JP5154427B2 - 滑膜細胞が充填されるコラーゲン膜またはゲルのための方法および装置 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
この出願は、ここに全文が引用により援用される２００５年１０月２４日に出願された米国仮出願番号第６０／７２９，２１３号の利益を主張する。

発明の分野
この発明は軟骨の損傷の修復の分野に関する。

背景技術の説明
ここで言及されるすべての米国特許および特許出願公報は、ここに全文が引用により援用される。抵触の場合、定義を含むこの明細書が統制することとなる。

軟骨の損傷の治療のための組成物および方法は当該技術において公知である。しかしながら、当該技術には、軟骨の損傷の修復のための改善された組成物および方法、ならびにこのような組成物を調製するための方法および装置の必要性が依然としてある。

発明の概要
この発明に従って、対象における軟骨の損傷の修復のためにインプラントが提供される。このインプラントは、滑膜細胞が充填されるコラーゲンマトリックスを含む。この発明はさらに、このようなインプラントを調製するための方法、このようなインプラントを調製するための装置、およびこのようなインプラントをこのような装置で調製する方法を包含する。

発明の詳細な説明
この発明は、滑膜細胞が充填されるコラーゲン膜およびゲルと、これらを製造し利用するための方法および装置とに関する。

ある局面において、この発明は必要のある対象における軟骨の損傷の修復のための膜インプラントを提供する。このインプラントは滑膜細胞が充填されるコラーゲン膜を含む。この発明はさらに、必要のある対象における軟骨の損傷の修復のためのゲルインプラントを提供する。このゲルインプラントは滑膜細胞を含むコラーゲンゲルを含む。この発明はさらに、ここで記載される膜インプラントおよびゲルインプラントを調製する方法と、これらのインプラントを対象における軟骨の損傷に対して適用することによりこのような損傷を修復する方法とを提供する。

この発明はさらに、細胞が充填される膜インプラントを調製するための装置を提供する。ある実施形態において、この装置は第１のチャンバと第２のチャンバとを含み、第１および第２のチャンバは膜と有孔フィルタとによって分離され、膜は第１のチャンバに導入される細胞を含む体液（fluid）から細胞を集めるようにされ、有孔フィルタは自身を介して第２のチャンバに対して体液の拡散を可能とする。この発明はさらに、細胞が充填される膜インプラントをこのような装置を利用することにより調製する方法を提供する。

以下の詳細な説明において、この発明が実施され得るさまざまな具体的な実施形態に対
して参照がなされる。これらの実施形態は、当業者がこの発明を実施可能であるよう十分な詳細さで記載される。他の実施形態が利用されてもよく、この発明の精神または範囲から逸脱することがなければ構造および論理の変更がされ得るということは理解されるべきである。

一実施形態において、この発明は、必要のある対象における軟骨の損傷の修復のために膜マトリックスインプラントを提供する。このインプラントは、滑膜細胞が充填されるコラーゲン膜を含む。この膜は、たとえば約０．１〜５ｍｍ、０．１〜１ｍｍ、０．１〜０．５ｍｍ、０．５〜１ｍｍなどの範囲内の任意の好適な厚みであってもよい。一局面に従えば、この膜は重力下または陽圧もしくは陰圧下で滑液のような液体を通すことができる一方、滑膜細胞のような細胞の通過を妨げ、前記膜の中またはその表面の上にこのような細胞を集める。

この発明の実施形態において、滑液は関節の滑膜腔から取除かれ、滑液からの細胞はコラーゲン膜の上に充填（装填）される。滑液は軟骨の修復の必要がある対象から得られ得る。次いで、滑膜細胞が充填されるコラーゲン膜が修復のために軟骨の損傷に対して適用される。

代替的には、滑液はコラーゲンパウダと混合され得、修復のために軟骨の損傷に挿入され得るゲルマトリックスインプラントへと形成され得る。ある実施形態では、このインプラントにおける滑膜細胞の最終濃度は約０．０００００１〜２５重量％の範囲内である。

