２０１１−１８５７８９号公報

「化学療法の領域」、２００３年、Ｓ−１、第１９巻、ｐ．２２４−２３１。 「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、２００３年、第２２巻、ｐ．３１３８−３１５１。 Ｓａｗａｉ Ｈ， Ｋａｗａｄａ Ｎ， Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ Ｋ， Ｎａｋａｊｉｍａ Ｈ， Ａｏｎｏ Ｓ， Ｓｈｉｒｏ Ｙ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｍｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ， ａ ｆｏｕｒｔｈ ｇｌｏｂｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００３．４２．５１３３−５１４２．

本発明は、安全性に優れ、美白効果、抗しわ効果及びメラノーマ治療効果に優れた新規な皮膚外用剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、この課題を解決すべく、鋭意検討した結果、サイトグロビンが優れたメラニン生成抑制効果、ヒアルロン酸合成促進効果及びメラノーマ増殖抑制効果を持ち、安全性においても優れていることを見出した。さらに、サイトグロビンを含有する皮膚外用剤が、安全であり、美白効果、抗しわ効果及びメラノーマ治療効果に優れていることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）からなる。

（１）サイトグロビンを含有することを特徴とする皮膚外用剤。
（２）サイトグロビンを含有することを特徴とする美白用皮膚外用剤。
（３）サイトグロビンを含有することを特徴とする抗老化用皮膚外用剤。
（４）サイトグロビンを含有することを特徴とするメラノーマ治療用皮膚外用剤。

本発明のサイトグロビンは、優れたメラニン生成抑制効果、ヒアルロン酸合成促進効果及びメラノーマ増殖抑制効果を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品の分野において貢献できるものである。

以下に、本発明について詳細に述べる。

本発明におけるサイトグロビンは、ヘムを含有するタンパク質であり、哺乳類で４つ存在するグロビン（ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン）のうちの一つである。肝臓、腎臓、肺等の多くの組織の細胞内に存在するので、サイトグロビンは、これらの細胞から抽出することができる。また、市販品を入手できる。

本発明における美白用皮膚外用剤は、シミ及びソバカスを目立たなくすることを目的に用いる。同様に、抗老化用皮膚外用剤は、しわ及びたるみを目立たなくすることを目的に用い、メラノーマ治療用皮膚外用剤はメラノーマの治療を目的に用いる。

本発明の皮膚外用剤には、サイトグロビンをそのまま使用しても良く、効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品又は医薬品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤等の成分を含有することもできる。

本発明の剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、マッサージクリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス等が挙げられる。

本発明に用いるサイトグロビンの含有量は、特に限定されないが、０．００００１〜1０重量％の範囲が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜１重量％である。また、添加の方法については、予め加えておいても製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すればよい。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるサイトグロビンの処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す含有量の％とは重量％を示す。

実験例１ メラニン生成抑制効果
メラニン生成においては、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１）及びチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）が主要な酵素として関与し、これら酵素の発現制御には小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）が重要な役割を担っている。ヒト正常メラノサイトＮＨＥＭ １．２５×１０^６個にサイトグロビン（フナコシ株式会社、ＲＰＲ−８４２）を０．１、１及び１０μｇ／ｍＬ添加し、４８時間培養後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦの発現量を、内部標準であるβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦの発現率は、コントロールのＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦ ｍＲＮＡの発現量に対するサイトグロビン添加群のＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＴＹＲ用のプライマーセット
ＴＧＣＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣ（配列番号１）
ＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＡＧＴ（配列番号２）
ＴＲＰ１用のプライマーセット
ＣＧＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＡＣＡＧＴ（配列番号３）
ＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣＴ（配列番号４）
ＴＲＰ２用のプライマーセット
ＧＧＡＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＴＴＧ（配列番号５）
ＡＡＡＧＣＧＴＴＴＧＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧ（配列番号６）
ＭＩＴＦ用のプライマーセット
ＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴ（配列番号７）
ＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＣ（配列番号８）
β−Ａｃｔｉｎ用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号９）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号１０）

実験結果を表１に示した。その結果、本発明のサイトグロビンは、濃度依存的にＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦの発現を抑制し、優れたメラニン生成抑制効果を示した。

実験例２ ヒアルロン酸合成促進効果
ヒト線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢを３５ｍｍ ｄｉｓｈに５×１０^４個播種し、セミコンフルエントになった時点でサイトグロビンを０．１、１及び１０μｇ／ｍＬ添加し、４８時間培養後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）の発現量を、内部標準であるβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＨＡＳ２の発現率は、コントロールのＨＡＳ２ ｍＲＮＡの発現量に対するサイトグロビン添加群のＨＡＳ２ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、ＨＡＳ２用のプライマーは次の通りである。

