JP5171977B2

JP5171977B2 - 共焦点レーザスキャニング顕微鏡

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Description

本発明は、例えば明視野観察などの各種観察法による試料の画像を取得することを可能とする共焦点レーザスキャニング顕微鏡に関する。

共焦点レーザスキャニング顕微鏡は、レーザ光源から出力されたレーザビームを試料に照射し、試料からの測定光を共焦点絞りを通して検出する。これにより、共焦点レーザスキャニング顕微鏡は、焦点深度の浅い試料の共焦点像を取得する。このような共焦点レーザスキャニング顕微鏡には、焦点深度の浅い試料の共焦点画像と焦点深度の深い非共焦点画像とを取得し、共焦点画像と非共焦点画像との表示を選択可能とするものがある。

例えば特許文献１には、共焦点画像と非共焦点画像との表示を選択可能とする共焦点レーザスキャニング顕微鏡が開示されている。すなわち、試料からの光は、共焦点絞りを通過して第１の検出器により検出される。第１の検出器は、共焦点絞りを通過した試料からの光を検出して共焦点画像信号を出力する。又、試料からの光は、第２の検出器により受光される。第２の検出器は、試料からの光を検出して非共焦点画像信号を出力する。第１の検出器から出力された共焦点画像信号と第２の検出器から出力された非共焦点画像信号とは、切換器に送られる。切換器は、第１の検出器から出力された共焦点画像信号と第２の検出器から出力された非共焦点画像信号とを電気的に切り換えてモニタに送る。モニタには、共焦点画像又は非共焦点画像が表示される。

このような特許文献１であれば、試料の共焦点画像と非共焦点画像との表示を選択可能である。非共焦点画像は、試料を落射照明して明視野観察法により取得する方法も含まれる。又、試料の観察では、試料に合わせて明視野観察を行う他に、例えば暗視野観察などの各種観察法により観察する要求がある。さらに、共焦点レーザスキャニング顕微鏡を用いてより試料上の細かい凹凸形状を観察したいという要求がある。
特開平９−１３３８６９号公報

上記特許文献１は、試料の共焦点画像と非共焦点画像とを選択可能であるが、このうちの非共焦点画像は、試料を落射照明して、明視野観察法により取得されるものである。試料の観察では、試料に合わせて明視野観察を行う他に例えば暗視野観察などの各種観察法により観察する要求がある。しかしながら、上記特許文献１では、共焦点レーザ顕微鏡を用いて試料の共焦点画像の他に、試料の明視野観察を可能とするが、例えば暗視野観察などの各種観察法で観察することは不可能である。

本発明は、レーザビームを出力するレーザ光源と、前記レーザ光源から出力された前記レーザビームを試料に照射し、前記試料からの測定光を検出して前記試料の共焦点画像を取得するレーザ光学系と、任意の波長を有する照明光を出射する光源と、前記光源から出射された前記照明光を前記レーザ光学系に導入して前記試料に照射し、前記試料からの測定光を検出して前記試料の非共焦点画像を取得する光学顕微鏡光学系と、前記光学顕微鏡光学系に配置された第１のフィールドレンズ系と、前記レーザ光学系に配置された第２のフィールドレンズ系と、を具備し、前記第１及び第２のフィールドレンズ系は、前記非共焦点画像及び前記共焦点画像を結像する各後側焦点距離を短くすることを特徴とする共焦点レーザスキャニング顕微鏡である。

本発明は、例えば明視野観察、暗視野観察又は微分干渉観察などの光学顕微鏡系の観察法の少なくとも２種の観察法が切り替え可能である共焦点レーザ顕微鏡を提供できる。

以下、本発明の第１の実施の形態について図面を参照して説明する。

図１は共焦点レーザスキャニング顕微鏡の構成図である。レーザ顕微鏡の試料台１上には、試料２が載置されている。共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系について説明する。レーザ光学系は、レーザ光源４と、レンズ５と、偏光ビームスプリッタ６と、光スキャナ７と、瞳投影レンズ８と、１／４波長板９と、第１のビームスプリッタ１０と、結像レンズ１１と、対物レンズ１２と、ビームスプリッタ１５と、共焦点用ピンホール１６と、第１の検出器１７と、第２の検出器１８とから構成されている。ここで、レーザ光源４と、レンズ５と、偏光ビームスプリッタ６と、光スキャナ７と、瞳投影レンズ８と、１／４波長板９と、第１のビームスプリッタ１０とを通る光軸を第３の光軸Ｌ₃とする。

観察光学系は、白色光源１９と、各レンズ２１、２２と、対物レンズ１２と、結像レンズ１１と、フィールドレンズ２７と、ＣＣＤカメラ２８とから構成されている。ここで、白色光源１９と、各レンズ２１、２２とを通る光軸を第１の光軸Ｌ₁とする。

ここで、レーザ光学系と観察光学系とで共通に用いられる各光学素子がある。これら光学素子は、対物レンズ１２と、結像レンズ１１と、第１のビームスプリッタ１０とである。又、対物レンズ１２と、結像レンズ１１と、第１のビームスプリッタ１０と、フィールドレンズ２７と、ＣＣＤカメラ２８とを通る光軸を第２の光軸Ｌ₂とする。

以下、具体的に説明する。レーザ顕微鏡本体３内には、レーザ光源４が設けられている。レーザ光源４は、例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光源４から出力されるレーザビームの光路上には、レンズ５、偏光ビームスプリッタ６、光スキャナ７、瞳投影レンズ８、共焦点レーザスキャニング顕微鏡用の１／４波長板９及び第１のビームスプリッタ１０が設けられている。

光スキャナ７は、例えばガルバノミラーからなる。光スキャナ７は、レーザ光源４から出力されたレーザビームを試料２上に２次元スキャンする。試料２上での２次元スキャンは、ＸＹ平面上に行われる。