この発明に従った利用のためのコラーゲン膜マトリックスは、コラーゲンＩ、コラーゲンII、コラーゲンIIIなどから形成され、コラーゲンＩ／IIIの混合物（たとえば、約９５％のコラーゲンＩおよび５％のコラーゲンIII）を含むコラーゲン膜のようなこれらの組合せを含むコラーゲン膜を含む任意の好適なコラーゲン膜であり得、対象へのインプランテーションの後でも完全に吸収性があることが好ましい。この発明に従った利用のための好ましい膜は、エー・デー・ガイストリヒ・ゾーネ・アクチェンゲゼルシャフト・フュール・ヒェーミシェ・インダストリー（Ed. Geistlich Soehne AG fuer chemische Industrie）からのビオジド（BioGide（登録商標））またはコンドロジド（ChondroGide（登録商標））である。ビオジド材料はここに引用により援用される米国特許第５，８３７，２７８号に記載され、牛または豚、好ましくは若い豚の腹膜から形成されるシートであるのが好ましい。図４に示されるように、このコラーゲン膜９は、細胞の付着を阻害し、細胞の通過を防ぐバリアとして作用するよう平滑面１０を有する障壁層を含む。この平滑面の反対側には、細胞の成長を自身の上で可能とする粗い繊維質面１２がある。滑膜細胞１４はこの繊維質面１２に対して充填されるのが好ましい。

実質的または主にコラーゲンIIから形成される膜シートか、または平滑面１７とビオジドの繊維質面１８とを有するビオジド膜１６（主にコラーゲンＩ／III）のような、ビオジドの繊維質面１８の上に主にコラーゲンＩＩマトリックス層２０が適用される（たとえばスラリーとして付着され、次いで凍結乾燥される）図５に示されるような複数層の膜を含む他の膜マトリックスが用いられてもよい。この実施形態において、滑膜細胞２２は上述したように複数層の膜のコラーゲンIIマトリックス層の上に堆積され得る。好ましくは、滑膜細胞が充填されるコラーゲンIIマトリックス層２０は損傷に対して向けられ、平滑面１６はこの損傷から離れるように向けられる。

この発明に従ったインプラントは、細胞が埋込まれて成長し得る天然培地を提供するよう働く、ヒアルロン酸、コンドロイチン６硫酸、ケラチン硫酸、デルマタン硫酸などのようなグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）を含んでもよい。軟骨と同じ組成、分子量、およ
び生物学的特性を必ずしも有さない異なる源からのグリコサミノグリカンをインプラント内に組込むことは可能であるが、好ましいグリコサミノグリカンは軟骨それ自体から抽出されたものである。

この発明はさらに、必要のある対象における軟骨の損傷の修復のためのゲルマトリックスインプラント２４を提供し、このインプラントは滑膜細胞２６を含むコラーゲンゲルを含む（図６参照）。このゲルインプラントにおけるコラーゲンは対象の中で完全に吸収性があるのが好ましく、任意の好適なコラーゲンであり得、コラーゲンＩ、コラーゲンII、もしくはコラーゲンIII、またはそれらの混合物もしくは組合せを含むのが好ましい。ゲルインプラント２４は、ゲル骨格またはゲルシートを含んでもよく、たとえば約１〜１０ｍｍ、好ましくは約５ｍｍの任意の好適な厚みであってもよい。ゲルインプラントは約０．５重量％から約４重量％のコラーゲン最終濃度を有してもよい。

他の実施形態において、インプラントは、前の段落で記載されたようにゲルマトリックスが付着するコラーゲン膜を上述したように含む複数層のインプラントを含んでもよい。したがって、インプラントは、骨格またはシートの形であり得るコラーゲン膜またはコラーゲンゲルのうちの少なくとも１つを含む。

この発明はさらに、必要のある対象における軟骨の損傷の修復のために膜インプラントを調製する方法を提供し、この方法は、滑膜細胞を含む体液を得るステップと、コラーゲン膜上に滑膜細胞を充填するステップとを含む。ある実施形態において、この体液は関節の滑膜腔から得られる滑液である。滑膜細胞は刻まれた滑液膜から得られ得る。

この発明はさらに、必要のある対象における軟骨の損傷の修復のためのゲルインプラントを調製する方法を提供し、この方法は、コラーゲンパウダを滑液と混ぜ合わせ、ゲルインプラントへと形成するステップを含む。ある実施形態において、コラーゲンパウダは（たとえばコラーゲンＩ、コラーゲンII、もしくはコラーゲンIIIのような）純粋な形、もしくは（たとえばコラーゲンＩおよび／もしくはIIおよび／もしくはIII）のような混合した形で用いられてもよく、または（たとえば、上述したようにヒアルロン酸または他のＧＡＧｓのような）プロテオグリカンのような細胞外マトリックスの他の成分と混ぜ合わされてもよい。この方法は、完全なゼラチン化に至らせるのに十分な時間の間、コラーゲンパウダと滑液とをインキュベートするステップを含んでもよい。

