CN102866492A - 平衡检测共聚焦显微镜成像系统及其三维影像重建方法 - Google Patents

Abstract

一种平衡检测共聚焦显微镜成像系统其三维影像重建方法，包含:光源；光束放大器；聚焦机构；扫瞄机构；等量分束器，将反射光束分成两等量光束；大面积光检测器接收来自该等量分束器的一道光束，并测得使光束的信号强度；针孔接收来自该等量分束器的另一道光束；光束倍增管接收来自该针孔的信号，并测得此信号的强度；处理器，接收来自该光束倍增管及该大面积光检测器所检测的信号的信号强度，并经过校准的程序以得到校准后的反射信号强度；并应用在不同的轴向深度处的不同截面上所得到信号强度，重建该样品的影像。使用三阶非线性拟合，可增加可应用的动态范围。且经由消除光源中的功率的变动，平衡的检测可以改进轴向的分辨率。

Description

平衡检测共聚焦显微镜成像系统及其三维影像重建方法

技术领域

本发明的领域属于立体影像重建，尤其是有关于一种平衡检测共聚焦显微镜(confocal microscope) 成像系统及其三维影像重建方法。

背景技术

共聚焦显微镜 早在1957年即为Marvin Minskey所提出，并于1961年获得专利。早先由于没有高功率的空间相干光源（spatial coherent light source），所以共聚焦显微镜 并无法善加应用。只是在激光技术产生后，此一现像才被改进。

共聚焦显微镜的信号光源主要为激光器或荧光(fluorescence)。由一高数值孔径(numerical aperture) 的聚焦装置搜集信号光且应用一光检测器进行检测。在聚焦深度外部的光将被光检测器之前的一针孔(pinhole)阻挡住。因为聚焦深度外部的光无法被光检测器所检测到，所以共聚焦显微镜具有深度辨识的能力。共聚焦显微镜的反射强度相对于轴向深度为一sinc square的曲线，且深度的分辨率为此曲线该最大值之半的全宽(full width at half maximum of this curve)。在可见光的范为内，其约为300纳米，而侧向的分辨率为入射的激光束的散射能力所限制，其最高值约为200纳米。

应用共聚焦显微镜在不同的轴向深度处作二维的扫瞄可以重建一扫瞄物件的三维影像。因为传统上使用的共聚焦显微镜无法对高速变动的物件进行实时的扫瞄，所以也无法进行实时进行三维成像。

共聚焦显微镜使用高NA物镜以使得照明的点距相当的紧密，而且在光检测器前方的光共轭平面中的针孔(pinhole)可以消除焦点外的信号。当来自聚焦深度外的光将被在该光检测器前方的针孔（pinhole）所阻档。共聚焦显微镜 具有深度辨识的能力，所以可以是一项理想的表面轮廓量测计.  

传统的共聚焦显微镜中，将一样本对位于该焦点上，且在轴方向进行平面扫描，再堆栈这些平面影像，可以得到三维影像。但是此过程必需精密的控制不同位的图像（sectioning image）的轴向位置，及影像重建的时间。因此传统的共聚焦显微镜 不适于检测高速三维变动的形态及对为微观处理的实时检测。

美国专利USP5,804,813(J.-P. Wang and C.-H Lee, “Differential 共聚焦显微镜”)中提出一种可实时检测变动物体的三维影像的方法， 该专利应用differential 共聚焦显微镜，其中使用共聚焦显微镜的轴响应曲线(axial response curve)中的线性区段以使得深度方向的分辨率可以达到最大。已证明此一方式可以克服传统的共聚焦显微镜 的限制。差动共聚焦显微镜(differential confocal microscope)可以使得在深度方向的分辨率高于20纳米，且可以操作在一开回路的组态(open loop configuration)下，而大大增加成像速度。因此可以达到实时的三维surface 成像。

但是此一方法的动态范围(dynamic range)不够大，所以当物件瞬时的变化较大时，所得到的三维影像相当的模糊。其次，此一方法并未考虑表面反射或荧光效应的差异所造成重建影样上的错误。此外，目前此技术的轴向分辨率主要受限于光源功率的变动。