第１のビームスプリッタ１０は、偏光特性を有しない。

第１のビームスプリッタ１０の下方への反射方向の光路上には、結像レンズ１１及び対物レンズ１２が設けられている。レーザ顕微鏡本体３の下部には、レボルバ１３が回転可能に設けられている。対物レンズ１２は、レボルバ１３に対して取り付けられている。レボルバ１３には、互いに倍率の異なる複数の対物レンズ１２が取り付けられている。従って、レボルバ１３を回転することにより任意の倍率の対物レンズ１２が選択されて第２の光軸Ｌ₂上に配置される。

偏光ビームスプリッタ６は、試料２上にレーザビームを照射したとき、試料２で反射され、対物レンズ１２、結像レンズ１１、ビームスプリッタ１０、１／４波長板９、瞳投影レンズ８、光スキャナ７を通って入射した第１の測定光を反射する。

偏光ビームスプリッタ６の反射方向の光路上には、結像レンズ１４、ビームスプリッタ１５が設けられている。ビームスプリッタ１５は、偏光特性を有しない。ビームスプリッタ１５は、結像レンズ１４により結像される第１の測定光を透過方向と反射方向との２方向に分岐する。

ビームスプリッタ１５の透過方向の光路上には、共焦点用ピンホール１６を介して第１の検出器１７が設けられている。ビームスプリッタ１５の反射方向の光路上には、第２の検出器１８が設けられている。第１の検出器１７及び第２の検出器１８は、それぞれ例えばフォトダイオード又はフォトマルチプライヤを用いる。

次に、光学顕微鏡の光学系について説明する。

レーザ顕微鏡本体３内には、白色光源１９が設けられている。白色光源１９は、例えば白色光の照明光を出力する。白色光源１９は、例えば光ファイバ２０の端部をレーザ顕微鏡本体３内に挿入して設けられている。なお、白色光源１９は、ランプ等の光源自体をレーザ顕微鏡本体３内に設けてもよい。白色光源１９から出力される照明光の光路上には、各レンズ２１、２２を介して光学素子切換部としての明・暗視野切換キューブ２３が設けられている。

図２は明・暗視野切換キューブ２３の構成図を示す。明・暗視野切換キューブ２３は、明視野用プリズム（明視野用ハーフプリズム）２４と暗視野用環状ミラー（暗視野用ドーナツミラー）２５とを有する。明・暗視野切換キューブ２３は、明視野用プリズム２４と暗視野用環状ミラー２５とを第２と第１との光軸Ｌ₂、Ｌ₁に対して互いに垂直であるＹ方向に挿脱し、第２と第１との光軸Ｌ₂、Ｌ₁の交点上に明視野用プリズム２４又は暗視野用環状ミラー２５のいずれか一方を配置する。明・暗視野切換キューブ２３は、明視野用プリズム２４又は暗視野用環状ミラー２５の切り替えを手動式にしてもよいし、モータ等を用いて自動的に行うようにしてもよい。

共焦点レーザスキャニング顕微鏡の光学系の瞳位置は、明視野用プリズム２４を第２の光軸Ｌ₂上に配置した状態で、対物レンズ１２の瞳位置と一致する。

明視野用プリズム２４は、偏向面２４ａを有する。偏向面２４ａは、Ｘ方向（第１の光軸Ｌ₁方向）に対する角度φ（＝４５°）に設定している。明視野用プリズム２４は、レーザ光源４から出力されたレーザビームを透過すると共に、このとき試料２で反射してきた第１の測定光を透過する。明視野用プリズム２４は、白色光源１９から出力された照明光を下方に反射すると共に、このときの試料２で反射してきた第２の測定光を透過する。

暗視野用環状ミラー２５は、環状に形成されている。暗視野用環状ミラー２５は、Ｘ方向（第１の光軸Ｌ₁方向）に対して角度φ（＝４５°）に傾斜して設けられている。暗視野用環状ミラー２５は、白色光源１９から出力された照明光をリング状に整形して下方に偏向すると共に、このときの試料２で反射してきた第２の測定光をリングの開口部に通過させる。

レーザ顕微鏡本体３内には、検出部としての光路切替えセンサ２６が設けられている。光路切替えセンサ２６は、明・暗視野切換キューブ２３により明視野用プリズム２４又は暗視野用環状ミラー２５のいずれかを第２の光軸Ｌ₂上に配置したかを検出し、その切替え信号を出力する。光路切替えセンサ２６は、例えばマイクロスイッチからなる。

第１のビームスプリッタ１０の透過方向の第２の光軸Ｌ₂上には、フィールドレンズ２７を介してＣＣＤカメラ２８が設けられている。ＣＣＤカメラ２８は、撮像面２８ａを有する。ＣＣＤカメラ２８は、撮像面２８ａ上に結像された試料２の像を撮像してその画像信号を出力する。

コントローラ２９は、画像処理部２９ａ、レーザビーム遮光部２９ｂ、画像メモリ２９ｃを有する。画像処理部２９ａは、レーザ光源４から出力されたレーザビームを試料２上にスキャンしたときに、第１の検出器１７の出力信号を画像処理して試料２の共焦点画像を取得し、かつ第２の検出器１８の出力信号を画像処理して試料２の非共焦点画像を取得する。

画像処理部２９ａは、白色光源１９から出力された照明光を試料２上に照射したときに、ＣＣＤカメラ２８から出力された画像信号を画像処理して明視野観察又は暗視野観察での試料２の非共焦点画像を取得する。

画像処理部２９ａは、試料２の共焦点画像、明視野観察又は暗視野観察での各共焦点画像データ、非共焦点画像データを画像メモリ２９ｃに保存し、かつこれら共焦点画像データ、非共焦点画像データをモニタ３０に表示する。

レーザビーム遮光部２９ｂは、光路切替えセンサ２６から出力された切替え信号を入力し、暗視野用環状ミラー２５が第２の光軸Ｌ₂上に配置されたか否かを検出する。レーザビーム遮光部２９ｂは、暗視野用環状ミラー２５が第２の光軸Ｌ₂上に配置されたことを検出すると、レーザ出力用電源からレーザ光源４への電力供給を遮断する。レーザ出力用電源からレーザ光源４への電力供給を遮断は、半導体を用いないリレー回路、例えばシーケンス回路を用いる。これにより、レーザビームは、レーザ光学系に導入されない。