この発明はさらに、対象における軟骨の損傷を修復する方法を提供し、これらの方法はここに記載されるインプラントを修復のために損傷に対して適用または挿入するステップを含む。対象は軟骨の損傷の修復の必要があるいかなる対象でもあり得るが、好ましくは人間の対象である。修復は半月板を再構築することを含んでもよい。

この発明はさらに、細胞が充填される膜インプラントを調製するための装置を提供する。好ましい実施形態において、この装置は第１のチャンバと第２のチャンバとを含み、第１および第２のチャンバは膜と有孔フィルタとによって分離され、膜は第１のチャンバに導入される細胞を含む体液から細胞を集めるようにされ、有孔フィルタは自身を介して第２のチャンバに対して体液の通過または拡散を可能とするようにされる。この有孔フィルタは任意の好適な材料を含み得、その選択は当業者の技能の範囲内である。好ましい実施形態では、有孔フィルタはポリエチレンまたはポリプロピレンを含む。ある実施形態では、装置は第２のチャンバにおいてフィルタパックをさらに含み得、このフィルタパックは拡散される体液を吸収するようにされる。このフィルタパックは意図される機能を実行するのに好適な任意の材料を含み得る。ある実施形態において、この装置は第１のチャンバを取囲む蓋をさらに含む。好ましい実施形態では、この蓋は自身を通るよう突き刺される針からの体液の通過を可能にするようにされる。この蓋は当業者にとって公知の任意の好
適な材料であり得る。好ましい実施形態では、蓋はゴムを含む。ある実施形態では、第１のチャンバおよび第２のチャンバは互いに取外し可能に接続される。これは、これら２つのチャンバの接続によって形成される継目を取囲むバンドまたはリング型の構造のような任意の好適な手段によって達成され得る。この構造は動作の間、これらチャンバを一緒に固定するスレッドまたは他の手段を含んでもよい。代替例においてチャンバは、チャンバ上でスレッドを連結させることにより接続され得、これによりさらなる接続要素がなくても一緒にねじ合わせされることが可能となる。好ましい実施形態において、膜はコラーゲン膜である。代替的な好ましい実施形態において、細胞を含む体液は滑膜細胞を含む滑液である。

この発明はさらに、細胞が充填される膜をここで記載される装置を用いて調製するための方法を提供する。ある実施形態において、この方法は、第１のチャンバと第２のチャンバとを含む装置を提供するステップを含み、第１および第２のチャンバは膜および有孔フィルタによって分離され、この方法はさらに、第１のチャンバに細胞を含む体液を導入するステップを含み、体液の中の細胞が膜の上に集められ、体液が膜および有孔フィルタを介して拡散され、これにより細胞が充填された膜を得る。好ましい実施形態において、膜はコラーゲン膜であり、膜に充填される細胞は滑液に含まれる滑膜細胞である。ある実施形態では、ここで記載されるように装置は第１のチャンバを取囲む蓋をさらに含み、方法は蓋を通って挿入される針を用いて第１のチャンバの中に体液を導入するステップをさらに含む。

したがって、この発明のある局面において、滑膜細胞が充填されるコラーゲン膜は、軟骨の損傷の修復のためのインプラントとして用いられる。ある実施形態において、滑液は関節の滑膜腔から取除かれ、その滑液からの細胞はコラーゲン膜に充填（装填）されるか、または滑膜細胞を含むコラーゲンゲルが形成される。

