JP5012505B2 - 抗肥満活性剤及び肥満抑制方法 - Google Patents

Description

本願発明は、カロテノイドの一種であるフコキサンチノール、特にホヤから抽出したフコキサンチノールを有効成分とする抗肥満活性剤及び肥満抑制方法に関するものである。

フコキサンチノールは、同じカロテノイドの一種であるフコキサンチンの−ＯＣＯＣＨ３基を−ＯＨ基に置換したものである。フコキサンチンは、海藻類、特に褐藻に特異的に含まれ、強い抗癌活性を示すことが報告されている（非特許文献１）。非特許文献１によれば、フコキサンチンの抗癌活性は、癌細胞の核内転写因子（ＰＰＡＲγ：proxisome proliferator activated receptor γ）の働きの増大と密接な関係を持ち、ＰＰＡＲγのリガンドとして知られる薬剤、トログリタゾンよりも遙かに強い増殖抑制作用を呈する。この場合、トログリタゾンとフコキサンチンとを併用することにより、大腸癌細胞の増殖がそれぞれ単独で添加するよりもより強く抑制されることとなる。

さらに、フコキサンチンは抗肥満活性としても強い作用があることが報告されている（非特許文献２）。非特許文献２によれば、フコキサンチンが脂肪細胞に対する分化抑制作用を示すことが明らかになり、ワカメ油投与による動物実験での体重及びＷＡＴ（白色脂肪組織）の減少は、フコキサンチンによる脂肪細胞への分化の抑制と、ＷＡＴ中のＰＰＡＲγに支配されたＵＣＰ１（脱共役蛋白質）の発現による脂肪燃焼に拠ることが明らかになった。

以上のようにフコキサンチンは、抗癌活性剤及び抗肥満活性剤として強い作用を呈することが明らかになっている。ここで、抗肥満に関する機能性食品素材に議論を絞ると、特に我が国ではカテキンやフラバンジェノールなどのポリフェノール類がすでに実用化、製品化され一市場を形成している。また、欧米においても肥満から生じる健康障害によってより強く健康志向が高まっており、機能性食品素材の開発が激化している。しかしながら、現在までに抗肥満活性である機能性食品素材の研究は始まったばかりで、海藻類以外にも抗肥満活性を呈する機能性食品素材が見い出される可能性は十分にあり得る。然も、その作用効果がフコキサンチンより強い場合もあり得る。抗肥満活性剤が、資源的に豊富な物質から手軽に且つ安価に抽出できることになれば、機能性食品素材の市場も更なる拡大を実現することが可能である。

なお、特許文献１は、フコキサンチンの精製方法に関する発明であり、海藻類から純度の高いフキコサンチンを得る方法が開示されている。また、特許文献２は、フコキサンチンを用いた抗酸化剤及び抗酸化方法に関する発明であり、珪藻類等の藻類から抽出したフコキサンチンの抗酸化能に着目して、これを食品、化粧品及び医薬品に用いて抗酸化剤とするものである。特許文献１、２共にフコキサンチノールへの言及はない。

なお、抗酸化剤としての作用とは、次のような作用を言う。体内で必要な酸素の一部は、体内に取り入れられた後に、酸化力の強い活性酸素となる。この活性酸素は細胞を傷つけたり、体内の脂肪を酸化して有害な過酸化脂質に変えたりする。この過酸化脂質が血液をどろどろにして動脈硬化や高血圧を引き起こす。このような活性酸素の働きを抑制する物質を抗酸化剤という。

Masashi Hosokawa, Masashiro Kudo, Hayato Maeda, Hiroyuki Kohno, Takuji Tanaka, Kazuo Miyashita," Fucoxanthin induces apoptosis and enhances the antiproliferative effect of the PPARγ ligand, troglitazone, on colon cancer cells", Biochimica et Biophysica Acta, 1675, 113-119 (2004). 今野賢亮、前多隼人、細川雅史、宮下和夫、船山桂、仲野隆久、「ワカメ油による抗肥満作用」、２００５年度日本水産学会大会講演要旨集、p130． 特開２００４−７５６３４号公報 特開平７−２２４２７８号公報

