JP4824032B2 - ｐＨ感受性のブロック共重合体及びこれを用いた高分子ミセル - Google Patents

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Description

本発明は、ｐＨ感受性の薬物担体用の生分解性ブロック共重合体及びこの製造方法、このブロック共重合体を含む高分子ミセル(micelle)型の薬物組成物に関し、さらに詳しくは、ｐＨに応じて水への溶解特性（電離度）を有するものの、自己集合現象によりミセルが形成できないポリ（β−アミノエステル）化合物と、親水性を示すポリエチレングリコール系の化合物とのブロック共重合体を誘導することにより、自己集合現象によりナノ寸法の高分子ミセル（粒子）が形成可能になることから、薬物担体として応用できるだけでなく、生体内における生分解速度を調節するために、主鎖に、エステル基に代えて、アミド基を有するためにポリ（β−アミノエステル）よりも生分解速度の遅いポリ（アミドアミン）を取り入れることにより、体内のｐＨ変化に応じて標的指向的な薬物送達が行えるだけでなく、生分解速度が調節可能なミセルを形成するｐＨ感受性のブロック共重合体及びこの製造方法に関する。
ミセルとは、通常、両親媒性、例えば、親水性基と疎水性基を併せ持つ低分子量の物質がなす熱力学的に安定で且つ均一な球状の構造を言う。前記ミセル構造を有する化合物に不溶性の薬物を溶かして投入する場合、薬物は、ミセルの内部に存在することになる。この種のミセルは、体内において温度やｐＨ変化に反応して標的指向的な薬物送達が行えるので、薬物担体としての応用可能性が極めて高いものとされている。
大韓民国特許出願第１０−２００１−００３５２６５号では、ポリエチレングリコールと生分解性高分子を用いたミセルの製造について記述されている。これらの物質はいずれも生分解性を有することから、バイオアフィニティを有しているというメリットはあるが、体内の変化、例えば、ｐＨなどの特定の変化に感受性があるものではないため、所望の個所への薬物送達が困難であるという欠点がある。
一方、体内のｐＨ環境は、通常、ｐＨ７．２〜７．４を示しているが、ガン細胞などの非正常細胞の周辺環境はｐＨ６．０〜７．２と弱酸性を示すことが知られている。近年には、ガン細胞に特定の薬物を送達するために、ｐＨ７．２以下において薬物を送達するための研究がなされている。
大韓民国特許出願第１０−２００１−００３５２６５号 米国特許第６１０３８６５号公報
米国特許第６,１０３,８６５号では、ｐＨ感受性を示す物質であるスルホンアミドを用いた高分子について示しているが、前記スルホンアミドは、ｐＨ７．４以下において不溶性となり、ｐＨ７．４以上においてはイオン化され、酸性を示す。この場合、ガン細胞に対する標的とは反対の特性を示すので、ガン細胞に対する標的のためには、塩基性を有する化合物が求められると言える。
米国特許第２００４／００７１６５４Ａ１では、塩基性を示すポリ（β−アミノエステル）の製造について示しているが、前記ポリ（β−アミノエステル）は、ポリ（アミノ酸）の一種として、主鎖にエステル基と３級アミン基を有しており、ｐＨに応じて水への溶解度が変わるイオン化特性を示すというメリットがある。
本発明者らは、ポリ（アミノ酸）の一種であるポリ（β−アミノエステル）やポリ（アミドアミン）を単体として用いる場合、ｐＨ依存性は示すものの、自己集合現象によりミセルを形成できないことに着目し、前記ポリ（β−アミノエステル）若しくはポリ（β−アミノエステル）とポリ（アミドアミン）との混合物に親水性のポリエチレングリコール系の化合物を共重合させてブロック共重合体を形成すると、得られたブロック共重合体が特定のｐＨにおいて標的送達可能なミセル構造を形成し、結果として、生分解速度の調節された徐放型の薬物送達用の担体として応用可能であるということを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは、ポリ（β−アミノエステル）の高い分解速度により薬物輸送担体としての機能が正常に行えなくなる問題点を解消するために、ポリ（β−アミノ酸）の一種として、主鎖に、エステル基に代えて、アミド基よりなる、分解速度が比較的に遅いポリ（アミドアミン）を共重合させることにより、所望の生分解速度を維持するように調節するのに成功した。
そこで、本発明は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＡ）若しくはこれらの共重合体（ＰＡＥＡ）とポリエチレングリコール系の化合物（ＭＰＥＧＡ）との重合により得られるブロック共重合体及びこの製造方法、このブロック共重合体を含む高分子ミセル型の薬物組成物を提供することを目的とする。