レーザ光学系にレーザビームを導入させない構成は、次のようにしてもよい。

図１においてシャッタ３１は、レーザ光源４とレンズ５との間の第３の光軸Ｌ₃上に設けられている。シャッタ３１は、例えば電力供給の遮断により閉じる。

レーザビーム遮光部２９ｂは、暗視野用環状ミラー２５が第２光軸Ｌ₂上に配置されたことを検出すると、シャッタ３１に対して電源供給を遮断する。これにより、シャッタ３１は、閉じる。レーザビームは、レーザ光学系に導入されない。

次に、上記の如く構成された顕微鏡の動作について説明する。

共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系を用いた明視野観察は、次のように行われる。

明・暗視野切換キューブ２３は、図２に示すように明視野用プリズム２４を光軸Ｌ₁上に配置する。この状態で、レーザ光源４から出力されたレーザビームは、レンズ５、偏光ビームスプリッタ６を通って光スキャナ７に入射する。

光スキャナ７は、入射したレーザビームを試料２上に対してＸＹ平面上にスキャンする。スキャンされたレーザビームは、瞳投影レンズ８により集光され、１／４波長板９を透過する。このときレーザ光源４から出力されたレーザビームがＰ偏光であれば、１／４波長板９を透過すると、円偏光に変換される。

１／４波長板９を透過したレーザビームは、第１のビームスプリッタ１０で下方に反射され、結像レンズ１１、明視野用プリズム２４、対物レンズ１２を通して試料２上にスキャンされる。

試料２で反射した第１の測定光は、試料２へのレーザビームの照射光路とは逆の光路、すなわち対物レンズ１２、明視野用プリズム２４、結像レンズ１１、第１のビームスプリッタ１０、１／４波長板９、瞳投影レンズ８、光スキャナ７を通って偏光ビームスプリッタ６に入射する。

第１の測定光は、１／４波長板９を透過することによりＳ偏光になる。偏光ビームスプリッタ６は、入射した第１の測定光を結像レンズ１４側に反射する。反射された第１の測定光は、結像レンズ１４を通ってビームスプリッタ１５に入射し、２方向に分岐される。

ビームスプリッタ１５により分岐された一方の第１の測定光は、共焦点用ピンホール１６を通って第１の検出器１７に入射する。第１の検出器１７には試料２の共焦点像が結像する。第１の検出器１７は、試料２の共焦点像の画像信号を出力する。

ビームスプリッタ１５により分岐された他方の第１の測定光は、第２の検出器１８に入射する。第２の検出器１８には試料２の非共焦点像が結像する。第２の検出器１８は、試料２の非共焦点像の画像信号を出力する。

コントローラ２９の画像処理部２９ａは、第１の検出器１７から出力された画像信号を入力すると共に、第２の検出器１８から出力された画像信号を入力する。

画像処理部２９ａは、第１の検出器１７の出力信号を画像処理して明視野観察での試料２の共焦点画像を取得する。これと共に画像処理部２９ａは、第２の検出器１８の出力信号を画像処理して明視野観察での試料２の非共焦点画像を取得する。

画像処理部２９ａは、共焦点画像データと非共焦点画像データとをそれぞれ画像メモリ２９ｃに保存する。これと共に、画像処理部２９ａは、共焦点画像データと非共焦点画像データとをそれぞれモニタ３０に表示する。

暗視野観察は、次のように行われる。

レーザ光学系による試料２の明視野観察中に明・暗視野切換キューブ２３の切り換えが行われる。暗視野用環状ミラー２５が明視野用プリズム２４に変って第２の光軸Ｌ₂上に配置される。光路切替えセンサ２６は、暗視野用環状ミラー２５が第２の光軸Ｌ₂上に配置されたことを検出し、その切替え信号を出力する。

レーザビーム遮光部２９ｂは、光路切替えセンサ２６から出力された切替え信号を入力し、暗視野用環状ミラー２５が第２の光軸Ｌ₂上に配置されたことを検出すると、レーザ出力用電源からレーザ光源４への電力供給を遮断する。上記の通りレーザ出力用電源からレーザ光源４への電力供給を遮断は、半導体を用いないリレー回路、例えばシーケンス回路を用いる。これにより、レーザビームは、レーザ光学系に導入されない。

シャッタ３１がレーザ光源４と光スキャナ７との間の第３の光軸Ｌ₃に設けられている場合、レーザビーム遮光部２９ｂは、暗視野用環状ミラー２５が第２の光軸Ｌ₂上に配置されたことを検出すると、シャッタ３１に対して電源供給を遮断する。これにより、シャッタ３１は、閉じる。レーザビームは、レーザ光学系に導入されない。

この結果、試料２に対する不必要なレーザビームの照射が防止される。

次に、光学顕微鏡の光学系を用いた明視野観察は、次のように行われる。

明・暗視野切換キューブ２３は、図２に示すように明視野用プリズム２４を第２の光軸Ｌ₂上に配置する。レーザ光源４は、レーザビームの出力動作を停止する。又はシャッタ３１は、閉じる。これにより、レーザ光源４から出力されるレーザビームは、シャッタ３１により遮光される。

白色光源１９は、白色光の照明光を出力する。この照明光は、各レンズ２１、２２を通って図２に示す明視野用プリズム２４に入射する。照明光は、明視野用プリズム２４で下方に反射され、対物レンズ１２を通して試料２上に照射される。

試料２で反射した第２の測定光は、対物レンズ１２、明視野用プリズム２４、結像レンズ１１、第１のビームスプリッタ１０、フィールドレンズ２７を通ってＣＣＤカメラ２８の撮像面２８ａに結像される。ＣＣＤカメラ２８は、撮像面２８ａ上に結像された試料２の像を撮像してその画像信号を出力する。

コントローラ２９の画像処理部２９ａは、ＣＣＤカメラ２８から出力された画像信号を入力する。画像処理部２９ａは、ＣＣＤカメラ２８から出力された画像信号を画像処理して明視野観察での試料２の非共焦点画像を取得する。画像処理部２９ａは、取得した非共焦点画像を画像メモリ２９ｃに保存する。これと共に画像処理部２９ａは、非共焦点画像をモニタ３０に表示する。