前述したように、フコキサンチンは抗肥満活性剤として有効であるが、褐藻類の成熟体に含まれるフコキサンチンの量は少なく、実用的な量を得るには時間と費用がかかるという問題点があった。また、抗肥満活性剤としての効果も更に強い効果を示すものが要望されていた。従って、本願発明の目的は従来技術の欠点を解消し、フコキサンチンより更に強い抗肥満活性を呈するカロテノイドを用いた抗肥満活性剤及び肥満抑制方法を提供することにある。

本願発明の内臓脂肪軽減剤は、フコキサンチノールを有効成分として成ることを特徴とする。本発明者らは、フコキサンチンより内臓脂肪軽減作用が強いカロテノイドは何か、また経済的に取得するにはどんな材料を用いればよいか、鋭意研究を重ね、その答えをフコキサンチノールに見い出した。多くの実験によりフコキサンチノールの抗肥満活性の効果はフコキサンチンより強いことを確認した。従って、フコキサンチンより少ない量で、或いは同量ならばフコキサンチンより効果が大なる内臓脂肪軽減剤を実現することが可能となった。

また、本願発明の内臓脂肪軽減剤は、フコキサンチノールを医薬品に添加して成ることを特徴とする。フコキサンチノールそれ自体で内臓脂肪軽減剤であることは前述の通りである。このフコキサンチノールを医薬品に添加することで、内臓脂肪軽減の医薬品などを構成することが出来る。この場合、含有するフコキサンチノールの量により内臓脂肪軽減の作用の強さを制御することが出来るので、目的に応じてその量を適宜調整することが可能である。本願発明では、フコキサンチノールを添加した医薬品もフコキサンチノール内臓脂肪軽減剤と称している。

本願発明の内臓脂肪軽減剤は、前記フコキサンチノールは生体から抽出したことを特徴とする。前記生体はホヤが望ましい。ホヤ（海鞘、Ascidian）は、脊索動物門尾策動物亜門ホヤ綱に属する海産動物の総称であり、全国的に生息している。このようにホヤは資源としては豊富に存在する。本願発明では特にホヤの内臓と殻からフコキサンチノールを抽出する。従って、食料としての身は身で利用し、残った殻と内臓より抽出するので、実用的なフコキサンチノールの量を得るのに時間と費用がそれ程かからず、従来技術の問題点を解決することが出来る。

また、ホヤから抽出したフコキサンチノールは、これまでのワカメより分取されるフコキサンチンより強い内臓脂肪軽減を示すことが研究により明らかになった。従って、従来の課題であったより強い内臓脂肪軽減を示すカロテノイドを見つけることが出来た。

本願発明の内臓脂肪軽減剤は、ワカメから分取したフコキサンチンを添加したことを特徴とする。即ち、本願発明のフコキサンチノールに従来から得られているフコキサンチンを加えた内臓脂肪軽減剤である。このように構成することで、フコキサンチンの内臓脂肪軽減とフコキサンチノールの内臓脂肪軽減の作用とが重なり合って更なる内臓脂肪軽減を呈することとなる。添加するフコキサンチン及びフコキサンチノールは適宜その量を調整することが出来ることは言うまでも無い。

これまでのワカメから抽出されるフコキサンチンより強い抗肥満活性を示すフコキサンチノールをホヤから抽出することが可能となった。これにより、抗肥満活性剤を今まで以上に安価で大量に取得することが可能となった。また、安価で効果が絶大な肥満抑制方法を提供することが可能になった。このフコキサンチノールを食品、肥料、農薬、化粧品又は医薬品に添加することで、抗肥満活性の機能性食品素材、抗肥満活性の肥料、抗肥満活性の医薬品などを構成することが出来るので、とりわけ機能性食品素材の市場を拡大することに大きく寄与することが予想される。

