JP2010537166A - サンプルを撮像する方法 - Google Patents

Abstract

サンプルを撮像する方法が、−スポットの基準アレイ１０４を提供するステップＳ１と、−上記スポットの基準アレイ１０４を用いて上記サンプル１０６を照射し、上記サンプル１０６と相互作用する上記スポットの基準アレイから生じるスポットのサンプル関連アレイ１０７を有する少なくとも１つのサンプル画像ＩＭ_Ｓｉを取得するステップＳ２と、−複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対してスポット特性パラメタを決定するステップＳ３と、−上記個別のサンプル関連スポット位置で上記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する上記スポット特性パラメタをプロットすることにより、上記サンプルの画像ＩＭ_Ｓを構成するステップＳ４とを有する。

Description

本発明の側面は、画像処理方法に関し、より詳細にはサンプルを撮像する方法に関する。本発明の別の側面は、マルチスポット走査型顕微鏡への上記方法の適用に関する。本発明の更なる側面は、サンプルを撮像する方法を実現するためのコンピュータプログラムに関する。

光学顕微鏡法の様々な技術が、従来技術において知られている。

第１に、いくつかの顕微鏡は、収差なしの(aberration-free)、大きな撮像野を持つ、及び重要な開口数を持つ対物レンズを使用する。しかしながら、斯かる顕微鏡は高価である。

第２に、測定されるサンプルに対して対物レンズの焦点を走査することにより画像を形成する走査型顕微鏡がある。逆もまた同じである。斯かる走査型顕微鏡は、小さな撮像野を持つ対物レンズを使用し、従って、前述の顕微鏡より比較的安価である。しかしながら、斯かる顕微鏡は、サンプルを素早く走査するのに、大きな撮像野を持つ顕微鏡より長い時間がかかるか、又はより複雑な方法を必要とする。

第３に、大きな数のスポット、より正確にはアレイ状のスポットでサンプルを走査することにより、画像を形成するマルチスポット顕微鏡がある。斯かるマルチスポット顕微鏡は、比較的安価であるが、走査型顕微鏡より短い時間において大きな撮像野を持つ画像を生成する。

汚れのないサンプル又は生体試料（例えば単細胞の微生物、組織培養等）といったサンプルの撮像は、斯かるサンプルがしばしば低い固有のコントラストを持つという事実により困難にされる。低コントラストは、サンプルにより規定される平面における吸収率及び屈折率の変動が非常に小さいことを意味する。通常、屈折率変動であれば、１０^−２のオーダーである。結果として、斯かるサンプルにおける特定の特徴は、画像上で見えないままである。

差分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法が、従来技術において知られており、斯かるサンプルのコントラストを増加させることを可能にする。ＤＩＣ顕微鏡法は、干渉分光法の原理に基づかれる。ＤＩＣ顕微鏡において、偏光源は、サンプルを通り異なる経路を取り、異なる光学経路長／フェーズを持つ２つのビームであって、更に再結合されて干渉を生じさせる２つのビームに分離される。従って、ＤＩＣ顕微鏡を用いて得られる画像において、サンプルの光学密度の変動は、強光での強い斜照明及び対応する表面での暗影の下で見られる３Ｄオブジェクトのような、暗さにおける目に見える変化（物理的起伏(relief)の出現）を生じさせる。しかしながら、ＤＩＣ顕微鏡は、特に偏光フィルタ及びノマルスキー修正ウォラストンプリズムを含む複雑な光学構造体を持つ。

本発明の目的は、従来技術の欠点のうちの少なくとも１つを解決するサンプル撮像方法を提案することである。特に、本発明は、マルチスポット走査型顕微鏡を用いて撮像される低い固有のコントラスト特徴を有するサンプルの画像コントラストを強調することを目的とする。

第１の側面によれば、本発明はサンプルを撮像する方法に関する。上記方法は、
−スポットの基準アレイを提供するステップと、
−上記スポットの基準アレイを用いて上記サンプルを照射し、上記サンプルと相互作用する上記スポットの基準アレイから生じるスポットのサンプル関連アレイを有する少なくとも１つのサンプル画像を取得するステップと、
−複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対してスポット特性パラメタを決定するステップと、
−上記個別のサンプル関連スポット位置で上記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する上記スポット特性パラメタをプロットすることにより、上記サンプルの画像を構成するステップとを有する。

