JP5071910B2

JP5071910B2 - 特定のシクロリグナン類の新しい使用

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Publication number: JP5071910B2
Application number: JP2003506277A
Authority: JP
Inventors: オレラルソン; マグナスアクセルソン
Original assignee: アクセラーエービー
Priority date: 2001-06-19
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2022-06-19
Also published as: EP1397369A1; CN1659171A; JP2004534078A; CA2451047C; EP1938819A3; KR100940055B1; EP1938818A2; EP1938818A3; AU2002311731B2; EP1938819A2; SE0102168D0; US20080119528A1; NZ530290A; US20080221207A1; US20100216728A1; CA2451047A1; AU2002311731B8; US20040186169A1; NO20035648L; US7348358B2

Description

本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ依存性疾患（特に癌）の処置のためのインスリン様増殖因子−１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）を抑制する特定のシクロリグナン類の使用に関する。

（発明の背景）
インスリン様増殖因子−１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）は、悪性細胞のトランスフォーメーションおよびアポトーシスに対する保護、増殖において重要な役割を果たす。ＩＧＦ−１Ｒはまた、腫瘍細胞の悪性表現型を維持するために重要であり、そして抗癌治療に対する腫瘍細胞保護に関与する。対照的に、ＩＧＦ−１Ｒは、正常な細胞成長のための絶対条件であるように思われない。

ＩＧＦ−１Ｒは、リガンド結合を担う２つの同一の細胞外αサブユニット、ならびに貫膜ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメインを有する２つの同一のβサブユニットからなる。リガンド−レセプター相互作用は、βサブユニットのチロシンキナーゼドメイン（これはアミノ酸９７３〜１２２９に広がる）におけるチロシン残基のリン酸化を生じる。リン酸化についての主要な部位は、１１３１位、１１３５位および１１３６位のクラスター化したチロシンである（ＬｅＲｏｉｔｈ，Ｄ．ら、ＥｎｄｏｃｒＲｅｖ１９９５Ａｐｒｉｌ；１６（２），１４３−６３）。自己リン酸化後、レセプターキナーゼの自己リン酸化は、インスリンレセプター基質−１およびＳｈｃのような細胞内タンパク質をリン酸化し、これらは、それぞれ、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達経路を活性化する。

悪性細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの中心的な役割に基づいて、ＩＧＦ−１Ｒが癌療法のための標的であることがますます明らかになっている（Ｂａｓｅｒｇａ，Ｒ．ら、ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＶｏｌ．７，ｎｏ．１，９９−１０２，Ａｕｇｕｓｔ１９９７）。ＩＧＦ−１Ｒ活性と干渉するための１つのストラテジーは、ＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼの選択的な阻害を誘導することである。しかし、現在のところ、ＩＧＦ−１Ｒの選択的なインヒビターは利用可能でない。

有名な毒性のシクロリグナンポドフィロトキシン（cyclolignan podophyllotoxin）を含む薬物は、何世紀にもわたって使用されており、その抗癌特性は、特別な興味を引いている。しかし、ポドフィロトキシンの望ましくない副作用は、抗癌薬物としてのその使用を妨げている。ポドフィロトキシンの細胞傷害性についての機構が、β−チューブリンへのその結合に寄与しており、微小管アセンブリの阻害および有糸分裂の停止を導く。ポドフィロトキシンのラクトン環におけるトランス立体配置が、β−チューブリンへの結合のために必要とされることが示されている。対照的に、その立体異性体のピクロポドフィロトキシン（これは、ラクトン環においてシス立体配置を有する）は、微小管重合に対して５０倍低い阻害効果およびラットにおける３５倍を超える高いＬＤ₅₀を有する。ピクロポドフィロトキシンの低い抗微小管効果に起因して、この化合物は、ほとんど興味を引いていない。最近十年間、ポドフィロトキシン誘導体に関する主な興味は、エトポシド（これは、４’−デメチル−ｅｐｉ−ポドフィロトキシンのエチリデングルコシド誘導体である）に関する。エトポシド（これは微小管に対して影響しない）は、トポイソメラーゼＩＩインヒビターであり、癌療法においてそれ自体使用されている。

（先行技術）
多数の合成チロシンキナーゼインヒビター（すなわちチルホスチン(tyrphostin)）は、Ｐａｒｒｉｚａｓ，Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１９９７，Ｖｏｌ．１３８，Ｎｏ．４，１４２７−１４３３によって研究されてきた。ＩＧＦ−１Ｒは、チロシンキナーゼレセプターファミリーのメンバーであり、これはまた、インスリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のレセプターを含む。ＩＧＦ−１Ｒに活性な全てのチルホスチンはインスリンレセプターと交差反応するが、これらのうちの２つは、ＩＧＦ−１Ｒについて適度な選択性（preference）を示した。従って、これらを区別し得る低分子を設計および合成することが可能であり得ることが示唆された。

ＩＧＦ−１レセプターキナーゼの基質競合インヒビターは、Ｂｌｕｍ，Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０００，３９，１５７０５−１５７１２によって議論されている。単離されたＩＧＦ−１Ｒキナーゼのインヒビターについての多数のリード化合物が報告されている。これらの化合物についてのサーチは、インスリンレセプターキナーゼドメイン（これは、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼドメインに対して８４％相同性である）の３次元構造の知識によって手助けされている。見出された最も強力なインヒビターは、４００ｎＭのＩＣ５０を有するチルホスチンＡＧ５３８であった。しかし、上記インヒビターはまた、インスリンレセプターキナーゼをブロックした。

Ｋａｎｔｅｒ−Ｌｅｗｅｎｓｏｈｎ，Ｌ．ら、ＭｏｌＣｅｌｌＥｎｄｏｃｒ１６５（２０００）、１３１−１３７は、黒色腫細胞に対するタモキシフェン（ＴＡＭ）の細胞傷害性効果がインスリン様増殖因子−１レセプターの発現または機能の妨害に依存し得るか否かについて調査した。ＴＡＭはＩＧＦ−１結合および細胞表面のＩＧＦ−１Ｒの発現に対して強い影響を有さなかったが、ＴＡＭはＩＧＦ−１Ｒ βサブユニットのチロシンリン酸化を効果的にブロックしたことを見出した。

Ｊ．Ｌ．Ｈａｒｔｗｅｌｌら、ＦｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅｄｅｒＣｈｅｍｉｅｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｒＮａｔｕｒｓｔｏｆｆｅ１５，１９５８，８３−１６６によるＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍの化学は、ポドフィロトキシンおよびその異なる誘導体（２つの植物種ＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍｐｅｌｔａｔｕｍおよびＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍｅｍｏｄｉに商業的に由来する）の概略を与える。

ピクロポドフィリンは、生物学的に不活性であると考えられている（Ａｙｒｅｓ，Ｄ．Ｃ．およびＬｏｉｋｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｌｉｇｎａｎａ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９９０）。

（発明の目的）
本発明の目的は、インスリン様増殖因子−１レセプターのチロシンキナーゼの阻害によって、ＩＧＦ−１Ｒ依存性疾患（特に癌）の処置のための新しい方法を見出すことである。

