CN104318620A - 利用共聚焦显微镜对试样表面进行三维重建的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用共聚焦显微镜对试样表面进行三维重建的方法，属于材料分析与测试领域。本发明充分利用了共聚焦显微镜的超大景深，同时排除掉来自非焦平面的反射光的干扰，从而可以得到高清晰度、高对比度的三维立体形貌，弥补了扫描电镜以及金相显微镜存在的一些不足之处。由于实验参数取值范围缩小，参数取值更具针对性和可操作性，所以不但提高了实验结果的准确性，而且大大节约了实验时间，从而提高了共聚焦显微镜的实验效率。
Description
技术领域
本发明属于材料分析与测试领域，特别涉及一种利用共聚焦显微镜对试样表面形貌进行三维重建的方法。
背景技术
激光共聚焦显微镜（LSCM）是在普通光学显微镜的基础上对成像原理作了改进，加装了激光扫描装置，用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，同时利用计算机图像处理技术，是光学显微镜发展史上的重大突破。利用共聚焦显微镜可以获得样品多幅连续的共聚焦图像，并且可用二维共聚焦图像重建出样品的三维图像，是一种对材料进行深层形貌观察的重要方法。
利用共聚焦系统由于有效地排除了焦点以外的光信号干扰，所以不但提高了分辨率，而且显著地改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间的定位。它能把物体分为若干光学断层，逐层扫描成像，层与层之间有高的纵深分辨率，这样成像图像更加清晰。LSCM的横向分辨率接近于普通显微镜的2倍，轴向分辨率可达到几百纳米。激光共聚焦显微镜除具有普通成像功能外，还具有图像处理以及三维重建功能等。
有关文献和研究显示，激光共聚焦显微技术已广泛应用于生物工程及生物医学等方面，但其在钢铁材料方面的研究和应用则相对较少。利用LSM700对钢铁材料进行激光扫描和图像采集阶段的实验参数是比较复杂的，不仅数量较多而且彼此之间有着非常密切的关系，因此在参数选择时有必要对它们进行综合考虑。LSM700在激光扫描及图像采集阶段几个主要参数包括：Lasers、Pinhole、Master Gain、Digital Offset、Digital Gain等。那么在具体三维重建过程中，以上这些参数到底如何恰当取值，截至目前，相关文献和研究还没有形成统一定论，即便给出取值范围，也相当的宽泛，在实际运用中缺乏可操作性，仍然需要进行多次摸索和尝试，不但影响了重建结果的准确性，而且还造成耗费时间过长，在一定程度上影响了三维重建效率。
目前，德国ZEISS LSM700激光共聚焦显微镜，利用其配置的Zen2010软件，不但可以对样品进行连续分层扫描，而且可以实现三维重建。要成功实现三维重建，关键就是要设置好图像采集时各个实验参数。大量的实验证明，实验参数设置的恰当与否，不仅会直接影响到三维重建的效果（得到高质量的能反映出样品真实形貌的三维立体图像），而且还会影响到后续数据的采集与分析（得到准确无误的样品表面信息）。
发明内容
鉴于上述背景技术中存在的问题和不足，本发明充分利用激光共聚焦显微镜的超大景深，同时排除掉来自非焦平面的反射光的干扰，通过在激光扫描和图像采集阶段几个重要参数的设置，提供一种对试样表面进行三维重建的方法，提高了实验结果的准确性和实验的效率，最终获得高清晰度、高分辨率的三维立体图像。
本发明的具体操作步骤如下：
（1）放入样品在明场模式下找到焦平面
启动 Zen2010 共聚焦软件，切换为明场观察模式。此时系统打开卤素灯，将明场光学模块转入光路；放入样品，通过调节粗调、微调旋钮，配合目镜筒观察是否已经接近焦平面；依次调整所用物镜放大倍数，同时调节载物台XY位置，精确确定样品观察区域；
（2）将明场观察模式切换到激光扫描模式
在共聚焦软件Zen2010中，点击“Ocular”标签，选择“Online”，点击“Acquisition”按钮。此时系统将明场光学模块转出光路，LSM700转入激光扫描模式。
（3）设置激光扫描参数
此时需要在“Acquisition”和“ Channels ”标签下进行扫描参数的设置。
参数之一，Lasers，即激光强度的调节。激光强度越高，则信号越强，但噪音也相应增强，会造成三维图像顶端的毛刺尖锐，降低图片质量。所以从理论上来说，为了实现高效率的激发，在保证图像质量的前提下，激光强度应该越低越好。本发明主要考虑钢铁样品，将Lasers设置为3.0～6.0%范围。