本発明は、（ａ）ポリエチレングリコール系の化合物（Ａ）と、（ｂ）ポリ（β−アミノエステル）及びポリ（アミドアミン）よりなる群から選ばれたいずれか１種以上のポリ（アミノ酸）化合物若しくは前記化合物の共重合体（Ｂ）とを共重合させることにより得られるｐＨ感受性のブロック共重合体及びこれを用いた高分子ミセルの製造方法を提供する。
さらに、本発明は、ｐＨ感受性のブロック共重合体と、前記ブロック共重合体に封入可能な生理活性物質とを含む高分子ミセル型の薬物組成物を提供する。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、ｐＨ感受性のポリ（アミノ酸）化合物、例えば、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（アミドアミン）若しくはこれらの共重合体と親水性を有するポリエチレングリコール系の化合物とを共重合させることにより、体内ｐＨ変化に感受性があるだけでなく、特定のｐＨ領域においてミセル構造が形成可能であり、しかも、形成されたミセルの生体内における生分解速度が調節されたブロック共重合体を提供することを特徴とする。
本発明によるｐＨ感受性のミセルは、特定のｐＨ、例えば、体内正常細胞のｐＨ範囲であるｐＨ７．２〜７．４においては安定したミセルを形成し、ガン細胞などの非正常細胞が示すｐＨ７．２以下においては前記ミセル構造が崩壊されることにより、ガン細胞に対して標的指向的な薬物送達用の担体として使用可能である。すなわち、低いｐＨ（ｐＨ７．０以下）においては、ポリ（アミノ酸）であるポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＡ）若しくはこれらの共重合体（ＰＡＥＡ）に存在する３級アミンのイオン化度が増加されるので、ＰＡＥ（若しくはＰＡＡ、ＰＡＥＡ）の全体が水溶性に変わってミセルを形成できなくなり、ｐＨ７．４においては、ＰＡＥ（若しくはＰＡＡ、ＰＡＥＡ）のイオン化度が低下して疎水性を示すことにより、自己集合によるミセルを形成するのである。
また、前記ｐＨ感受性のミセルを形成可能なブロック共重合体は、遺伝子送達、薬物送達の分野だけでなく、病気の診断のための物質を非正常細胞に送達することにより、診断イメージングなどの診断用途にも応用可能である。
加えて、本発明においては、正常体内の条件と同じｐＨ７．２〜７．４の範囲においてはミセルを形成し、ガン細胞などの非正常条件であるｐＨ７．２以下においてはミセルが崩壊されるようなガン細胞標的指向的なミセルを工夫して適用しているが、前記ブロック共重合体の構成成分、これらのモル比、分子量及び／またはブロック内の官能基を適宜変えることにより、ガン細胞だけでなく、遺伝子変異若しくは他の応用分野に標的指向的なミセルを工夫してこれを有効に応用することができる。
さらには、本発明においては、前記ｐＨ感受性のブロック共重合体の形成条件、例えば、前述のブロック共重合体の構成成分、これらのモル比、分子量及び／またはブロック内官能基などを種々に調節することにより、ｐＨ感受性のブロック共重合体ミセルの生体内の生分解速度を容易に調節することができ、これにより、薬物送達が行われるべき体内の適所に標的指向的に薬物を送達することができる。
本発明によりｐＨ感受性のミセルを形成するブロック共重合体の構成成分の一方としては、当業界における周知の親水性を有する生分解性化合物を制限無しに使用することができ、特に、ポリエチレングリコール系の化合物が好適に使用できる。より好ましくは、ポリエチレングリコール系の化合物の末端にアクリレート若しくはメタクリレートなどの単一官能基を有するものであり、この一例としては、分子の末端部がアクリレートで置換された下記一般式１：
Figure 0004824032
 [式中、Ｒは、水素原子若しくは炭素原子数１〜６のアルキル基であり、このとき、ｘは、１〜１０，０００の範囲の自然数である]
の化合物がある。
前記アルキル基は、線状若しくは分岐状の低級飽和脂肪族炭化水素を意味するものであり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル及びｎ−ペンチル基などがある。