（発明の詳細な説明）
１１３１位、１１３５位および１１３６位におけるチロシン残基を含む、ＩＧＦ−１Ｒチロシンドメインの１２アミノ酸配列の３次元構造を、チロシン残基を模倣しそしてそのリン酸化を妨げる能力を有する化合物を見出すために、コンピュータープログラムを使用して分析した。１２アミノ酸ペプチドを使用する場合、３つの重要なチロシンのうちの２つ（すなわち１１３５および１１３６）（これらは活性化のためにＩＧＦ−１Ｒにおいて自己リン酸化される必要がある）は、お互いに０．９５ｎｍ（９．５Å）ほどの近距離に位置し得ること、およびこれらの基の間のみかけの角度は約６０°であることが発見された。上記配列の立体配置は図１に示される。このような短い距離は、インスリンレセプターにおける対応するチロシンについては観察されていない。図１はまた、ポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンの空間構造を示す。

分子モデリングにより、阻害性分子は、たった１炭素原子によって分離された２つのベンゼン環からなり得ることが示された。２炭素架橋が試みられる場合、ベンゼン環の置換基間の距離は長すぎ、約１．３ｎｍ（１３Å）であった。

チロシン中のヒドロキシ基に対応する置換基は、メトキシ基またはメチレンジオキシ基であるように選択された。なぜなら、これらは化学的に比較的安定である、すなわち、これらは酸化またはリン酸化されないためである。これらの置換基間の距離は、約０．９５±０．１０ｎｍ（９．５±１．０Å）であるべきである。

次いで、驚くべきことに、シクロリグナン類ポドフィロトキシン及びピクロポドフィリンの２つの角度をなしかつ置換されたベンゼン環は、チロシン１１３５と１１３６との間のポケットにほぼ正確に適合することが見出され、このことは、上記化合物がチロシン残基の自己リン酸化を妨げ得ることを示した。微小管に対する効果とは対照的に、ＩＧＦ−１Ｒ阻害は、ラクトン環においてトランス立体配置を有するシクロリグナン類に限定されなかった。

レセプターに侵入するために、阻害分子は小さい必要がある。例えば、ポドフィロトキシンがグルコシド誘導体と複合体化した、ポドフィロトキシン−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシドは、ＩＧＦ−１Ｒ阻害に対する効果は完全に消滅した。さらに、ラクトン環のジオール構造への還元後、分子のサイズは、分子から突き出る（sticking out）還元された置換基に起因して増加し、化合物の劇的に減少した活性を生じた。ポドフィロトキシン−ジオールのメチレンジオキシ誘導体またはアセトニドを形成することによってサイズを増加することはまた、ほとんどまたは全く活性を有さない化合物を生じた。

インヒビター分子はまた、細胞膜およびＩＧＦ−１レセプターに自由に侵入し得るように比較的非極性である必要があり、水中で適度に可溶性であるように十分に極性である必要がある。この分子の極性は、酸素官能基の数および性質によって決定される。この極性は、水溶性がデオキシポドフィロトキシンの水溶性（すなわち約０．０１ｍＭ）とポドフィロトキシンの水溶性（約０．１〜０．２ｍＭ）との間にある場合に最適であるように見える。荷電したかまたは高度に極性の基は、分子上に存在しない。

本発明は、医薬としての使用のための式Ｉ

式中、Ｒ₁は、同じであっても異なっていても良く、ＯＨまたはＯＣＨ₃であり、ｎは０、１または２であり、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は同じであっても異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｏ、ＯＯＣＨ₃、ＯＯＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ₃、もしくはＯＣ₂Ｈ₅であるか、またはＲ₃およびＲ₄は一緒になってエーテルもしくはラクトンであり、必要に応じて二重結合Δ⁷⁽⁸⁾またはΔ^8(8')を含む、
の化合物に関する。

特に、式Ｉの全ての化合物の９位および９’位における炭素はシス立体配置を有し、すなわち、式Ｉの実線によって示されるように、８−９および８’−９’結合は、炭素環（β結合）の平面中または平面上に位置する。炭素１’と７’との間のような波線は、結合がαまたはβ結合のいずれかであり得ることを示す。α結合（これは、炭素環の平面の下にある）は、破線で示される。ベンゼン環は、好ましくは、ピクロポドフィリン、デオキシピクロポドフィリン、αおよびβアポピクロポドフィリンによって示されるように、α位に存在するべきである。

本発明は特に、医薬としての使用のための式

ここで、Ｒ₂は式Ｉにおけるように定義される、
の化合物に関する。好ましい化合物は、ピクロポドフィリンまたはデオキシピクロポドフィリンである。上記化合物の化学構造は、図２において示される。

ポドフィロトキシンおよびデオキシポドフィロトキシン（記載されたピクロ誘導体の合成のための出発物質として使用される）は、植物中に天然に存在する。精製形態の上記物質を調製するために、例えば、ＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍｅｍｏｄｉまたはＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍｐｅｌｔａｔｕｍの乾燥しかつ細かく粉砕した根茎を有機溶媒で抽出する。次いで、抽出物を濾過し、シリカゲルで濃縮する。この物質を含む画分を回収し、後者を酸アルミナおよびシリカゲルなどのクロマトグラフィーによってさらに精製し、そして最終的に再結晶化する。

デオキシピクロポドフィリンおよびピクロポドフィリンは、それぞれデオキシポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシンから調製され得る。後者の１ｍｇを７０％水性メタノール中に溶解した。該溶液に、２０ｍｇの酢酸ナトリウムを添加し、次いで混合物を、５５℃で２０時間インキュベートした。アルコールの蒸発後、生成物を、酢酸エチルで抽出し、次いで、シリカゲル（移動相：ヘキサン−酢酸エチル混合物）、および/または、オクタデシルシラン結合シリカ（移動相：水性メタノール）ＨＰＬＣ上でのクロマトグラフィーによって精製した。

医薬としての使用のための特に興味深い本発明の他の化合物は、以下の式ＩＩＩ

ここで、Ｒ₃およびＲ₄は式Ｉにおいて定義される通りであり、さらに、二重結合Δ⁷⁽⁸⁾またはΔ^8(8')を含む、
によって記載され得る。式ＩＩＩの好ましい化合物は、α−アポピクロポドフィリンおよびβ−アポピクロポドフィリンである。

αおよびβ−アポピクロポドフィリンは、Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．ら、ＪＰｈａｒｍａｃｅｕｔＳｃｉ７５，１０７６−１０８０，１９８６によって記載されるように、上昇した温度で、緩衝化エタノール性溶液中でのインキュベーションによってポドフィロトキシンから調製され得る。ピクロポドフィリンおよびそのアポ誘導体の全合成は、Ｇｅｎｓｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ８２，１７１４−１７２７，１９６０によって記載されている。

式Ｉの化合物のさらなる例として、以下が言及される：エピピクロポドフィリン、ピクロポドフィロン、４’−デメチルピクロポドフィリン、ならびにピクロポドフィリンのアセテート誘導体ならびにピクロポドフィリン酸のメチルエステルおよびエチルエステル誘導体。