本发明的目的即在解决此一现有技术的困难点，利用三阶（three order）非线性拟合来增加其动态范围，利用平衡检测来消除光源功率变动的影响进而提高轴向分辨率和解决表面反射或荧光效应的差异所造成重建影样上的错误，以得到更佳的影像效果。

发明内容

本发明的目的为提出一种平衡检测的共聚焦显微镜成像系统及其三维影像重建方法，其中本发明使用非线性拟合(fitting)，可以增加可应用的动态范围。本发明中消除光源中的功率的变动。应用平衡检测可以改进轴向的分辨率。

为达到上述目的，本发明的一种平衡侦测的共聚焦显微镜成像系统包含：一光源；一光束放大器接收来自该光源的光束并经散射后放大该光束的截面； 一聚焦机构，用于聚焦通过该光束放大器的光，以将在光束聚焦到一待测样品上；一扫瞄机构，可以调整该聚焦机构相对于该样品的轴向深度，并在不同深度处的样品平面上的移动，以使得该光束在不同的样品点上聚焦后并产生反射光束；一等量分束器，将反射光束分成两等量光束；一大面积光检测器接收来自该等量分束器的一道光束，并测得使光束的信号强度；一针孔接收来自该等量分束器的另一道光束；一光束倍增管接收来自该针孔的信号，并测得此信号的强度；一处理器，接收来自该光束倍增管及该大面积光检测器所检测的信号的信号强度，并经过校准的程序以得到校准后的反射信号强度；并应用在不同的轴向深度处的不同截面上所得到信号强度，重建该样品的影像。

进一步的，其尚包含：

一控制器用于控制该二维扫描光学装置及该物镜的位置以使得该二维扫描光学装置及该物镜可以沿着轴向进行不同轴向点处的二维扫瞄；一存储器用于记录相关资料，其中包含来自该大面积光检测器及该光束倍增管的信号值，该二维扫描光学装置及该PZT驱动的物镜的相对位置及坐标。

进一步的，其尚包含一导光装置用于导引该截面放大的光束进入该扫瞄机构，且导引该反射光束进入该分束器，其中的导光机构包含：一极化分束器(polarization beamsplitter)位于该光束放大器的后方，主要是由两介电系数不同的棱镜所构成；利用介电系数的不同，使得当光束从第一面射入时可以直接穿过该分束器，反之当光从第二面射入时，碰到第一面的边界处将使得入射在该边界处产生全反射；一四分之一波长光板(quarter wave plate)为在该极化分束器该后方，该四分之一波长光板包含反向的第一端及第二端，使得进入第一端的入射光及从第二端通过的反射光之间的极性相差90度，所以反射光束再如第二端进入该极化分束器之两棱镜的界面时会被反射，而不会穿过该界面。

进一步的，该扫瞄机构为一二维扫描光学装置，其包含一镜面，且可以由一驱动装置驱动，应用该二维扫描光学装置的移动可以改变入射光反射后的路径，所以该反射后的光束可以扫瞄过一照射物体。

该聚焦机构为一PZT驱动的物镜，可以随者该二维扫描光学装置的位置改变而改变此PZT驱动的物镜使得该PZT驱动的物镜对准由该二维扫描光学装置反射的光线。

该光源为线性极化光源。

本发明另提供一种应用成像系统进行三维影像重建的方法，其包含步骤为：

由该光源发射一光束，该光束经过一光束放大器将该光束的截面放大；

经该极化分束器后的光束入射一二维扫描光学装置，必经由该二维扫描光学装置的镜面反射，改变的光束的行进方向；

由一驱动装置驱动该二维扫描光学装置以改变入射光束后的路径；

将经过该二维扫描光学装置的光束投射向一物镜；其中，该物镜可以随着该二维扫描光学装置的位置改变而改变其轴向深度，及在垂直于此轴向深度之平面上的位置，使得该物镜对准由该二维扫描光学装置所传送过来的光束；

反射光束经过该等量分束器后分成两等量的光束；

其中之一等量光束入射到一大面积光检测器，以检测到一信号功率；此信号功率的平均值表示在不同的轴向深度处的功率的平均值，其中已避免由于光源的不稳定所产生的功率不稳定； 

