JP5888763B2 - 発酵ソバ抽出物 - Google Patents
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Description
HPLC分析機器
HPLCシステム:Prominence (株式会社島津製作所)
構成 ワークステーション:LC-solution
システムコントローラー:CBM-20A
送液ユニット:LC-20AD
カラムオーブン:CTO-10A
検出器:SPD-M20A
HPLC分析条件 (1)
カラム:CHEMCOBOND
5-ODS-W (4.6×150 mm, 5 micro
m)
移動相:トリフルオロ酢酸(TFA)含有水(pH 2.0)
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm
このソバ抽出物は、本発明のようなソバ植物体発酵物の抽出物ではなく、しかも、結実前のソバの若株の粉末そのものであり、上記と同様に、本発明の抽出物とは含有する成分が異なるものである。
しかしながら、この成分は、本発明の血圧降下作用および血管拡張作用活性成分のペプチドとは全く化学構造が異なるものである。
しかしながら、これらのペプチドも本発明の血圧降下作用および血管拡張作用活性成分のペプチドとは全く異なるものである。
この食品や、飲料は、ソバ発芽体搾汁の発酵物をそのまま凍結乾燥して得た粉末あるいはソバの芽の搾汁を発酵して得た上清液そのものであり、本発明の抽出物とは含有する成分において全く異なるものである。
本方法で分離された画分は、明細書記載からも明らかなとおり、下記のHPLC分析条件(2)で、保持時間約4分〜約17分の範囲において複数のピークとして検出される成分を含むものであり、本発明の抽出物とは全く成分の異なるものである。
カラム:CHEMCOBOND
5-ODS-W (4.6×150 mm, 5 micro
m)
移動相:TFA含有水(pH 2.0)
流速:0.8 ml/min
分離温度:19度(C)
検出波長:215 nm
また、これまでに、チロシン(Tyr)については、降圧作用を示すことが報告されている(非特許文献1)ものの、オリゴペプチドについては、血圧降下作用を有することについては全く報告されていない。また、これらのアミノ酸またはペプチドの血管拡張作用については全く報告例が無い。
[1] ソバ植物体、好ましくは発芽して間もないソバ幼植物体の破砕物を乳酸菌発酵処理して得られる発酵ソバ上清の水溶性抽出物であって、少なくとも、下記HPLC分析条件(1)で保持時間約18分〜約21分の範囲においてほぼ単一のピーク(ピークY)として検出される成分(成分Y)を含むことを特徴とする抽出物、
HPLC分析条件(1)
カラム:CHEMCOBOND
5-ODS-W (4.6×150 mm, 5 micro
m)
移動相:TFA含有水(pH 2.0)
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm、
[2] ソバ植物体が、ソバ(Fagopyrum esulentum)またはダッタンソバ(Fagopyrum
tataricum)であることを特徴とする、[1]に記載の抽出物、
[3] 乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus
casei)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ラクティス(Streptococcus lactis)、ストレプトコッカス・クレモリス(Streptococcus cremoris)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)の群から選ばれる一種であることを特徴とする、[1]に記載の抽出物、
[4] 乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)であることを特徴とする、[3]に記載の抽出物、
[5] 乳酸菌発酵処理が、殺菌処理したソバ植物体破砕物に、[3]に記載の乳酸菌の群から選ばれる一種を添加し、常温で発酵させるものであることを特徴とする、[1]に記載の抽出物、
[6] 以下の工程によって抽出、分取されたものであることを特徴とする、[1]に記載の抽出物、
工程1:ソバ植物体を殺菌液に浸して殺菌した後、水切りし、破砕機で破砕してソバ植物体破砕物を得る、
工程2:ソバ植物体破砕物を、乳酸菌を用いて発酵させ、発酵物を遠心分離し、その上清を減圧濃縮、凍結乾燥して発酵ソバ上清粉末を得る、
工程3:発酵ソバ上清粉末を固相抽出により前処理したものを、下記HPLC分析条件(1)で、保持時間約18分〜約21分の範囲においてほぼ単一のピーク(ピークY)として検出される成分(成分Y)が検出される画分を集めて減圧濃縮、凍結乾燥して発酵ソバ抽出物を得る、
HPLC分析条件 (1)
カラム:CHEMCOBOND
5-ODS-W (4.6×150 mm, 5 micro
m)
移動相:TFA含有水(pH 2.0)
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm、
および、
[7] 工程1の殺菌処理が、ソバ植物体を次亜塩素酸ナトリウム水溶液に浸して殺菌するものであり、工程2の発酵処理が、[3]に記載の乳酸菌の群から選ばれる一種を添加し、常温で2週間発酵させるものであり、工程3の固相抽出法が、カラムとしてSep-Pak(登録商標) Vac C18カートリッジ(ウォーターズ社製)を用い、溶出液としてTFA含有水(pH 2.0):メタノール=1:9混合液を用いるものであることを特徴とする、[6]に記載の抽出物、
に関する。
[8] [1]に記載の抽出物に含まれる血圧降下作用および血管拡張作用活性成分であって、
化学式、
YAFDVWY(Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr) ・・・・ (1)
化学式、
WTFR(Trp-Thr-Phe-Arg) ・・・・ (2)
化学式、
DVWY(Asp-Val-Trp-Tyr) ・・・・ (3)
または化学式、
VAE(Val-Ala-Glu) ・・・・ (4)
の何れかで表されるオリゴペプチド、
に関する。
[9] 活性成分として、チロシン (Tyr)、並びにオリゴペプチドのYAFDVWY(Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr)、DVWY(Asp-Val-Trp-Tyr)、FDART(Phe-Asp-Ala-Arg-Thr)、WTFR(Trp-Thr-Phe-Arg)、FQ(Phe-Gln)、VVG(Val-Val-Gly)およびVAE(Val-Ala-Glu)の群から選ばれる少なくとも1種または2種以上を含有することを特徴とする、[1]に記載の抽出物、および、
[10] 活性成分として、さらに、下記HPLC分析条件(3)で保持時間約37分にピーク(ピークI)を示す成分(成分I)、保持時間約38分にピーク(ピークII)を示す成分(成分II)、保持時間約59分にピーク(ピークIII)を示す成分(成分III)および保持時間約65分にピーク(ピークIV)を示す成分(成分IV)の群から選ばれる少なくとも1種または2種以上を含有することを特徴とする、[9]に記載の抽出物。
HPLC分析条件 (3)
カラム:TSKgel
Amide-80 (4.6×250 mm, 5 micro
m)
移動相A:TFA含有水(pH 2.0)
移動相B:アセトニトリル
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm
グラジエント:5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→25% (20→80分)、
25→55% (80→105分)、55% (105→125分)、
に関する。
[11] [1]〜 [10]の何れかに記載の抽出物および[8]に記載のオリゴペプチドの何れかを活性成分として含有することを特徴とする食品または医薬組成物、