以下、本願発明のフコキサンチノール及びそれを用いた抗肥満活性剤の実施の形態について図を参照しながら説明する。但し、本願発明はこの実施の形態だけに限定されるものではない。

本願発明のフコキサンチノールの抽出方法を説明する。ホヤ中に含まれるカルテノイドを全て抽出し、そして分離する方法を採用した。まず、ホヤの内臓と殻を取り出し、その内臓と殻の全重量に対して２倍量のアセトンを用いて４日間抽出する。この操作を２回繰り返す。

ホヤのアセトン抽出物をシリカゲルカラムに供し、n-ヘキサンとジエチルエーテルを体積比で９５：５で混合したものを使って中性脂質、主にトリアシルグリセロールを除去した後、アセトンを用いて粗カロテノイド画分を溶出する。

粗カロテノイド画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィープレートにスポットし、アセトンとn-ヘキサンを体積比で４：６に混合したもので展開し、黄色や橙色を呈したスポットを目印に、大まかに５つの画分に分け、アセトンを用いてシリカゲルから溶出した。

図１に、ホヤ抽出物の薄相クロマトグラムを示す。写真撮影した薄相クロマトグラムを模式的に描写した。Fraction１から５に、各種カロテノイドが抽出されている。具体的には、Fraction３にハロシンチアキサンチン、Fraction4にフコキサンチノールが含まれていた。それ故、細胞試験及び構造分析をするために、更に下記の精製を行った。

Fraction３（ハロシンチアキサンチン）の精製：ＲＰ−８逆相薄層クロマトグラフィープレート（ＲＰ−８：オクチルシランという分離用の担体）にスポットし、メタノールと水を体積比で９：１に混合したもので展開後、橙色の画分を分離し、アセトンで溶出した。

Fraction ４（フコキサンチノール）の精製：ＲＰ−８逆相薄層クロマトグラフィープレート（ＲＰ−１８：オクタデシルシランという分離用の担体）にスポットし、メタノールとアセトンと水を体積比で４：６：２で混合したもので展開後、橙色の画分を分離し、アセトンで溶出した。

ハロシンチアキサンチン及びフコキサンチノールの構造は、質量分析及びＮＭＲ分析により同定した。図２は、同定したフコキサンチノールの構造式を示す。

次いで、ホヤから抽出したフコキサンチノールとフコキサンチンの抗肥満活性について説明する。実験方法は下の通りである。

細胞培養：３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞はＦＢＳを１０％（体積比）含むDMEM培地を用いて３７℃、ＣＯ_２（５％）存在下で培養した。なお、ＦＢＳは５６℃で３０分間非働化したものを用いた。また、細胞は実験ごとに液体窒素中に保存した新しい細胞を使用した。９６穴マイクロプレートに１wellに対して、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を５×１０^４ cellsまき、４８時間前培養した。

次に、培地をwellから取り除き、Insulin（１０μｇ／ｍL）、Dexametazone（０．２５μｇ／ｍL）、ＩＢＭＸ（０．５ｍM）を含むＤＭＥＭ培地を加え、さらに４８時間培養した。その後、Insulinのみを５μｇ／ｍL含むDMEM培地を用いて培地交換を４日間隔で培地交換を繰り返しながら、脂肪細胞への分化誘導を行った。その際、培地にフコキサンチノールを添加し分化誘導に及ぼす影響を調べた。

オイルレッド０による細胞内脂質の定量：９６穴マイクロプレート中で培養した細胞をホルマリンにより固定後、オイルレッド０液を加え、細胞内の脂質を染色した。染色後、蒸留水で３回洗浄し、細胞観察を行った。次いで、イソプロパノ−ルを各wellに加え、色素を溶出させマイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸光値を測定した。