上記方法は、
−上記サンプル及び上記スポットの基準アレイの相対的な位置を走査するステップと、
−上記サンプル照射ステップ、上記サンプル画像取得ステップ及び上記スポット特性パラメタ決定ステップを繰り返すステップと、
−上記スポットのサンプル関連アレイと上記スポットの基準アレイとの相対位置の関数として、上記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する上記スポット特性パラメタをプロットすることにより、上記サンプルの画像を構成するステップとを有することができる。

上記スポット特性パラメタ決定ステップが、
−上記スポットの基準アレイにおいて基準スポットを特定し、
−上記スポットの撮像されたサンプル関連アレイにおけるサンプルスポットを特定し、及び
−複数の特定されたサンプルスポットを対応する特定された基準スポットに関連付けることにより、
上記スポットの基準アレイと上記スポットの撮像されたサンプル関連アレイとの間を比較するステップを有することができる。

第１の実施形態によれば、スポット特性パラメタを決定するステップが、
−上記スポットの撮像されたアレイに含まれる上記複数の特定されたスポットに関して上記基準位置を決定するステップと、
−上記スポットの撮像されたサンプル関連アレイに含まれる上記複数の特定されたスポットに関してサンプル位置を決定するステップと、
−上記基準位置と上記複数の関連付けられるスポットのサンプル位置との間の差を計算することにより、複数のスポットに関する変位ベクトルを決定するステップとを有する。

上記スポット特性パラメタを決定するステップが、上記変位ベクトルの直交座標フレームに対する大きさ又はフェーズ又は成分を計算するステップを更に有することができる。

上記スポットの撮像されたアレイに含まれる上記複数の特定されたスポットに関して上記基準位置を決定するステップが、
−少なくとも２つの基準位置を規定するステップと、
−上記少なくとも２つの基準位置に関してスポットの撮像されたサンプル関連アレイ（ＩＭ_Ｓ）に含まれる上記特定されたスポットに関する上記変位ベクトルを決定するステップと、
−上記変位ベクトルの大きさの二乗の平均を計算するステップと、
−上記変位ベクトルの大きさの二乗の最小平均を用いて上記基準位置を選択するステップとを有することができる。

第２の実施形態によれば、上記複数のスポットに対する上記スポット特性パラメタを決定するステップが、上記サンプルと相互作用する上記スポットの基準アレイが原因による上記スポット形状の変化を決定するステップを有する。

第３の実施形態によれば、上記複数のスポットに対する上記スポット特性パラメタを決定するステップが、上記サンプルと相互作用する上記スポットの基準アレイが原因による上記偏光の変化を決定するステップを有する。

第４の実施形態によれば、上記方法が、
−ピクセルの行列を有するピクセル化された検出器上の上記スポットを撮像するステップと、
−上記ピクセルを領域にグループ化するステップと、
−各サンプルスポットに領域を関連付けるステップであって、上記領域内のピクセルが、上記特定されたサンプルスポットに対応する上記特定された基準スポットに最も近い、ステップと、
−各領域のピクセル強度を合計することにより、上記スポット特性パラメタを決定するステップとを更に有する。

第５の実施形態によれば、上記方法は、
−ピクセルの行列を有するピクセル化された検出器上の上記スポットを撮像するステップと、
−上記ピクセルを領域にグループ化するステップと、
−各サンプルスポットに少なくとも２つの領域を関連付けるステップであって、上記少なくとも２つの領域内のピクセルが、上記特定されたサンプルスポットに対応する上記特定された基準スポットに最も近い、ステップと、
−各領域のピクセル強度を合計するステップと、
−上記少なくとも２つの領域の上記合計された強度の差を取ることにより、スポット特性パラメタを決定するステップとを更に有することができる。

各スポットに関連付けられる領域は、円又は正方形とすることができる。この領域は、スポットの直径より実質的に小さなサイズを持つことができる。より詳細には、円は実質的にスポット直径より小さな半径を持つことができ、正方形は実質的にスポット直径より小さな辺を持つことができる。

オプションで、上記スポットの撮像されたアレイに含まれる上記複数の特定されたスポットに関する上記基準位置は、実質的に一様なサンプル上での較正作動の間、取得されることができる。

有利なことに、上記発明は、マルチスポット走査型顕微鏡に適用でき、このマルチスポット走査型顕微鏡は、
−ビームを生成する照射源と、
−スポットの基準アレイを生成するスポット生成器と、
−サンプルを支持する顕微鏡スライドと、
−上記スポット生成器又は上記顕微鏡スライドのいずれかを移動させることにより、上記スライドにわたり上記スポットのアレイを走査する走査手段と、
−ピクセル化された検出器上の上記サンプルと相互作用する各スポットを撮像する撮像手段と、
−上記検出器に結合され、本発明のサンプルを撮像する方法を実現することにより、上記サンプルの画像を構成する処理及び格納モジュールとを有する。