前記ポリエチレングリコール系の化合物の分子量（Ｍｎ）には特に制限はないが、５００〜５０００の範囲であることが好ましい。ポリエチレングリコール系の化合物の分子量（Ｍｎ）が前記範囲外である場合、例えば、５００未満である場合や５，０００を超える場合、最終的に得られるブロック共重合体の分子量が調節し難いだけでなく、前記ブロック共重合体を用いてミセルを形成することが決して容易ではない。すなわち、分子量が５００未満である場合、特定のｐＨにおける親水性ブロックが短過ぎて親水性／疎水性による自己集合が起こらず、結果として、ミセルを形成し難いだけでなく、たとえミセルが形成されるとしても、水に溶解されて崩壊され易い。また、分子量が５，０００を超える場合、疎水性であるポリ（アミノ酸）の分子量に比べてブロックが長過ぎて親水性／疎水性のバランスが崩れ、特定のｐＨにおいてミセルが形成できずに沈殿することがある。
本発明によりｐＨ感受性のミセルを形成するブロック共重合体の構成成分の他方としては、疎水性とｐＨ感受性を併せ持つポリ（アミノ酸）化合物がある。この非制限的な例としては、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＡ）若しくはこれらの混合共重合体（ＰＡＥＡ）などがある。
ポリ（アミノ酸）の一種である前記ＰＡＥ、ＰＡＡ、及びＰＡＥＡは、体内に存在する３級アミン基によりｐＨに応じて水への溶解度が異なるイオン化特性を有することにより、上述のように、体内ｐＨ変化に応じてミセル構造を形成及び／または崩壊することができる。前記化合物は、当業界における周知の方法により製造可能であり、この一実施例を挙げると、ミカエル反応を通じて二重結合のあるビスアクリレート化合物若しくはビスアクリルアミド化合物にアミン系の化合物を重合させて、ポリ（アミノ酸）化合物を得ることができる。
このときに用いられるビスアクリレート化合物は、下記式２：
Figure 0004824032
 [式中、Ｒ３は、炭素原子数１〜３０のアルキル基である]
で表わすことができ、この非制限的な例としては、エチレングリコールジアクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，３−ブタンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオネートジアクリレート、１，７−ヘプタンジオールジアクリレート、１，８−オクタンジオールジアクリレート、１，９−ノナンジオールジアクリレート、１，１０−デカンジオールジアクリレート若しくはこれらの混合物などがある。
ビスアクリルアミド系の化合物は、下記一般式３：
Figure 0004824032
 [式中、Ｒは、炭素原子数１〜２０のアルキル基である]
で表わすことができる。このとき、ジアクリルアミドの非制限的な例としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド若しくはこれらの混合物などがある。前記ビスアクリルアミド系の化合物と、アミン系の化合物、例えば４−アミノメチルピペリジン（ＡＭＰＤ）、Ｎ−メチルエチレンジアミン（ＭＥＤＡ）、または１−（２−アミノエチル）ピペリジン（ＡＥＰＺ）とを、当業界における通常の方法、例えばミカエル反応により反応させ、ポリ（アミノ酸）を製造することが可能である。
また、アミン系の化合物は、アミン基を有するものである限り、制限なしに使用可能であるが、特に、下記一般式４：
Figure 0004824032
 で表わされる１級アミン、下記一般式５：
Figure 0004824032
 [式中、Ｒ１及びＲ２は、炭素原子数１〜２０のアルキル基である]
で表わされる２級アミン含有のジアミン化合物若しくはこれらの混合物などが好適に使用可能である。
前記１級アミン化合物の非制限的な例としては、３−メチル−４−（３−メチルフェニル）ピペラジン、４−（エトキシカルボニルメチル）ピペラジン、４−（フェニルメチル）ピペラジン、４−（１−フェニルエチル）ピペラジン、４−（１，１−ジメトキシカルボニル）ピペラジン、４−（２−（ビス−（２−プロペニル）アミノ）エチル）ピペラジン、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、ヘキシルアミン、２−エチルヘキシルアミン、２−ピペリジン−１−エチルアミン、Ｃ−アジリジン−１−イル−メチルアミン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、４−（アミノメチル）ピペラジン、Ｎ−メチルエチレンジアミン、Ｎ−エチルエチレンジアミン、Ｎ−ヘキシルエチレンジアミン、ピコラミン（pycoliamine）、アデニンなどがあり、前記２級アミン含有のジアミン化合物の非制限的な例としては、ピペラジン、ピペリジン、ピロリジン、３，３−ジメチルピペリジン、４，４’−トリメチレンジピペリジン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジエチルエチレンジアミン、イミダゾリジン若しくはジアゼピンなどがある。
