JP2008239498A - 発芽発酵ソバからace阻害活性画分を分画する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】そば芽の搾汁を醗酵させて得た発芽発酵ソバの上清液よりアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害活性成分を含有する画分を分取する方法であって、
(a)発芽発酵ソバを遠心分離し、その上清液を凍結乾燥し、
(b)得られた凍結乾燥物を含水アルコール溶液に溶解し、溶解液を遠心分離して得た上清液を凍結乾燥し、
(c)凍結乾燥物を水に溶解させ、不溶物を濾別し、
(d)得られた濾液を逆相高速液体クロマトグラフィー(逆相HPLC)に付し、ACE阻害活性含有画分を分取する、
ことを特徴とするACE阻害活性画分の分離方法。
【選択図】図3
Description
したがって、大量飲料に代わる、発芽発酵ソバを効果的に含有する製品の開発が望まれていた。
その結果、一般的なカラムクロマトグラフィー等の分離手段ではかかるACE阻害活性成分を含有する画分の分取を行うことは困難であり、特異的な条件に基づく逆相高速液体クロマトグラフィー(逆相HPLC)を用い、移動相として直線濃度勾配(グラジエント)による手法により、発芽発酵ソバの上清液からACE阻害活性成分を含有する分画の分取に成功した。
更に、当該画分からACE阻害活性成分を単離するべくより詳細な分画を行い、ACE阻害活性成分を高濃度で含有する分画の取得に成功し、本発明を完成させるに至った。
更に本発明は、上記で得られたACE阻害活性成分を含有する画分を更に詳細に分画し、ACE阻害活性成分を高濃度で含有する分画を分取する方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、上記で分画された、ACE阻害活性成分を含有する画分を提供すことを課題とする。
(1)そば芽の搾汁を醗酵させて得た発芽発酵ソバの上清液よりアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害活性成分を含有する画分を分取する方法であって、
(a)発芽発酵ソバを遠心分離し、その上清液を凍結乾燥し、
(b)得られた凍結乾燥物を含水アルコール溶液に溶解し、溶解液を遠心分離して得た上清液を凍結乾燥し、
(c)水に溶解させた凍結乾燥物を、所望により不溶物を濾別後、逆相高速液体クロマトグラフィー(逆相HPLC)に付し、ACE阻害活性含有画分を分取する、
ことを特徴とするACE阻害活性画分の分離方法;
である。
したがって、この画分をそのままヒトに適用することにより効果的な高血圧治療剤、更には高血圧・脳卒中など生活習慣病の危険要因の低減・除去効果、すなわち、心拍数低下作用、血中中性脂肪低下作用を有する機能性食品、機能性飲料を提供できる利点を有している。
かかる分画方法に使用する発芽発酵ソバの上清液は、具体的には以下のようにして得ることができる。すなわち、そばの種子を発芽させて発育させた3〜20cm程度の茎を有するそばの若芽を洗浄し、ミキサー等により粉砕し、搾汁することによって搾汁液(青汁)を得る。次いで、得られた搾汁液を一旦冷凍して凍結させた後、凍結した搾汁液を常温により解凍すると共に、そばの若芽に付着しているおよび/または空気中に存在する自然の乳酸菌および/または酵母菌により醗酵させる。その醗酵した搾汁液の上清液として、本発明で使用する発酵発芽そばエキスの上清液を得ることができる。
なお、以下に説明する具体的分画方法は、その好ましい一例として記載するものであって、その目的を達成するために種々の変形が可能であり、かかる変形も本発明の技術的範囲内に包含されるものである。
また、かかる種々の変形に基づく分画方法により得られたACE阻害活性画分も、本発明の技術的範囲内に包含されるものである。
上記で得られた発芽発酵ソバの上清液を遠心分離(4℃/3220g/20分間)し、上清液を得、凍結乾燥し、凍結乾燥粉末を得る。
次いで、この凍結乾燥粉末を含水アルコール、例えば、70%メタノール水溶液に溶解させ、溶解液を遠心分離(4℃/3220g/20分間)し、上清液を得、凍結乾燥し、凍結乾燥粉末を得た。
なお、ここで使用するアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられ、その含水率は適宜変更することができる。
