JP2009242406A - 特定のシクロリグナン類の新しい使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】インスリン様増殖因子−1レセプターの阻害のための、特定のシクロリグナン類の使用に関し、ここで、9位および9’位における炭素原子は、シス立体配置を有する。上記化合物は、癌、感染、動脈硬化症および先端巨大症のようなIGF−1R依存性疾患の処置のために使用され得る。好ましい化合物は、ピクロポドフィリンである。この化合物が乾癬の予防または治療に使用できることを示す。
【選択図】なし
Description
インスリン様増殖因子−1レセプター(IGF−1R)は、悪性細胞のトランスフォーメーションおよびアポトーシスに対する保護、増殖において重要な役割を果たす。IGF−1Rはまた、腫瘍細胞の悪性表現型を維持するために重要であり、そして抗癌治療に対する腫瘍細胞保護に関与する。対照的に、IGF−1Rは、正常な細胞成長のための絶対条件であるように思われない。
多数の合成チロシンキナーゼインヒビター(すなわちチルホスチン(tyrphostin))は、Parrizas,M.ら、Endocrinology 1997,Vol.138,No.4,1427−1433によって研究されてきた。IGF−1Rは、チロシンキナーゼレセプターファミリーのメンバーであり、これはまた、インスリン、上皮成長因子(EGF)、神経成長因子(NGF)、および血小板由来増殖因子(PDGF)のレセプターを含む。IGF−1Rに活性な全てのチルホスチンはインスリンレセプターと交差反応するが、これらのうちの2つは、IGF−1Rについて適度な選択性(preference)を示した。従って、これらを区別し得る低分子を設計および合成することが可能であり得ることが示唆された。
本発明の目的は、インスリン様増殖因子−1レセプターのチロシンキナーゼの阻害によって、IGF−1R依存性疾患(特に癌)の処置のための新しい方法を見出すことである。
1131位、1135位および1136位におけるチロシン残基を含む、IGF−1Rチロシンドメインの12アミノ酸配列の3次元構造を、チロシン残基を模倣しそしてそのリン酸化を妨げる能力を有する化合物を見出すために、コンピュータープログラムを使用して分析した。12アミノ酸ペプチドを使用する場合、3つの重要なチロシンのうちの2つ(すなわち1135および1136)(これらは活性化のためにIGF−1Rにおいて自己リン酸化される必要がある)は、お互いに0.95nm(9.5Å)ほどの近距離に位置し得ること、およびこれらの基の間のみかけの角度は約60°であることが発見された。上記配列の立体配置は図1に示される。このような短い距離は、インスリンレセプターにおける対応するチロシンについては観察されていない。図1はまた、ポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンの空間構造を示す。
の化合物に関する。好ましい化合物は、ピクロポドフィリンまたはデオキシピクロポドフィリンである。上記化合物の化学構造は、図2において示される。
びエトポシドが言及され得る。
医薬としての使用のための式Iの化合物:
項2.
式II
項3.
ピクロポドフィリン(picropodophyllin)、デオキシピクロポドフィリン(deoxypicropodophyllin)からなる群より選択される、項1または2に記載の化合物。
項4
式III:、
を有する項1に記載の化合物。
項5
β−アポピクロポドフィリンおよびα−アポピクロポドフィリンからなる群より選択される、項4に記載の化合物。
項6
生理学的に許容される担体と組み合わせて、項1〜5のいずれか1項に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
項7
インスリン様増殖因子−1レセプター(insulin-like growth factor-1 receptor)のチロシンリン酸化を阻害する医薬の調製のための、項1〜5のいずれか1項に記載の化合物の使用。
項8
IGF−1R依存性疾患の予防(prophylaxis)または処置のための医薬の調製のための、項1〜5のいずれか1項に記載の化合物の使用。
項9
癌の予防または処置のための医薬の調製のための、項1〜5のいずれか1項に記載の化合物の使用。
項10
悪性黒色腫、ユーイング肉腫、乳癌もしくは前立腺癌の予防または処置のための、項9に記載の使用。
項11
白血病の予防または処置のための医薬の調製のための、項1〜5のいずれか1項に記載の化合物の使用。
項12
癌の処置のための細胞増殖抑制剤(cytostaticum)と組み合わせた、項1〜5のいずれか1項に記載の化合物の使用。