ここで、同様の要素が同様の参照符号によって指定される図面を参照すると、図１〜図３はこの発明に従った細胞が充填されるコラーゲン膜を調製するのに用いられ得る好ましい装置およびそれらの局面を示す。したがって、たとえば、（上述するように）滑膜細胞は図１、図２、および図３に示される装置を用いてコラーゲン膜に充填され得る。図示される実施形態に従えば、たとえば、滑液が装置の第１または上チャンバ３の中にゴム蓋１を通って注射され得る。滑膜細胞は、滑液がコラーゲン膜６と有孔非活性フィルタプレート７とを通って引出されると、上チャンバ３の底部でコラーゲン膜６に装填され得、滑液はこの体液の吸収のためのフィルタ材料で満たされ得る第２または下チャンバ５の中に吸収される。体液の吸収のためのフィルタ材料は非活性フィルタプレートにきつく結合され得る。非活性フィルタプレートはコラーゲン膜に対して反応性がないのが好ましい。滑膜細胞が充填されるコラーゲン膜は次いで、修復のために軟骨の損傷へと適用される。代替的には、滑液はコラーゲンパウダと混合され、修復のために軟骨の損傷へと挿入され得るゲルインプラントへと形成され得る。

図に示されるように、装置は、ゴム蓋１を上チャンバに固定するのを助ける固定リング２と、２つのチャンバを動作の間に互いに接続するための手段４とを含み得る。２つのチャンバが互いに近くに配置されると２つのチャンバによって形成される継目を取囲む分離装置を含む任意の好適な接続手段が用いられ得る。代替例において、チャンバはチャンバ上でスレッドを連結させることにより接続され得、これによりさらなる接続要素がなくても一緒にねじ合わせされることが可能になる。

この発明は、限定を意図するものではない以下の実施例によってさらに説明される。

一実施形態に従った方法は以下のとおりである。
滑液は間充繊幹細胞の特性を有する繊維芽細胞様の滑膜細胞を含む。滑液は純粋な形で用いられてもよく、または塩化ナトリウム溶液でたとえば１：１に希釈されてもよい。この方法は、非増幅細胞またはインビトロ増幅細胞としても、繊維質またはガラス質の軟骨でも軟骨の再生のために滑液の細胞の利用を含み得る。滑液は無菌で吸引によって集められる。体液は、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培地で１：１に希釈されてもよく、次いで細胞の培養のために２５ｃｍ²の培養フラスコの中に入れられる。代替的には、この体液はＣａ／Ｍｇを有する１ｘＰＢＳで１：５に希釈され、室温で５〜１０分間、５００ｘｇで遠心分離器にかけられてもよい。上澄みが取除かれ、ペレットが１０ｍｌ ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳにおいて再懸濁され、細胞懸濁液は２５ｃｍ²の培養フラスコに移される。培地は初代培養の２４時間後に交換され、その後２〜３日ごとに交換される。細胞は７５％の密集度に到達するまで培養される。細胞は、３ｍｌ ０．０２％ＥＤＴＡの３ｍｌ処理と、その結果必要となる２ｍｌ トリプシン（typsin）／ＥＤＴＡ０．１％／０．０２の処理とで１０分間、細胞が完全に剥がれるまで処理される。トリプシン処理は１０ｍｌ ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで停止するか、または代替的には１ｍ １ｘ大豆インヒビターで停止する。細胞懸濁液は室温で５分間、５００ｘｇで遠心分離器にかけられる。ペレット化された細胞は新しいフラスコに移される。

上述したように、図１〜図３に示される装置およびその局面は、細胞をコラーゲン膜の上に装填または充填するよう、この発明に従って用いられ得る。上チャンバ３は、無菌の塩化ナトリウム溶液とたとえば１：１で混合される総量約５０〜６０ｍｌの滑液を保持し得る。記載された実施形態における混合物は、ゴム蓋１を通って注射器の針を介して注射される。上チャンバ３および下チャンバ５は、コラーゲン膜６と下にある有孔不活性フィルタ７とを介して分離され、これにより体液が下にあるフィルタパックの中に拡散されることを可能にする。体液の吸収のためのこのフィルタの容量は約６０ｍｌであってもよい。非活性フィルタプレート７は、たとえばポリエチレンまたはポリプロピレンのものであり得る。孔の大きさは、たとえば直径１ｍｍであってもよい。各ｍｍごとに孔（たとえば、１ｃｍごとに５つの孔）が局在化されてもよい。膜６の好適な直径は、たとえば約２ｃｍ〜５ｃｍのような播種装置の直径に適合される。播種システムは、異なる体積を有してもよい。なぜならば、滑液の量はすべての関節で同じではないからである。２〜５ｍｌ、２０〜３０ｍｌ、および５０〜６０の充填が例として挙げられる。この装置は、（患者の新たに分離した細胞または適用に先立って培養された細胞の播種でも）任意の種類の細胞播種のために用いられ得る。