参数之二，Pinhole，即针孔的调节。针孔的大小决定了共聚焦光学切片的厚度，该值越大，切片越厚，采集到的激光信号越强，但轴向分辨率会降低，导致共聚焦图像效果变差。对于探测针孔，其值越大，进入光检测器的信号越多，信噪比越好，但是进行蚀坑表面的精确定位时，探测针孔应尽可能的小。在保证图像质量的前提下，总体来看，该值越接近1AU（Airy Unit），得到的光切片就会越薄，获取的图像分辨率就越高。总体来看，将Pinhole设置为1AU 36.0～47.0 范围。
参数之三，Master Gain，即光电倍增管增益的调节。光检测器的灵敏度和光电倍增管上所加的电压有着密切的关系。该值若增大则激光的信号和噪音都会增强，减小则信号和噪音均会减小。在保证图像质量的前提下，总体来看，Gain值越小越好。通过反复实验对比，本发明将Master Gain设置为 200~450 范围。
参数之四，Digital Offset，即数码降噪和数码增益的调节，该参数不但可以进一步增强激光信号，而且可以更有效地扣除背景噪音，但样品的信号也会有一定程度的扣除。总体来看，在保证图像质量的前提下，将Digital Offset设置为 1.0~5.0 范围。
参数之五，Digital Gain：该值若增大则激光的信号和噪音都会增强，减小则信号和噪音均都会减小。本发明在保证图像质量的前提下，将Digital Gain设置为 0～3.0 范围。
需要强调的是，为了使扫描画面处于最佳状态，在设置以上参数时，还要注意避免出现曝光过度和曝光不足的情况，以免影响图像质量和后续的数据分析。各参数设置完成后，即可在激光扫描模式下进行扫描和成像，这时可得到清晰的共聚焦图像。
（4）选用“Z-Stack”模式，完成光学切片
选用“Z-Stack”模式，可获得一系列光学切片图像。在扫描过程中，可以选择进入“Gallery”标签，并激活“Range Indicator”，以便直观显示。
（5）利用软件合成2D图像
扫描结束后，点击“Topography”按钮，即可得到合成的2D图像。
（6）分析扫描结果，进行三维形貌重建
在前面得到样品2D图像的基础上，为了达到最好的去噪和平滑处理的效果，我们还需要作以下的参数设置：
Display 设置为3D；Filte设置为Average；Pixels 设置为7~9。
上述参数设置完成后，点击“Topography”按钮，即可得到样品的3D图像，它是利用2D共聚焦图像进行三维重建而得到的3D立体图像。至此，三维形貌重建全部完成。
本发明具有如下优点：
（1） 由于充分利用了共聚焦显微镜的超大景深，同时排除掉来自非焦平面的反射光的干扰，从而可以得到高清晰度、高对比度的三维立体形貌，弥补了扫描电镜以及金相显微镜存在的一些不足之处。
（2） 由于实验参数取值范围缩小，参数取值更具针对性和可操作性，所以不但提高了实验结果的准确性，而且大大节约了实验时间，从而提高了共聚焦显微镜的实验效率。
附图说明
图1为实施例1中蚀坑的激光扫描图像。
图2为实施例1中蚀坑的光学切片图像。
图3为实施例1中蚀坑的2D图像。
图4为实施例1中经过三维重建后的蚀坑3D图像。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明涉及的一种利用共聚焦显微镜对表面粗糙的试样进行三维形貌重建的方法作进一步详细描述。
钢种选用Q235B，根据JB/T 7901- 1999《金属材料实验室均匀腐蚀全浸试验方法》规定做成标准挂片试样，尺寸为（50mm×25mm×5mm），试样模拟海水环境进行全浸实验，选取腐蚀周期为3小时的挂片为研究对象，用蒸馏水洗净，烘箱烘干。利用LSM700共聚焦显微镜对其表面出现的蚀坑形貌进行三维重建。
实施例1
结合Q235腐蚀挂片试样进行三维形貌重建，包括以下步骤：
（1）放入样品在明场模式下找到焦平面
（2）将明场观察模式切换到激光扫描模式
（3）设置激光扫描参数
在Acquisition 标签下设置为：
Frame size：1024× 1024
Speed：8
在Channels 标签下设置为：
Lasers： 5.0%（LSM700所用激光波长为405nm）
Pinhole：1AU（Airy Unit）47.0
Master Gain：285 （显微镜在500倍下观察）
Digital Offset：2.0
Digital Gain：1.0
各参数设置完成后，即可在激光扫描模式下进行扫描和成像，这时可得到清晰的激光扫描图像，见图1所示。
（4）选用“Z-Stack”模式，完成光学切片，见图2所示。
（5）利用软件合成2D共聚焦图像，见图3所示。
（6）分析扫描结果，进行三维形貌重建。
在前面样品2D图像的基础上，为了达到最好的去噪和平滑处理的效果，我们还需要作以下的参数设置：