本発明は特に、インスリン様増殖因子−１レセプターのチロシンリン酸化を阻害する医薬の調製のための式Ｉの化合物の使用に関する。

治療目的のためのＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼのインヒビターを設計するために、インヒビターが、インスリンレセプターキナーゼ（これは、ＩＧＦ−１Ｒと高度に相同性である）と交差反応しないことが非常に重要である。インスリンレセプターの同時阻害は、インビボでの糖尿病誘発応答を生じる。この応答は、非常に深刻な副作用を含み、これは、レセプターキナーゼがブロックされているのでインスリン処置によって克服し得ない。しかし、図３を参照すると、ピクロポドフィリン（これは、チルホスチンベースの化合物よりもはるかに強力なＩＧＦ−１Ｒインヒビターである）は、インスリンレセプターチロシンキナーゼと全く干渉しないことが現在立証された。これはまた、上皮成長因子、血小板由来増殖因子または繊維芽細胞増殖因子レセプターのチロシンリン酸化と干渉しない。

好ましい局面に従って、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ依存性疾患（例えば、癌、動脈硬化症（血管手術後の冠状動脈の再狭窄の予防を含む）、乾癬および先端巨大症）の予防または処置のための医薬調製のための上記化合物の使用に関する。

ポドフィロトキシンは、癌療法に長い間関与してきたが、許容できない副作用を生じた。抗癌効果および副作用は、微小管アセンブリの阻害および有糸分裂ブロックに起因した。現在、ポドフィロトキシンおよびその非毒性異性体のピクロポドフィリン（これは、一般に、生物学的に不活性であると考えられている）が、インスリン様増殖因子−１レセプター（これは、癌細胞中の生存因子として極めて重要な役割を果たす）のチロシンリン酸化の非常に強力かつ特異的なインヒビターであることが立証された。最も重要なことには、ピクロポドフィリンまたはラクトン環中にシス立体配置を有する他のピクロ誘導体のいずれも、インスリンレセプター（これは、ＩＧＦ−１Ｒに非常に相同性である）を阻害しない。また、これらは、他の主要な成長因子レセプターキナーゼも阻害しない。ポドフィロトキシンと比較したピクロポドフィリンの一般的に低い細胞傷害性は、前者の化合物が非常に選択的なＩＧＦ−１Ｒインヒビターであることを示唆する。

生物学的実験の結果は、サブマイクロモル濃度のピクロポドフィリンまたは他のピクロ誘導体は、腫瘍細胞の死を引き起こすのに十分であり得ることを示唆する。しかし、最適な処置のために、比較的一定の濃度のインヒビターを長期間にわたって維持し、これらが全てのＩＧＦ−１Ｒを連続的に飽和し、このようにして最終的にできるだけたくさんの悪性細胞を殺すことが重要であると考えられている。従って、化合物の血漿濃度をモニタリングすることと組み合わせたピクロポドフィリンまたは誘導体の注入は、処置間のＩＧＦ−１Ｒの再活性化を導き得る繰り返し（例えば、毎日）投与の代わりの選択のストラテジーであり得る。

ヒトおよび動物をポドフィロトキシンで処置する以前の試みは、これが全身的（ラットについてのＬＤ₅₀は１４ｍｇ/ｋｇである）および局所的（組織損傷性）の両方で、比較的毒性の化合物であることを実証した。その細胞傷害性は、β−チューブリンへのその結合に関連しているが、これは、インビトロで試験される場合のＩＧＦ−１Ｒ阻害について要求されるものよりも遙かに高い濃度でのみ生じるはずである（０．５−１．０μＭのＩＣ₅₀対０．００１μＭのＩＣ₅₀）。この細胞傷害性は、非経口、経口、および局所投与のための薬物としてのその使用を妨げる。

本発明は特に、異なる型の癌（例えば、悪性黒色腫）；原始神経外胚葉性腫瘍（例えば、ユーイング肉腫）；神経膠腫（例えば、グリオブラストーマおよび星状細胞腫）；前立腺癌；乳癌；骨髄増殖性およびリンパ増殖性疾患（例えば、白血病およびリンパ腫）；消化管腫瘍（例えば、胃癌、結腸癌および膵臓癌）；婦人科的癌（例えば、卵巣癌および子宮内膜癌）の予防または処置のための医薬の調製のための記載されるような化合物の使用に関する。

ＩＧＦ−１Ｒに完全には依存しない腫瘍の場合、本発明の化合物は、他の抗癌薬物の効果を強化するのに有用であり得る。従って、本発明はまた、別の細胞増殖抑制剤(cytostaticum)と組み合わせた式Ｉの化合物の使用に関する。本発明のシクロリグナンと共に使用され得る細胞増殖抑制剤(cytostatica)の例としては、ビンクリスチン、タキソールおよびエトポシドが言及され得る。

特別な局面に従って、本発明は、白血病の処置のための医薬調製のための式ＩＩＩの化合物の使用に関する。

癌療法に加えて、シクロリグナン類は、その病原性が動脈硬化症および乾癬と同様に、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒに関与する他の疾患の処置のために有用であり得る（例えば、Ｂａｙｅｓ−Ｇｅｎｉｓ，Ａ．ら、ＣｉｒｃＲｅｓ８６，１２５−３０（２０００）を参照のこと）。

特別な局面に従って、本発明は、乾癬の処置のための医薬の調製のための式Ｉの化合物の使用に関する。上皮過形成は、一般的な皮膚障害である乾癬の重要な特徴である。ＩＦＧ−１による上皮ケラチノサイトの刺激は細胞分裂に必須であり、従って、ＩＧＦ−１に対する増加した感受性が乾癬において発生し得る。最近の研究において、ＩＧＦ−１Ｒアンチセンスオリゴヌクレオチドがヒト乾癬病変に注射され、そしてこの処置は、過形成上皮の劇的な正常化を引き起こした（Ｗｒａｉｇｈｔ，Ｃ．Ｔ．ら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１８，５２１−６（２０００））。これは、ＩＧＦ−１Ｒ刺激が乾癬の上皮過形成における律速段階であること、そして選択的なインヒビターによるＩＧＦ−１Ｒ標的化が潜在的な新しい乾癬療法の基礎を形成し得ることを強力に示唆する。

別の局面に従って、本発明は、動脈硬化症および冠動脈血管形成後の再狭窄の処置のための医薬調製のための式Ｉの化合物の使用に関する。ＩＧＦ−１は、動脈細胞についての成長プロモーターおよび心臓血管疾患（例えば、動脈硬化班の発生および冠動脈血管形成後の再狭窄）のメディエーターである。ＩＧＦ−１は、マクロファージ走化性、過剰なＬＤＬコレステロール取り込み、および炎症性（proinflammatory）サイトカインの放出を促進する。さらに、ＩＧＦ−１は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）増殖および遊走を刺激して新生内膜（neointima）を形成する。このようにして、ＩＧＦ−１は、これらの事象において重要な役割を果たすようであり、動脈硬化症および再狭窄の新生内膜過形成において、プラーク成長および易損性(vulnerability)を制限または逆転させるために、ＩＧＦ−１の活性は、ＩＧＦ−１Ｒインヒビターを使用して抑制され得る（Ｂａｙｅｓ−Ｇｅｎｉｓ，Ａ．ら、ＣｉｒｃＲｅｓ８６，１２５−１３０，２０００）。