更に追加的な側面によれば、本発明は、撮像デバイスによりサンプルを撮像するためのコンピュータプログラムに関し、このプログラムは、上記撮像デバイスの処理及び格納モジュールの内部メモリにロードされるとき、上記処理及び格納モジュールに、
−スポット特性パラメタを複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対して決定するステップであって、上記スポットのサンプル関連アレイが、上記サンプルと相互作用する上記スポットの基準アレイから生じる少なくとも１つのサンプル画像に含まれる、ステップと、
−上記個別のサンプル関連スポット位置で上記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する上記スポット特性パラメタをプロットすることにより、上記サンプルの画像を構成するステップとを実行させる命令セットを有する。

代替的に、上記サンプルの画像を構成するステップが、上記スポットのサンプル関連アレイと上記スポットの基準アレイとの相対位置の関数として、上記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する上記スポット特性パラメタをプロットするステップを有することができる。

オプションで、上記コンピュータプログラムは、上記処理及び格納モジュールに前述の第１、第２、第３又は第４の実施形態による本発明のサンプル撮像方法のステップを実行させることもできる。

こうして、本発明は、マルチスポット走査型顕微鏡を用いてサンプルの高コントラスト撮像を可能にする。例えば生体試料サンプルといったサンプルは、吸収及び屈折率におけるほとんど一様な特徴を有する。本発明は、非常にコスト効率の良い態様で短時間に高分解能で大きな領域を撮像することを可能にする。本発明は、ライフサイエンス、病理学、及びリアルタイム光学生検（例えば高速な生体外ＤＮＡ血球計算法に基づく癌検診及び早期癌検出）のための最小侵襲的システムにおいて特定の用途を持つことができる。

マルチスポット走査型顕微鏡を概略的に表す図である。 図１のマルチスポット走査型顕微鏡のサンプルにおけるアレイ状スポットの画像を示す拡大図である。 本発明の撮像方法の原理を図式的な態様で示す図である。 本発明のコントラスト強調方法を適用する前の、マルチスポット走査型顕微鏡を用いて得られるサンプルの画像を示す図である。 本発明のコントラスト強調方法の第１の実施形態を適用した後の、マルチスポット走査型顕微鏡を用いて得られるサンプルの画像を示す図である。 本発明のコントラスト強調方法の第４の実施形態を適用した後の、マルチスポット走査型顕微鏡を用いて得られるサンプルの画像を示す図である。 本発明の異なる実施形態の原理を示すピクセル化された検出器の部分上のスポットを概略的に表す図である。 本発明の異なる実施形態の原理を示すピクセル化された検出器の部分上のスポットを概略的に表す図である。 本発明の異なる実施形態の原理を示すピクセル化された検出器の部分上のスポットを概略的に表す図である。 本発明の異なる実施形態の原理を示すピクセル化された検出器の部分上のスポットを概略的に表す図である。

本発明のこれらの及び他の態様が、以下に説明される実施形態より明らとなり、これらの実施形態を参照して説明されることになる。

本発明は、例示を介して説明され、添付の図面に限定されるものではない。図面において、類似する要素は同様な参照符号で示される。

図１は、マルチスポット走査型顕微鏡を概略的に表す。マルチスポット走査型顕微鏡は通常、照射源１０１、スポット生成器１０３、サンプル１０６を支持するサンプルアセンブリ１０５、撮像手段１０８、ピクセル化された検出器１０９、処理及び格納モジュール１１０、ディスプレイ１１１及び走査手段１１２を有する。

照射源１０１は、例えばスポット生成器１０３の方へ向けられる平行なビーム１０２を生成する。照射源１０１は通常、レーザ光源、レンズ、ビームスプリッタ及び順方向感知光検出器を有することができる（これらの要素は、図示省略される）。レーザは、レンズにより平行化され、スプリッタに入射するビームを放出する。送信される部分は、レーザドライバを介した光出力を制御するため光出力を測定する順方向感知光検出器によりキャプチャされる。反射される部分は、スポット生成器１０３に入射する。

スポット生成器１０３は、サンプルアセンブリ１０５の方へ向けられるスポットの基準アレイ１０４を生成する。例えば、スポット生成器１０３は、ホログラム若しくはバイナリフェーズ構造体といった回析構造体、又はマイクロレンズアレイとすることができる。例えば、斯かるスポット生成器は、何百から何千ものスポットを生成することができる。