Display 设置为3D；Filte设置为Average；Pixels设置为9。
上述参数设置完成后，点击“Topography”按钮，即可得到样品的3D图像，它是利用2D共聚焦图像进行三维重建而得到的3D立体图像，见图4所示。至此，三维形貌重建全部完成。
实施例2
结合Q235腐蚀挂片试样进行三维形貌重建，包括以下步骤：
（1）放入样品在明场模式下找到焦平面
（2）将明场观察模式切换到激光扫描模式
（3）设置激光扫描参数
在Acquisition 标签下设置为：
Frame size：1024×1024
Speed：8
在Channels 标签下设置为：
Lasers： 3.0%（LSM700所用激光波长为405nm）
Pinhole：1AU（Airy Unit）36.0
Master Gain：200 （显微镜在500倍下观察）
Digital Offset：5.0
Digital Gain：2.0
各参数设置完成后，即可在激光扫描模式下进行扫描和成像。
（4）选用“Z-Stack”模式，完成光学切片。
（5）利用软件合成2D共聚焦图像。
（6）分析扫描结果，进行三维形貌重建。
在前面样品2D图像的基础上，为了达到最好的去噪和平滑处理的效果，我们还需要作以下的参数设置：
Display 设置为3D；Filte设置为Average；Pixels设置为7。
上述参数设置完成后，点击“Topography”按钮，即可得到样品的3D图像，它是利用2D共聚焦图像进行三维重建而得到的3D立体图像。
实施例3
结合Q235腐蚀挂片试样进行三维形貌重建，包括以下步骤：
（1）放入样品在明场模式下找到焦平面
（2）将明场观察模式切换到激光扫描模式
（3）设置激光扫描参数
在Acquisition 标签下设置为：
Frame size：1024×1024
Speed：8
在Channels 标签下设置为：
Lasers： 6.0%（LSM700所用激光波长为405nm）
Pinhole：1AU（Airy Unit）40.0
Master Gain：450 （显微镜在500倍下观察）
Digital Offset：1.0
Digital Gain：3.0
各参数设置完成后，即可在激光扫描模式下进行扫描和成像。
（4）选用“Z-Stack”模式，完成光学切片。
（5）利用软件合成2D共聚焦图像。
（6）分析扫描结果，进行三维形貌重建。
在前面样品2D图像的基础上，为了达到最好的去噪和平滑处理的效果，我们还需要作以下的参数设置：
Display 设置为3D；Filte设置为Average；Pixels设置为8。
上述参数设置完成后，点击“Topography”按钮，即可得到样品的3D图像，它是利用2D共聚焦图像进行三维重建而得到的3D立体图像。
Claims (3)
1.一种利用共聚焦显微镜对试样表面进行三维重建的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）放入样品，在明场观察模式下找到焦平面
启动 Zen2010 共聚焦软件，切换为明场观察模式，打开卤素灯，将明场光学模块转入光路；放入样品，精确确定样品观察区域；
（2）将明场观察模式切换到激光扫描模式
在Zen2010共聚焦软件中，点击“Ocular”标签，选择“Online”，点击“Acquisition”按钮，将明场光学模块转出光路，LSM700转入激光扫描模式；
（3）设置激光扫描参数
在“Acquisition”和“ Channels ”标签下进行扫描参数的设置：
将Lasers设置为3.0～6.0%范围；
将Pinhole设置为1AU 36.0～47.0 范围；
将Master Gain设置为200~450范围；
将Digital Offset设置为1.0~5.0范围；
将Digital Gain设置为0～3.0范围；
各参数设置完成后，在激光扫描模式下进行扫描和成像，得到清晰的共聚焦图像；
（4）选用“Z-Stack”模式，完成光学切片；
（5）利用软件合成2D图像；
（6）分析扫描结果，进行三维形貌重建。
2.根据权利要求1所述利用共聚焦显微镜对试样表面进行三维重建的方法，其特征在于步骤（1），通过调节粗调、微调旋钮，配合目镜筒观察是否已经接近焦平面；依次调整所用物镜放大倍数，同时调节载物台XY位置。
3.根据权利要求1所述利用共聚焦显微镜对试样表面进行三维重建的方法，其特征在于在合成2D图像的基础上，进行去噪和平滑处理，进行以下的参数设置：
Display 设置为3D；Filte设置为Average；Pixels 设置为7~9。
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