[12] 活性成分が、オリゴペプチドのYAFDVWY(Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr)、DVWY(Asp-Val-Trp-Tyr)、FDART(Phe-Asp-Ala-Arg-Thr)、WTFR(Trp-Thr-Phe-Arg)、FQ(Phe-Gln)、VVG(Val-Val-Gly)およびVAE(Val-Ala-Glu)、並びに、 [10]に記載の成分I、成分II、成分III、および成分IVの群から選ばれる少なくとも1種または2種以上である、[11]に記載の食品または医薬組成物、
[13] 活性成分が、DVWY(Asp-Val-Trp-Tyr)、FQ(Phe-Gln)、VVG(Val-Val-Gly)および成分IIの群から選ばれる少なくとも1種または2種以上である、[12]に記載の食品または医薬組成物に関する。
カラム:CHEMCOBOND
5-ODS-W (4.6×150 mm, 5 micro
m)
移動相:TFA含有水(pH 2.0)
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm
カラム:TSKgel
Amide-80 (4.6×250 mm, 5 micro
m)
移動相A:TFA含有水(pH 2.0)
移動相B:アセトニトリル
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm
グラジエント:5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→25% (20→80分)、
25→55% (80→105分)、55% (105→125分)、
TSKgel Amide-80カラムによる分離だけでは、ピークの重なりが確認され、物質の同定には分離が不十分であった。このため、TOSOH TSKgel Amide-80カラムで成分Y試料の分離を行う前にもう1ステップ他のカラムで分離を行うHPLC分離が必要であると考え、前処理方法について検討を加えた。
このことから、出来るだけ濃い濃度で試料をインジェクトするためには、成分Yを移動相Aに溶解させる分離モードが好ましく、さらに、ある程度試料の濃度が濃くても対応できるカラムが望ましいと考えられた。
カラム:Superdex
Peptide 10/300 GL (10×300 mm, 13 micro m)
移動相:TFA含有水(pH 2.0)
流速:0.5 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm、
TSKgel Amide-80 (4.6×250 mm, 5 micro
m)を用いて細分画を行った。
HPLC分析条件は、移動相AにTFA含有水(pH 2.0)、移動相Bにアセトニトリルをそれぞれ用い、流速0.8 ml/min、分離温度30度(C)、検出波長215 nm、注入量20 micro lで行った。
また、画分Aは移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→19% (20→56分)、19→55% (56 →60分)、55% (60→75分)の濃度でグラジエントを変化させ、画分Bは移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→22% (20→68分)、22→55% (68 →70分)、55% (70→85分)の濃度でグラジエントを変化させ、画分Cは移動相Aを5 % (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→23% (20→72分)、23→55% (72 →74分)、55% (74→90分)の濃度でグラジエントを変化させ、画分DおよびEは移動相Aを5 % (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→16% (20→44分)、16→55% (44 →48分)、55% (48→65分)の濃度でグラジエントを変化させた。
その結果、下記HPLC分析条件 (3)での分析において、約3〜7分および約12分にピークを示す成分については、オリゴペプチドのYAFDVWY(Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr)、DVWY(Asp-Val-Trp-Tyr)、FDART(Phe-Asp-Ala-Arg-Thr)およびWTFR(Trp-Thr-Phe-Arg)の混合物であると同定された。
約16〜20分にピークを示す成分については、チロシン(Tyr)と同定できた。また、約28〜30分にピークを示す成分については、オリゴペプチドのVVG(Val-Val-Gly)、FQ (Phe-Gln)およびVAE (Val-Ala-Glu)の混合物であると同定できた。
カラム:TSKgel
Amide-80 (4.6×250 mm, 5 micro
m)
移動相A:TFA含有水(pH 2.0)
移動相B:アセトニトリル
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm
グラジエント:5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→25% (20→80分)、
25→55% (80→105分)、55% (105→125分)、
一方、拡張期血圧に対する血圧降下作用においては、オリゴペプチドのFQ(Phe-Gln)、VVG(Val-Val-Gly)、成分Iおよび成分IIが特に顕著な降圧作用を示した。
methyl ester)共存下では、発酵ソバ上清粉末およびの血管拡張作用が顕著に抑制されたことから血管内皮に作用して血管拡張を引き起こしていることが示唆された。
工程1:ソバ植物体を殺菌液に浸して殺菌した後、水切りし、破砕機で破砕してソバ植物体破砕物を得る。
工程2:ソバ植物体破砕物を、微生物を用いて発酵させ、発酵液を遠心分離し、その上清を減圧濃縮、凍結乾燥して発酵ソバ上清粉末を得る。
工程3:固相抽出法により前処理した発酵ソバ上清粉末を、下記HPLC分析条件(1)で、保持時間約21分にピーク(ピークY)を示す成分(成分Y)が検出される画分を集めて減圧濃縮、凍結乾燥して発酵ソバ抽出物を得る。
HPLC分析条件 (1)
カラム:CHEMCOBOND
5-ODS-W (4.6×150 mm, 5 micro
m)
移動相:TFA含有水(pH 2.0)
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm、
本発明の発酵ソバ抽出物に含まれる活性成分の中の新規なオリゴペプチドのYAFDVWY(Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr)(1)は、例えば、下記、反応式で示される合成チャートに従って合成することができる。
tataricum)を挙げることができる。
casei)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)など、および、ストレプトコッカス属乳酸菌のストレプトコッカス・ラクティス(Streptococcus lactis)、ストレプトコッカス・クレモリス(Streptococcus cremoris)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)などを挙げることができ、その中では、ラクトバチルス属乳酸菌が好ましく、中でも、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)が最も好ましい。
約15 cmに成長したソバ幼植物体20 kgを、有効塩素濃度100〜200 ppmの次亜塩素酸ナトリウム液約20Lに浸して殺菌した。殺菌したソバ幼植物体を水切りし、約2 cmの長さにカットした後ジューサーで破砕してソバ幼植物体破砕物を得た。
上記で得たソバ幼植物体破砕物の0.36
kgを分取し、これを50 ml容遠沈管10本に36 gずつ秤量し、遠心分離(5度(C), 4000 rpm, 30分)を行い、上清を回収した。回収した上清について減圧濃縮・凍結乾燥を行い、4.27 gの発芽ソバ試料を得た。