項13
乾癬の予防または処置のための医薬の調製のための、項1〜5のいずれか1項に記載の化合物の使用。
項14
動脈硬化症の予防または処置のための医薬の調製のための、項1〜5のいずれか1項に記載の化合物の使用。
項15
先端巨大症の予防または処置のための医薬の調製のための、項1〜5のいずれか1項に記載の化合物の使用。
項16
哺乳動物における癌の処置の方法であって、該方法は、腫瘍に罹患する患者への持続注入によって、生理学的に許容される担体と組み合わせて、式Iを有する化合物を含む薬学的組成物を投与する工程、該化合物の血漿レベルを制御する工程、および腫瘍が遅延するかまたは消滅するのに十分な期間、0.05〜5.0μMの濃度で血漿レベルを維持するために注入速度を調整する工程を包含する。
材料
化学薬品
細胞培養試薬、すなわち、培地、胎児ウシ血清および抗生物質は、Gibco,Swedenから購入した。全ての他の化学薬品は、他に述べられない限り、Sigma(St.Louis.MO,USA)から購入した。ホスホチロシンに対するマウスモノクローナル抗体(PY99)およびIGF−1Rのαサブユニットに対するポリクローナル抗体(N20)およびインスリンレセプターのαサブユニット、ならびに血小板由来増殖因子レセプターに対するポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnology Inc(Santa Cruz,CA,USA)から購入した。IGF−1Rのαサブユニットに対するモノクローナル抗体(αIR−3)および繊維芽細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体は、Oncogene Science(Manhasset,NY,USA)から購入した。上皮成長因子レセプターに対するマウスモノクローナル抗体はLife Scienceから購入し、抗IRS−1アガロース結合抗体はUBI(Lake Placid,NY,USA)から購入した。
ヒト黒色腫細胞株SK−MEL−2、SK−MEL−5およびSK−MEL−28、ユーイング肉腫細胞株RD−ESおよびES−1、ヘパトーマ細胞株HepG2、前立腺癌細胞株PC−3、ならびに乳癌細胞株MCF−7は、American Tissue Culture Collection、USAからのものであった。悪性黒色腫細胞株BE、DWBおよびFM55を、R Kiessling教授、CCK,Karolinska Hospital,Stockholm,Swedenから得た。R−およびP6細胞株は、R.Baserga教授、Thomas Jefferson University,Philadelphia,PA,USAからの贈呈であった。R細胞は、IGF−1Rネガティブであるが、P6細胞はIGF−1Rを過剰発現する。
インビトロチロシンキナーゼアッセイ
ポリTyrGlu(pTG)のIGF−1R触媒基質リン酸化を、本質的に以前に記載されたようにして実施した[Parrizas M.ら、同書、およびBlum G.ら、同書]。P6細胞抽出物からのIGF−1R、HepG2からのIRを免疫沈殿し、上清を免疫枯渇(immunodepleted)して、非IGF−1Rチロシンキナーゼをアッセイした。リン酸化したポリマー基質を、西洋わさびペルオキシダーゼ(HARP)に複合体化した精製ホスホチロシン特異的モノクローナル抗体でプローブした。色を、HRP色素形成基質のo−フェニレン−ジアミンジヒドロクロライド(OPD)で顕色した(developed)。色は、分光光度計(ELISAリーダー)によって定量化し、チロシンキナーゼの相対量を反映する。沈殿物を、IGF−1RおよびIRに対する抗体で免疫ブロットし、レセプターの存在を確かめた。連続希釈液を使用して、IGF−1RおよびIRの量に関する最適条件をアッセイした。シグナルは、30分間直線であり、75ng/ウェルまでIGF−1R濃度の関数であった。手短には、96ウェルプレート(Immunolog,Nunc)を、1μg/mlの濃度でIGF−1Rのβサブユニットに対するマウスモノクローナル抗体(LabVision)で、4℃で一晩コーティングした。プレートを、PBS中のBSA(ELISA blocking buffer,Pierce)でブロックし、P6細胞株由来の80μg/mlの総タンパク質溶解物を添加した。プレートを1時間インキュベートし、そしてPBS Tweenで洗浄した。調査した化合物を、IGF−1でのキナーゼ活性化の前に、30分間室温でPBS中に添加した。キナーゼアッセイを、製造業者の指示に従って、インビトロリン酸化のためのSigmaキットを使用して行った。分光測定後、インヒビターのIC50値を、Statisticaプログラムの回帰関数を使用して測定した。