次に、光学顕微鏡の光学系を用いた暗視野観察は、次のように行われる。

明・暗視野切換キューブ２３は、明視野用プリズム２４を第２の光軸Ｌ₂上から外し、暗視野用環状ミラー２５を第２の光軸Ｌ₂上に配置する。白色光源１９から出力された照明光は、上記同様に、各レンズ２１、２２を通って暗視野用環状ミラー２５に入射する。

暗視野用環状ミラー２５は、入射した照明光をリング状に整形して下方に反射する。偏光されたリング状の照明光は、対物レンズ１２を通して試料２上に照射される。なお、暗視野観察において対物レンズ１２は、暗視野用のものである。

試料２で反射した第２の測定光は、上記同様に、対物レンズ１２、暗視野用環状ミラー２５の開口部、結像レンズ１１、第１のビームスプリッタ１０、フィールドレンズ２７を通ってＣＣＤカメラ２８の撮像面２８ａに結像される。ＣＣＤカメラ２８は、撮像面２８ａ上に結像された試料２の像を撮像してその画像信号を出力する。

コントローラ２９の画像処理部２９ａは、ＣＣＤカメラ２８から出力された画像信号を入力する。画像処理部２９ａは、ＣＣＤカメラ２８から出力された画像信号を画像処理して暗視野観察での試料２の非共焦点画像を取得する。画像処理部２９ａは、上記同様に、取得した非共焦点画像データを画像メモリ２９ｃに保存し、かつモニタ３０に表示する。

このように上記第１の実施の形態によれば、共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系の光軸Ｌ₂に対して、明・暗視野切換キューブ２３を用いて光学顕微鏡用の明視野用プリズム２４と暗視野用環状ミラー２５とを挿脱可能に設けた。

これにより、共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系による試料２の共焦点画像と非共焦点画像とが取得できる。さらに、光学顕微鏡による明視野観察と暗視野観察とが可能である。従って、明視野観察で試料２の非共焦点画像が取得できる。暗視野観察で試料２の非共焦点画像が取得できる。

レーザ光学系による試料２の観察中に、暗視野用環状ミラー２５を第２の光軸Ｌ₂上に配置した場合、レーザ光源４のレーザビームの出力動作を停止するか、又はレーザ光源４

から出力されるレーザビームをシャッタ３１により遮光する。試料２に対して規定値以上の出力のレーザビームを照射することが防止できる。

１／４波長板９は、第１のビームスプリッタ１０と偏光ビームスプリッタ６との間の第３の光軸Ｌ₃上において出来るだけ対物レンズ１２側でかつ第２の光軸Ｌ₂に入らない位置に設けられる。１／４波長板９の配置位置は、レーザ光学系への各光学素子からの迷光を低減させると共に対物レンズ１２、明視野用プリズム２４、結像レンズ１１、第１のビームスプリッタ１０、フィールドレンズ２７及びＣＣＤカメラ２８からなるＣＣＤカメラ撮像系の偏光特性に影響を与えない。

次に、本発明の第２の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

図３は共焦点レーザスキャニング顕微鏡の構成図である。レーザ顕微鏡本体３には、微分干渉プリズム（Differential Interfererxe Cortrast：以下、ＤＩＣプリズムと称する）挿入穴４１が設けられている。ＤＩＣプリズム挿入穴４１は、対物レンズ１２と明・暗視野切換キューブ２３との間の第２の光軸Ｌ₂上に設けられている。具体的に説明すれば、ＤＩＣプリズム挿入穴４１は、対物レンズ１２と明視野用プリズム２４との間の第２の光軸Ｌ₂上に設けられている。ＤＩＣプリズム挿入穴４１は、ＤＩＣプリズム４０が挿脱される。

具体的にＤＩＣプリズム４０は、例えばＤＩＣプリズム用スライダに取り付けられている。ＤＩＣプリズム用スライダは、ＤＩＣプリズム挿入穴４１内に挿脱される。これにより、ＤＩＣプリズム４０は、第２の光軸Ｌ₂上に設けられる。

レーザ顕微鏡本体３には、アナライザ挿入穴４３が設けられている。アナライザ挿入穴４３は、結像レンズ１１と明視野用プリズム２４との間の第２の光軸Ｌ₂上に設けられている。アナライザ挿入穴４３は、アナライザ４２が挿脱される。

具体的にアナライザ４２は、例えばアナライザ用スライダに取り付けられている。アナライザ用スライダは、アナライザ挿入穴４３に挿脱される。これにより、アナライザ４２は、第２の光軸Ｌ₂上に設けられる。

レーザ顕微鏡本体３には、ポラライザ挿入穴４５が設けられている。ポラライザ挿入穴４５は、レンズ２２と明視野用プリズム２４との間の第１の光軸Ｌ₁上に設けられている。ポラライザ挿入穴４５には、ポラライザ４４が挿脱される。

具体的にポラライザ４４は、例えばポラライザ用スライダに取り付けられている。ポラライザ用スライダは、ポラライザ挿入穴４５に挿脱される。これにより、ポラライザ４４は、第１の光軸Ｌ₁上に設けられる。

１／４波長板９は、第１のビームスプリッタ１０と偏光ビームスプリッタ６との間の第３の光軸Ｌ₃上において出来るだけ対物レンズ１２側でかつ第２の光軸Ｌ₂に入らない位置に設けられる。１／４波長板９の配置位置は、レーザ光学系への各光学素子からの迷光を低減させると共に、対物レンズ１２、明視野用プリズム２４、結像レンズ１１、第１のビームスプリッタ１０、フィールドレンズ２７及びＣＣＤカメラ２８からなるＣＣＤカメラ撮像系の偏光特性に影響を与えない。

なお、第１のビームスプリッタ１０及び明視野用プリズム２４は、それぞれ偏光特性を持っていない。

レーザ光学系を用いた明視野観察において、ＤＩＣプリズム４０は、ＤＩＣプリズム挿入穴４１から取り外される。アナライザ４２は、アナライザ挿入穴４３から取り外される。ポラライザ４４は、ポラライザ挿入穴４５から取り外しても、外さなくてもよい。