残りのソバ幼植物体搾汁液に、ソバ幼植物体搾汁液1 kgあたり26.7 mlの乳酸菌スターターを添加し、タンクに移した。ソバ幼植物体搾汁液を移したポリタンクは、脱気をした後に不活性化ガスで置換を行った。毎日1回攪拌をし、常温で2週間静置することにより、発酵ソバを製造した。
上記で製造した、発酵ソバ8.09
kgを500 ml容遠沈管20本に405 gずつ秤量し、遠心分離(5度(C), 4000 rpm, 30分)を行い、上清を回収した。回収した上清について減圧濃縮・凍結乾燥を行い、48.95 gの発酵ソバ試料を得た。
発芽ソバ試料と発酵ソバ試料の血圧降下作用測定
実施例1で製造した発芽ソバ試料および発酵ソバ試料を試験試料として、以下の試験を行った。
試験には14週齢の雄性SHR/Izm 10匹を日本チャールス・リバー株式会社より入手し、7日間の馴化飼育後、15週齢で試料の経口投与および血圧測定を行った。
実験に用いたラットは搬入後、金属製のケージに個別に収容し、クリーン条件下で飼育した。飼育室の環境は、室温23±4度(C)、湿度50±20%、明暗条件は明期が12時間(8〜20時)、残り12時間を暗期とした。馴化飼育期間中は市販固形飼料CRF-1(日本チャールス・リバー株式会社)と水道水の自由摂取で飼育した。試験物質投与前日に各個体の体重および血圧(収縮期血圧、拡張期血圧)を測定した後、各群内の平均体重および血圧が同程度になるように1群6匹ずつ、2群(発芽ソバ試料投与群、発酵ソバ試料投与群)に群分けを行った。また、試験物質の経口投与前に、14〜16時間の絶食を行った。
各試験物質を純水に溶解させた後、ステンレス製経口胃ゾンデ(株式会社夏目製作所)を用いて単回経口投与を行った。投与量は、発芽ソバ試料および発酵ソバ試料共に、ラットの体重1 kgあたり1 mg/kg(以下1 mg/kg b.w.)とした。
各試料を経口投与後、0、3、6、9、および24時間後にテイルカフ法で収縮期血圧、拡張期血圧をそれぞれ測定した。
試験物質投与後、0、3、6、9、および24時間後の血圧(収縮期血圧、拡張期血圧)を、0時間での血圧と比較した経時的な血圧変化の値(平均値±標準誤差)を求めた。また、各時間での発酵ソバ試料投与群の血圧変化値と発芽ソバ試料投与群の血圧変化値を比較してStudentのt検定を行った。なお、本発明では、p<0.1を有意差があるとした。
収縮期血圧変化について、発芽ソバ試料投与群と発酵ソバ試料投与群を比較すると、投与3、6、および9時間後に収縮期血圧降下値に有意差が確認され、その平均値の差はそれぞれ25.5 mmHg(投与3時間後)、31.8 mmHg(投与6時間後)、13.0 mmHg(投与9時間後)であった。なお、発芽ソバ試料投与群では投与前と比較して、投与6時間後に13.6 mmHgの収縮期血圧降下が確認された。
また、拡張期血圧変化について、発芽ソバ試料投与群と発酵ソバ試料投与群を比較すると、投与3、6、および9時間後に拡張期血圧降下値に有意差が確認され、その平均値の差はそれぞれ33.8 mmHg(投与3時間後)、47.7 mmHg(投与6時間後)、37.7 mmHg(投与9時間後)であった。なお、発芽ソバ試料投与群では投与前と比較して、投与6時間後に7.1 mmHgの拡張期血圧降下が確認された。
収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表1および表2に示した。
発芽ソバ試料と発酵ソバ試料のHPLC分析測定
発芽ソバ試料および発酵ソバ試料をHPLC分析し、発酵ソバの発酵による変化を調べた。
実施例1で製造した発芽ソバ試料および発酵ソバ試料をそれぞれ1 mgずつ1.5 ml容マイクロチューブに秤量し、1 ml TFA含有水(pH 2.0)を加え、1 mg/mlの濃度に調製し、Millex-LH(登録商標)フィルター(0.45 micro l)を通したものをHPLC分析試料とした。
上記で調製した1 mg/mlの発芽ソバ試料、発酵ソバ試料を用いて、下記表3記載のHPLC分析条件(1)によりHPLC分析を行った。
発芽ソバ試料および発酵ソバ試料を1
mg/mlの濃度でHPLC分析した結果を図1に示す。
このピークXおよびピークYの保持時間は、その後の分析結果から、カラムの劣化により多少変動するものの、概ね、ピークXは保持時間約11分〜約13分の範囲内でほぼ単一ピークとして検出され、ピークYは保持時間約18分〜約21分の範囲内でほぼ単一ピークとして検出されることを確認した。
(1)成分Xおよび成分Y含有画分の分取(検討試験)
固相抽出カートリッジとしてSep-Pak(登録商標) Vac C18 カートリッジ(2 g、ウォーターズ社製)を用い、固相抽出溶媒としてTFA含有水(pH 2.0)、およびTFA含有水(pH 2.0):MeOH=9:1に調整したものを使用した。
カートリッジをMeOH
24 mlで活性化し、各固相抽出溶媒 30 mlで平衡化した後、実施例1で製造した発酵ソバ試料(50 mg/ml)1 mlをアプライした。その後、各固相抽出溶媒を40 ml加え、1.5 ml容チューブに1 mlずつ溶離液を回収した。得られた溶離液は減圧濃縮・凍結乾燥後、上記表3に示したHPLC分析条件(1)でHPLC分析を行い、ピークX、ピークYの面積値比較を行った。
また、固相抽出溶媒にTFA含有水(pH 2.0):MeOH=9:1を使用して固相抽出を行うと、ピークXは5 mlから13 mlの間に溶出され、ピークYは5 mlから12 mlの間に溶出され、両ピークの溶出時間が殆ど重なることが確認された。
このことから、TFA含有水(pH 2.0):MeOH=9:1を溶媒として固相抽出を行う方が、より短時間でピークX、ピークYが効率良く抽出できることが確認された。
上記でピークX、ピークYが効率良く抽出できることが確認された方法の、固相抽出溶媒にTFA含有水(pH 2.0):MeOH=9:1を使用する方法についてスケールアップを行った。なお、固相抽出カートリッジは、Sep-Pak(登録商標) Vac C18カートリッジ (ウォーターズ社製)を10 gに変更して行った。
Sep-Pak(登録商標)
Vac C18 カートリッジ
(10 g、ウォーターズ社製)を用い、固相抽出溶媒にTFA含有水(pH2.0):MeOH=9:1を用いて溶離液を10 mlずつ分取した。この結果、ピークXは溶出20 mlから90 ml、ピークYは溶出30 mlから90 mlの間に含まれていることが確認された。
さらに、ピークXおよびYの溶出時間を詳細に調べるため、同様の固相抽出条件で3 mlずつ溶離液を回収し、HPLC分析を行った。HPLC分析の結果から、溶出割合の低い36 mlより前の溶離液を除き、36から78 mlまでの溶離液を回収して、ピークXおよびピークYを含む試料を効率良く得ることができた。
上記で得たピークXおよびピークYを含む試料について、ODSカラムによるピークX、ピークYの精製を行った。
ピークXおよびピークYの分取にはCHEMCOBOND 5-ODS-W (4.6×150 mm)の分取用カラムである、CHEMCOBOND
5-ODS-W (20×250 mm)を用いた。
HPLC分析条件は、上記条件に加えて、移動相にTFA含有水(pH 2.0)を用い、流速10 ml/min、分離温度30度(C)、検出波長215 nm、注入量250 micro lで行った。HPLC分析条件を表5に示した。
また、ピークXおよびピークYを含む試料を50 mg/mlの濃度でHPLC分析を行った結果を図2に示した。
図2中に示したピークX、ピークYを分取し、減圧濃縮・凍結乾燥したものを、それぞれピークX試料、ピークY試料とした。
成分Xと成分Yの血圧降下作用測定
実施例2で得られたピークX試料、ピークY試料について、試験例1記載の方法と同様にして、血圧降下作用を測定した。
試験物質投与後、0、3、6、9、および24時間後に血圧(収縮期血圧、拡張期血圧)を測定し、0時間での血圧と比較した経時的な血圧変化の値(平均値±標準誤差)を求めた。また、試料投与群は、0.1 mg/kg投与群と0.01 mg/kg投与群の2群とし、対照群には、純水2 ml/kgを投与した。
各時間での試料投与群の血圧変化値と対照群の血圧変化値を比較してStudentのt検定を行った。