ｐＨ感受性を示すポリ（アミノ酸）、例えば、ＰＡＥ、ＰＡＡ、及びＰＡＥＡの製造に際し、前記ビスアクリレート化合物若しくはビスアクリルアミド化合物とアミン系の化合物との反応モル比は、１：０．５〜２．０の範囲であることが好ましい。前記アミン系の化合物のモル比が０．５未満であるか、あるいは、２．０を超える場合、重合される高分子の分子量が１０００以下となるためにミセルを形成し難くなる。
前述の如き親水性ポリエチレングリコール系の化合物とポリ（アミノ酸）との共重合により得られる本発明によるｐＨ感受性のブロック共重合体は、下記一般式６、７、若しくは８：
Figure 0004824032
Figure 0004824032
Figure 0004824032
 [式中、
Ｒは、水素原子若しくは炭素原子数１〜６のアルキル基であり、このとき、ｘは、１〜１０，０００の範囲の自然数であり、
Ｒ１及びＲ２は、炭素原子数１〜２０のアルキル基であり、
Ｒ３は、炭素原子数１〜３０のアルキル基であり、
Ｒ４は、炭素原子数１〜２０のアルキル基であり、
ｙは、１〜１０，０００の範囲の自然数である]
で表わすことができる。
前記一般式６、７若しくは８で表わされるブロック共重合体は、上述の両親媒性とｐＨ感受性によりｐＨ変化に応じてミセルを形成したり崩壊したりでき、好ましくは、ｐＨが７．０〜７．４の範囲である場合にはミセルを形成し、ｐＨが６．５〜７．０の範囲である場合にはミセルが崩壊されることになる。特に、本発明によるブロック共重合体は、ｐＨ±０．２範囲内において優れた感受性を示すというメリットを有するので、体内ｐＨ変化による感受性が求められるような用途、例えば、薬物送達用の担体若しくは診断用途などにおいて満足のいく結果を導き出すことができる。
本発明によるブロック共重合体は、ｐＨ感受性を維持し、且つ、ミセル形成物性を維持する限り、前述の親水性ポリエチレングリコール系の化合物とポリ（アミノ酸）化合物の他に、当業界における通常の単位体をさらに含むことができ、これもまた本発明の範疇に属する。
前記ブロック共重合体の分子量範囲には特に制限はないが、１，０００〜２０，０００の範囲であることが好ましい。分子量が１，０００未満である場合、特定のｐＨにおいてブロック共重合体ミセルを形成し難いだけでなく、たとえミセルが形成されるとしても、水に溶解されて崩壊され易しい。また、分子量が２０，０００を超える場合、親水性／疎水性のバランスが崩れて、特定のｐＨにおいてミセルが形成できずに沈殿することがある。
本発明によるｐＨ感受性のブロック共重合体中のポリエチレングリコール系のブロック（Ａ）の含量には特に制限がないが、５〜９５重量部であることが好適であり、好ましくは、１０〜４０重量部である。ポリエチレングリコール系のブロックの含量が５重量部未満である場合、前記ブロック共重合体がミセルを形成できずに沈殿することがあり、９５重量部を超える場合、ミセルの内部をなすブロックが小さ過ぎてミセルを形成できず、溶解されたままで存在してしまう。さらに、前記ブロック共重合体は、ポリエチレングリコール系の化合物とポリ（アミノ酸）、例えば、ＰＡＥ、ＰＡＡ、若しくはＰＡＥＡとの反応モル比を調節することにより、ＡＢ型のジブロック共重合体、ＡＢＡ若しくはＢＡＢ型のトリブロック共重合体、若しくはそれ以上の種々のブロック状を形成することができる。
本発明によるｐＨ感受性のブロック共重合体は、当業者における通常の方法に従い製造可能であり、この実施例を挙げると、下記の反応式１，２若しくは３のルートを経て合成可能である。
Figure 0004824032
前記反応式１で示される製造方法の一実施例を挙げると、アクリレート末端基を有するポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ−Ａ）、１級アミン及びビスアクリレートを用い、当業者における周知の共重合反応を行う。このとき、１級アミンとビスアクリレートは、ミカエル付加反応によりポリ（β−アミノエステル）を形成し、形成されたポリ（β−アミノエステル）を、末端がアクリレート官能基を有するポリエチレングリコール系の化合物と共重合させて前記一般式６で表わされるブロック共重合体を得ることができる。
Figure 0004824032