本発明はまた、生理学的に許容される担体と組み合わせた式Ｉの化合物を包含する薬学的組成物に関する。この薬学的組成物（これは必要に応じて従来の添加物を含む）は、処置される疾患および患者の状態に依存して、任意の適切な経路によって患者に投与され得る。

非経口投与のために、該化合物は、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントを添加してかまたは添加せずに、薬学的担体（これは、水、アルコール、油、および他の許容される有機溶媒のような滅菌した液体であり得る）としての生理学的に許容される希釈剤中の該化合物の溶液、懸濁液もしくはエマルジョンの注射可能な投薬量としてかまたは連続的な静脈内注入によって投与され得る。

該化合物はまた、デポー注射(depot injection)またはインプラント調製物の形態で投与され得、これらは、活性成分の徐放性放出を可能にするような様式で処方され得る。

経口投与のために、該化合物は、カプセル剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、散剤、液剤、懸濁剤またはエマルジョンのような固体または液体の調製物に処方され得る。

局所適用のために、該化合物は、軟膏(unguent)、クリーム、軟膏(ointment)、ローションまたはパッチの形態で投与され得る。

従って、本発明はまた、哺乳動物における癌の処置の方法に関し、該方法は、腫瘍に罹患する患者への持続注入によって、生理学的に許容される担体と組み合わせて式Ｉを有する化合物を含む薬学的組成物を投与する工程、該化合物の血漿レベルを制御する工程、および腫瘍が遅延するかまたは消滅するのに十分な期間、０．０５〜５．０μＭの濃度で血漿レベルを維持するために注入速度を調整する工程を包含する。

実験
材料
化学薬品
細胞培養試薬、すなわち、培地、胎児ウシ血清および抗生物質は、Ｇｉｂｃｏ，Ｓｗｅｄｅｎから購入した。全ての他の化学薬品は、他に述べられない限り、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ホスホチロシンに対するマウスモノクローナル抗体（ＰＹ９９）およびＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットに対するポリクローナル抗体（Ｎ２０）およびインスリンレセプターのαサブユニット、ならびに血小板由来増殖因子レセプターに対するポリクローナル抗体は、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットに対するモノクローナル抗体（αＩＲ−３）および繊維芽細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体は、ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｎｈａｓｓｅｔ，ＮＹ，ＵＳＡ）から購入した。上皮成長因子レセプターに対するマウスモノクローナル抗体はＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅから購入し、抗ＩＲＳ−１アガロース結合抗体はＵＢＩ（ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から購入した。

（³Ｈ）チミジンおよび（³Ｈ）ロイシンは、ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔ．（ＵＫ）からのものであり、α−平滑筋アクチンに対するモノクローナル抗体は、ＳｉｇｍａＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのものであった。組換えＩＧＦ−１は、ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｊｏｈｎ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）からの贈呈であった。デオキシポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン（純度９９．９７％）、ならびにα−アポピクロポドフィリン、β−アポピクロポドフィリンは、ＡｎａｌｙｔｅｃｏｎＳＡ，ＰｒｅＪｏｒａｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからの贈呈であり、ポドフィロトキシン−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシドは、ＣｏｎｐｈａｒｍＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎからであった。エトポシドはＳｉｇｍａからのものであった。

細胞培養
ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＳＫ−ＭＥＬ−２８、ユーイング肉腫細胞株ＲＤ−ＥＳおよびＥＳ−１、ヘパトーマ細胞株ＨｅｐＧ２、前立腺癌細胞株ＰＣ−３、ならびに乳癌細胞株ＭＣＦ−７は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＡからのものであった。悪性黒色腫細胞株ＢＥ、ＤＷＢおよびＦＭ５５を、ＲＫｉｅｓｓｌｉｎｇ教授、ＣＣＫ，ＫａｒｏｌｉｎｓｋａＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎから得た。Ｒ−およびＰ６細胞株は、Ｒ．Ｂａｓｅｒｇａ教授、ＴｈｏｍａｓＪｅｆｆｅｒｓｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡからの贈呈であった。Ｒ細胞は、ＩＧＦ−１Ｒネガティブであるが、Ｐ６細胞はＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する。

ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）は、ＭｏｎａＢａｃｋｄａｈｌ教授、ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ＫａｒｏｌｉｎｓｋａＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎによって提供され、ＭｏｎａＢａｃｋｄａｈｌ教授との協力で試験した。ＨａＣａＴ細胞株は、自発的に不死化したヒトケラチノサイト細胞株（ＢｏｕｋａｍｐＰら、ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１０６：７６１−７７１，１９８８）であり、これは、乾癬についての実験モデルとして頻繁に使用される（Ｗｒａｉｇｈｔ，Ｃ．Ｊ．ら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１８：５２１−５２６，２０００）。ＨａＣａＴ細胞を、１０％胎児ウシ血清、グルタミン、ベンジルペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。

ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）を、本質的に以前に記載されたように、ヒト腎動脈の外科検体から単離および培養した（ＲｏｓｓＲ．，ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ５０：１７２−１８６，１９７１）。手短には、ＶＳＭＣを、一次体外移植組織から遊走させ、引き続きコンフルエントで継代した。細胞を、１５％胎児ウシ血清、０．０５ｍｇ/ｍｌアスコルビン酸、２μｇ/ｍｌファンギゾン(fungizone)および２００ＩＵ／ｍｌのペニシリンを含むＦ１２培地中で維持した。培養した細胞は、平滑筋特異的α−アクチン（これは、ユニークエピトープを認識する）についての免疫染色及びそれらの形態の両方によって同定されるヒト平滑筋細胞の均一な集団であった。培養を、３７℃の温度、８５％の湿度、および大気中５％のＣＯ₂濃度で行った。培地を一週間に二回交換し、細胞を、トリプシン（０．２５％）およびＥＤＴＡ（０．０２％）の溶液を使用して、２〜８継代で収穫した。

ヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２／ＳおよびＫ５６２／Ｖｃｒ３０株および急性骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０／０およびＨＬ６０／Ｎｏｖは、ＡＴＣＣから得た。Ｋ５６２／ＳおよびＫ５６２／Ｖｃｒ３０は野生型（非耐性）細胞であるが、Ｋ５６２／Ｖｃｒ３０およびＨＬ６０／Ｎｏｖは、細胞増殖抑制性剤耐性亜株である。全ての白血病細胞株を、１０％胎児ウシ血清および２ｍＭＬ−グルタミン、ベンジルペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ/ｍｌ）で補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞を、加湿したインキュベーター中３７℃で９５％空気/５％ＣＯ₂雰囲気で維持した組織培養フラスコ中で増殖した。実験については、細胞は、６０ｍｍプラスチックディッシュまたは９６ウェルプラスチックプレート中で培養した。