其中另一等量光束入射到该针孔后在入射到该光束倍增管以检测并放大该信号； 

将上述结果相关的资料储存起来，储存的资料包含来自该大面积光检测器及该光束倍增管的信号值，该二维扫描光学装置及该物镜的相对位置及坐标等等；并对该光束倍增管所得到的信号值进行校准；

调整该二维扫描光学装置及该物镜的相对位置后在同一轴向深度对方该样品进行二维扫描，并执行相同的作业以得到对应的数据；

然后改变该二维扫描光学装置及该PZT驱动的物镜的轴向深度，并重覆上述的步骤，对方该样品进行二维扫描，并执行相同的作业以得到对应的数据；以及

应用上述所得到的校准后的数据产生该样品的三维影像。

其中：

将该放大截面的光束通过一极化分束器及一四分之一波长光板；且由样品反射该光束经该PZT驱动的物镜后照射到一样品后，此光束经该样品反射，并经该二维扫描光学装置反射后以反方向入射该四分之一波长光板，并在该极化方束器上的两棱镜的界面处反射向该等量分束器。

该校准的步骤包含:在量测前，选定一基准点，在几μm的行程中，在样品及物镜之间的轴方向上不同的位置处将光束入射该样品；撷取自该光束倍增管所得到的信号，以得到不同轴向点的反射功率分布函数，其为近似sinc2 的曲线；由此曲线可以找到一工作点，即为sinc2 曲线之微分值为最大的一点；使用三阶非线性的fitting，在该工作点的附近得到一三阶(three order)的匹配曲线，其可匹配该轴向点功率分布函数；因此可以得到一较大的动态范围；以及记录该大面积光检测器所得到的光信号强度。

该二维扫瞄的步骤尚包含步骤为: 微调样品与物镜之间的距离到该工作点；在原先进行校准之点的附近进行二维扫瞄；每一扫瞄点所得到的反射光束经不同的镜面作用后由大面积光检测器及该光束倍增管撷取对应的信号；其中因为由该光束倍增管所得到的信号先经过该针孔的过滤，所以唯有在该工作点附近之深度处的信号才会被撷取；而由该大面积光检测器所得到的信号强度代表在该扫瞄点的反射信号的总强度；依据在扫瞄点及基准点所量测的反射信号总强度的差异，将由扫瞄点所得到的工作点的反射信号强度(即由光束倍增管所接收信号的强度)进行调整；修正轴向高度所产生的误差，先将扫瞄点所得到的工作点的反射信号强度(即由光束倍增管所接收信号的强度)除以在工作点的斜率即可得到轴向高度差(即扫瞄点与基准点)之间的高度差；应用此高度差找到在该3D拟合曲线上对应的点；应用此对应点与该工作点在该3D拟合曲线上对应的功率的比值修正由该工作点的反射信号强度(即由光束倍增管所接收信号的强度)，即将该工作点的反射信号强度乘上该比值，如此得到在该扫瞄点的反射功率，并记忆到一存储器中；对其它的扫瞄点进行同样的运算；如果发现某一扫瞄点的反射信号“总”强度(即来自大面积光检测器的信号强度)与其它点的偏差过大时，有可能是样品的结构产生很大的变异，则必须重新进行较准的工作。

可将由扫瞄点所得到的工作点的反射信号强度(即由光束倍增管所接收信号的强度)进行调整的方式将扫瞄点所得到的工作点的反射信号强度x 扫瞄点B的反射信号总强度/基准点的反射信号总强度。

可应用压电转换器(PZT)驱动该物镜。

由下文的说明可更进一步了解本发明的特征及其优点，阅读时并请参考附图。

附图说明

图1为应用共聚焦显微镜在不同的轴向点位置处，所得到的功率分布。

图2为在本发明的元件方块图。

图3-1为现有技术的一阶拟合的模拟结果。

图3-2示本发明的三阶拟合的模拟结果。

图4显示本发明的模拟结果。

其中图4-1表示样品的纵剖面；图4-2表示由光束倍增管9所得到的二维影像。为符合实际操作情形，我们在影像中加入了光源功率变动(噪声)以及表面反射的差异(上下半部影像强度不同)；图4-3表示由差动共聚焦显微镜对该样品的重建之影像的剖面图；图4-4表示由本发明之平衡共聚焦显微镜对该样品的重建之影像的剖面图；4-4表示应用本发明的结果所得到的影像。