サンプルアセンブリ１０５は、カバースリップ、サンプル層及び顕微鏡スライドを有する。サンプルアセンブリ１０５は、例えば生体試料といったサンプル１０６を支持することができる。

走査手段１１２は、スポット生成器１０３又はサンプルアセンブリ１０５のいずれかを動かすことにより、アレイ状スポットがスライド１０５にわたり走査されることを可能にする。

アレイ状スポットのため、走査は、スポットの間の領域だけで実行される。撮像手段１０８は、ピクセル化された検出器１０９上でサンプル１０６と相互作用する各スポット１０７を撮像するため、サンプルアセンブリ１０５の後段に配置される焦束手段とすることができる。図２は、サンプルにおけるアレイ状スポットの画像を示す。

ピクセル化された検出器１０９は、例えばＣＭＯＳ又はＣＣＤピクセルの行列とすることができる。有利なことに、ピクセル化された検出器１０９は、一方では、ピクセル化された検出器のピクセルの数が、アレイ状スポットにおけるスポットの数より実質的に大きいようなものであり、他方では、検出器のアレイ状ピクセルにおけるスポットの直径は、少なくとも２つのピクセルより実質的に大きいようなものである。

処理及び格納モジュール１１０が、ピクセル化された検出器１０９に結合される。例えば、処理及び格納モジュール１１０は、映像処理集積回路及び内部メモリを有する。処理及び格納モジュール１１０は、サンプル画像の構成及び図３を用いて以下説明されることになる本発明の撮像方法を実現する。処理及び格納モジュール１１０は、サンプルの画像を表示するディスプレイ１１１に結合される。サンプルにわたりスポットを走査し、複数の位置で画像を取得することにより、多数の画像が、処理及び格納モジュール１１０の内部メモリに集められる。処理及び格納モジュール１１０は、サンプルの単一高解像度画像へと全ての画像を結合する。図４は、本発明の撮像方法を適用することなしにサンプルを走査した後、図２に示される画像のシリーズから構成されたサンプルの画像を示す。

図３は、本発明による撮像方法の原理を図式的な態様で示す。

第１のステップＳ１において、スポットの基準アレイ（ＲＥＦ）が提供される。

第１のステップＳ１に関する変形例によれば、スポットの基準アレイを更に供給するため、マルチスポット走査型顕微鏡を用いて、スポットの基準アレイを有する基準画像ＩＭ_Ｒｅｆが取得されることもできる（この変形例は、図３における破線により示される）。基準画像ＩＭ_Ｒｅｆは、基準スポットの公称の位置を決定することを可能にする。この代替的なステップの間、顕微鏡スライドは空であり、こうして、一様な透過的サンプルに等しいサンプルの画像が取得される。基準画像は、較正作動の間、取得されることができる。斯かる作動は、顕微鏡の製造の間実行されることができるか、又は定期的な態様で繰り返されることができる。基準画像から、基準スポットの公称位置が計算されることができる。

第２のステップＳ２において、サンプルがスポットの基準アレイを用いて照射され、スポットのサンプル関連アレイを有する少なくとも１つのサンプル画像ＩＭ_Ｓｉが、マルチスポット走査型顕微鏡（ＳＡＭ）を用いて取得される。スポットのサンプル関連アレイは、顕微鏡スライドにおけるサンプルと相互作用するスポットの基準アレイから生じる。

代替的に、複数のサンプル画像ＩＭ_Ｓ１、ＩＭ_Ｓ２、ＩＭ_Ｓ３、...ＩＭ_Ｓｎが取得されることができる。これは、サンプル１０６及びスポットの基準アレイ１０４の相対的な位置を走査することにより実行されることができる。スポットの撮像されたサンプル関連アレイをより多数取得することにより、より良好な画像分解能が実現されることができる。各画像は、サンプルと相互作用するスポットの基準アレイから生じるサンプルにおける異なる位置でスポットの別のサンプル関連アレイを有する。

第３のステップＳ３において、スポット特性パラメタ（ＤＥＴ ＳＣＰ）が、複数のスポットに関して決定される。スポット特性パラメタは、サンプルの屈折率の強度及び方向における変動に依存する。

「複数のスポット」という言葉は、全ての取得されたスポット、スポットの所定の選択又はスポットのランダムな選択さえ表すことができる点に留意されたい。この選択は、少なくともサンプルの部分を撮像するよう選ばれる。