ＨＡＳ２用のプライマーセット
ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＴＡ（配列番号１１）
ＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧ（配列番号１２）

実験結果を表２に示した。その結果、本発明のサイトグロビンは、優れたヒアルロン酸合成促進効果を示した。

実験例３ メラノーマ細胞増殖抑制効果
ヒト悪性黒色腫由来Ｇ−３６１細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５×１０^３個播種し、サイトグロビン（最終濃度０．１、１及び１０μｇ／ｍＬ）を添加した０．１％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ５Ａ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で６日間培養した。細胞数の測定は、ＭＴＴ法により行った。すなわち、培養終了後、培養液を除き、５００μｇ／ｍＬの濃度にて、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を溶解させたＭｃＣｏｙ５Ａに培地を入れ替え、２時間培養した後、１５０μＬのｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌに細胞を溶解させ、マイクロプレートリーダーを用いて５７０及び６３０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞数は、５７０ｎｍの吸光度値から、６３０ｎｍの吸光度値を引いた値にて算出し、試料未添加の細胞数をコントロールとし、コントロールに対する試料添加時の細胞数から試料の細胞増殖促進効果を評価した。

これらの実験結果を表３に示した。その結果、サイトグロビンは、ヒト悪性黒色腫由来Ｇ−３６１細胞に対して優れた細胞増殖抑制効果を示した。

処方例１ 化粧水
処方 含有量（％）
１．サイトグロビン ０．０００１
２．１，３−ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

処方例２ 乳液
処方 含有量（％）
１．サイトグロビン ０．００１
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却後、成分１を加え、製品とする。

処方例３ クリーム
処方 含有量（％）
１．サイトグロビン ０．１
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２５
１２．１，３−ブチレングリコール ８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１１〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却後、成分１を加え、製品とする。

比較例１ 従来のクリーム
処方例３において、サイトグロビンを含有しないものを従来のクリームとした。

処方例４ パック
処方 含有量（％）
１．サイトグロビン ０．００１
２．ポリビニルアルコール １２．０
３．エタノール ５．０
４．１，３−ブチレングリコール ８．０
５．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
７．クエン酸 ０．１
８．クエン酸ナトリウム ０．３
９．香料 適量
１０．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜１０を均一に溶解し製品とする。

処方例５ ファンデーション
処方 含有量（％）
１．サイトグロビン ０．０００１
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）１．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１０．ベントナイト ０．５
１１．プロピレングリコール ４．０
１２．トリエタノールアミン １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．二酸化チタン ８．０
１５．タルク ４．０
１６．ベンガラ １．０
１７．黄酸化鉄 ２．０
１８．香料 適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１０〜１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４〜１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１８を加え、更に３０℃まで冷却後、成分１を加え、製品とする。

処方例６ 浴用剤
処方 含有量（％）
１．サイトグロビン ０．０００１
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。

処方例７ ゲル剤
処方 含有量（％）
１．サイトグロビン ０．００１
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３−ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

処方例８ 軟膏
処方 含有量（％）
１．サイトグロビン １．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却後、成分１を加え、製品とする。

実験例４ 使用試験
処方例３のクリーム及び比較例１の従来のクリームを用いて、各々女性３０人（２０〜４５歳）を対象に３カ月間の使用試験を行った。使用後、シミ、ソバカス及びしわの改善についてのアンケート調査を行って、皮膚性状の改善効果を判定した。アンケートの評価基準は、有効なものを「優」、やや有効なものを「良」、わずかに有効なものを「可」、無効なものを「不可」として評価した。

これらの結果を表４に示した。処方例３のサイトグロビンを含有するクリームは優れた美白効果及びしわ改善効果を示した。なお、試験期間中皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。

処方例１の化粧水、処方例２の乳液、処方例４のパック、処方例５のファンデーション、処方例６の浴用剤、処方例７のゲル剤、処方例８の軟膏の使用試験を行ったところ、いずれも安全で優れた美白効果及びしわ改善効果を示した。

以上のことから、本発明のサイトグロビンは、優れたメラニン生成抑制効果、ヒアルロン酸合成促進効果及びメラノーマ増殖抑制効果を有し、安全性にも優れていた。よって、本発明のサイトグロビンを含有する皮膚外用剤は特に、美白、抗しわ及びメラノーマ治療に有効である。

Claims (1)

1. サイトグロビンを含有することを特徴とする美白用皮膚外用剤。