この２チャンバシステム（注射器の針で刺され得る蓋１を有する上チャンバ３、フィルタ７を有する下チャンバ５、たとえば上チャンバ３に対して粗い表面を有するビオジド／コンドロジドのような中間のコラーゲン膜６）は、吸引された無菌の滑液または混合物で満たされる。滑液の相は、コラーゲン膜６およびフィルタプレート７を通過し、コラーゲン膜６の上、たとえばビオジドの粗い側の上に滑膜細胞が堆積されることとなる。上述したように、クック（Cook）からのＳＩＳ膜、パラガイド（paraguide）膜またはヒアフ（Hyaff（登録商標））のようなヒアルロン酸膜のような他のコラーゲン膜が用いられてもよい。代替的には、手術行為の間に得られる滑膜の生検の切片を用いて半月板を再構築するのにコラーゲンＩＩゲルが用いられてもよい。

細胞の膜の上の接着を可能とするよう少なくとも３０分待つのが好ましい。上述したように、滑液はゼラチン状の滑液の吸収を促進するよう生理塩化ナトリウム溶液で希釈され得る。

次いで、滑膜細胞が充填されるコラーゲン膜が修復のために軟骨／半月板の損傷に対して適用される。ビオジド／コンドロジドが用いられる場合には、細胞が充填される粗い側
は損傷に対して向けられ、平滑な側は損傷から離れ、関節腔に対して向けられる。

この発明の別の実施形態はこの実施例において記載されるように、パウダ化されたコラーゲン、たとえばコラーゲンＩ／IIIを軟骨の修復のための滑液ゲルの製造に用いる。

この実施例において、滑液は上述したように無菌で吸入される。
この滑液はゼラチン化を誘導するコラーゲンパウダを含むチャンバに移される。滑液（たとえば３０ｍｌ）のゼラチン化を誘導するのにコラーゲンパウダを用いることは、円形の単一チャンバシステム（４．５ｃｍの直径、高さ２ｃｍ、ここで示される装置における蓋のような蓋、チャンバに事前に適用されるコラーゲンパウダ）の中で行なわれ得る。このシステムはコラーゲン最終濃度が０．５〜４％である（直径が４．５ｃｍ、高さが５ｍｍ）丸いゲルを発生させる。コラーゲンパウダは、純粋な形（コラーゲンＩ、IIもしくはIII）で用いられてもよく、（コラーゲンＩおよび／もしくはIIおよび／もしくはIIIで）混合されてもよく、またはプロテオグリカン（ヒアルロン酸もしくは他のＧＡＧｓ）のような細胞外マトリックスの他の成分と混合されてもよい。コラーゲンパウダの量は軟骨の再構築のために必要とされるゲルの大きさに依存する。コラーゲンパウダは、バランスをプロテオグリカンのような他のＥＣＭ成分として、たとえば５０〜１００％のコラーゲンであってもよい。コラーゲン最終濃度は０．５〜４重量％であってもよい。インキュベートする温度は室温であってもよく、継続時間は少なくとも約３０分であってもよい。最終の丸いゲルにおける滑膜細胞は、患者から得られる細胞のメンバーに依って患者ごとに異なり得る。この実施形態において、滑液はコラーゲンパウダと混合され、チャンバはゼラチン化が完了するまで水平にインキュベートされる。

次いで、滑膜細胞が充填されるコラーゲンゲルは修復のために軟骨の損傷にインプラントされる。

この発明に従った、滑膜細胞が充填されるインプラントを調製するための装置を示す。 この発明に従った装置の上部分を示す。 この発明に従った装置の下部分を示す。 一実施形態に従った膜を概略的に示す。 第２の実施形態に従った膜を概略的に示す。 第３の実施形態に従ったゲルインプラントを概略的に示す。

Claims (17)