全ての他の細胞株を、１０％胎児ウシ血清、グルタミン、１％ベンジルペニシリンおよびストレプトマイシンを含む最小必須培地中で培養した。細胞は、加湿したインキュベーター中３７℃で９５％空気/５％ＣＯ₂雰囲気で維持した組織培養フラスコ中単層で増殖した。実験については、細胞は、３５ｍｍもしくは６０ｍｍプラスチックディッシュまたは９６ウェルプラスチックプレート中のいずれかで培養した。実験は、サブコンフルエントな増殖条件下で開始した。

方法
インビトロチロシンキナーゼアッセイ
ポリＴｙｒＧｌｕ（ｐＴＧ）のＩＧＦ−１Ｒ触媒基質リン酸化を、本質的に以前に記載されたようにして実施した［ＰａｒｒｉｚａｓＭ．ら、同書、およびＢｌｕｍＧ．ら、同書］。Ｐ６細胞抽出物からのＩＧＦ−１Ｒ、ＨｅｐＧ２からのＩＲを免疫沈殿し、上清を免疫枯渇（immunodepleted）して、非ＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼをアッセイした。リン酸化したポリマー基質を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＡＲＰ）に複合体化した精製ホスホチロシン特異的モノクローナル抗体でプローブした。色を、ＨＲＰ色素形成基質のｏ−フェニレン−ジアミンジヒドロクロライド（ＯＰＤ）で顕色した（developed）。色は、分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）によって定量化し、チロシンキナーゼの相対量を反映する。沈殿物を、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲに対する抗体で免疫ブロットし、レセプターの存在を確かめた。連続希釈液を使用して、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲの量に関する最適条件をアッセイした。シグナルは、３０分間直線であり、７５ｎｇ/ウェルまでＩＧＦ−１Ｒ濃度の関数であった。手短には、９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ，Ｎｕｎｃ）を、１μｇ/ｍｌの濃度でＩＧＦ−１Ｒのβサブユニットに対するマウスモノクローナル抗体（ＬａｂＶｉｓｉｏｎ）で、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ中のＢＳＡ（ＥＬＩＳＡｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，Ｐｉｅｒｃｅ）でブロックし、Ｐ６細胞株由来の８０μｇ/ｍｌの総タンパク質溶解物を添加した。プレートを１時間インキュベートし、そしてＰＢＳＴｗｅｅｎで洗浄した。調査した化合物を、ＩＧＦ−１でのキナーゼ活性化の前に、３０分間室温でＰＢＳ中に添加した。キナーゼアッセイを、製造業者の指示に従って、インビトロリン酸化のためのＳｉｇｍａキットを使用して行った。分光測定後、インヒビターのＩＣ₅₀値を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａプログラムの回帰関数を使用して測定した。

ＩＧＦ−１Ｒチロシン自己リン酸化を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。手短には、９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ，Ｎｕｎｃ）を、ＩＧＦ−１Ｒ βサブユニットに対する１μｇ/ウェルのモノクローナル抗体Ａｂ−５（ＬａｂＶｉｓｉｏｎ）で、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴｗｅｅｎ中の１％ＢＳＡで一時間ブロックし、次いでＰ６細胞株由来の８０ｇ/ウェルの総タンパク質溶解物を添加した。ネガティブコントロールとして、Ｒ細胞株由来の総タンパク質溶解物を使用した。調査した化合物を、ＡＴＰでのキナーゼ活性化の前に、室温で３０分間、ＡＰＴを含まないチロシンキナーゼ緩衝液中に添加した。キナーゼアッセイを、Ｓｉｇｍａキットを使用して行った。分光測定後、インヒビターのＩＣ₅₀値を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａプログラムの回帰関数を使用して測定した。

細胞増殖および生存アッセイ
細胞増殖キットＩＩ（ＲｏｃｈｅＩｎｃ．）は、生存能力のある細胞の呼吸鎖によるオレンジホルマザン染色中の黄色のテトラゾリウム塩ＸＴＴの比色変化に基づいている（Ｒｏｅｈｍ，ＮＷら、ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ１４２：２５７−２６５，１９９１）。９６ウェルプレート中に１００μｌ培地中に５０００／ウェルの濃度で播種した細胞を、所定の濃度で異なる薬物で処理した。２４または４８時間後、製造業者のプロトコルに従って、ＸＴＴラベリング混合液と共に、細胞をインキュベートした。４時間後、ホルマザン染色を、４９５ｎｍフィルターを備えたスキャンニングマルチウェル分光光度計を使用して定量する。吸光度は、生きている細胞の数と直接相関している。標準吸光度曲線を、１０００細胞/ウェルの増加率で、１０００〜１００００細胞/ウェルの濃度で播種した未処理細胞によって作製した。全てのスタンダードおよび実験を、三連(triplicate)で行った。

インタクト細胞におけるレセプターのチロシンリン酸化アッセイ
細胞を、６ｃｍプレート中でサブコンフルエントまで培養し、次いで１０％ＦＢＳおよび所望の化合物を含む新しい培地を１時間添加した。次いで細胞を溶解し、特定の抗体を使用する免疫沈降に供した。免疫沈降物を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロースメンブレンに移し、抗ホスホチロシン抗体と共にインキュベートした。アクチン（細胞抽出物中の）またはＩＧＦ−１Ｒ βサブユニットに対する抗体を、ローディングコントロールとして使用した。検出後、フィルムを定量化のためにスキャンした。

免疫沈降およびタンパク質含量の測定
次いで単離された細胞を、プロテアーゼインヒビターを含む１０ｍｌ氷冷ＰＢＳＴＤＳ中に溶解した（Ｃａｒｌｂｅｒｇ，Ｍ．ら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７１：１７４５３−１７４６２，１９９６）。５０μｌプロテインＡまたはＧアガロースを、１ｍｌサンプル中に添加し、回転式振盪機で、４℃で１５分間インキュベートした。４℃で１０，０００ｒ/分での１０分間の遠心分離後、上清を採取した(saved)。タンパク質含量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入した試薬での色素結合アッセイによって測定した。ウシ血清アルブミンを、スタンダードとして使用した。１５μｌプロテインＧプラスアガロースおよび５μｌ抗ＩＧＦ−１Ｒを添加した。回転式振盪機での４℃での３時間のインキュベーション後、沈殿物を、１４，０００×ｇで１０秒間、マイクロ遠心分離機でのパルス遠心分離によって回収した。上清を捨て、ペレットをＰＢＳＴＤＳで３回洗浄した。

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)
タンパク質サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液および０．５％メタノールを含む２×サンプル緩衝液中で溶解し、９６℃で５分間煮沸した。サンプルを、４％スタッキングゲルおよび７．５％分離ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、全ての実験において同時に泳動した。

ウエスタンブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）に一晩移し、次いで４％スキムミルク粉末およびＰＢＳ中０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０の溶液（ｐＨ７．５）中で、室温で１時間ブロックした。一次抗体とのインキュベーションを、室温で１時間行い、続いてＴｗｅｅｎを含むＰＢＳで３回洗浄し、１時間室温で二次抗体と共にインキュベーションした。さらに３回洗浄した後、膜をストレプトアビジン標識した西洋わさびペルオキシダーゼと共に３０分間インキュベートし、次いでＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を使用して検出した。フィルムを、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ（ＢｉｏＲａｄ）によってスキャンした。