収縮期血圧変化について、試料投与群と対照群を比較すると、0.1 mg/kg投与群では投与3、6および9時間後に、0.01 mg/kg投与群では投与6時間後に、対照群と比較して有意差が見られた。また、0.1 mg/kg投与群では最大53.5 mmHgの、0.01 mg/kg投与群では最大30.0 mmHgの収縮期血圧の降下が見られた。
また、拡張期血圧変化について、試料投与群と対照群を比較すると、0.1 mg/kg投与群では対照群と比較して投与3、6および9時間後に有意差が見られた。0.01
mg/kg投与群では対照群と比較して投与6時間後に、有意差が見られた。また、0.1 mg/kg投与群では最大58.3 mmHgの、0.01 mg/kg投与群では最大25.0 mmHgの拡張期血圧の降下が見られた。
ピークX試料の収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表5および表6に示した。
収縮期血圧変化について、試料投与群と対照群を比較すると、0.1 mg/kg投与群では対照群と比較して投与3および 6時間後に有意差が見られた。0.01 mg/kg投与群では対照群と比較して投与3、6および9時間後に有意差が見られた。また、0.1 mg/kg投与群では最大41.1 mmHgの、0.01 mg/kg投与群では最大44.6 mmHgの収縮期血圧の降下が見られた。
また、拡張期血圧変化について、試料投与群と対照群を比較すると、0.1 mg/kg投与群では対照群と比較して投与3および6時間後に有意差が見られた。0.01 mg/kg投与群では対照群と比較して投与3、6および9時間後に有意差が見られた。また、0.1 mg/kg投与群では最大42.6 mmHgの、0.01 mg/kg投与群では最大51.8 mmHgの拡張期血圧の降下が見られた。
ピークY試料の収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表7および表8に示した。
実施例2と同様にして得たピークY試料を実験に用いた。
分画は2段階で行い、前処理の分画カラムとして、ゲル濾過カラムのSuperdex Peptide 10/300 GLカラムを用い、その後、TOSOH TSKgel Amide-80カラムで分離する方法を行った。
(1)ゲルろ過カラムによるピークY試料の分画
前処理として、ゲルろ過カラムを用いて、ピークY試料を分画した。
使用したカラムはSuperdex
Peptide 10/300 GL (10×300 mm, 13 micro m)で、HPLC分析条件は、下記、表9記載のHPLC分析条件 (4)で、注入量が100 micro lである。
分画ピークを図3に示す。
Amide-80カラムを用いた分析
シリカゲル基材にアクリルアミド基を固定化したTOSOH TSKgel Amide-80 (4.6×250 mm, 5 micro m)を用いてピークY試料の分析を行った。
HPLC分析条件は、移動相AにTFA含有水(pH 2.0)、移動相Bにアセトニトリルを用い、移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→25% (20→80分)、25→55% (80→105分)、55% (105→125分)の濃度でグラジエントを変化させ、流速0.8 ml/min、分離温度30度(C)、検出波長215 nm、注入量20 micro lとした。
HPLC分析条件を表10に示した。
Amide-80 (4.6×250 mm, 5 micro
m)によるピークY試料の分析結果を図4に示した。
Amide-80カラムを用いたピークY試料の細分画
上記で、ピークY試料の良好な分離結果が得られたカラムのTOSOH TSKgel Amide-80 (4.6×250 mm, 5 micro m)を用いて、上記で得た、各ゲルろ過画分A〜Fについて細分画を行った。
HPLC分析条件は、移動相AにTFA含有水(pH 2.0)、移動相Bにアセトニトリルを用い、流速0.8
ml/min、分離温度30度(C)、検出波長215 nm、注入量20 micro lとした。画分Aは移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→19% (20→56分)、19→55% (56 →60分)、55% (60→75分)の濃度でグラジエントを変化させ、画分Bは移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→22% (20→68分)、22→55% (68 →70分)、55% (70→85分)の濃度でグラジエントを変化させ、画分Cは移動相Aを5 % (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→23% (20→72分)、23→55% (72 →74分)、55% (74→90分)の濃度でグラジエントを変化させ、画分DおよびEは移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→16% (20→44分)、16→55% (44 →48分)、55% (48→65分)の濃度でグラジエントを変化させた。
画分AのHPLC分析条件(7)を表11に、画分BのHPLC分析条件(8)を表12に、画分CのHPLC分析条件(9)を表13に、画分D、EのHPLC分析条件(10)を表14に示した。
上記方法により分離したピークについて分取を行い、減圧濃縮・凍結乾燥して、以下の分析に供した。
実施例3で分画した、成分Yに含まれる成分の細分画画分について、ペプチドシークエンサー装置に気相シーケンサーであるProcise492HT (Applied Biosystems)を用いて、アミノ酸配列分析を行った。
各試料は、N-methylpiperidine/H2O/MeOH
存在下でphenyl
isothiocyanateの 5% n-heptane 溶液と反応させ、N-phenyl isothiocarbamoyl ペプチド(PTC-peptide)を得た。酢酸エチルとn-butyl chlorideを用いて不純物を取り除いた後、PTC-peptideとTFAを反応させアミノ酸の2-アニリノ-5-チアゾリノン誘導体(ATZ-AA)の切り出しを行った。
さらにATZ-AAはTFAと64度(C)で9時間反応を行い、安定化した構造を持つフェニルチオヒダントイン化アミノ酸(PTH-AA)に変換した。このようにして得られたPTH-AAを、イオンペアー試薬を溶媒に添加してODSカラムを用いて分離を行うことで、含有アミノ酸の決定を行った。
以上を5 cycle行い、ペプチド配列を決定した。なお、試料調製はエドマン分解法により行った。本試験は、分析機関の株式会社ニッピにて実施した。
TOSOH TSKgel Amide-80 (4.6×250 mm, 5 micro m)を用いて、ゲルろ過カラムにより分画した画分についてLC-MS/MS分析を行った。
移動相Aには、イオン化の効率化のため、TFA含有水(pH 2.0)の代わりにギ酸含有水(pH 2.0)を用いてLC-MS/MS分析を行った。
移動相にTFA含有水とギ酸含有水を用いる場合とでは、ピークの挙動が異なるが、TFA含有水を用いてLC-MS分析を行った時の質量電荷比(m/z)と、ギ酸含有水を用いてLC-MS分析を行った時のm/zとを比較することでピークを対応させた。
LC-MS/MS分析条件は、移動相Aにギ酸含有水(pH 2.0)、移動相Bにアセトニトリルを用い、流速が0.8 ml/min (LC)および0.3 ml/min (MS)、分離温度が30度(C)、注入量が20 micro l、Capillary 電圧が3500 V、N2
gas flow (desolvation)が350 L/hr、N2
gas flow (cone)が50 L/hr、N2 source tempが100度(C)、N2
desolvation tempが350度(C)である。