このようにＤＩＣプリズム４０及びアナライザ４２が第２の光軸Ｌ₂上から外され、ポラライザ４４が第１の光軸Ｌ₁上から外されると、レーザ光学系は、図１に示す上記第１の実施の形態におけるレーザ光学系の構成と同一になる。従って、レーザ光学系による試料２の共焦点画像及び非共焦点画像の取得動作は、上記第１の実施の形態と同一となり、その説明は省略する。

光学顕微鏡の光学系を用いた明視野観察及び暗視野観察は、次のように行われる。

光学顕微鏡の光学系を用いた明視野観察及び暗視野観察においても、ＤＩＣプリズム４０は、ＤＩＣプリズム挿入穴４１から取り外される。アナライザ４２は、アナライザ挿入穴４３から取り外される。ポラライザ４４は、ポラライザ挿入穴４５から取り外される。

このようにＤＩＣプリズム４０及びアナライザ４２が第２の光軸Ｌ₂上から外され、ポラライザ４４が第１の光軸Ｌ₁上から外されると、光学顕微鏡の光学系は、図１に示す上記第１の実施の形態における光学顕微鏡の光学系の構成と同一になる。従って、光学顕微鏡の光学系による試料２の非共焦点画像の取得動作は、上記第１の実施の形態と同一となり、その説明は省略する。

次に、光学顕微鏡の光学系を用いた明視野での微分干渉観察は、次のように行われる。

光学顕微鏡の光学系を用いた微分干渉観察において、ＤＩＣプリズム４０は、ＤＩＣプリズム挿入穴４１内に挿入される。アナライザ４２は、アナライザ挿入穴４３内に挿入される。ポラライザ４４は、ポラライザ挿入穴４５内に挿入される。

明・暗視野切換キューブ２３は、明視野用プリズム２４を第２の光軸Ｌ₂上に配置する。

白色光源１９から出力された白色光の照明光は、各レンズ２１、２２からポラライザ４４を通って明視野用プリズム２４に入射する。照明光は、明視野用プリズム２４で下方に反射され、ＤＩＣプリズム４０、対物レンズ１２を通して試料２上に照射される。

試料２で反射した第２の測定光は、対物レンズ１２、ＤＩＣプリズム４０、明視野用プリズム２４、アナライザ４２、結像レンズ１１、第１のビームスプリッタ１０、フィールドレンズ２７を通ってＣＣＤカメラ２８の撮像面２８ａに結像される。ＣＣＤカメラ２８は、撮像面２８ａ上に結像された試料２の像を撮像してその画像信号を出力する。

画像処理部２９ａは、ＣＣＤカメラ２８から出力された画像信号を入力する。画像処理部２９ａは、ＣＣＤカメラ２８から出力された画像信号を画像処理して明視野観察での試料２の微分干渉画像を取得する。画像処理部２９ａは、取得した微分干渉画像データを画像メモリ２９ｃに保存し、かつモニタ３０に表示する。

次に、光学顕微鏡の光学系を用いた明視野での試料２の簡易偏光観察は、次のように行われる。

光学顕微鏡の光学系を用いた明視野での簡易偏光観察において、アナライザ４２は、アナライザ挿入穴４３内に挿入される。ポラライザ４４は、ポラライザ挿入穴４５内に挿入される。ＤＩＣプリズム４０は、ＤＩＣプリズム挿入穴４１から取り外される。

白色光源１９から出力された白色光の照明光は、各レンズ２１、２２からポラライザ４４を通って明視野用プリズム２４に入射する。照明光は、明視野用プリズム２４で下方に反射され、対物レンズ１２を通して試料２上に照射される。

試料２で反射した第２の測定光は、対物レンズ１２、明視野用プリズム２４、アナライザ４２、結像レンズ１１、第１のビームスプリッタ１０、フィールドレンズ２７を通ってＣＣＤカメラ２８の撮像面２８ａに結像される。ＣＣＤカメラ２８は、撮像面２８ａ上に結像された試料２の像を撮像してその画像信号を出力する。

画像処理部２９ａは、ＣＣＤカメラ２８から出力された画像信号を入力する。画像処理部２９ａは、ＣＣＤカメラ２８から出力された画像信号を画像処理して明視野観察での試料２の簡易偏光画像を取得する。画像処理部２９ａは、取得した簡易偏光画像データを画像メモリ２９ｃに保存し、かつモニタ３０に表示する。

次に、共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系を用いたレーザ微分干渉観察は、次のように行われる。

レーザ微分干渉観察において、ＤＩＣプリズム４０は、ＤＩＣプリズム挿入穴４１に挿入される。アナライザ４２は、アナライザ挿入穴４３から取り外される。このとき、ポラライザ４４は、ポラライザ挿入穴４５から取り外してもよいし、外さなくてもよい。

レーザ光源４から出力されたレーザビームは、レンズ５、偏光ビームスプリッタ６を通って光スキャナ７に入射する。光スキャナ７は、入射したレーザビームを試料２上に対してＸＹ平面上にスキャンする。スキャンされたレーザビームは、瞳投影レンズ８により集光され、１／４波長板９を透過する。レーザ光源４から出力されたレーザビームがＰ偏光であれば、１／４波長板９を透過すると、円偏光に変換される。

１／４波長板９を透過したレーザビームは、第１のビームスプリッタ１０で下方に反射され、結像レンズ１１、ＤＩＣプリズム４０、明視野用プリズム２４、対物レンズ１２を通して試料２上にスキャンされる。

試料２で反射した第１の測定光は、試料２へのレーザビームの照射光路とは逆の光路、すなわち対物レンズ１２、ＤＩＣプリズム４０、明視野用プリズム２４、結像レンズ１１、第１のビームスプリッタ１０、１／４波長板９、瞳投影レンズ８、光スキャナ７を通って偏光ビームスプリッタ６に入射する。