実験１．培養した黒色腫細胞中のＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対するポドフィロトキシン誘導体の効果
ＦＭ５５黒色腫細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）で補充した最小必須培地中で、１０，０００細胞/ｃｍ²の濃度で、６ｃｍディッシュ中に播種した。細胞が、ディッシュ中で６５，０００細胞/ｃｍ²の密度に達したときに、これらを、０．０５μＭのポドフィロトキシン、デオキシポドフィロトキシン、ピクロポドフィリン、デオキシピクロポドフィリン、４’−デメチル−７−（４，６−Ｏ−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシル）エピポドフィロトキシン（エトポシド）およびポドフィロトキシン−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｐｆ−４，６−Ｏ）で１時間処理した。エトポシドおよびｐｆ−４，６−Ｏはまた、１５μＭで投与した。次いで細胞を、方法で記載されるようなＩＧＦ−１Ｒリン酸化のアッセイおよび定量化のために収穫した。表１で示す値は、３実験の平均値を示す。

結果は、ポドフィロトキシン、デオキシポドフィロトキシン、ピクロポドフィリンおよびデオキシピクロポドフィリンは全て、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化の強力なインヒビターであるが、エトポシドおよびＰｆ−４，６−Ｏはそうではなかったことを示す。

実験２．無細胞系におけるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対するピクロポドフィリンの用量応答効果
インタクトな細胞に対する全てのこれらのデータは、ピクロポドフィリンおよびポドフィロトキシンがＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を妨げることを示したが、これがチロシンキナーゼに対する直接的または間接的な効果であるかどうかは明らかにしなかった。従って、本発明者らは、レセプターを単離し、インビトロでのＩＧＦ−１Ｒ触媒基質チロシンリン酸化およびＩＧＦ−１Ｒ自己リン酸化に対するピクロポドフィリンの効果を測定した。ピクロポドフィリンは、ｐＴＧ基質のリン酸化を効果的に減少させた（ＩＣ₅₀値０．００６μＭ、図３を参照のこと）。対照的に、ＥＧＦＲおよびＩＲチロシンキナーゼの基質リン酸化および他の“非ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ”（これらは、ＩＧＦ−１Ｒの免疫枯渇(immunodepletion)によって得られた）の基質リン酸化を妨げることはできなかった（図３）。ポドフィロトキシンは、ピクロポドフィリンと同様の結果を生じた。

無細胞実験の次のセットにおいて、本発明者らは、ＰＰＰが、約０．００１μＭのＩＣ₅₀値で、ＩＧＦ−１Ｒの自己リン酸化（詳細については、方法を参照のこと）を効率的に阻害したことを示した（図４を参照のこと）。同様の応答が、ＰＰＴによって得られた（データは示されていない）。ＰＰＰがＡＴＰレベルまたは基質レベルでのチロシン自己リン酸化（すなわち、ＩＧＦ−１Ｒ βサブユニットのチロシンキナーゼドメイン）と干渉するか否かを調査するために、種々の濃度のＡＴＰ（１９−３００μＭ）を、アッセイの間、反応緩衝液に添加した。示されるように、これは、ＰＰＰのＩＣ₅₀値（これは、０．００１−０．００２μＭで維持された）を変化させなかった（図４）。これらの結果は、ＩＧＦ−１Ｒ自己リン酸化のインヒビターがＡＴＰとの干渉によって作用するのではなく、むしろＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼによる基質リン酸化を阻害することを示唆する。

実験３．培養細胞中の種々のレセプターチロシンキナーゼに対するピクロポドフィリンおよびポドフィロトキシンの特異性
ＦＭ５５黒色腫細胞を、実験１に記載されるのと同じ方法で培養した。ディッシュ中で６５，０００細胞/ｃｍ²の密度に達したときに、これらを、それぞれ、０（コントロール）および０．０５μＭのピクロポドフィリンおよびポドフィロトキシンで、１時間処理した。次いで細胞を単離して、それぞれの分子に対する抗体を使用して、ＩＧＦ−１Ｒ、繊維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、インスリンレセプター（ＩＲ）およびインスリン基質−１（ＩＲＳ−１）の免疫沈降に供した。ＩＲＳ−１は、ＩＧＦ−１Ｒの基質であり、従って、そのリン酸化は、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒに依存している。ゲル電気泳動、ウエスタンブロッティングおよび異なるシグナルの定量化は、上記のように行った。

これは、ピクロポドフィリンおよびポドフィロトキシンがＩＧＦ−１Ｒに特異的であることを示す。

実験４．種々の悪性細胞型のＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対するポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンの効果
異なる起源の１２細胞株を、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）で補充した最小必須培地中に１０，０００細胞/ｃｍ²の濃度で、６ｃｍディッシュに播種した。細胞が６５，０００細胞/ｃｍ²の濃度に達したときに、これらを、０、０．０１、０．０２５、０．０５、０．１または１．０μＭ用量のポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンで一時間処理した。次いで細胞を、上記のようにＩＧＦ−１Ｒリン酸化のアッセイおよび定量化のために収穫した。次いで、ＥＣ５０値（各インヒビターおよび細胞株について５０％有効濃度（すなわち、リン酸化を５０％減少させるために必要な濃度））を計算する。値は以下の表３に示す。結果は、２つの異なる実験に基づく。

これは、ポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンが、種々の癌細胞におけるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害することを示す。

実験５．多数の悪性細胞型の生存率に対するポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンの効果
１２の異なる型の細胞株を、胎児ウシ血清で補充した最小必須培地中で１０，０００細胞/ｃｍ²の濃度で、９６ウェルプレート（ウェル中の培地容量は、１００μｌであった）中に播種した。細胞が、６５，０００細胞/ｃｍ²の濃度に達したときに、これらを、異なる用量のポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンで４８時間処理した。次いで細胞生存率をアッセイした（上記を参照のこと）。濃度として計算される、各インヒビターおよび細胞株についてのＥＣ５０値（細胞生存において５０％の減少を生じる）は、以下の表４において示す。ピクロポドフィリンで処理した黒色腫細胞株ＦＭ５５およびユーイング肉腫細胞株ＲＤ−ＥＳについての用量応答曲線を図５Ａに示す。両方の腫瘍細胞株の生存率は、ピクロポドフィリン濃度によって減少する。図５Ｂは、マウス繊維芽細胞株（ヒトＩＧＦ−１Ｒを欠く（Ｒ−）かまたは過剰発現する（Ｐ６））についての用量応答曲線を示す。Ｐ６細胞の生存率はピクロポドフィリン用量と共に低下するが、Ｒ−細胞は反応性ではない。これは、ピクロポドフィリンがＩＧＦ−１Ｒについて選択的であることを示唆する。表４および図５に示される全ての結果は、４つの異なる実験に基づく。

ポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンは、腫瘍細胞生存率の非常に強力なインヒビターである。