このとき、画分Aは移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→19% (20→56分)、19→55% (56 →60分)、55% (60→75分)の濃度でグラジエントを変化させ、画分Bは移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→22% (20→68分)、22→55% (68 →70分)、55% (70→85分)の濃度でグラジエントを変化させ、画分Cは移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→23% (20→72分)、23→55% (72 →74分)、55% (74→90分)の濃度でグラジエントを変化させ、画分DおよびEは移動相Aを5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→16% (20→44分)、16→55% (44 →48分)、55% (48→65分)の濃度でグラジエントを変化させた。また、イオン化電圧は分析を行うピークごとに10〜100 Vで検討を行い、最もイオン化が良好であった条件を用いた。なお、本発明における全てのLC-MS/MS分析は、Waters 2695 (LCユニット、Waters)、Quattro micro API (MSユニット、Waters)で構成されるLC-MS/MSシステムを用いて行った。
画分AのLC-MS/MS分析条件(1)を表15に、画分BのLC-MS/MS分析条件(2)を表16に、画分CのLC-MS/MS分析条件(3)を表17に、画分D、EのLC-MS/MS分析条件(4)を表18にそれぞれ示した。
実施例3で細分画した、図4に示される、6個のピークの画分について、上記実施例4、5および6記載の方法によるアミノ酸配列分析、LC-MS/MS分析、NMR分析の結果により、物質同定を行った。
このうち、特に215 nmで強い吸光が確認された約16〜20分のピークおよび約28〜30分のピークの中の最初のピーク(化合物1)についての解析データを以下に例示する。
上記、実施例3で細分画した、6個の画分のうちの、約16〜20分に溶出されるピークのH NMR、C NMR、LC-MS/MS分析の結果より、約16〜20分に溶出されるピークはチロシン(Tyr)であることが確認された。旋光性は測定していないが、ソバという生物体に含まれていることからL体であると考えられる。
上記、実施例3で細分画した、6個の画分のうちの、約28〜30分に溶出されるピークの分析結果について、以下に示す。
約28〜30分に溶出されるピークは、分離検討によって2つのピークに分離することが出来たため、各々のピークが含有する物質について同定を行った。そのうちの、1つめの化合物(化合物1)におけるアミノ酸配列分析の結果を図5、図6および図7に、LC-MS/MS分析を行った結果を図8に示した。
これらの結果より、化合物1はVal-Val-Gly(VVG)であることが示された。
上記と同様に、化合物2におけるアミノ酸配列分析およびLC-MS/MS分析を行い、アミノ酸配列分析の結果、および、274.2 m/zを親イオンとした、LC-MS/MS分析を行った結果より、化合物2はPhe-Gln(FQ)であることが示された。
上記と同様に、約4〜8分ピーク含有物質のアミノ酸配列分析およびLC-MS/MS分析を行った結果より、約4〜8分ピーク含有物質は、Tyr-Ala- Phe-Asp-Val-Trp-Tyr (YAFDVWY)、Asp-Val-Trp-Tyr (DVWY)、Phe-Asp-Ala-Arg-Thr (FDART)およびTrp-Thr-Phe-Arg (WTFR)であることが示された。
上記と同様に、約32分に溶出される化合物のアミノ酸配列分析およびLC-MS/MS分析を行った結果、約32分に溶出される化合物は、Val-Ala-Glu (VAE)であることが示された。
ピークIについて分取を行い、H NMR分析およびLC-MS/MS分析を行った結果、H NMRの2 ppm、8-9 ppm付近に検出されるスペクトルがピークII、III、IVと共通である、親イオン315.9 m/zの化合物であることが推察された。
ピークIIについて分取を行い、H NMR分析およびLC-MS/MS分析を行った結果、H NMRの2 ppm、8-9 ppm付近に検出されるスペクトルがピークI、III、IVと共通である、親イオン345.9 m/zの化合物であることが推察された。
ピークIIIについて分取を行い、H NMR分析およびLC-MS/MS分析を行った結果、H NMRの2 ppm、8-9 ppm付近に検出されるスペクトルがピークI、II、IVと共通である、親イオン372.8 m/zの化合物であることが推察された。
ピークIVについて分取を行い、H NMR分析およびLC-MS/MS分析を行った結果、H NMRの2 ppm、8-9 ppm付近に検出されるスペクトルがピークI、II、IIIと共通である、親イオン477.9 m/zの化合物であることが推察された。
実施例7で同定(推定)した物質について、降圧作用を測定した。降圧作用は、SHRに各同定物質の合成物またはHPLC精製した物質を単回経口投与し、経時的な収縮期血圧変化、拡張期血圧変化を調べることで確認した。
試料のうち、チロシン(Tyr)は関東化学より購入したものを用いた。また、Tyr-Ala-
Phe-Asp-Val-Trp-Tyr (YAFDVWY)、Asp-Val-Trp-Tyr (DVWY)、Phe-Asp-Ala-Arg-Thr (FDART)、Trp-Thr-Phe-Arg (WTFR)、Val-Val-Gly (VVG)は、株式会社ベックスより固相合成されたものを購入した。Phe-Gln (FQ)、Val-Ala-Glu (VAE)は、前記式1および式2記載の合成チャートに従って合成したものを用いた。なお、これらの合成品は、LC-MS/MS分析により生成するフラグメントを確認した後に動物試験に使用した。
上記、YAFDVWY、DVWY、FDART、WTFR、Tyr、FQ、VVG、VAE、ピークI、ピークII、ピークIIIおよびピークIVの各試料について、SHRへの単回経口投与および血圧測定を行った。動物試験では、試験実施者に投与物質が分からないよう、二重盲目試験による血圧測定を実施した。本試験は、期間を3回に分けて行った。
試験には11〜15週齢の雄性SHR/Izm計75匹(日本チャールス・リバー株式会社より入手)を使用した。7日間の馴化飼育後、試料の単回経口投与および血圧測定を行った。試料の単回経口投与を行う2〜3日前には全SHRの血圧測定を行い、高血圧を発症していることを確認した。経口投与試験には11〜15週齢のSHRを使用した。
実験に用いたラットは搬入後、金属製のケージに個別に収容し、クリーン条件下で飼育した。飼育室の環境は、室温23±4度(C)、湿度50±20%、明暗条件は明期が12時間(8〜20時)、残り12時間を暗期とした。馴化飼育期間中は市販固形飼料CRF-1(日本チャールス・リバー株式会社)と水道水の自由摂取で飼育した。試験物質投与前日に各個体の体重および血圧(収縮期血圧、拡張期血圧)を測定した後、各群内の平均体重および血圧が同程度になるように1群5匹ずつ群分けを行った。また、試験物質の経口投与前に、14〜16時間の絶食を行った。本実験は、試験期間を3回に分けて行った。
動物の体重1 kgあたり0.1 mgの各試験物質を、動物体重1 kgあたり2 mlの純水に溶かしたもの{0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)}を投与試料とし、ステンレス製経口胃ゾンデ(株式会社夏目製作所)を用いてSHRに単回経口投与を行った。投与物質は、YAFDVWY、DVWY、FDART、WTFR、Tyr、FQ、VVG、VAE、ピークI、ピークII、ピークIIIおよびピークIVである。対照には、ラットの体重1
kgあたり2 mlの純水を単回経口投与した。
各試料を単回経口投与後、0、3、6、9および24時間後にテイルカフ法で収縮期血圧、拡張期血圧をそれぞれ測定した。
1.
Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr(YAFDVWY)の単回経口投与試験結果
Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr(YAFDVWY)を0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。
試験物質投与後、0、3、6、9および24時間後に血圧(収縮期血圧、拡張期血圧)を測定し、0時間での血圧と比較した経時的な血圧変化の値を平均値±標準誤差で表した。
対照として、純水を2 ml/kgの用量で投与したものを、対照群とした。
また、各時間でのYAFDVWY投与群と対照群の血圧変化値を比較してStudentのt検定を行った。
1-1. 収縮期血圧変化
YAFDVWY投与群は、対照群と比較して投与6時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差は35.4 mmHgであった。また、YAFDVWY投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の34.5mmHgであった。
1-2. 拡張期血圧変化
YAFDVWY投与群は、対照群と比較して投与6時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差は29.2 mmHgであった。また、YAFDVWY投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の29.2 mmHgであった。
YAFDVWYの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表19および表20に示した。
Asp-Val-Trp-Tyr(DVWY)の単回経口投与試験結果
上記と同様にして、Asp-Val-Trp-Tyr(DVWY)を0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
2-1. 収縮期血圧変化
DVWY投与群は、対照群と比較して投与3、6時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ35.5 mmHg、48.2 mmHgであった。また、DVWY投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の48.2 mmHgであった。
2-2. 拡張期血圧変化
DVWY投与群は、対照群と比較して投与3、9時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ25.6 mmHg、27.8mmHgであった。また、DVWY投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の28.6 mmHgであった。
DVWYの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表21および表22に示した。
Phe-Asp-Ala-Arg-Thr(FDART)の単回経口投与試験結果
上記と同様にして、Phe-Asp-Ala-Arg-Thr(FDART)を0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
3-1. 収縮期血圧変化
FDART投与群は、対照群と比較して投与3、9時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ13.3 mmHg、24.3 mmHgであった。また、FDART投与群の血圧降下の最大値投与6時間後の29.0 mmHgであった。
3-2. 拡張期血圧変化
FDART投与群は、対照群と比較して投与3、9時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ15.1 mmHg 、26.4 mmHgであった。また、FDART投与群の血圧降下の最大値は投与9時間後の26.4 mmHgであった。
FDARTの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表23および表24に示した。
Trp-Thr-Phe-Arg(WTFR)の単回経口投与試験結果
上記と同様にして、Trp-Thr-Phe-Arg(WTFR)を0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
4-1. 収縮期血圧変化
WTFR投与群は、対照群と比較して投与3、6、9時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ26.5 mmHg、29.5 mmHg、27.8 mmHgであった。また、WTFR投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の29.5 mmHgであった。
4-2. 拡張期血圧変化
WTFR投与群は、対照群と比較して投与3、6、9時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ18.4 mmHg、18.5 mmHg、30.2 mmHgであった。また、WTFR投与群の血圧降下の最大値は投与9時間後の30.2 mmHgであった。
WTFRの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表25および表26に示した。
上記と同様にして、チロシン(Tyr)を0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
5-1. 収縮期血圧変化
Tyr投与群は、対照群と比較して投与6時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差は24.8 mmHgであった。また、Tyr投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の24.8 mmHgであった。
5-2. 拡張期血圧変化
Tyr投与群は、対照群と比較して投与3、9時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ12.5 mmHg、24.4 mmHg、であった。また、Tyr投与群の血圧降下の最大値は投与9時間後の24.4 mmHgであった。
Tyrの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表27および表28に示した。
Phe-Gln(FQ)の単回経口投与試験結果
上記と同様にして、Phe-Gln(FQ)を0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
6-1. 収縮期血圧変化
FQ投与群は、対照群と比較して投与3、6、9、24時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ28.8 mmHg 、29.5 mmHg、33.6 mmHg、12.3 mmHgであった。また、FQ投与群の血圧降下の最大値は投与9時間後の33.6 mmHgであった。
6-2. 拡張期血圧変化
FQ投与群は、対照群と比較して投与3、9、24時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ33.2 mmHg、41.4 mmHg、11.3 mmHgであった。また、FQ投与群の血圧降下の最大値は投与9時間後の41.4 mmHgであった。
FQの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表29および表30に示した。
Val-Val-Gly(VVG)の単回経口投与試験結果
上記と同様にして、Val-Val-Gly(VVG)を0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
7-1. 収縮期血圧変化
VVG投与群は、対照群と比較して投与3、6、9時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ19.3 mmHg 、23.5 mmHg、28.3 mmHgであった。また、VVG投与群の血圧降下の最大値は投与9時間後の28.3 mmHgであった。