第１に、スポット特性パラメタは、スポットの基準アレイ１０４と、基準及びサンプル特定ステップ並びに関連付けステップによるスポットの撮像されたサンプル関連アレイＩＭ_Ｓｉとを比較することにより決定される。まず基準スポットが、スポットの基準アレイ１０４において特定される。次に、サンプルスポットは、スポットの撮像されたサンプル関連アレイＩＭ_Ｓｉにおいて特定される。最終的に、複数の特定されたサンプルスポットの各々が、対応する特定された基準スポットに関連付けられる。通常この特定は、４つのステップを有する。第１のステップにおいて、閾値より大きな強度を持つ画像に含まれるピクセルが特定される。第２のステップにおいて、大きな強度を持つ隣接するピクセルがグループ化される。各グループは可能性のあるスポットを表す。第３のステップにおいて、正確な公称ピッチを持つ正方形グリッドが画像上にオーバレイされる。こうして、ユニットセルに画像が分割される。各ユニットセルは、ピッチと同じサイズの正方形である。好ましくは、正方形グリッドは、スポットの公称位置により形成されるグリッドに近い。第４のステップにおいて、各ユニットセルに含まれる最も高い強度を持つスポットが、そのユニットセルの基準スポットに対応するサンプルスポットとして規定される。

第２に、サンプル関連画像から基準スポット位置を決定するため、最小二乗平均法が実現されることができる。この方法によれば、スポットの撮像された基準アレイに含まれる特定されたスポットに関する少なくとも２つの基準位置が規定される。すると、スポットの撮像されたサンプル関連アレイに含まれる複数の特定されたスポットに関する少なくとも２つの変位ベクトルが決定される。少なくとも２つの変位ベクトルの大きさの二乗平均が計算される。変位ベクトルの大きさの二乗の最小平均を用いて基準位置が選択される。この方法を繰り返すことにより、公称スポット位置のグリッドが、スポットの撮像されたサンプル関連アレイＩＭ_Ｓｉを介して適合されることができる。

代替的に、基準画像ＩＭ_Ｒｅｆが較正により決定されるとき、スポットの撮像された基準アレイ及びスポットの撮像されたサンプル関連アレイの間の比較ステップは、基準及びサンプル特定ステップ、並びに関連付けステップを有することができる。まず、スポットの撮像された基準アレイＩＭ_Ｒｅｆにおける基準スポットと、スポットの撮像されたサンプル関連アレイＩＭ_Ｓｉにおけるサンプルスポットとが特定される。すると、複数の特定されたサンプルスポットが、対応する特定された基準スポットに関連付けられる。

複数のサンプル画像ＩＭ_Ｓ１、ＩＭ_Ｓ２、ＩＭ_Ｓ３、...ＩＭ_Ｓｎが取得されるとき、各画像の複数のスポットに関する複数のスポット特性パラメタが決定されることができる。

第４のステップＳ４において、サンプルの画像は、スポット特性パラメタの機能において、個別のスポット位置（ＣＯＮＳ ＩＭ_Ｓ）に構成される。構成された画像は、強調されたコントラストを持つサンプルの画像ＩＭ_Ｓに対応する。より詳細には、サンプルの画像ＩＭ_Ｓは、画像におけるスポットの位置の関数として、スポット特性パラメタをプロットすることにより構成される。従って、図４にて図示するように、本発明の方法を適用することなしに得られるサンプル画像と、図５及び６にて図示するように、本発明の方法を用いて得られるサンプル画像とを比較するとき、ディスプレイ上の画像の複数のピクセルの強度が、スポット特性パラメタの機能において修正される。これは結果として、高コントラストのサンプル画像を生じさせる。

分解能を改善するため複数のサンプル画像ＩＭ_Ｓ１、ＩＭ_Ｓ２、ＩＭ_Ｓ３、...ＩＭ_Ｓｎが取得されるとき、サンプルの画像は、スポットのサンプル関連アレイとスポットの基準アレイとの相対位置の関数として、複数のサンプル関連スポットに対するスポット特性パラメタをプロットすることにより構成される。

以下、第３のステップのスポット特性パラメタ決定ステップ及び第４のステップの画像構成ステップが、様々な実施形態及び変形例を参照して詳細な態様で説明されることになる。

第１の実施形態によれば、複数のスポットに関するスポット特性パラメタ決定は、基準位置とサンプル位置との間の位置シフトを決定するステップを有する。図７は、公称位置ＮＰとサンプル位置ＳＰとの間のピクセル化された検出器の部分上のスポットの位置シフトを概略的に示す。より詳細には、複数のスポットに関して、スポットの基準アレイからスポットのサンプル関連アレイへの変位ベクトルＤＶが計算される。スポットの基準アレイに含まれる複数の特定されたスポットに関する基準位置と、スポットの撮像されたサンプル関連アレイに含まれる複数の特定されたスポットに関するサンプル位置とが決定される。すると、複数のスポットに関する変位ベクトルが、複数の関連付けられるスポットの基準位置とサンプル位置との間の差を計算することにより決定される。