第１の測定光は、１／４波長板９を透過し、偏光ビームスプリッタ６により結像レンズ１４側に反射する。反射された第１の測定光は、結像レンズ１４を通ってビームスプリッタ１５に入射し、２方向に分岐される。

ビームスプリッタ１５により分岐された一方の第１の測定光は、共焦点用ピンホール１６を通って第１の検出器１７に入射する。第１の検出器１７には試料２の共焦点微分干渉像が結像する。第１の検出器１７は、試料２の共焦点微分干渉像の画像信号を出力する。

ビームスプリッタ１５により分岐された他方の第１の測定光は、第２の検出器１８に入射する。第２の検出器１８には試料２の非共焦点微分干渉像が結像する。第２の検出器１８は、試料２の非共焦点微分干渉像の画像信号を出力する。

画像処理部２９ａは、第１の検出器１７の出力信号を画像処理して明視野観察での試料２の共焦点微分干渉画像を取得する。これと共に画像処理部２９ａは、第２の検出器１８の出力信号を画像処理して明視野観察での試料２の非共焦点微分干渉画像を取得する。

画像処理部２９ａは、共焦点微分干渉画像データと非共焦点微分干渉画像データとをそれぞれ画像メモリ２９ｃに保存し、かつ共焦点微分干渉画像データと非共焦点微分干渉画像データとをそれぞれモニタ３０に表示する。

このように上記第２の実施の形態によれば、共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系の光軸Ｌ₂に対してＤＩＣプリズム４０及びアナライザ４２を挿脱可能にすると共に、光学顕微鏡の光学系の光軸Ｌ₃に対してポラライザ４４を挿脱可能にした。

これにより、共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系を用いた試料２の共焦点画像及び非共焦点画像が取得できる。

光学顕微鏡の光学系を用いて以下の各画像が取得できる。すなわち、明視野観察による試料２の非共焦点画像が取得できる。暗視野観察による試料２の非共焦点画像が取得できる。明視野観察による試料２の微分干渉画像が取得できる。

アナライザ４２及びポラライザ４４を挿入し、ＤＩＣプリズム４０を取り外せば、試料２の簡易偏光画像が取得できる。試料２の簡易偏光画像は、明視野で取得できる。

ＤＩＣプリズム４０を挿入し、アナライザ４２及びポラライザ４４を取り外すので、レーザ光学系を用いて明視野観察での試料２の共焦点微分干渉画像及び非共焦点微分干渉画像が取得できる。これら共焦点微分干渉画像及び非共焦点微分干渉画像は、通常の共焦点画像、非共焦点画像に比べて細かい凹凸形状を観察するに有効である。

共焦点レーザスキャニング顕微鏡用の１／４波長板９は、出来るだけ対物レンズ９に近く、かつＣＣＤカメラ撮像系の光学系でない位置に設けた。これにより、レーザ光学系への各光学素子からの迷光を低減させると共に、効率がよく、かつＣＣＤカメラ撮像系の偏光特性に影響を与えることはない。

次に、本発明の第３の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図３と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

図４は共焦点レーザスキャニング顕微鏡の構成図である。第２の光軸Ｌ₂上には、結像レンズ５０が設けられている。結像レンズ５０は、第１のビームスプリッタ１０とアナライザ挿入穴４３との間の第２の光軸Ｌ₂上に設けられている。

第２の光軸Ｌ₂上には、第１のフィールドレンズ５１が設けられている。第１のフィールドレンズ５１は、第１のビームスプリッタ１０とＣＣＤカメラ２８との間の第２の光軸Ｌ₂上に設けられている。

第１のフィールドレンズ５１は、結像レンズ５０と合わせた後ろ側焦点距離を短くする。第１のフィールドレンズ５１は、例えば複数の光学レンズを組み合わせたレンズ群からなる。

瞳投影レンズ５２及び第２のフィールドレンズ５３が光スキャナ７と１／４波長板９との間の第３の光軸Ｌ₃上に設けられている。第２のフィールドレンズ５３は、結像レンズ５０及び瞳投影レンズ５２と合わせた後ろ側焦点距離を短くする。第２のフィールドレンズ５３は、例えば複数の光学レンズを組み合わせたレンズ群からなる。

第１のフィールドレンズ５１と結像レンズ５０とを組み合わせたときのＣＣＤカメラ２８の撮像面２８ａ上の非共焦点画像の視野の大きさと、第２のフィールドレンズ５３と結像レンズ５０及び瞳投影レンズ５２とを組み合わせたときの第１の検出器１７上の共焦点画像の視野の大きさとは、同一である。

このような上記第３の実施の形態であれば、第１のフィールドレンズ５１を設けることによって第１のフィールドレンズ５１と結像レンズ５０とを合わせた後ろ側焦点距離を短くできる。第２のフィールドレンズ５３を設けることによって第２のフィールドレンズ５３と結像レンズ５０及び瞳投影レンズ５２とを合わせた後ろ側焦点距離を短くできる。

これによって共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系及びＣＣＤカメラ撮像系の各光路長を短くでき、レーザ顕微鏡本体３の小型化を実現できる。

第１のフィールドレンズ５１及び第２のフィールドレンズ５３は、それぞれただ単に第２の光軸Ｌ₂、第３の光軸Ｌ₃上に設けると、ＣＣＤカメラ２８の撮像面２８ａ上の非共焦点画像の第１の視野の大きさと、第１の検出器１７上の共焦点画像の第２の視野の大きさとを異ならせてしまう。しかるに、第１の視野と第２の視野との各大きさが同一になるような各焦点距離を有する第１のフィールドレンズ５１及び結像レンズ５０の組み合わせと、第２のフィールドレンズ５３、結像レンズ５０及び瞳投影レンズ５２の組み合わせとが行なわれる。

共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系による明視野観察は、ＤＩＣプリズム４０、アナライザ４２及びポラライザ４４をそれぞれＤＩＣプリズム挿入穴４１、アナライザ挿入穴４３及びポラライザ挿入穴４５から取り外す。

光学顕微鏡の光学系による明視野観察及び暗視野観察は、ＤＩＣプリズム４０、アナライザ４２及びポラライザ４４をそれぞれＤＩＣプリズム挿入穴４１、アナライザ挿入穴４３及びポラライザ挿入穴４５から取り外す。