7-2. 拡張期血圧変化
VVG投与群は、対照群と比較して投与3、6、9、24時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ31.9 mmHg、28.6 mmHg、37.1 mmHg、13.1 mmHgであった。また、VVG投与群の血圧降下の最大値は投与9時間後の37.1 mmHgであった。
VVGの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表31および表32に示した。
Val-Ala-Glu(VAE)の単回経口投与試験結果
上記と同様にして、Val-Ala-Glu(VAE)を0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
8-1. 収縮期血圧変化
VAE投与群は、対照群と比較して投与6時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ24.1 mmHgであった。また、VAE投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の24.1 mmHgであった。
8-2. 拡張期血圧変化
VAE投与群は、対照群と比較して投与3時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ17.7 mmHgであった。また、VAE投与群の血圧降下の最大値は投与3時間後の17.7 mmHgであった。さらに、投与6時間後においても血圧降下値17.5 mmHgという、投与3時間後と同程度の血圧降下が確認された。
VAEの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表33および表34に示した。
上記と同様にして、ピークIを0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
9-1. 収縮期血圧変化
ピークI投与群は、対照群と比較して投与3、6、24時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ19.7 mmHg、27.6 mmHg、18.0 mmHgであった。また、ピークI投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の27.6 mmHgであった。
9-2. 拡張期血圧変化
ピークI投与群は、対照群と比較して投与3、6、24時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ33.4 mmHg、28.4 mmHg、11.4 mmHg、であった。また、ピークI投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の28.4 mmHgであった。
ピークIの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表35および表36に示した。
上記と同様にして、ピークIIを0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
10-1. 収縮期血圧変化
ピークII投与群は、対照群と比較して投与3、6、9、24時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ21.9 mmHg、34.6 mmHg、27.8 mmHg、19.3 mmHgであった。また、ピークII投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の34.6 mmHgであった。
10-2. 拡張期血圧変化
ピークII投与群は、対照群と比較して投与3、6、9、24時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差はそれぞれ33.5 mmHg、30.5 mmHg、30.7 mmHg、19.9 mmHgであった。また、ピークII投与群の血圧降下の最大値は投与9時間後の30.7 mmHgであった。さらに、投与6時間後においても血圧降下値30.5 mmHgという、投与9時間後と同程度の血圧降下が確認された。
ピークIIの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表37および表38に示した。
上記と同様にして、ピークIIIを0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
11-1. 収縮期血圧変化
ピークIII投与群は、対照群と比較して投与6時間後に有意な収縮期血圧降下の差が確認され、その差は27.2 mmHgであった。また、ピークIII投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の27.2 mmHgであった。
11-2. 拡張期血圧変化
ピークIII投与群は、対照群と比較して有意差は見られなかった。また、ピークIII投与群の血圧降下の最大値は投与6時間後の12.6 mmHgであった。
ピークIIIの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表39および表40に示した。
上記と同様にして、ピークIVを0.1 mg/2 ml/ kg (b.w.)の用量で単回経口投与試験を行った。結果は以下のとおりであった。
12-1. 収縮期血圧変化
ピークIV投与群は、対照群と比較して有意差は見られなかった。また、ピークIV投与群の血圧降下の最大値は投与3時間後の13.8 mmHgであった。
12-2. 拡張期血圧変化
ピークIV投与群は、対照群と比較して投与6時間後に有意な拡張期血圧降下の差が確認され、その差は17.5 mmHgであった。また、ピークIV投与群の血圧降下の最大値は投与9時間後の21.2 mmHgであった。
ピークIVの収縮期血圧変化および拡張期血圧変化の結果を、以下の表41および表42に示した。
上記の各物質投与群と対照群との比較において、最大の血圧降下を示した時の値を、図9および図10に示した。
収縮期血圧では、12種の投与物質の中でDVWYの降圧作用が一番高く、その次にYAFDVWY、ピークII、FQが並ぶ。特にDVWYは一番収縮期血圧降下値の小さいピークIVと比較し、血圧降下値に34.4
mmHgもの差が見られ、収縮期血圧降下作用を有していることが確認された。
また、拡張期血圧では、12種の投与物質の中でFQの降圧作用が一番高く、その次にVVG、ピークI、ピークIIが続く。特にFQは一番拡張期血圧降下値の低いピークIIIと比較し、血圧降下値に28.8
mmHgもの差が見られ、拡張期血圧降下作用を有していることが確認された。
上記の試験で、高い降圧作用を示したピークY試料含有物質の4種(DVWY、FQ、VVG、ピークII)の物質について、現在医薬品として使用されているカプトプリル(ACE阻害剤)、ロサルタン(AT-II受容体拮抗薬)と、降圧作用を比較した。
本試験で比較したロサルタンおよびカプトプリルの投与量は5 mg/kgとし、DVWY、FQ、VVG、ピークIIの投与量は上記と同じ0.1 mg/kgとした。
収縮期血圧降下作用を図11に、拡張期血圧降下作用を図12に示した。DVWYの収縮期血圧降下作用は、ロサルタンと同程度で非常に高く、拡張期血圧降下作用は、ロサルタンよりも少し劣るが、カプトプリルよりも21.0 mmHg多く降下が見られた。血圧降下のパターンは、投与3時間後に最も効果が表れるロサルタンとは異なり、カプトプリルと類似していた。
FQの収縮期血圧降下作用は、DVWY同様ロサルタンと同程度で非常に高く、拡張期血圧降下作用では、ロサルタンよりも投与6、9時間後に高い血圧降下を示した。FQの血圧降下のパターンは、投与3〜9時間にかけてゆっくりと効果が表れる傾向にあり、ロサルタン、カプトプリルとは異なっていた。