第１の変形例によれば、画像構成ステップは、変位ベクトルの大きさＤＶに依存する。変位ベクトルの大きさは、屈折率変動の値に関連付けられる。例えば、図５は、第１の変形例による本発明の撮像方法を図４の画像に対して適用した後のサンプルの画像を示す。異なる特徴のエッジｅ１、ｅ２、ｅ３、ｅ４が、図４のものと比較してより明確である点に留意されたい。

第２の変形例によれば、画像構成ステップは、変位ベクトルのフェーズ、即ち変位ベクトルの角度に依存する。変位ベクトルのフェーズは、屈折率変動の方向に関連付けられる。

第３の変形例によれば、画像構成ステップは、直交座標フレームに対する変位ベクトルの成分に依存する。

図５において示される画像に類似する画像が、上記した代替的な実施形態を用いて得られることができる。

第２の実施形態によれば、複数のスポットに関するスポット特性パラメタ決定は、サンプルと相互作用するスポットの基準アレイが原因によるスポット形状の変化を、複数のスポットに対して決定するステップを有する。例えばこの変化は、スポット形状の円形対称性からのずれとすることができる。スポット形状の変化は、スポットの少なくとも１つの方向における高さ及び／又は幅を決定することにより測定されることができる。図８は、ピクセル化された検出器の部分のスポットを概略的に表し、公称位置ＮＰとサンプル位置ＳＰとの間のスポットの変化（例えば長軸方向の伸び）を示す。

第３の実施形態によれば、複数のスポットに関するスポット特性パラメタ決定は、サンプルと相互作用するスポットの基準アレイが原因による偏光の変化を、複数のスポットに対して決定するステップを有する。例えばこの変化は、サンプルにおける複屈折が原因で起こりうる。偏光の変化は、検出光路に偏光フィルタを加えることにより測定されることができる。

第４の実施形態によれば、複数のスポットに関するスポット特性パラメタ決定は、複数のスポットに関連付けられる領域のピクセル強度を合計するステップを有する。より詳細には、ピクセル化された検出器のグループ化されたピクセルの領域が、複数のサンプルスポットに関連付けられる。この領域に含まれるピクセルが、特定されたサンプルスポットに対応する特定された基準スポットに最も近いよう、この領域は規定される。スポット特性パラメタは、各領域のピクセル強度を合計することにより決定される。例えば、最も近い公称スポットＮＰ位置までの距離が決定数Ｒより小さい領域を形成するピクセルのグループの強度が、画像を構成するため加えられる。有利には決定数Ｒは、ピクセル化された検出器上のスポットの公称サイズより小さい半径である。図１０は、本発明の第３の実施形態を示すピクセル化された検出器の部分上のスポットを概略的に表す。この実施形態は、共焦点像をエミュレートする。この画像は、小さい開口、いわゆるピンホール上へサンプルから戻るビームを焦束することにより得られる走査型顕微鏡画像である。この実施形態の利点は、入射するビームが焦束される深さとは異なる深さからのサンプルから放射される光が、ピンホールでフィルタアウト（filtered out：フィルタ除去）される点にある。従って、この実施形態は、顕微鏡が深さ方向において分解能を持つことを可能にする。

第５の実施形態によれば、複数のスポットに関するスポット特性パラメタ決定は、複数のスポットに関連付けられる領域のピクセル強度を微分するステップを有する。より詳細には、ピクセル化された検出器のグループ化されたピクセルの少なくとも２つの領域が、複数のサンプルスポットに関連付けられる。２つの領域に含まれるピクセルが特定されたサンプルスポットに対応する特定された基準スポットに最も近いよう、これらの領域は規定される。各領域のピクセル強度は合計される。スポット特性パラメタは、２つの領域の合計された強度を微分することにより決定される。例えば、スポット特性パラメタ決定は、画像の水平方向ｘに対して複数のスポットの強度を微分するステップを有する。４つの象限、即ち左上象限Ｑ_ＴＬ、右上象限Ｑ_ＴＲ、左下象限Ｑ_ＢＬ及び右下象限Ｑ_ＢＲを形成する隣接するピクセルの４つのグループ上でスポットは撮像されることができる。例えば、図９は、４つの象限Ｑ_ＴＬ、Ｑ_ＴＲ、Ｑ_ＢＬ、Ｑ_ＢＲ上で撮像されるピクセル化された検出器の部分にあるサンプル位置ＳＰにおけるスポットを概略的に表す。上記隣接する象限間で測定される微分強度は、高コントラストのサンプル画像を生成するために使用することができる。図６は、本発明の第４の実施形態による方法を適用し、水平方向に対して強度を微分することにより、図４における画像に基づき構成される画像を示す。図６の画像がより詳細に描写されるものであり、図４の画像と比較してより好適な信号対雑音比を持つ点に留意されたい。