具体实施方式

兹谨就本发明的结构组成，及所能产生的功效与优点，配合附图，举本发明之一较佳实施例详细说明如下。

本发明运作的原理: 

图1中显示的是应用共聚焦显微镜，在不同的轴向点位置处，所得到的功率分布，其中显示的功率相对于轴向点呈 sinc2 曲线的分布，其最大点处对应到物镜的焦点。虽然在焦点处可以得到最大的信号值。但对于该sinc2曲线取微分后得到其微分曲线，可以发现功率最大点处的微分值为零。亦即在此位置，共聚焦信号对于样品的位移并不敏感。反之，差动共聚焦显微镜的概念即在于将工作点置于sinc2 曲线中微分值最大的一点，而不是在焦点。此工作点的意义为当我们在此点进行量测时，即使样品位置仅有微小的偏移，也能造成极大的信号变化。

本发明是对于此现有技术提出更进一步的改进，其中本发明应用三阶的非线性拟合增加量测的动态范围，使得本发明中的差动共聚焦显微镜可以用于量测较厚的样品。另外，本发明应用平衡检测来消除光源功率变动的影响进而提高轴向分辨率和解决表面反射或荧光效应的差异所造成重建影样上的错误，以得到更佳的影像效果。

图2显示在本文中所提出的“平衡检测差动共聚焦显微镜(balanced detection differential confocal microscope)共聚焦显微镜”的较佳实施例。与现有的技术比较下，本发明有两项显著的改进，第一项为本发明应用非线性的拟合(nonlinear fitting)，所以使得动态范围增加；另外，本发明中使用平衡检测(balance detection)经由消除光源的不稳定而改进轴向分辨率。已知差动共聚焦显微镜 在深度方向的分辨率为系统的噪声所限制，其中噪声主要是来自光源中光能的不稳定(fluctuation)所致。因此，由本发明中所提出的平衡检测以去除噪声将有效的改进轴向分辨率。此外，也可以消除(表面形态)中的分歧，其主要是源自于表面反射或荧光效应中的差异。

图2中显示本发明的组件的安装结构。其中本发明包含下列元件: 

一线性极化光源1，可放出线性的极化光。

一光束放大器(beam expander)2接收来自该线性极化光源1的光束并将该光束发散以增加散射截面。本例中该光束放大器由一凹透镜及一凸透镜所形成。其中该凹透镜的作用在于将入射的光束发散，以增加光束面积，该凸透镜的作用是接收来自该凹透镜的散射光后聚焦后成为平行光束，以便于后段的光信号处理。

一极化分束器(polarization beamsplitter)3主要是由两介电系数不同的棱镜所构成。利用介电系数的不同，使得当平行极化的光束入射时可以直接穿过该分束器，反之当垂直极化的光束入射时，碰到该第二面与该第一面的边界处将使得入射光在的边界处产生全反射。此装置在现有技术中已熟知，所以不再赘述其细节。

一四分之一波长光板(quarter wave plate) 4，其目的在于使得进入第一端的入射光及从反向的第二端通过的反射光之间的极性相差90度，所以反射光束再由该极化方束器3的第二端进入该极化分束器3的两棱镜的界面时会被反射，而不会穿过该界面。

一二维扫描光学装置5，基本上此二维扫描光学装置5为一镜面，且可以由一驱动装置(图中没有显示，此为现有技术中所熟知的)驱动，应用该二维扫描光学装置5的移动可以改变入射光在该镜面反射后的路径，所以该反射后的光束可以扫瞄过一照射物体。