実験６．インビボにおける悪性細胞増殖の阻害
４〜５週齢の無病原体ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を使用して、滅菌施設中のプラスチックアイソレーター中で飼育した。ユーイング肉腫細胞株ＥＳ−１および黒色腫細胞株ＢＥ（共にＩＧＦ−１Ｒを発現することが証明されている）を、０．２ｍｌの容量の滅菌生理食塩水中で、１０⁷細胞/マウスで皮下注射した。ポドフィロトキシン、デオキシポドフィロトキシンまたはピクロポドフィリンを用いる実験処置を、ＤＭＳＯおよび生理学的食塩水（８：２）の混合物からなる、１００μｌ容量の溶媒中の化合物の毎日の腹腔内注射によって行った。コントロールマウスを溶媒で処理した。３〜６匹の動物を、各群において処理した。動物を、疾患および腫瘍増殖の兆候について、１週間に３回モニターした。腫瘍体積を式（ｄ²×Ｄ）/２を使用して概算した。ここで、ｄおよびＤは、それぞれ、腫瘍の小さい直径および大きい直径を示す。マウスを、副作用の存在について注意深く観察し、そして病変の組織学的分析のための実験の終わりに犠牲にした。全ての実験を、施設倫理委員会（institutional ethical committee）によって提供される実験室動物使用のための倫理ガイドラインに従って実施した。

第１のセットの実験を、ポドフィロトキシン、デオキシポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンのヌードマウスに対する可能性のある局所的および全身的毒性影響を調査するために実施した。最初の実験において、無薬物溶媒、ポドフィロトキシン（０．２５ｍｇ）、デオキシポドフィロトキシン（０．２５ｍｇ）またはピクロポドフィリン（０．２５ｍｇ）のいずれかでロードした(loaded)浸透圧ポンプを側腹領域に皮下移植した。薬物を、７日にわたって、０．６μｌ/ｈの一定の流れで、皮下送達した。ポンプの容量は、１００μｌであった。７日後、マウスを殺して、皮膚およびポンプの出口に隣接する皮下組織を分析して、経験のある病理学者によって組織反応についてスコアリングした。各群において３匹のマウスが存在した。溶媒を用いる処置（コントロール）は、何らの傷害も生じなかった。対照的に、ポドフィロトキシンは、壊死、出血および炎症を有する重篤な組織反応を引き起こした（表５）。デオキシポドフィロトキシンで処理したマウスは、軽い損傷を得たが、ピクロポドフィリン処理した動物は、目に見える反応を示さなかった（表５）。

次の実験において、本発明者らは、５日間にわたって毎日、１００μｌの各化合物を腹腔内注射することによって薬物の全身的効果を分析した。２つの用量を注射し（７または２８ｍｇ/ｋｇ/ｄ）、そして３〜６匹のマウスを、各薬物および用量に使用した。マウスを、不快、疾患および体重減少の兆候について毎日注意深くチェックした。マウスが無薬物溶媒に十分に耐えることが最初に確認された。しかし、低い用量および高い用量のポドフィロトキシンで処理されたマウスは病気になり、２日以内にそれぞれ６７％および１００％の動物が死亡した（表６）。低用量のデオキシポドフィロトキシン処理マウスは、３日後に疾患の重大な兆候を示した。高用量において、実験は、重大な疾患または死亡に起因して２日後に停止した。対照的に、ピクロポドフィリンのいずれかの用量で処理したマウスは、全５日間の実験を生き残り、疾患のいずれの証拠も示さなかった（表６）。

ポドフィロトキシンおよびデオキシポドフィロトキシンの毒性に起因して、本発明者らは、腫瘍異種移植片に対する効果を分析するためにピクロポドフィリンのみを使用した。この目的のために、ＥＳ−１（ユーイング肉腫細胞）およびＢＥ（黒色腫細胞）異種移植片を、ヌードマウスにおいて確立した。ＥＳ−１およびＢＥ腫瘍が皮下増殖を開始しそして測定可能な場合、マウスを、ピクロポドフィリン（２８ｍｇ/ｋｇ、これは、血漿中の０．０５μＭを超える平均濃度のピクロポドフィリンを与えるために必要とされる）または担体としての生理食塩中の８０％ＤＭＳＯの腹腔内注射で４〜６日間、毎日処理し、その後、４〜６日間処置しなかった。次いでマウスを殺し、そして経験のある病理学者によって腫瘍を分析した。ピクロポドフィリンは、両方の型の腫瘍の増殖を有意に阻害し、退行を引き起こし（図６Ａおよび６Ｂを参照のこと）、腫瘍標本の組織学的分析は、広範囲の壊死を示した。

結果は、ピクロポドフィリンは、ポドフィロトキシンおよびデオキシポドフィロトキシンと対照的に、動物によって十分に耐えられ、腫瘍の退行を引き起こすことを示す。

実験７．ヒト白血病細胞の生き残りに対するピクロポドフィリンおよび誘導体の効果
白血病細胞株（Ｋ５６２／Ｓ、Ｋ５６２／Ｖｃｒ３０、ＨＬ６０／０およびＨＬ６０／Ｎｏｖ）は全て、方法ならびに実験１および２において記載されるように、ウエスタンブロッティング分析によってアッセイされるように、ＩＧＦ−１Ｒを発現する。

上記細胞株の細胞を、胎児ウシ血清で補充したＲＰＭＩ４０において、９６ウェルプレート中に播種した（２５０００細胞/ウェル、１ウェル当たりの培地容量は１００μｌであった）。２４ｈ後、ピクロポドフィリンおよび誘導体のα−アポピクロポドフィリンおよびβ−アポピクロポドフィリンを、異なる濃度で添加し、そして細胞を７２時間インキュベートした。次いで細胞生存率を、アッセイした（上記を参照のこと）。各化合物および細胞株についてのＥＣ５０値を以下に示す（表７）。結果は、３つの異なる実験に基づく。

結果（表７に示す）は、０．１１〜０．３２μＭピクロポドフィリンが、４つの細胞株のうち３つにおいて５０％細胞死を引き起こすのに必要であるが、ビンクリスチン耐性細胞株Ｋ５６２／Ｖｃｒ３０については、０．５μＭを超えて必要とされる。対照的に、α−およびβ−アポピクロポドフィリンについてのＩＣ５０値は、０．０１〜０．０５μMほどに低い。

ピクロポドフィリン誘導体α−およびβ−アポピクロポドフィリンは、白血病細胞増殖および生存の高度に強力なインヒビターであることが結論付けられ得る。

実験８．細胞増殖抑制剤で処理した悪性細胞に対するピクロポドフィリンの相互作用効果
白血病細胞株Ｋ５６２／Ｓ、Ｋ５６２／Ｎｏｖ、ＨＬ６０／０およびＨＬ６０／Ｎｏｖを、実験７において記載されるように、９６ウェルプレート中で培養した。２４ｈ後、細胞を、０．０５μＭピクロポドフィリンと同時インキュベートするかまたはしないで、異なる濃度の抗癌剤ビンクリスチンで７２ｈ処理した。この濃度におけるピクロポドフィリンは、腫瘍細胞における何らの検出可能な細胞死を引き起こさないことが証明された。次いで細胞生存率をアッセイした。各インヒビターおよび細胞株についてのＩＣ₅₀を以下に示す（表８）。結果は、３つの異なる実験に基づいている。