サンプルの画像を構成するため、異なる実施形態／変形例の組合せが実現されることができる。更に、異なる実施形態／変形例が、サンプル画像のコントラストを強調することを可能にする任意の従来技術と組み合わせて実現されることができる。

本書における図面及び説明は、本発明を説明するものであり限定するものではない。

ハードウェア若しくはコンピュータプログラム（ソフトウェア）又はその両方のアイテムを用いて、これまでに述べられた機能又は方法ステップを実現する多数の方法が存在する。この点において、図面は非常に図式的であり、各図面は、本発明の１つの可能な実施形態を表すにすぎない。従って、図面が、異なる機能を異なるブロックとして示すとしても、これは決してハードウェア又はソフトウェアの単一アイテムが複数の機能を実行することを除外するものではない。そして、ハードウェア若しくはソフトウェア又はその両方のアイテムのアセンブリが機能を実行する点を除外するものでもない。

請求項における如何なる参照符号も、この請求項を限定するものとして解釈されるべきではない。「有する」という語は、請求項に記載される以外の他の要素の存在を除外するものではない。ある要素に先行する「ａ」又は「ａｎ」という語は、斯かる要素が複数存在することを除外するものではない。

Claims (15)

1. サンプルを撮像する方法において、
   ａ）スポットの基準アレイを提供するステップと、
   ｂ）前記スポットの基準アレイを用いて前記サンプルを照射し、前記サンプルと相互作用する前記スポットの基準アレイから生じるスポットのサンプル関連アレイを有する少なくとも１つのサンプル画像を取得するステップと、
   ｃ）複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対してスポット特性パラメタを決定するステップと、
   ｄ）前記個別のサンプル関連スポット位置で前記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する前記スポット特性パラメタをプロットすることにより、前記サンプルの画像を構成するステップとを有する、方法。
2. ｅ）前記サンプル及び前記スポットの基準アレイの相対的な位置を走査するステップと、
   ｆ）前記サンプル照射ステップ、前記サンプル画像取得ステップ及び前記スポット特性パラメタ決定ステップを繰り返すステップと、
   ｇ）前記スポットのサンプル関連アレイと前記スポットの基準アレイとの相対位置の関数として、前記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する前記スポット特性パラメタをプロットすることにより、前記サンプルの画像を構成するステップとを更に有する、請求項１に記載のサンプルを撮像する方法。
3. 前記スポット特性パラメタ決定ステップが、
   −前記スポットの基準アレイにおいて基準スポットを特定し、
   −前記スポットの撮像されたサンプル関連アレイにおけるサンプルスポットを特定し、及び
   −複数の特定されたサンプルスポットを対応する特定された基準スポットに関連付けることにより、
   前記スポットの基準アレイと前記スポットの撮像されたサンプル関連アレイとの間を比較するステップを有する、請求項１又は２に記載のサンプルを撮像する方法。
4. スポット特性パラメタを決定するステップが、
   −前記スポットの撮像されたアレイに含まれる前記複数の特定されたスポットに関して前記基準位置を決定するステップと、
   −前記スポットの撮像されたサンプル関連アレイに含まれる前記複数の特定されたスポットに関してサンプル位置を決定するステップと、
   −前記複数の関連付けられるスポットの前記基準位置と前記サンプル位置との間の差を計算することにより、複数のスポットに関する変位ベクトルを決定するステップとを有する、請求項３に記載のサンプルを撮像する方法。
5. 前記スポット特性パラメタを決定するステップが、前記変位ベクトルの直交座標フレームに対する大きさ又はフェーズ又は成分を計算するステップを更に有する、請求項４に記載のサンプルを撮像する方法。
6. 前記スポットの撮像されたアレイに含まれる前記複数の特定されたスポットに関して前記基準位置を決定するステップが、
   −少なくとも２つの基準位置を規定するステップと、
   −前記少なくとも２つの基準位置に関してスポットの撮像されたサンプル関連アレイに含まれる前記特定されたスポットに対する前記変位ベクトルを決定するステップと、
   −前記変位ベクトルの大きさの二乗の平均を計算するステップと、
   −前記変位ベクトルの大きさの二乗の最小平均を用いて前記基準位置を選択するステップとを有する、請求項４に記載のサンプルを撮像する方法。
7. 前記スポット特性パラメタを決定するステップが、前記サンプルと相互作用する前記スポットの基準アレイが原因による前記スポットの形状又は偏光のいずれかの変化を決定するステップを有する、請求項３に記載のサンプルを撮像する方法。