細胞増殖キットII(Roche Inc.)は、生存能力のある細胞の呼吸鎖によるオレンジホルマザン染色中の黄色のテトラゾリウム塩XTTの比色変化に基づいている(Roehm,NWら、J Immunol Methods 142:257−265,1991)。96ウェルプレート中に100μl培地中に5000/ウェルの濃度で播種した細胞を、所定の濃度で異なる薬物で処理した。24または48時間後、製造業者のプロトコルに従って、XTTラベリング混合液と共に、細胞をインキュベートした。4時間後、ホルマザン染色を、495nmフィルターを備えたスキャンニングマルチウェル分光光度計を使用して定量する。吸光度は、生きている細胞の数と直接相関している。標準吸光度曲線を、1000細胞/ウェルの増加率で、1000〜10000細胞/ウェルの濃度で播種した未処理細胞によって作製した。全てのスタンダードおよび実験を、三連(triplicate)で行った。
細胞を、6cmプレート中でサブコンフルエントまで培養し、次いで10%FBSおよび所望の化合物を含む新しい培地を1時間添加した。次いで細胞を溶解し、特定の抗体を使用する免疫沈降に供した。免疫沈降物を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分離し、ニトロセルロースメンブレンに移し、抗ホスホチロシン抗体と共にインキュベートした。アクチン(細胞抽出物中の)またはIGF−1R βサブユニットに対する抗体を、ローディングコントロールとして使用した。検出後、フィルムを定量化のためにスキャンした。
次いで単離された細胞を、プロテアーゼインヒビターを含む10ml氷冷PBSTDS中に溶解した(Carlberg,M.ら、J Biol Chem 271:17453−17462,1996)。50μlプロテインAまたはGアガロースを、1mlサンプル中に添加し、回転式振盪機で、4℃で15分間インキュベートした。4℃で10,000r/分での10分間の遠心分離後、上清を採取した(saved)。タンパク質含量を、Bio−Radから購入した試薬での色素結合アッセイによって測定した。ウシ血清アルブミンを、スタンダードとして使用した。15μlプロテインGプラスアガロースおよび5μl抗IGF−1Rを添加した。回転式振盪機での4℃での3時間のインキュベーション後、沈殿物を、14,000×gで10秒間、マイクロ遠心分離機でのパルス遠心分離によって回収した。上清を捨て、ペレットをPBSTDSで3回洗浄した。
タンパク質サンプルを、Laemmli緩衝液および0.5%メタノールを含む2×サンプル緩衝液中で溶解し、96℃で5分間煮沸した。サンプルを、4%スタッキングゲルおよび7.5%分離ゲルを用いるSDS−PAGEによって分離した。分子量マーカー(Bio Rad,Sweden)を、全ての実験において同時に泳動した。
SDS−PAGE後、タンパク質をニトロセルロース膜(Hybond,Amersham,UK)に一晩移し、次いで4%スキムミルク粉末およびPBS中0.02%Tween20の溶液(pH7.5)中で、室温で1時間ブロックした。一次抗体とのインキュベーションを、室温で1時間行い、続いてTweenを含むPBSで3回洗浄し、1時間室温で二次抗体と共にインキュベーションした。さらに3回洗浄した後、膜をストレプトアビジン標識した西洋わさびペルオキシダーゼと共に30分間インキュベートし、次いでAmersham ECL system(Amersham,UK)を使用して検出した。フィルムを、Fluor−S(BioRad)によってスキャンした。
FM55黒色腫細胞を、10%胎児ウシ血清(FCS)で補充した最小必須培地中で、10,000細胞/cm2の濃度で、6cmディッシュ中に播種した。細胞が、ディッシュ中で65,000細胞/cm2の密度に達したときに、これらを、0.05μMのポドフィロトキシン、デオキシポドフィロトキシン、ピクロポドフィリン、デオキシピクロポドフィリン、4’−デメチル−7−(4,6−O−エチリデン−β−D−グルコピラノシル)エピポドフィロトキシン(エトポシド)およびポドフィロトキシン−4,6−O−ベンジリデン−β−D−グルコピラノシド(pf−4,6−O)で1時間処理した。エトポシドおよびpf−4,6−Oはまた、15μMで投与した。次いで細胞を、方法で記載されるようなIGF−1Rリン酸化のアッセイおよび定量化のために収穫した。表1で示す値は、3実験の平均値を示す。