示されるように、ピクロポドフィリンとの同時インキュベーションは、全ての４細胞株において、細胞生存率についてのＩＣ₅₀を減少させた。

結果は、ピクロポドフィリンが従来の細胞増殖抑制剤について悪性細胞を敏感にすることを示す。

実験９．ヒト乾癬モデル細胞株のＩＧＦ−１Ｒリン酸化および細胞生存に対するピクロポドフィリンおよびポドフィロトキシンの効果
ＨａＣａＴ細胞（これらは不死化したヒトケラチノサイトであり、乾癬についてのモデル細胞株を表す）を、１０％胎児ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中７，０００細胞/ｃｍ²の濃度で、６ｃｍディッシュまたは９６ウェルプレート（ウェル中の培地容量は、１００μｌであった）中に播種した。細胞が５０，０００細胞/ｃｍ²の濃度に達したとき、これらを、培養培地中０または０．０５μＭの最終濃度までの、ポドフィロトキシンまたはピクロポドフィリンと共にインキュベートした。０μＭでの処置は、未処理のコントロールを示す。１ｈのインキュベーション後、６ｃｍディッシュ中の細胞を、実験１において記載されるように、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化のアッセイおよび定量化のために収穫した。４８ｈのインキュベーション後、９６ウェルプレート中で培養した細胞を、上記のように、細胞増殖キットＩＩによって細胞生存率についてアッセイした。

結果は、ポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンの両方がＨａＣａＴ細胞における細胞生存率およびＩＧＦ−１Ｒリン酸化の効率的なインヒビターであることを示す。

実験１０．動脈硬化症および再狭窄についてのモデルにおける培養されたヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）のＩＧＦ−１Ｒリン酸化および細胞増殖に対するポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンの効果
ＩＧＦ−１は、動脈細胞についての増殖プロモーターおよび心臓血管疾患（例えば、冠動脈硬化症班発生および冠動脈血管形成後の再狭窄）のメディエーターである。これらの事象における重要な役割は、血管壁におけるＶＳＭＣの過度の増殖（これは、ＩＧＦ−１によって引き起こされる）によって果たされている（Ｂａｙｅｓ−ＧｅｎｉｓＡら、同書）。実験のために、単離かつ培養されたＶＳＭＣを、２４ウェルプレート中で増殖し（２０．０００〜４０．０００細胞/ウェル）、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化ならびにＶＳＭＣの増殖および生存に対するポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンの効果に関する研究を、本質的に実験９において記載されるように行った。さらに、細胞増殖を、ＤＮＡへの（³Ｈ）チミジン取り込み（ＤＮＡ合成）およびタンパク質への（³Ｈ）ロイシン取り込み（タンパク質合成）を測定することによって評価する。前者の場合、細胞（２０．０００〜４０．０００細胞/ウェル）を、２４ウェルプレート中で増殖し、異なる濃度（０〜１．０μＭ）のポドフィロトキシンまたはピクロポドフィリンを含むかまたは含まず、１μＣｉ／ｍｌ（³Ｈ）チミジンおよびＩＧＦ−１（ｎＭ〜μＭ濃度；単独または胎児ウシ血清中に存在）を添加して、２４時間インキュベートする。次いで、細胞を、Ｆ１２培地で洗浄し、ＤＮＡを５％氷冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させる。ＤＮＡを０．１ＭＫＯＨ中で可溶化し、各ウェルにおける５００μｌの溶液を、シンチレーション液に添加し、放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。後者の場合において、細胞は、上記のように２４時間インキュベートするが、（³Ｈ）チミジンは使用しない。代わりに（³Ｈ）ロイシンが、１μＣｉ／ｍｌの濃度に達するまで添加されるが、最後９０分のインキュベーション間のみである。次いで、細胞を冷リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ＝７．４）でリンスし、タンパク質は、氷冷ＴＣＡ中に沈殿する。タンパク質を、以下を含む溶液中に可溶化する：５％ドデシル硫酸ナトリウム、２０ｍＭＮａ₂ＣＯ₃および２ｍＭＥＤＴＡ。放射能は、液体シンチレーションカウンティングによって測定する。ＶＳＭＣにおけるＤＮＡおよびタンパク質合成に関する結果は、コントロール細胞（すなわち、ポドフィロトキシンまたはピクロポドフィリンなしでインキュベートされるもの）の％として表される。

結論
ピクロポドフィリンおよびラクトン環中にシス立体配置を有するその誘導体は、ＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼの高度に特異的かつ強力なインヒビターであることが示された。

インスリン様増殖因子−１レセプターのピクロポドフィリン誘導性不活化は悪性細胞において広範な細胞死を引き起こすが、インスリン様増殖因子−１レセプターを欠く細胞は耐性であった。ピクロポドフィリンおよびその誘導体のこの新しい機構は、癌および他のＩＧＦ−１Ｒ依存性疾患の治療において有用であり得る。

図１は、ＩＧＦ−１レセプターのチロシン１１３１、１１３５および１１３６を含む１２アミノ酸ペプチドのコンピューターモデルを示す。図２Ａは、化合物ピクロポドフィリンおよびポドフィロトキシンの構造式を示す。図２Ｂは、デオキシピクロポドフィリンおよびβ−アポピクロポドフィリンの構造式を示す。図３は、異なるレセプターのチロシンリン酸化に対するピクロポドフィリンの効果を示す図である。図４は、ＩＧＦ−１Ｒの自己リン酸化に対するピクロポドフィリンの効果を示す図である。図５Ａおよび５Ｂは、４つの異なる細胞株の生存率に対するピクロポドフィリンの用量応答効果を示す図である。図５Ａは、それぞれ黒色腫細胞株ＦＭ５５および肉腫細胞株ＲＤ−ＥＳに対する効果を示す。図５Ａおよび５Ｂは、４つの異なる細胞株の生存率に対するピクロポドフィリンの用量応答効果を示す図である。図５Ｂは、２つの操作された細胞株Ｒ−およびＰ６に対する効果を示す。図６Ａおよび６Ｂは、マウスにおける腫瘍重量に対するピクロポドフィリンの効果を示す図である。

Claims

ユーイング肉腫、前立腺癌、もしくは乳癌の予防または処置のための医薬の調製のための式IIの化合物の使用。

（式中、Ｒ₂がＯＨであり、９位および９’位における炭素はシス立体配置を有し８−９および８’−９’結合はβ結合であり、且つベンゼン環はα位に存在する、ピクロポドフィリンである化合物）
前記化合物が細胞増殖抑制剤（cytostaticum）と組み合わせて使用される、請求項１に記載の使用。
前記化合物がビンクリスチンと組み合わせて使用される、請求項１に記載の使用。
ユーイング肉腫の予防または処置のための医薬の調製のための請求項１−３のいずれか一項に記載の使用。
前立腺癌の予防または処置のための医薬の調製のための請求項１−３のいずれか一項に記載の使用。
乳癌の予防または処置のための医薬の調製のための請求項１−３のいずれか一項に記載の使用。