前記反応式２で示される製造方法の一実施例を挙げると、アクリレート末端基を有するポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ−Ａ）、２級アミン含有のジアミン化合物及びビスアクリレートを用いて前記一般式７で表わされるブロック共重合体を得ることができ、このブロック共重合体の製造に際し、有機溶媒としては、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メチレンクロリドなどが使用可能である。
Figure 0004824032
Figure 0004824032
前記反応式３で示される製造方法の一実施例を挙げると、アクリレート末端基を有するポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ−Ａ）、１級若しくは２級アミン、及びビスアクリルアミドを用いて当業者における周知の共重合反応を行う。このとき、１級若しくは２級アミンとビスアクリレートは、ミカエル付加反応によりポリ（アミドアミン）というポリ（アミノ酸）を形成し、形成されたポリ（アミドアミン）を、末端がアクリレート官能基を有するポリエチレングリコール系の化合物と共重合させて、前記一般式８で表わされるｐＨ感受性のブロック共重合体を得ることができる。
一方、本発明においては、このようにして合成されたブロック共重合体の分子量を測定するために、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用し、且つ、ｐＨ変化によるミセルの濃度変化及びミセル寸法の変化を測定するために、蛍光分光器（Fluorescence spectrometer）と粒径測定装置（ＤＬＳ：Dynamic Light Scattering）を使用した。実際に、上述の如き分析により、ｐＨ感受性のミセルとしての適用可能性を確かめることができた。
また、本発明は、（ａ）ｐＨ変化に応じてミセルを形成する前述のブロック共重合体と、（ｂ）前記ブロック共重合体に封入可能な生理活性物質とを含む高分子ミセル型の薬物組成物を提供する。
前記高分子ミセル型の薬物組成物は、体内に取り込まれたときにミセルを形成していて、ガン細胞など局所的に低ｐＨの個所に達すると、ミセルが崩壊されることにより、封入された担持薬物の放出により標的指向的な薬物送達が行われうる。
本発明による高分子ミセル型のブロック共重合体に封入可能な生理活性物質には特に制限がなく、この非制限的な例としては、抗ガン剤、抗菌剤、ステロイド類、消炎鎮痛剤、性ホルモン、免疫抑制剤、抗ウィルス剤、麻酔剤、制吐剤、若しくは抗ヒスタミン剤などがある。また、上述の成分のほかに、当業界における通常の添加剤、例えば、賦形剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、保存剤、結合剤、若しくは崩壊剤などを含むこともできる。
本発明による高分子ミセルの製造方法は、攪拌、加熱、超音波照射、乳化法を用いた溶媒蒸発法、マトリックス形成若しくは有機溶媒を用いた透析法などの方法を単独で若しくは併用することができる。
得られた高分子ミセルの直径には特に制限がないが、１０〜１０００ｎｍの範囲であることが好ましい。また、前記高分子ミセル薬物組成物は、経口剤若しくは非経口剤として製剤化して使用することができ、静脈、筋肉若しくは皮下注射剤として製造可能である。
さらに、本発明は、前記ｐＨ感受性のブロック共重合体を薬物輸送用若しくは疾病診断用の担体として使用する方法を提供する。このとき、ブロック共重合体内に含有される物質は、疾病の治療、防止若しくは診断のための物質であれば、特に制限がない。
これらに加えて、本発明は、（ａ）エステル基と３級アミン基を含む化合物、及びアミド基と３級アミン基を含む化合物よりなる群から選ばれたいずれか１種以上の化合物若しくは前記化合物の共重合体と、（ｂ）親水性若しくは両親媒性を有する化合物とを共重合させることにより、ミセルを形成可能なｐＨ感受性のブロック共重合体の製造方法を提供する。
[発明を実施するための最良の態様]
以下、本発明を下記の実施例及び実験例を挙げてより詳細に説明する。但し、下記の実施例は単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
［実施例１〜２０］
ｐＨ感受性のブロック共重合体の合成
［実施例１］
（ポリエチレングリコール−ポリ（β−アミノエステル）ブロック共重合体（ＰＡＥ）の製造）