VVGの収縮期血圧降下作用は、ロサルタンよりも少し劣るがカプトプリルと比較して21.4 mmHg多く血圧降下が見られ、拡張期血圧降下作用は、ロサルタンよりも投与6、9時間後に高い血圧降下を示した。血圧降下のパターンは、投与3〜9時間にかけてゆっくりと効果が表れる傾向にあり、FQと類似し、ロサルタン、カプトプリルとは異なっていた。
ピークIIの収縮期血圧降下作用は、ロサルタンと同程度の血圧降下が見られ、拡張期血圧降下作用は、ロサルタンよりも少し劣るものの、カプトプリルと比較して23.2 mmHgの血圧降下が確認された。血圧降下のパターンは、投与6時間後に最大の血圧降下が見られるカプトプリルと類似していた。
以上のように、ピークY試料が含有する物質のうち、DVWY、FQ、VVG、ピークIIは、既存の医薬品のロサルタンまたはカプトプリルよりも少量で同程度またはそれ以上の降圧作用を示した。また、血圧降下パターンは、DVWY、ピークIIはカプトプリルの血圧降下パターンと類似しており、さらにFQとVVGは互いに血圧降下パターンが類似し、ロサルタン、カプトプリルの何れとも異なっていた。
試験には12〜13週齢の雄性SHR/Izm(日本チャールス・リバー株式会社より入手)を使用した。3〜7日間の馴化飼育後、エーテル麻酔下でラットを開腹、放血死させ、速やかに胸部大動脈を摘出した。摘出した大動脈を、4度(C)に保冷したKrebs-Henseleit溶液に浸し、血液をよく洗い流した後、血管に付着した結合組織および脂肪組織を除去し、幅約2〜3 mmのリング標本を作製した。内皮細胞の除去は血管を濾紙に軽く擦りつけることで行い、これを内皮細胞除去標本とした。
(Val-Ala-Glu)添加によるリング標本の張力変化を図13、図14に示した。
(Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr)、DVWY (Asp-Val-Trp-Tyr)、FDART (Phe-Asp-Ala-Arg-Thr)、WTFR (Trp-Thr-Phe-Arg)、FQ (Phe-Gln)、VVG (Val-Val-Gly) およびVAE (Val-Ala-Glu)のマグヌス試験結果を表43に示す。
Claims (11)
- ソバ植物体の破砕物を乳酸菌発酵処理して得られる発酵ソバ上清の水溶性抽出物であって、
(A)以下の工程によって抽出、分取され、
工程1:ソバ植物体を殺菌液に浸して殺菌した後、水切りし、破砕機で破砕してソバ植物体破砕物を得る、
工程2:ソバ植物体破砕物を、乳酸菌を用いて発酵させ、発酵物を遠心分離し、その上清を減圧濃縮、凍結乾燥して発酵ソバ上清粉末を得る、
工程3:発酵ソバ上清粉末を固相抽出により前処理したものを、下記HPLC分析条件(1)で、保持時間18分〜21分の範囲においてほぼ単一のピーク(ピークY)として検出される成分(成分Y)が検出される画分を集めて減圧濃縮、凍結乾燥して発酵ソバ抽出物を得る、
HPLC分析条件(1)
カラム:CHEMCOBOND 5-ODS-W (4.6×150 mm, 5 micro m)
移動相:TFA含有水(pH 2.0)
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm、
(B)少なくとも、上記HPLC分析条件(1)で保持時間18分〜21分の範囲においてほぼ単一のピーク(ピークY)として検出される成分(成分Y)を含むことを特徴とする抽出物。 - 工程1の殺菌処理が、ソバ植物体を次亜塩素酸ナトリウム水溶液に浸して殺菌するものであり、工程2の発酵処理が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ラクティス(Streptococcus lactis)、ストレプトコッカス・クレモリス(Streptococcus cremoris)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)の乳酸菌の群から選ばれる一種を添加し、常温で2週間発酵させるものであり、工程3の固相抽出法が、カラムとしてSep-Pak(登録商標) Vac C18カートリッジ(ウォーターズ社製)を用い、溶出液としてTFA含有水(pH 2.0):メタノール=1:9混合液を用いるものであることを特徴とする、請求項1に記載の抽出物。
- 乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)であることを特徴とする、請求項2に記載の抽出物。
- ソバ植物体が、発芽して間もないソバ幼植物体であることを特徴とする、請求項1または2に記載の抽出物。
- ソバ植物体が、ソバ(Fagopyrum esculentum)またはダッタンソバ(Fagopyrum tataricum)であることを特徴とする、請求項4に記載の抽出物。
- ソバ植物体の破砕物を乳酸菌発酵処理して得られる発酵ソバ上清の水溶性抽出物であって、少なくとも、下記HPLC分析条件(1)で保持時間18分〜21分の範囲においてほぼ単一のピーク(ピークY)として検出される成分(成分Y)を含むことを特徴とする抽出物に含まれる血圧降下作用および血管拡張作用活性成分であって、
化学式、
YAFDVWY (Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr) ・・・・ (1)
化学式、
WTFR (Trp-Thr-Phe-Arg) ・・・・ (2)
化学式、
DVWY (Asp-Val-Trp-Tyr) ・・・・ (3)
の何れかで表されるオリゴペプチド。
HPLC分析条件 (1)
カラム:CHEMCOBOND 5-ODS-W (4.6×150 mm, 5 micro m)
移動相:TFA含有水(pH 2.0)
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm - 活性成分として、アミノ酸のチロシン (Tyr)、並びにオリゴペプチドのYAFDVWY (Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr)、DVWY (Asp-Val-Trp-Tyr)、FDART (Phe-Asp-Ala-Arg-Thr)、WTFR (Trp-Thr-Phe-Arg)、FQ (Phe-Gln)、VVG (Val-Val-Gly)およびVAE (Val-Ala-Glu)の群から選ばれる少なくとも1種または2種以上を含有することを特徴とする、請求項1または4に記載の抽出物。
- 活性成分として、さらに、下記HPLC分析条件(3)で保持時間37分にピーク(ピークI)を示す成分(成分I)、保持時間38分にピーク(ピークII)を示す成分(成分II)、保持時間59分にピーク(ピークIII)を示す成分(成分III)および保持時間65分にピーク(ピークIV)を示す成分(成分IV)の群から選ばれる少なくとも1種または2種以上を含有することを特徴とする、請求項7に記載の抽出物。
HPLC分析条件 (3)
カラム:TSKgel Amide-80 (4.6×250 mm, 5 micro m)
移動相A:TFA含有水(pH 2.0)
移動相B:アセトニトリル
流速:0.8 ml/min
分離温度:30度(C)
検出波長:215 nm
グラジエント:5% (0→15分)、5→10% (15→20分)、10→25% (20→80分)、
25→55% (80→105分)、55% (105→125分) - 請求項1〜5、7および8の何れかに記載の抽出物および請求項6に記載のオリゴペプチドの何れかを活性成分として配合することを特徴とする食品または医薬組成物。
- 活性成分が、オリゴペプチドのYAFDVWY(Tyr-Ala-Phe-Asp-Val-Trp-Tyr)、DVWY(Asp-Val-Trp-Tyr)、FDART (Phe-Asp-Ala-Arg-Thr)およびWTFR(Trp-Thr-Phe-Arg)、並びに、請求項8に記載の成分I、成分II、成分III、および成分IVの群から選ばれる少なくとも1種または2種以上を配合する、請求項9に記載の食品または医薬組成物。
- 請求項1〜5、7および8の何れかに記載の抽出物および請求項6に記載のオリゴペプチドの何れかを含有することを特徴とする食品用組成物。
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