ＧＰＤＨ活性測定：ＧＰＤＨ (glycerol-３-phosphate-dehydro- genase )活性の測定にはＧＰＤＨ活性測定キット(ホクドー(株))を用いた。即ち、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を４８時間、２４wellプレートにて前培養後、上記と同様の方法で脂肪細胞への分化誘導を行った。培養後培地を取り除き、ＰＢＳにてwellを洗浄後、酵素抽出溶液をwellに加え細胞を回収した。次に細胞を超音波破砕機にて破砕後、１２８００ｇで遠心分離し、上清を回収し、酵素活性を測定した。

以下、得られた結果について図３〜５を用いて詳述する。
脂肪蓄積抑制効果：図３は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の分化に伴う脂肪蓄積に及ぼすフコキサンチノールの影響を示した説明図である。縦軸は、オイルレッド０による細胞内脂質の定量の際のマイクロプレートリーダーを用いて測定される４９０ｎｍの吸光値であり、この値が高いほど脂肪細胞が多いことを意味する。図３から明らかなように、前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）は分化することより細胞内には多くの脂肪が蓄積されている。これに対して、フコキサンチノール添加によりその蓄積は顕著に抑制されていることが解かる。フコキサンチノールの添加量に比例して、その抑制効果が如実に現れている。この結果は、細胞レベルでのフコキサンチノールの抗肥満作用を示すものである。従って、フコキサンチノールを添加することは、フコキサンチノールを抗肥満活性剤として添加していることと同じ意味を有する。

図４は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の分化に伴う脂肪蓄積に及ぼすフコキサンチンとフコキサンチノールの影響を示した説明図である。図３にワカメから分取したフコキサンチンの活性を示した図になっている。図４から明らかなように、ワカメから分取したフコキサンチンの活性の効果はフコキサンチノールよりも明らかに低い。なお、図示してはいないが、ワカメから分取したフコキサンチンとホヤから抽出したフコキサンチノールを同時に添加すれば、それぞれの効果が重畳されるので、更なる抗肥満活性が期待できる。ホヤから抽出されたフコキサンチノールにワカメから分取されたフコキサンチンを添加することは必要に応じて行えば良いことである。

図５は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の分化に伴うＧＰＤＨ活性増大に及ぼすフコキサンチンとフコキサンチノールの影響を示した説明図である。縦軸は、前駆脂肪細胞を１とした時の相対ＧＰＤＨ活性であり、その値が大きい程活性が高いことを意味する。図５より、細胞内での脂肪蓄積に関与する酵素（ＧＰＤＨ）活性は、フコキサンチノール添加によりこの酵素活性が低下していることが明らかである。この結果は、フコキサンチノールの脂肪蓄積抑制効果の少なくとも一部が、こうした脂肪合成酵素活性の阻害によることを示すものである。一方、ワカメから分取したフコキサンチンでは有意な差は認められなかった。

次に動物実験を行った結果について説明する。
動物と飼料：動物実験にはＫＫ−Ａｙマウス（雌；３週齢）を用いた。試験餌料はＡＩＮ−９３Ｇ組成に従って調製した。飼料中の脂質は動物１３．５％にした。フコキサンチノール添加群では飼料油脂の０．２％をフコキサンチノールに置換した。飼料は、調製後直ちに真空パックして給餌まで−２０℃以下に保存した。

飼育と分析：１週間対照群用の飼料により予備飼育を行い、成長に異常のない固体を各群６匹ずつ体重にばらつきがないように群分けした。滅菌ウッドチップ床敷を入れたプラスチックゲージに群ごとに２匹ずつ入れて飼育した。飼育室の温度は２３±１℃、湿度５０％、明暗を１２時間周期とした。飼料及び水は自由摂取とし、２４日間実験試料による飼育を行った。

給餌期間終了後、１２時間の絶食を行った。ついで、エーテル麻酔下で首よりＥＤＴＡ下採血を行った。臓器は採血後直ちに摘出し、生理食塩水でよく洗い充分に脱血した。肝臓は秤量の後、分析に供するまで−４０℃以下に保存した。血液中のレプチンの濃度および血糖値濃度は市販のキットを用いて測定した。