一PZT(压电转移，piezoelectric transfer)驱动的物镜6，可以随者该二维扫描光学装置5的位置改变而改变此PZT驱动的物镜6使得该PZT驱动的物镜6对准由该二维扫描光学装置5反射的光线。此动作是有一计算机进行精密的控制，以在一二维的平面上对该样品进行精细的扫描。并可以沿着该物镜6的轴向(垂直物镜的镜面)改变深度。经由在不同的轴向深度处进行二维平面扫描可以建立三维的扫描结果。

当由该二维扫描光学装置5反射的光线入射该PZT驱动的物镜6时，将为该物镜6所聚焦，然后入射到样本20。此入射光束在该样本不同深度处将产生不同的反射光，这些反射光形成反射光束并沿着入射光路径的反方向入射该二维扫描光学装置5。随后由该二维扫描光学装置5反射后穿过该四分之一波长光板 4 入射该极化分束器(polarization beamsplitter)3，并在两棱镜的交界处产生反射。

一等量分束器7(50/50 beamsplitter), 反射光束在此等量的分束器7后分成两束等量的光束并沿着不同的方向行进。

一大面积光检测器(large area photo detector) 10接收来自该等量分束器7的一道光束并检测其能量。

一针孔8接收来自该等量分束器7的另一道光束。

一光束倍增管9接收来自该针孔8的光束的信号。

一处理器11，接收来自该光束倍增管9及该大面积光检测器10的信号，并进行与本发明相关的运算。

一控制器12用于控制该二维扫描光学装置5及该PZT驱动物镜6的位置以使得该二维扫描光学装置5及该PZT驱动物镜6可以沿着轴向进行不同轴向点处的二维扫瞄。

一存储器13用于记录与本发明相关的资料，如储存的资料包含来自该大面积光检测器10及该光束倍增管9的信号值，该二维扫描光学装置5及该PZT驱动的物镜6的相对位置及坐标等等。

一显示器14用于显示与本发明相关的资料及处理结果。

下文中说明本发明之装置的操作如下: 

由线性极化光源1发射一光束，该光束经过光束放大器一将该光束的截面放大；

将该放大截面的光束经极化分束器3；由于此处该光束尚未经过四分之一波长光板，其极化仍然为平行方向，因此得完全通过极化分束器3；

经极化分束器后的光束入射一二维扫描光学装置5，必经由该二维扫描光学装置5的镜面反射，改变的光束的行进方向；

由一驱动装置(图中没有显示，此为现有技术中所熟知的)驱动，应用该二维扫描光学装置5的移动可以改变入射光的路径，以使得该入射光束扫瞄过一样品。

将经过该二维扫描光学装置5投射向该PZT驱动的物镜6，

其中该PZT驱动的物镜6可以随者该二维扫描光学装置5的位置改变而改变此PZT驱动的物镜6使得该PZT驱动的物镜6对准由该二维扫描光学装置5反射的光线；

经该PZT驱动的物镜6后照射到一样品后，此光束经该样品反射，并经该二维扫描光学装置5及该四分之一波长光板 4，其极化改变为垂直方向，由反向入射该极化分束器3在该极化分束器3的两棱镜的界面处反射向一等量光束器7, 反射光束经此等量方束器7后分成两束等量的光束；

其中之一等量光束入射到一大面积光检测器10；以检测到一信号功率，此信号并没有经过空间滤波，此信号再经一类比数字转换器转换成数字信号；

所以当在同一时点下，此信号功率的平均值表示在不同的轴向深度处的功率的平均值，其可以避免由于光源 的不稳定所产生的功率震荡，所以由此大面积光检测器10所得到平均功率将用于作校准之用。

其中另一光束入射到一针孔8后再入射到一光束倍增管9以检测其光能并放大该信号；该放大的信号在经一类比数字转换器转换成数字信号；

将上述结果相关的资料储存起来，储存的资料包含来自该大面积光检测器10及该光束倍增管9的信号值，该二维扫描光学装置5及该PZT驱动的物镜6的相对位置及坐标等等；

调整该二维扫描光学装置5及该PZT驱动的物镜6的相对位置后在同一轴向深度对方该样品进行二维扫描，并执行相同的作业以得到对应的数据；

然后改变该二维扫描光学装置5及该PZT驱动的物镜6的轴向深度，并重覆上述的步骤，对方该样品进行二维扫描，并执行相同的作业以得到对应的数据；

应用上述所得到的数据产生该样品的三维影像。

本发明的校准方式说明如下: 