ポリエチレングリコールメチルエーテル（ＭＰＥＧ２０００、Ｍｎ＝２０００）とアクリロイルクロリドを、トリエチルアミン（ＴＥＡ）入りメチレンクロリドの存在下で反応させた後、希塩酸水溶液により抽出し、ｎ−ヘキサンに沈殿させて親水性成分であるポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（ＭＰＥＧ２０００−Ａ、Ｍｎ＝２０００）を製造した。ＭＰＥＧ２０００−Ａ０．１モルと、ジアミン成分としての４，４’−トリメチレンジピペリジン１モル及び１，６−ヘキサンジオールジアクリレート１モルを２口丸フラスコに入れて、減圧後に、窒素を充填した。このとき、反応溶媒としてはクロロホルムを使用し、５０℃において４８時間反応させて、分子量（Ｍｐ）が７７００のポリエチレングリコール−ポリ（β−アミノエステル）ブロック共重合体（ＭＰＥＧＡ−ＰＡＥ）を製造した。
［実施例２］
ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（ＭＰＥＧ２０００−Ａ）の使用量を０．１モルから０．２モルに変えたことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が４８００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
［実施例３］
ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（ＭＰＥＧ２０００−Ａ）の使用量を０．１モルから０．３モルに変えたことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が４４００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
［実施例４］
ＭＰＥＧ２０００に代えて、ＭＰＥＧ５０００を用いて製造されたＭＰＥＧ５０００−Ａ０．１モルを使用したことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が１３５００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
［実施例５］
ＭＰＥＧ２０００に代えて、ＭＰＥＧ５０００を用いて製造されたＭＰＥＧ５０００−Ａ０．４モルを使用したことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が１２５００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
［実施例６］
ＭＰＥＧ２０００に代えて、ＭＰＥＧ５０００を用いて製造されたＭＰＥＧ５０００−Ａ０．１モルを使用し、且つ、４，４’−トリメチレンジピペリジン０．８モルを使用したことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が８８００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
［実施例７］
ＭＰＥＧ２０００に代えて、ＭＰＥＧ５０００を用いて製造されたＭＰＥＧ５０００−Ａ０．１モルを使用し、且つ、４，４’−トリメチレンジピペリジン１．１モルを使用したことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が２００００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
［実施例８］
ＭＰＥＧ２０００に代えて、ＭＰＥＧ５０００を用いて製造されたＭＰＥＧ５０００−Ａ０．１モルを使用し、且つ、４，４’−トリメチレンジピペリジン１．３モルを使用したことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が７９００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
［実施例９］
ＭＰＥＧ２０００に代えて、ＭＰＥＧ５０００を用いて製造されたＭＰＥＧ５０００−Ａ０．１モルを使用し、且つ、４，４’−トリメチレンジピペリジン１．５モルを使用したことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が６９００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
［実施例１０］
ＭＰＥＧ２０００に代えて、ＭＰＥＧ５０００を用いて製造されたＭＰＥＧ５０００−Ａ０．１モルを使用し、且つ、４，４’−トリメチレンジピペリジンに代えて、ピペラジンを使用したことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が６２００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