飼育期間中および飼育終了後の動物の状態：対照群（コントロール）とフコキサンチン投与群で体重増加と摂餌量に各群間に有意差は認められず、また摂餌状態、毛艶、行動にも異常がないことを確認した。また、肝臓重量、小腸重量、肝臓脂質重量にも両群で差は認められなかった。

フコキサンチノールの内臓脂肪軽減作用：図６は、体重１００ｇあたりの内臓脂肪重量（ｇ）を対照群とフコキサンチノール投与群とで比較したものである。図６に示したように、フコキサンチノール投与により、内臓脂肪重量の有意な減少が認められた。このことより、フキサンチノールが脂肪減少作用を有することが分かった。

フコキサンチノールによるレプチン及び血糖値低下作用：図７は、血中のレプチン濃度（ｐｇ／ｍｌ）を対照群とフコキサンチノール投与群とで比較したものである。実験に用いたＫＫ−Ａｙマウスは肥満・糖尿病病態マウスであり、内臓脂肪の増大と血糖値の増加が起こる。内臓脂肪の増大により血中のレプチン濃度が増加するが、フコキサンチノールによりレプチン濃度が有意に減少することが認められた。

図８は、血糖値濃度（ｍｇ／ｄｌ）を対照群とフコキサンチノール投与群とで比較したものである。図７から解るように血糖値もフコキサンチノールの投与により減少することが認められた。これらの結果は、フコキサンチノールによる肥満に伴う関連血中因子の改善効果を示すものである。

以上で説明したように、発明者らは抗肥満活性を示すカロテノイドを種々の分野及び材料において調査、研究を行うことによって、ホヤからフコキサンチノールを抽出し、その抗肥満活性の作用がワカメから分取されるフコキサンチンより強いことを明確にした。これにより、抗肥満活性剤を今まで以上に安価で大量に取得することが可能となり、効果的な肥満抑制方法を確立することができた。フコキサンチノールを添加した機能性食品は、機能性食品素材の市場を拡大することに大きく寄与することが予想される。

本願発明は、フコキサンチノールを有効成分として成る抗肥満活性剤であり、また肥満の抑制にフコキサンチノールを用いる肥満抑制方法である。フコキサンチノールはホヤから抽出したものが望ましい。このフコキサンチノールを添加した食品は機能性食品として作用する。従って、産業上は食品、とりわけ機能性食品素材の分野で活用することが可能であり、その他にも医学、農業の分野で応用することが可能である。

本願発明のフコキサンチノールに関わり、ホヤ抽出物の薄相クロマトグラムを示す。 本願発明のフコキサンチノールの構造式を示す。 本願発明のフコキサンチノールの３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の分化に伴う脂肪蓄積に及ぼす影響を示した説明図である。 本願発明のフコキサンチノールの３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の分化に伴う脂肪蓄積に及ぼす影響を示した説明図である。但し、フコキサンチンと比較して示している。 本願発明のフコキサンチノールの３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の分化に伴うＧＰＤＨ活性増大に及ぼす影響を示した説明図である。但し、フコキサンチンと比較して示している。 本願発明のフコキサンチノールの動物実験における内臓脂肪重量に及ぼす影響を示した説明図である。 本願発明のフコキサンチノールの動物実験における血糖値濃度に及ぼす影響を示した説明図である。 本願発明のフコキサンチノールの動物実験における血中レプチン濃度に及ぼす影響を示した説明図である。

Claims (5)

1. フコキサンチノールを有効成分として成ることを特徴とする内臓脂肪軽減剤。
2. フコキサンチノールを医薬品に添加して成ることを特徴とする請求項１記載の内臓脂肪軽減剤。
3. 前記フコキサンチノールは生体から抽出したことを特徴とする請求項１又は２に記載の内臓脂肪軽減剤。
4. 前記生体はホヤであることを特徴とする請求項３に記載の内臓脂肪軽減剤。
5. ワカメから分取したフコキサンチンを添加したことを特徴とする請求項１乃至４の何れか一に記載の内臓脂肪軽減剤。

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