インタクトな細胞に対する全てのこれらのデータは、ピクロポドフィリンおよびポドフィロトキシンがIGF−1Rのリン酸化を妨げることを示したが、これがチロシンキナーゼに対する直接的または間接的な効果であるかどうかは明らかにしなかった。従って、本発明者らは、レセプターを単離し、インビトロでのIGF−1R触媒基質チロシンリン酸化およびIGF−1R自己リン酸化に対するピクロポドフィリンの効果を測定した。ピクロポドフィリンは、pTG基質のリン酸化を効果的に減少させた(IC50値0.006μM、図3を参照のこと)。対照的に、EGFRおよびIRチロシンキナーゼの基質リン酸化および他の“非IGF−1Rキナーゼ”(これらは、IGF−1Rの免疫枯渇(immunodepletion)によって得られた)の基質リン酸化を妨げることはできなかった(図3)。ポドフィロトキシンは、ピクロポドフィリンと同様の結果を生じた。
FM55黒色腫細胞を、実験1に記載されるのと同じ方法で培養した。ディッシュ中で65,000細胞/cm2の密度に達したときに、これらを、それぞれ、0(コントロール)および0.05μMのピクロポドフィリンおよびポドフィロトキシンで、1時間処理した。次いで細胞を単離して、それぞれの分子に対する抗体を使用して、IGF−1R、繊維芽細胞増殖因子レセプター(FGFR)、血小板由来増殖因子レセプター(PDGFR)、上皮成長因子レセプター(EGFR)、インスリンレセプター(IR)およびインスリン基質−1(IRS−1)の免疫沈降に供した。IRS−1は、IGF−1Rの基質であり、従って、そのリン酸化は、リン酸化されたIGF−1Rに依存している。ゲル電気泳動、ウエスタンブロッティングおよび異なるシグナルの定量化は、上記のように行った。
異なる起源の12細胞株を、胎児ウシ血清(FCS)で補充した最小必須培地中に10,000細胞/cm2の濃度で、6cmディッシュに播種した。細胞が65,000細胞/cm2の濃度に達したときに、これらを、0、0.01、0.025、0.05、0.1または1.0μM用量のポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンで一時間処理した。次いで細胞を、上記のようにIGF−1Rリン酸化のアッセイおよび定量化のために収穫した。次いで、EC50値(各インヒビターおよび細胞株について50%有効濃度(すなわち、リン酸化を50%減少させるために必要な濃度))を計算する。値は以下の表3に示す。結果は、2つの異なる実験に基づく。
12の異なる型の細胞株を、胎児ウシ血清で補充した最小必須培地中で10,000細胞/cm2の濃度で、96ウェルプレート(ウェル中の培地容量は、100μlであった)中に播種した。細胞が、65,000細胞/cm2の濃度に達したときに、これらを、異なる用量のポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンで48時間処理した。次いで細胞生存率をアッセイした(上記を参照のこと)。濃度として計算される、各インヒビターおよび細胞株についてのEC50値(細胞生存において50%の減少を生じる)は、以下の表4において示す。ピクロポドフィリンで処理した黒色腫細胞株FM55およびユーイング肉腫細胞株RD−ESについての用量応答曲線を図5Aに示す。両方の腫瘍細胞株の生存率は、ピクロポドフィリン濃度によって減少する。図5Bは、マウス繊維芽細胞株(ヒトIGF−1Rを欠く(R−)かまたは過剰発現する(P6))についての用量応答曲線を示す。P6細胞の生存率はピクロポドフィリン用量と共に低下するが、R−細胞は反応性ではない。これは、ピクロポドフィリンがIGF−1Rについて選択的であることを示唆する。表4および図5に示される全ての結果は、4つの異なる実験に基づく。
4〜5週齢の無病原体ヌードマウス(nu/nu)を使用して、滅菌施設中のプラスチックアイソレーター中で飼育した。ユーイング肉腫細胞株ES−1および黒色腫細胞株BE(共にIGF−1Rを発現することが証明されている)を、0.2mlの容量の滅菌生理食塩水中で、107細胞/マウスで皮下注射した。ポドフィロトキシン、デオキシポドフィロトキシンまたはピクロポドフィリンを用いる実験処置を、DMSOおよび生理学的食塩水(8:2)の混合物からなる、100μl容量の溶媒中の化合物の毎日の腹腔内注射によって行った。コントロールマウスを溶媒で処理した。3〜6匹の動物を、各群において処理した。動物を、疾患および腫瘍増殖の兆候について、1週間に3回モニターした。腫瘍体積を式(d2×D)/2を使用して概算した。ここで、dおよびDは、それぞれ、腫瘍の小さい直径および大きい直径を示す。マウスを、副作用の存在について注意深く観察し、そして病変の組織学的分析のための実験の終わりに犠牲にした。全ての実験を、施設倫理委員会(institutional ethical committee)によって提供される実験室動物使用のための倫理ガイドラインに従って実施した。