在量测前，先选定一基准点A，在几微米的行程中，在样品及PZT-驱动的物镜 6之间的轴方向上不同的位置处对该样品进行量测，并撷取自该光束倍增管9所得到的信号，以得到不同轴向点的反射功率分布函数，其为近似sinc2 的曲线(请参考图1)。由此曲线可以找到一工作点，即为sinc2 曲线之微分值为最大的一点。然后使用三阶非线性的拟合，在该工作点的附近，找到一三阶(three order)的匹配曲线，其可匹配该轴向点功率分布函数。与现有技术中的线性拟合比较下，本发明中使用三阶非线性的拟合，因此可以得到一较大的动态范围(如图3所示)。图3中显示应用现有技术的一阶线性拟合其可应用的动态范为约为400纳米，但本发明中使用三阶的非线性拟合其动态范围增加为1000纳米。

同时由该大面积光检测器10所得到的光信号强度也被记录下来。

微调样品与PZT驱动的物镜6之间的距离到该工作点(图1中所标示的)，然后在原先之基准点的附近进行二维扫瞄。每一扫瞄点B所得到的反射光束经不同的镜面作用后由大面积光检测器10及该光束倍增管9撷取对应的信号。其中由该光束倍增管9所得到的信号先经过该针孔8的过滤，所以唯有在该工作点附近之深度处的信号才会被撷取，而其余的信号会被过滤掉。而由该大面积光检测器10所得到的信号强度代表在该扫瞄点B的反射信号的总强度。

由于样品在轴向的密度分布不均匀的缘故，所以在扫瞄点B的反射信号总强度(即由大面积光检测器10所接收信号的强度)与在基准点A的反射信号总强度会产生差异。此差异适可用来校正由该光束倍增管9所得到的信号的强度。

首先，依据在扫瞄点B及基准点A所量测的反射信号总强度的差异，将由扫瞄点B所得到的工作点的反射信号强度(即由光束倍增管9所接收信号的强度)进行调整(如将扫瞄点B所得到的工作点的反射信号强度x 扫瞄点B的反射信号总强度/基准点A的反射信号总强度)，以消除因为样品在轴向的密度分布不均匀所产生的误差。

然后修正轴向高度所产生的误差，先将扫瞄点B所得到的工作点的反射信号强度(即由光束倍增管9所接收信号的强度)除以在工作点的斜率即可得到轴向高度差(即扫瞄点B与基准点A)之间的高度差。应用此高度差可以找到在该3D 拟合曲线(fitting curve)上对应的点。应用此对应点与该工作点在该3D拟合曲线上对应的功率的比值修正由该工作点的反射信号强度(即由光束倍增管9所接收信号的强度)，即将该工作点的反射信号强度乘上该比值，如此得到在该扫瞄点B的反射功率，并记忆到该存储器中，然后对其它的扫瞄点进行同样的运算。如果发现某一扫瞄点的反射信号”总”强度(即来自大面积光检测器10的信号强度)与其它点的偏差过大时，有可能是样品的结构产生很大的变异，则必须重新进行较准的工作。如此反覆此一作业，直到整个平面均扫瞄完成为止，并将这些结果储存在该存储器中。然后改变样品与PZT驱动的物镜6之间的距离(轴向深度)，对另一平面重覆相同的操作，直到整个样品所涵盖的空间(或所欲埽瞄的空间)均被扫瞄过后，停止该项操作。最后，将所有的数据进行影像重建以得到样品的三维影像。

与现有技术中相比较，可以得知本发明提供两项的改进。第一点，本发明使用非线性拟合曲线，而非仅使用线性区域，所以可以增加可应用的动态范围。第二点，经由消除光源中的功率的变动，平衡的检测可以改进轴向的分辨率。其中显示差动共聚焦显微镜在深度方向的分辨率受到系统噪声的限制，其中噪声主要是由于光源本身即存在的功率不稳定(power fluctuation)所致。因此噪声主要来自光源中的功率不稳定。本发明中提出应用平衡移除此一噪声将有效的改进轴向分辨率。此外，由于表面反射或荧光效应的差异所产的分歧可以消除掉。