この凍結乾燥粉末を水に溶解し、0.45μmのフィルター Millex(登録商標:ミリポア社製)による濾過を行い、得られた濾液を用いてACE阻害活性画分の検索を行った。
逆相HPLC分取条件は、装置:SCL−10Avp、LC−6AD、CTO−10Avp、SPD−M10Avp、Multi−PDA、Class−VP workstation;カラム:COSMOSIL 5C18−AR−300(ナカライテスク社製);移動相A:水;移動相B:アセトニトリルで、直線勾配(グラジエント)による0→15%(0→10分)、15→70%(10→25分)、流速:10mL/分;カラムオーブン温度:40℃;検出波長251nmである。
このときのHPLCクロマトグラムを図1に示した。
かくして得られたACE阻害活性成分が含まれている画分を、遠心エバポレーターで溶媒を留去して、−40℃にて保存した。
以上のようにして得られたACE阻害活性成分が含まれている画分(第一次画分)を更に分画し、ACE阻害活性物質の分離を検討した。
凍結乾燥しておいた上記で得られたACE阻害活性成分が含まれている第一次画分を、適当な濃度で水に溶解させ、0.45μmのフィルター Millex(登録商標:ミリポア社製)で濾過し、濾液(以下、ACE阻害活性画分サンプル)を用いてACE阻害活性物質の分離検討を行った。
最初にシリカゲルカラムを用いた逆相HPLCによる分離検討を行った。HPLC装置は上記1で用いた装置と同様であり、カラムとしてTSK−gel(登録商標)Silica−150(4.6×250mm)(東ソー社製)を使用し、移動相Aにメタノール、移動相Bをイソプロパノール、酢酸エチル、ジクロロメタンとした3種類の溶媒系を用い、移動相Bの混合比率を0、25、50、75、100%に変化させた合計13通りの条件で分析を行った。
その結果、ACE阻害活性ピークに含まれる物質のカラム充填剤への吸着は認められず、ピークの分離には至らなかった。
なお、混合比率50、75及び100%では僅かにピークの分離がみられ、混合比率100%のとき、すなわち、イソプロパノールのみを移動相とした場合には、さらに3つのピークに分離できたが、その分離は不十分であった。
次に、ACE阻害活性画分サンプルを95%アセトニトリルに溶解し、0.25mg/mLに調整した。これを装置:LC−2010C、Class−VP workstation;カラム:TSK−gel(登録商標)Amide−80(4.6×250mm)(東ソー社製)を使用し、流速:1.0mL/分;カラム温度:40℃;検出波長:215nmの条件で移動相Aに水、移動相Bにアセトニトリルを用いた条件、及び、移動相Aに0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)含有水、移動相Bに0.1%TFA含有アセトニトリルを用いた2種類の溶媒系を用い、移動相Bの混合比率を85、90、95%に変化させ、合計6通りの条件で分析を行った。
その結果、アセトニトリル濃度が高いものほど保持が強くなり、ACE阻害活性を含有する第一次画分を2本のピークに分離することができたが、水−アセトニトリル系でのアミドカラムでは十分な分離は出来なかった。
更に、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラムの2種類のカラムを用いて分析を行った。
すなわち、陰イオン交換カラムでの分析は装置:SIL−10A、LC−10AD、CTO−10AS、CBM−10A、SPD−M10A、LC10;カラム:Shodex(登録商標)DEAE−825(8.0×75mm)(昭和電工社製)、流速:0.8mL/分;カラム温度:40℃;検出波長:215nmの条件で移動相を5mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.4)、10mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.4)の2通りの条件で分析を行った。
ACE阻害活性画分サンプルを水に溶解し、2.5mg/mLに調整した。これを装置:SIL−20A,LC−20AD,CTO20A、SPD−M20A、CBM−20A、LCsolution;カラム:TSK−gel(登録商標)OApak−P+TSK−gel(登録商標)OApak−A(6.0×40mm+7.8×300mm)(東ソー社製)、流速:0.8mL/分;検出波長:215nmの条件で、移動相として,0.1%燐酸及び1%燐酸を用いた2条件で分析を行った。