白血病細胞株(K562/S、K562/Vcr30、HL60/0およびHL60/Nov)は全て、方法ならびに実験1および2において記載されるように、ウエスタンブロッティング分析によってアッセイされるように、IGF−1Rを発現する。
白血病細胞株K562/S、K562/Nov、HL60/0およびHL60/Novを、実験7において記載されるように、96ウェルプレート中で培養した。24h後、細胞を、0.05μMピクロポドフィリンと同時インキュベートするかまたはしないで、異なる濃度の抗癌剤ビンクリスチンで72h処理した。この濃度におけるピクロポドフィリンは、腫瘍細胞における何らの検出可能な細胞死を引き起こさないことが証明された。次いで細胞生存率をアッセイした。各インヒビターおよび細胞株についてのIC50を以下に示す(表8)。結果は、3つの異なる実験に基づいている。
HaCaT細胞(これらは不死化したヒトケラチノサイトであり、乾癬についてのモデル細胞株を表す)を、10%胎児ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中7,000細胞/cm2の濃度で、6cmディッシュまたは96ウェルプレート(ウェル中の培地容量は、100μlであった)中に播種した。細胞が50,000細胞/cm2の濃度に達したとき、これらを、培養培地中0または0.05μMの最終濃度までの、ポドフィロトキシンまたはピクロポドフィリンと共にインキュベートした。0μMでの処置は、未処理のコントロールを示す。1hのインキュベーション後、6cmディッシュ中の細胞を、実験1において記載されるように、IGF−1Rリン酸化のアッセイおよび定量化のために収穫した。48hのインキュベーション後、96ウェルプレート中で培養した細胞を、上記のように、細胞増殖キットIIによって細胞生存率についてアッセイした。
IGF−1は、動脈細胞についての増殖プロモーターおよび心臓血管疾患(例えば、冠動脈硬化症班発生および冠動脈血管形成後の再狭窄)のメディエーターである。これらの事象における重要な役割は、血管壁におけるVSMCの過度の増殖(これは、IGF−1によって引き起こされる)によって果たされている(Bayes−Genis Aら、同書)。実験のために、単離かつ培養されたVSMCを、24ウェルプレート中で増殖し(20.000〜40.000細胞/ウェル)、IGF−1Rリン酸化ならびにVSMCの増殖および生存に対するポドフィロトキシンおよびピクロポドフィリンの効果に関する研究を、本質的に実験9において記載されるように行った。さらに、細胞増殖を、DNAへの(3H)チミジン取り込み(DNA合成)およびタンパク質への(3H)ロイシン取り込み(タンパク質合成)を測定することによって評価する。前者の場合、細胞(20.000〜40.000細胞/ウェル)を、24ウェルプレート中で増殖し、異なる濃度(0〜1.0μM)のポドフィロトキシンまたはピクロポドフィリンを含むかまたは含まず、1μCi/ml(3H)チミジンおよびIGF−1(nM〜μM濃度;単独または胎児ウシ血清中に存在)を添加して、24時間インキュベートする。次いで、細胞を、F12培地で洗浄し、DNAを5%氷冷トリクロロ酢酸(TCA)で沈殿させる。DNAを0.1M KOH中で可溶化し、各ウェルにおける500μlの溶液を、シンチレーション液に添加し、放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。後者の場合において、細胞は、上記のように24時間インキュベートするが、(3H)チミジンは使用しない。代わりに(3H)ロイシンが、1μCi/mlの濃度に達するまで添加されるが、最後90分のインキュベーション間のみである。次いで、細胞を冷リン酸緩衝化生理食塩水(pH=7.4)でリンスし、タンパク質は、氷冷TCA中に沈殿する。タンパク質を、以下を含む溶液中に可溶化する:5%ドデシル硫酸ナトリウム、20mM Na2CO3および2mM EDTA。放射能は、液体シンチレーションカウンティングによって測定する。VSMCにおけるDNAおよびタンパク質合成に関する結果は、コントロール細胞(すなわち、ポドフィロトキシンまたはピクロポドフィリンなしでインキュベートされるもの)の%として表される。
ピクロポドフィリンおよびラクトン環中にシス立体配置を有するその誘導体は、IGF−1Rチロシンキナーゼの高度に特異的かつ強力なインヒビターであることが示された。
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