大面积光检测器10不具深度辨识的能力，只是其表示光源的功率不稳定，及表面反射的映射或荧光效应(fluorescence efficiency) 的结果。另言之，由该光束倍增管9所得到的信号的强度表示光源中所有的功率震动，表面反射及的荧光效应及表面形态的总合结果。由光束倍增管9及大面积光检测器10的平衡检测，不只允许可以得到表面形态，而不受表面反射或荧光效应变动的影响，而且可以移除由于光源的功率振动所产生的噪声。此噪声将限制轴向的分辨率。图4显示本发明的模拟结果。其中图4-1表示样品的剖面影像；图4-4表示应用本发明的结果所得到的影像。

综上所述，本发明人性化之体贴设计，相当符合实际需求。其具体改进现有缺失，相较于现有技术明显具有突破性之进步优点，确实具有功效之增进，且非易于达成。

上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明，只是该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为之的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims (12)

1.一种平衡检测共聚焦显微镜成像系统，其特征在于，包含:

一光源；

一光束放大器接收来自该光源的光束并经散射后放大该光束的截面； 

一聚焦机构，用于聚焦通过该光束放大器的光，以将在光束聚焦到一待测样品上；

一扫瞄机构，能调整该聚焦机构相对于该样品的轴向深度，并在不同深度处的样品平面上的移动，以使得该光束在不同的样品点上聚焦后并产生反射光束；

一等量分束器，将该反射光束分成两等量光束；

一大面积光检测器接收来自该等量分束器的一道光束，并测得该光束的信号强度；

一针孔接收来自该等量分束器的另一道光束；

一光束倍增管接收来自该针孔的光束的信号，并测得此光束的信号的强度；

一处理器，接收来自该光束倍增管及该大面积光检测器所检测的信号的信号强度，并经过校准的程序以得到校准后的反射信号强度；并应用在不同的轴向深度处的不同截面上所得到信号强度重建该样品的影像。

2.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，尚包含：

一控制器，用于控制该扫瞄机构中的二维扫描光学装置及物镜的位置以使得该二维扫描光学装置及该物镜可以沿着轴向进行不同轴向点处的二维扫瞄；

一存储器，用于记录相关资料，其中包含来自该大面积光检测器及该光束倍增管的信号值、该二维扫描光学装置及该物镜的相对位置及坐标。

3.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，尚包含一导光装置用于导引该截面放大的光束进入该扫瞄机构，且导引该反射光束进入该分束器，其中的导光机构包含：

一极化分束器位于该光束放大器的后方，主要是由两介电系数不同的棱镜所构成；利用介电系数的不同，使得当光束从第一面射入时可以直接穿过该分束器，反之当光从第二面射入时，碰到第一面的边界处将使得入射在该边界处产生全反射；

一四分之一波长光板位于该极化分束器该后方，该四分之一波长光板包含反向的第一端及第二端，使得进入第一端的入射光及从第二端通过的反射光之间的极性相差90度，所以反射光束再如第二端进入该极化分束器之两棱镜的界面时会被反射，而不会穿过该界面。

4.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，该扫瞄机构为一二维扫描光学装置，其包含一镜面，且可以由一驱动装置驱动，应用该二维扫描光学装置的移动可以改变入射光反射后的路径，所以该反射后的光束可以扫瞄过一照射物体。

5.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，该聚焦机构为一应用压电转换器驱动的物镜，能随着该二维扫描光学装置的位置改变而改变此应用压电转换器驱动的物镜使得该应用压电转换器驱动的物镜对准由该二维扫描光学装置反射的光线。