8. −ピクセルの行列を規定するピクセル化された検出器上の前記スポットを撮像するステップと、
   −前記ピクセルを領域にグループ化するステップと、
   −各サンプルスポットに領域を関連付けるステップであって、前記領域内のピクセルが、前記特定されたサンプルスポットに対応する前記特定された基準スポットに最も近い、ステップと、
   各領域のピクセル強度を合計することにより、前記スポット特性パラメタを決定するステップとを更に有する、請求項３に記載のサンプルを撮像する方法。
9. −ピクセルの行列を規定するピクセル化された検出器上の前記スポットを撮像するステップと、
   −前記ピクセルを領域にグループ化するステップと、
   −各サンプルスポットに少なくとも２つの領域を関連付けるステップであって、前記少なくとも２つの領域内のピクセルが、前記特定されたサンプルスポットに対応する前記特定された基準スポットに最も近い、ステップと、
   各領域のピクセル強度を合計するステップと、
   前記少なくとも２つの領域の前記合計された強度の差を取ることにより、スポット特性パラメタを決定するステップとを更に有する、請求項３に記載のサンプルを撮像する方法。
10. 各スポットに関連付けられる前記少なくとも１つの領域が、円又は正方形であり、及び／又は前記サンプルスポットの前記直径より実質的に小さなサイズを持つ、請求項８又は９に記載のサンプルを撮像する方法。
11. 前記スポットの撮像されたアレイに含まれる前記複数の特定されたスポットに関する前記基準位置が、実質的に一様なサンプル上で較正作動の間に取得される、請求項３乃至１０のいずれか一項に記載のサンプルを撮像する方法。
12. マルチスポット走査型顕微鏡であって、
    −ビームを生成する照射源と、
    −スポットの基準アレイを生成するスポット生成器と、
    −サンプルを支持する顕微鏡スライドと、
    −前記スポット生成器又は前記顕微鏡スライドのいずれかを移動させることにより、前記スライドにわたりスポットの前記アレイを走査する走査手段と、
    −ピクセル化された検出器上の前記サンプルと相互作用する各スポットを撮像する撮像手段と、
    −前記検出器に結合される処理及び格納モジュールとを有し、
    前記処理及び格納モジュールが、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のサンプルを撮像する方法を実現することにより、前記サンプルの画像を構成する、マルチスポット走査型顕微鏡。
13. 撮像デバイスによりサンプルを撮像するためのコンピュータプログラムであって、
    前記撮像デバイスの処理及び格納モジュールの内部メモリにロードされるとき、前記処理及び格納モジュールに、
    −複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対してスポット特性パラメタを決定するステップであって、前記スポットのサンプル関連アレイが、前記サンプルと相互作用する前記スポットの基準アレイから生じる少なくとも１つのサンプル画像に含まれる、ステップと、
    −前記個別のサンプル関連スポット位置で前記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する前記スポット特性パラメタをプロットすることにより、前記サンプルの画像を構成するステップとを実行させる命令セットを有する、コンピュータプログラム。
14. 前記サンプルの画像を構成するステップが、前記スポットのサンプル関連アレイと前記スポットの基準アレイとの相対位置の関数として、前記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する前記スポット特性パラメタをプロットするステップを有する、請求項１３に記載のコンピュータプログラム。
15. 撮像デバイスによりサンプルを撮像するコンピュータプログラムであって、
    前記撮像デバイスの処理及び格納モジュールの内部メモリにロードされるとき、前記処理及び格納モジュールに、
    −複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対してスポット特性パラメタを決定するステップであって、前記スポットのサンプル関連アレイが、前記サンプルと相互作用する前記スポットの基準アレイから生じる少なくとも１つのサンプル画像に含まれる、ステップと、
    −前記個別のサンプル関連スポット位置で前記複数のサンプル関連スポットのそれぞれに対する前記スポット特性パラメタをプロットすることにより、前記サンプルの画像を構成するステップとを実行させる命令セットを有し、
    前記命令セットが更に、前記処理及び格納モジュールに請求項３乃至１１のいずれか一項に記載のサンプルを撮像する方法のステップを実行させる、コンピュータプログラム。

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