1. 対象における軟骨の損傷の修復のためのインプラントであって、
   前記インプラントは滑膜細胞が充填されたコラーゲンマトリックスを含み、
   前記マトリックスは、コラーゲンＩ、コラーゲンIIIまたはそれらの混合物を含む、コラーゲン膜またはコラーゲンゲルのうちの少なくとも１つを含み、
   前記コラーゲン膜は、平滑面とインプラント前に滑膜細胞が充填された対向する粗い繊維質面とを有し、
   第１のチャンバと第２のチャンバとを含み、前記第１および第２のチャンバが前記コラーゲン膜マトリックスと有孔フィルタとによって分離されている装置の中で、前記コラーゲン膜マトリックスを通して滑液を流すことによって、前記滑膜細胞が前記コラーゲン膜マトリックスの前記繊維質面に接着しており、
   前記滑液は第１のチャンバに導入され、前記滑液中の滑膜細胞は前記コラーゲン膜マトリックス上で集められ、前記滑液は有孔フィルタを介して拡散され、それによって前記細胞が充填されたコラーゲン膜マトリックスが得られ、その後、前記細胞が充填されたコラーゲン膜マトリックスを前記対象の前記損傷に適用する前に少なくとも３０分間待って、前記の粗い繊維質面の上への細胞の接着が可能とされており、
   前記コラーゲンゲルは、完全なゼラチン化に至らせるのに十分な時間の間、コラーゲンパウダと滑液とをインキュベートすることで製造される、インプラント。
2. 前記コラーゲン膜マトリックスはコラーゲン膜材料のシートを含む、請求項１に記載のインプラント。
3. 前記コラーゲン膜マトリックスはさらにコラーゲンIIを含む、請求項１に記載のインプラント。
4. 対象における軟骨の損傷の修復のための請求項１に記載の滑膜細胞が充填されたコラーゲンゲルを調製する方法であって、
   コラーゲンパウダと滑液を混合するステップと、
   ゲルインプラントに形成させるステップと、
   完全なゼラチン化に至らせるのに十分な時間の間、コラーゲンパウダと滑液とをインキュベートするステップをさらに含む、方法。
5. 前記コラーゲン膜マトリックスは複数層のインプラントを含む、請求項１に記載のインプラント。
6. 前記複数層のインプラントは、コラーゲンＩおよびコラーゲンIIIを含む第１の層を含み、コラーゲンIIを含む第２の層をさらに含む、請求項５に記載のインプラント。
7. 請求項１に記載の細胞が充填されたコラーゲン膜を調製するための装置であって、
   第１のチャンバと第２のチャンバとを含み、前記第１および第２のチャンバはコラーゲン膜と有孔フィルタとによって分離され、
   前記コラーゲン膜は前記第１のチャンバに導入される細胞を含む体液から細胞を集めるようにされ、前記有孔フィルタは自身を介して前記第２のチャンバに対して前記体液の拡散を可能とするようにされる、装置。
8. 前記有孔フィルタはポリエチレンまたはポリプロピレンを含む、請求項７に記載の装置。
9. 前記第２のチャンバにおいてフィルタパックをさらに含み、前記フィルタパックは前記拡散される体液を吸収するようにされる、請求項７に記載の装置。
10. 前記第１のチャンバを取囲む蓋をさらに含む、請求項７に記載の装置。
11. 前記蓋は自身を通るよう突き刺される針からの体液の通過を可能にするようにされる、請求項１０に記載の装置。
12. 前記蓋はゴムを含む、請求項１１に記載の装置。
13. 前記第１のチャンバおよび前記第２のチャンバは互いに取外し可能に接続される、請求項１２に記載の装置。
14. 前記体液は滑膜細胞を含む、請求項７に記載の装置。
15. 請求項７に記載の装置で、細胞が充填されたコラーゲン膜マトリックスを調製するための方法であって、
    ａ） 装置を提供するステップを含み、前記装置は、
    第１のチャンバと第２のチャンバとを含み、前記第１および第２のチャンバはコラーゲン膜マトリックスおよび有孔フィルタによって分離され、前記方法はさらに、
    ｂ） 前記第１のチャンバに細胞を含む体液を導入するステップを含み、前記体液の中の細胞が前記コラーゲン膜マトリックスの上に集められ、前記体液が前記コラーゲン膜マトリックスおよび前記有孔フィルタを介して拡散され、これにより細胞が充填されたコラーゲン膜マトリックスを得る、方法。
16. 前記体液は滑膜細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記装置は前記第１のチャンバを取囲む蓋をさらに含み、前記方法は前記蓋を通って挿入される針を用いて前記第１のチャンバに前記体液を導入するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

Images