その結果、どちらの移動相条件においても物質の保持がみられいくつかのピークに分離することができたが、発芽発酵ソバのACE阻害物質分離方法としては不十分であった。
ACE阻害活性画分サンプルを水に溶解して調製した2.5mg/mL溶液を用い、2種類のODSカラムで分離条件の検討を行った。すなわち、ODSカラムとして、COSMOSIL(登録商標)5C18−PAQを用いた分離検討では装置:SIL−20A、LC−20AD、CTO20A、SPD−M20A、CBM−20A、LCsolution;カラム:COSMOSIL(登録商標)5C18−PAQ(4.6×150mm)(ナカライテスク社製)、流速:0.8mL/分;検出波長:215nmの条件で、移動相として、水及びTFAでpH2.6に調整した水を用いた2条件で分析を行った。また、CHEMCOBOND(登録商標)5−ODS−Wを用いた分離検討ではカラム:CHEMCOBOND(登録商標)5−ODS−W(4.6×150mm;ケムコ社製);流速:0.8mL/分;検出波長:215nmの条件で、移動相として水、TFAでpH2.6に調整した水、TFAでpH2.0に調整した水を用いた3条件で分析を行った。
どちらの移動相条件においても分析物質の保持がみられ、移動相にTFA含有水(pH2.6)を用いた場合に、さらに分離が向上し7本のピークに分離された。
移動相のpHを低下させることで分離が向上しており、移動相にTFA含有水(pH2.0)を用いたもので最も良好な分離が認められた。
以上の結果から、移動相pH2.0での分離により、上記の「1:ACE阻害活性画分サンプルの調整」で述べたCOSMOSIL(登録商標)5C18−AR−300による分離で1ピークとして検出されたACE阻害画分(第一次画分)を、10本のピークに分離することができた。
かかるODSカラムとしては、CHEMCOBOND(登録商標)5−ODS−W、或いは、COSMOSIL(登録商標)5C18−PAQに限らず,これと類似した性質の充填剤で構成されるカラムであれば本発明での分離方法に使用することができる。
3.分離溶媒のpHの検討
上記の検討結果から、ACE阻害活性画分の分離のためには、水溶媒用のODSカラムが適していることが判明した。この条件検討の過程で、移動相のpHを小さくすることで分離能に大きな変化が認められた。
カラム条件検討の結果で得られた最適条件では、より低いpHに調整したTFA水(pH2.0)を移動相とした分析で、さらに良好な分離結果が得られている。
そこで移動相のpHを2.0から1.1まで0.1ずつ変化させて、各ピークの保持時間を求めた。
その結果、pHの低下とともに10本に分かれていたピークのなかでも、保持時間の短い順序でのピーク3、4、6、7、9の保持が高まった。ピーク1と2は、検討したpH領域でほとんどリテンションタイムに変化がなかった。
これらの結果から、ACE阻害活性物質を検索するために必要な各ピークの取得のためには、下記表1に示した移動相のpHで行うのがよいことが判明した。
カラム:CHEMCOBOND(登録商標)5−ODS−W(4.6×150mm)
移動相:TFA含有水(pH1.7)
流速:0.8mL/分
カラム温度:19℃
検出波長:215nm
試料注入量:10μL
図中に示した結果からも判明するように、活性画分をそれぞれ独立した10本のピークとして分離されていることが判明する。
実験系ではアンジオテンシンIの類似化合物として、基質となるHippuryl-His-Leuを用い、ACEの作用により遊離する遊離の馬尿酸の生成量を算出した。
2mL容チューブに、基質(Hippuryl-His-Leu)溶液(250mL)と試料溶液(30μL)を入れ、37℃で約5分間保温した。ここに酵素溶液(100μL)を添加し撹拌した後、37℃で30分間反応させた。1N塩酸(250μL)を添加して反応を停止させた後、酢酸エチル(1000μL)を添加し、十分に撹拌して遊離した馬尿酸を酢酸エチル中に抽出した。これをeppendorf centrifuge 5415Rにより遠心分離(4℃/800g/10分)した後、酢酸エチル層800μLを回収し、別のチューブに入れ、遠心エバポレーター(IWAKI VEC-310)で酢酸エチルを留去した。ここに水500μLを添加し十分に撹拌した後HPLCに供し、遊離馬尿酸の量を測定した。