6.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，该光源为线性极化光源。

7.一种成像系统进行三维影像重建的方法，其特征在于，包含步骤为：

由该光源发射一光束，该光束经过一光束放大器将该光束的截面放大；

经该极化分束器后的光束入射一二维扫描光学装置，并通过该二维扫描光学装置的镜面反射，改变的光束的行进方向；

由一驱动装置驱动该二维扫描光学装置以改变入射光束后的路径；

将经过该二维扫描光学装置的光束投射向一物镜；其中，该物镜能随着该二维扫描光学装置的位置改变而改变其轴向深度，及在垂直于此轴向深度之平面上的位置，使得该物镜对准由该二维扫描光学装置所传送过来的光束；

反射光束经过该等量分束器后分成两等量的光束；

其中之一的等量光束入射到一大面积光检测器，以检测到一信号功率；此信号功率的平均值表示在不同的轴向深度处的功率的平均值以避免由于光源的不稳定所产生的功率不稳定； 

其中另一等量光束入射到该针孔后在入射到该光束倍增管以检测并放大该信号； 

将上述结果相关的资料储存起来，储存的资料包含来自该大面积光检测器及该光束倍增管的信号值、该二维扫描光学装置及该物镜的相对位置及坐标等等；并对该光束倍增管所得到的信号值进行校准；

调整该二维扫描光学装置及该物镜的相对位置后在同一轴向深度对方该样品进行二维扫描，并执行相同的作业以得到对应的数据；

然后改变该二维扫描光学装置及该物镜的轴向深度，并重覆上述的步骤，对方该样品进行二维扫描，并执行相同的作业以得到对应的数据；以及

应用上述所得到的校准后的数据产生该样品的三维影像。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将该放大截面的光束通过一极化分束器及一四分之一波长光板；且由样品反射该光束经应用压电转换器驱动的该物镜后照射到一样品后，此光束经该样品反射，并经该二维扫描光学装置反射后以反方向入射该四分之一波长光板，并在该极化方束器上的两棱镜的界面处反射向该等量分束器。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该校准的步骤包含:

在量测前，选定一基准点，在几个μm的行程中，在样品及物镜之间的轴方向上不同的位置处将光束入射该样品；

撷取自该光束倍增管所得到的信号，以得到不同轴向点的反射功率分布函数，其为近似sinc2 的曲线；由此曲线可以找到一工作点，即为sinc2 曲线之微分值为最大的一点；

使用三阶非线性的fitting，在该工作点的附近得到一三阶的匹配曲线，其可匹配该轴向点功率分布函数；因此可以得到一较大的动态范围；以及

记录该大面积光检测器所得到的光信号强度。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该二维扫瞄的步骤尚包含步骤: 

微调样品与物镜之间的距离到该工作点；

在原先进行校准之点的附近进行二维扫瞄；每一扫瞄点所得到的反射光束经不同的镜面作用后由大面积光检测器及该光束倍增管撷取对应的信号；其中因为由该光束倍增管所得到的信号先经过该针孔的过滤，所以唯有在该工作点附近之深度处的信号才会被撷取；而由该大面积光检测器所得到的信号强度代表在该扫瞄点的反射信号的总强度；

依据在扫瞄点及基准点所量测的反射信号总强度的差异，将由扫瞄点所得到的工作点的反射信号强度即由光束倍增管所接收信号的强度进行调整； 

修正轴向高度所产生的误差，先将扫瞄点所得到的工作点的反射信号强度即由光束倍增管所接收信号的强度除以在工作点的斜率即可得到轴向高度差即扫瞄点与基准点之间的高度差；

应用此高度差找到在该3D拟合曲线上对应的点；应用此对应点与该工作点在该3D拟合曲线上对应的功率的比值修正由该工作点的反射信号强度即由光束倍增管所接收信号的强度，即将该工作点的反射信号强度乘上该比值，如此得到在该扫瞄点的反射功率，并记忆到一存储器中；

对其它的扫瞄点进行同样的运算；当发现某一扫瞄点的反射信号“总”强度即来自大面积光检测器的信号强度与其它点的偏差过大时，则必须重新进行较准的工作。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将由扫瞄点所得到的工作点的反射信号强度即由光束倍增管所接收信号的强度进行调整的方式将扫瞄点所得到的工作点的反射信号强度x 扫瞄点B的反射信号总强度/基准点的反射信号总强度。

12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，应用压电转换器驱动该物镜。

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