このようにＤＩＣプリズム４０、アナライザ４２及びポラライザ４４を取り外すと、光学顕微鏡の光学系は、図１に示す上記第１の実施の形態における光学顕微鏡の光学系の構成と同一になる。従って、光学顕微鏡の光学系による試料２の非共焦点画像の取得動作は、上記第１の実施の形態と同一となり、その説明は省略する。

光学顕微鏡の光学系による微分干渉観察は、ＤＩＣプリズム４０、アナライザ４２及びポラライザ４４をそれぞれＤＩＣプリズム挿入穴４１、アナライザ挿入穴４３及びポラライザ挿入穴４５に挿入する。

このようにＤＩＣプリズム４０、アナライザ４２及びポラライザ４４を挿入すると、光学顕微鏡の光学系は、図２に示す上記第２の実施の形態における光学顕微鏡の光学系の構成と同一になる。従って、光学顕微鏡の光学系による試料２の微分干渉画像の取得動作は、上記第２の実施の形態と同一となり、その説明は省略する。

光学顕微鏡の光学系による試料２の簡易偏光観察は、アナライザ４２とポラライザ４４とをそれぞれアナライザ挿入穴４３とポラライザ挿入穴４５とに挿入し、ＤＩＣプリズム４０をＤＩＣプリズム挿入穴４１から取り外す。

このようにアナライザ４２及びポラライザ４４を挿入し、ＤＩＣプリズム４０を取り外すと、光学顕微鏡の光学系は、図２に示す上記第２の実施の形態における光学顕微鏡の光学系の構成と同一になる。従って、光学顕微鏡の光学系による試料２の簡易偏光画像の取得動作は、上記第２の実施の形態と同一となり、その説明は省略する。

レーザ微分干渉観察は、ＤＩＣプリズム４０を挿入し、アナライザ４２及びポラライザ４４を取り外す。このようにＤＩＣプリズム４０を挿入し、アナライザ４２及びポラライザ４４を取り外すと、レーザ光学系は、図２に示す上記第２の実施の形態におけるレーザ光学系の構成と同一になる。従って、レーザ光学系による試料２の共焦点微分干渉画像及び非共焦点微分干渉画像の取得動作は、上記第２の実施の形態と同一となり、その説明は省略する。

共焦点レーザスキャニング顕微鏡のレーザ光学系による試料２の観察中に、暗視野用環状ミラー２５を第２の光軸Ｌ₂上に配置した場合、レーザ光源４のレーザビームの出力動作を停止するか、又はレーザ光源４から出力されるレーザビームをシャッタ３１により遮光する。これにより、試料２に対して規定値以上の出力のレーザビームを照射することを防止できる。

なお、上記第１及び第２の実施の形態では、第２の光軸Ｌ₂に対して第３の光軸Ｌ₃を第１のビームスプリッタ１０を介して折り曲げて第２の光軸Ｌ₂に一致するようにしているが、第３の光軸Ｌ₃を折り曲げずに直線的な光軸に構成し、この第３の光軸Ｌ₃に対してフィールドレンズ２７及びＣＣＤカメラ２８からなる光軸を折り曲げて直線的な第３の光軸Ｌ₃に一致させるようにしてもよい。

次に、本発明の他の特徴とするところを説明する。

本発明は、試料を載置する試料台と、レーザ光を出力するレーザ光源と、任意の波長を有する照明光を出力する光源と、前記レーザ光源から出力された前記レーザ光を２次元的にスキャンする光スキャナと、前記光スキャナによりスキャンされた前記レーザ光を集光する瞳投影レンズと、前記瞳投影レンズにより集光された前記レーザ光を前記試料側に反射すると共に当該レーザ光を前記試料上に照射したときの前記試料からの前記第１の測定光を前記瞳投影レンズ、前記光スキャナ側に偏向し、かつ前記光源から出力された前記照明光を前記試料上に照射したときの前記試料からの前記第２の測定光を透過する第１のビームスプリッタと、前記第１のビームスプリッタにより偏向された前記レーザ光の光軸上に設けられた少なくとも結像レンズ及び対物レンズからなる照明・観察光学系と、前記光源から出力された前記照明光を前記照明・観察光学系に導入する明視野用プリズムと暗視野用環状ミラーとを有し、これら明視野用プリズムと前記暗視野用環状ミラーとを前記結像レンズと前記対物レンズとの間の光軸上に切り替えて挿脱可能とする明・暗視野切替えキューブと、前記明視野用プリズムと前記暗視野用環状ミラーとの前記照明・観察光学系の光軸上への挿脱を検出する切替えセンサと、前記切替えセンサにより前記暗視野用環状ミラーが前記照明・観察光学系の光軸上に挿入されたことを検出すると、前記レーザ光源のレーザ出力動作を停止、又は前記レーザ光源から出力されたレーザ光を遮光するレーザ光遮光部と、前記第１のビームスプリッタにより偏向されて前記瞳投影レンズから前記光スキャナを通った前記第１の測定光を分岐する偏光ビームスプリッタと、前記偏光ビームスプリッタにより分岐された前記第１の測定光の光路上に配置されたピンホールと、前記ピンホールを通過した前記第１の測定光を検出する検出器と、前記第１のビームスプリッタを透過した前記第２の測定光を撮像する撮像素子と、前記対物レンズと前記第１のビームスプリッタとの間の光軸上に挿脱可能な微分干渉プリズムと、前記結像レンズと前記第１のビームスプリッタとの間の光軸上に挿脱可能なアナライザと、前記光源と前記第１のビームスプリッタとの間の光軸上に挿脱可能なポラライザと、前記第２のビームスプリッタと前記偏光ビームスプリッタとの間の光軸上でかつ前記ビームスプリッタ側に配置され、前記レーザ光源から出力された前記レーザ光の波長を１／４波長位相シフトすると共に、前記試料からの前記第２の測定光の波長を１／４波長位相シフトする１／４波長板と、前記第２のビームスプリッタの透過光軸上に配置され、前記結像レンズと合わせた後ろ側焦点距離を短くする第１のフィールドレンズと、前記第２のビームスプリッタの偏向光軸上に配置され、前記瞳投影レンズ及び前記結像レンズと合わせた後ろ側焦点距離を短くする第２のフィールドレンズと、前記検出器の出力信号を処理して明視野観察、暗視野観察又は微分干渉観察での前記試料の共焦点画像を取得し、かつ前記撮像素子から出力される画像信号を処理して明視野観察、暗視野観察又は微分干渉観察での前記試料の非共焦点画像を取得する画像処理部とを具備し、
前記第１のフィールドレンズと前記結像レンズとの組み合わせによる前記撮像素子上の前記非共焦点画像の視野の大きさと前記第２のフィールドレンズと前記瞳投影レンズとの組み合わせによる前記検出器上の前記共焦点画像の視野の大きさとを同一にすることを特徴とする共焦点レーザ顕微鏡である。