馬尿酸の量の測定におけるHPLCの条件は、装置:LC2010−CTH、Class−VP workstation(島津製作所社製)、カラム:TSK−gel(4.6×150ミリメートル)ODS 120A(東ソー社製)、移動相A:水(TFAによりpH3.2に調整)、移動相B:アセトニトリル:0.1%TFA=1000:1、グラジエント:10→25%(0→15分)(B)、カラム温度40℃、流速:1mL/分、サンプル注入量:10μL、検出波長:228nmであった。
ACE阻害活性は、サンプル(S)、サンプルコントロール(Sc)、ブランク(B)、ブランクコントロール(Bc)での遊離馬尿酸量を次の式に代入して求めた。
阻害率(%)=[{(B−Bc)−(S−Sc)}/(B−Bc)]×100
例えば、図4の番号8のピーク面積値とACE阻害活性との相関性を図5に示した。
図中に示した結果からも判明するように、番号8のピーク面積値とACE阻害活性とは非常に高い相関性(R2=0.9729)を持つことから、番号8のピーク面積値からACE阻害活性を類推することが可能である。
すなわち、HPLCクロマトグラフ上においてピーク面積が大きい分画部は、ACE阻害活性が高いという相関関係にある。
なお、ピーク8だけでなく、ACE阻害活性に関係する、その他の1つまたはそれ以上のピークも、同様の相関関係を示しているものであり、それらを総合的に評価し、より高い精度で発酵発芽ソバのACE阻害活性を求めることが可能となる。
これに対して本発明のACE阻害活性の測定方法は、本発明が提供するACE阻害活性を有する画分を分離する段階で得られた、HPLC各画分のピーク面積値をHPLCクロマトグラフトして測定するだけで、ACE阻害活性を求めることができる。
したがって、発芽発酵ソバのACE阻害活性測定が大幅に簡略化され、測定時間を短縮化することが可能となり、また、必要経費が大幅に削減できるものである。
本発明で分画される画分をそのままヒトに適用することにより効果的な高血圧治療剤、更には高血圧・脳卒中など生活習慣病の危険要因の低減・除去効果、すなわち、心拍数低下作用、血中中性脂肪低下作用を有する機能性食品、機能性飲料を提供できる利点を有している。
Claims (8)
- そば芽の搾汁を醗酵させて得た発酵発芽ソバの上清液よりアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害活性成分を含有する画分を分取する方法であって、
(a)発芽発酵ソバを遠心分離し、その上清液を凍結乾燥し、
(b)得られた凍結乾燥物を含水アルコール溶液に溶解し、溶解液を遠心分離して得た上清液を凍結乾燥し、
(c)水に溶解した凍結乾燥物を逆相高速液体クロマトグラフィー(逆相HPLC)に付し、ACE阻害活性含有画分を分取する、
ことを特徴とするACE阻害活性画分の分離方法。 - 逆相HPLCが、ODSカラムを用いた逆相HPLCであり、移動相として、水−アセトニトリルの直線濃度勾配(0%〜70%)で溶出することを特徴とする請求項1に記載のACE阻害活性画分の分離方法。
- ODSカラムが、COSMOSIL 5C18−AR−300である請求項2に記載のACE阻害活性画分の分離方法。
- 上記請求項1〜3で得られたACE阻害活性画分を、更にODSカラムを用いたHPLCに付し、移動相としてトリフルオロ酢酸(TFA)含有水(pH1.0〜2.0)により溶出させることを特徴とするACE阻害活性画分の分離方法。
- ODSカラムが、CHEMCOBOND 5−ODS−Wである請求項4に記載のACE阻害活性画分の分離方法。
- 上記請求項1〜3に記載のいずれかの分離方法により分離されたことを特徴とするACE阻害活性成分を含有する画分。
- 上記請求項4又は5に記載の方法により分離されたことを特徴とするACE阻害活性成分を含有する画分。
- 前記請求項4に記載の方法により分離されたACE阻害活性画分について、各画分のHPLCにおけるピーク面積値を基準にして、そのACE阻害活性を測定する方法。
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