本発明に係る共焦点レーザスキャニング顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図。同顕微鏡における明・暗視野切換キューブの構成図。本発明に係る共焦点レーザスキャニング顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図。本発明に係る共焦点レーザスキャニング顕微鏡の第３の実施の形態を示す構成図。

１：試料台、２：試料、３：レーザ顕微鏡本体、４：レーザ光源、５：レンズ、６：偏光ビームスプリッタ、７：光スキャナ、８：瞳投影レンズ、９：１／４波長板、１０：第１のビームスプリッタ、１１：結像レンズ、１２：対物レンズ、１３：レボルバ、１４：結像レンズ、１５：ビームスプリッタ、１６：共焦点用ピンホール、１７：第１の検出器、１８：第２の検出器、１９：白色光源、２０：光ファイバ、２１，２２：レンズ、２３：明・暗視野切換キューブ、２４：明視野用プリズム、２４ａ：明視野用プリズムの偏向面、２５：暗視野用環状ミラー、２６：光路切替えセンサ、２７：リレーレンズ、２８：ＣＣＤカメラ、２８ａ：ＣＣＤカメラの撮像面、２９：コントローラ、２９ａ：画像処理部、２９ｂ：レーザ光遮光部、２９ｃ：画像メモリ、３０：モニタ、３１：シャッタ、４０：微分干渉プリズム、４１：ＤＩＣプリズム挿入穴、４２：アナライザ、４３：アナライザ挿入穴、４４：ポラライザ、４５：ポラライザ挿入穴、５０：結像レンズ、５１：第１のフィールドレンズ、５２：瞳投影レンズ、５３：第２のフィールドレンズ。

Claims

レーザビームを出力するレーザ光源と、
前記レーザ光源から出力された前記レーザビームを試料に照射し、前記試料からの測定光を検出して前記試料の共焦点画像を取得するレーザ光学系と、
任意の波長を有する照明光を出射する光源と、
前記光源から出射された前記照明光を前記レーザ光学系に導入して前記試料に照射し、前記試料からの測定光を検出して前記試料の非共焦点画像を取得する光学顕微鏡光学系と、
前記光学顕微鏡光学系に配置された第１のフィールドレンズと、
前記レーザ光学系に配置された第２のフィールドレンズと、
を具備し、
前記第１及び第２のフィールドレンズは、前記非共焦点画像及び前記共焦点画像を結像する各後側焦点距離を短くする、
ことを特徴とする共焦点レーザスキャニング顕微鏡。
前記光学顕微鏡光学系と前記レーザ光学系の共通光軸上に配置された結像レンズと、前記レーザ光学系の光軸上に配置された瞳投影レンズとを備え、
前記第１のフィールドレンズは、前記結像レンズと合わせた前記非共焦点画像を結像する後側焦点距離を短くし、前記第２のフィールドレンズは、前記結像レンズ及び前記瞳投影レンズと合わせた前記共焦点画像を結像する後側焦点距離を短くすることを特徴とする請求項１記載の共焦点レーザスキャニング顕微鏡。
前記第１のフィールドレンズと前記結像レンズとを組み合わせたときの前記非共焦点画像の視野の大きさと、第２のフィールドレンズと前記結像レンズ及び前記瞳投影レンズとを組み合わせたときの前記共焦点画像の視野の大きさを同一にすることを特徴とする請求項２記載の共焦点レーザスキャニング顕微鏡。
前記照明光を前記レーザ光学系に導入する明視野用プリズムと、
前記照明光を環状に整形して前記レーザ光学系に導入する暗視野用環状ミラーと、
前記光源から出射された前記照明光を前記レーザ光学系に導入する位置に前記明視野用プリズムと前記暗視野用環状ミラーとを挿脱して切り替え配置する光学素子切換部と、
前記レーザ光学系及び前記光学顕微鏡光学系の光軸上にそれぞれ挿脱可能で、前記試料からの測定光を検出して前記試料の微分干渉画像を取得する微分干渉プリズム、アナライザ及びポラライザを有し、
前記微分干渉プリズム及び前記アナライザは、それぞれ前記レーザ光学系に挿脱され、
前記ポラライザは、前記光源から出射される前記照明光を前記レーザ光学系に導入する位置との間の光軸上に挿脱される、
ことを特徴とする請求項１記載の共焦点レーザスキャニング顕微鏡。
前記レーザ光学系と前記光学顕微鏡光学系との分岐点に配置され、前記レーザ光学系と前記光学顕微鏡光学系とを分離するビームスプリッタと、
前記レーザ光源から出力される前記レーザビームの光軸上に配置された偏光ビームスブリッタと、
前記レーザ光源から出力される前記レーザビームの波長を１／４波長位相シフトすると共に、前記試料からの前記測定光の波長を１／４波長位相シフトする１／４波長板とを有し、
前記１／４波長板は、前記ビームスプリッタと前記偏光ビームスプリッタとの間の光軸上に配置される、
ことを特徴とする請求項１記載の共焦点レーザスキャニング顕微鏡。
前記ビームスプリッタは、偏光特性を有しないことを特徴とする請求項５記載の共焦点レーザスキャニング顕微鏡。