［実施例１１］
ＭＰＥＧ−ＰＡＥブロック共重合体の生分解速度を調節するために、ＭＰＥＧ５０００を用いて製造されたＭＰＥＧ５０００−Ａ０．１モルを使用し、且つ、アミン系の化合物としてのピペラジン１モルと、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート０．８モルに、生分解速度調節剤であるジアクリルアミド成分としてのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを０．２モルずつ付加し、分子量１３，２００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥＡブロック共重合体を製造した。
［実施例１２］
１，６−ヘキサンジオールジアクリレート０．６モルに、生分解速度調節剤であるジアクリルアミド成分としてのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを０．４モル付加したことを除いては、実施例１１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が１３，７００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥＡブロック共重合体を製造した。
［実施例１３］
１，６−ヘキサンジオールジアクリレート０．４モルに、生分解速度調節剤であるジアクリルアミド成分としてのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを０．６モル付加したことを除いては、実施例１１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が１３，４００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥＡブロック共重合体を製造した。
［実施例１４］
１，６−ヘキサンジオールジアクリレート０．２モルに、生分解速度調節剤であるジアクリルアミド成分としてのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを０．８モル付加したことを除いては、実施例１１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が１３，３００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥＡブロック共重合体を製造した。
［実施例１５］
ＭＰＥＧ５０００を用いて製造されたＭＰＥＧ５０００−Ａ０．１モルを使用し、アミン系の化合物としてのピペラジン１モルと、ジアクリルアミド化合物としてのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを１モルずつ付加し、分子量１３，８００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＡブロック共重合体を製造した。
［実施例１６］
ＭＰＥＧ５０００−Ａ０．１モルに代えて、ＭＰＥＧ２０００を用いて製造されたＭＰＥＧ２０００−Ａ０．１モルを使用したことを除いては、前記実施例１１の方法と同様にして、分子量が１０，２００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥＡブロック共重合体を製造した。
［実施例１７］
ＭＰＥＧ２０００を用いて製造されたＭＰＥＧ２０００−Ａ０．１モルを使用し、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート０．６モルに、生分解速度調節剤であるジアクリルアミド成分としてのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを０．４モル付加したことを除いては、実施例１１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が１０，４００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥＡブロック共重合体を製造した。
［実施例１８］
ＭＰＥＧ２０００を用いて製造されたＭＰＥＧ２０００−Ａ０．１モルを使用し、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート０．４モルに、生分解速度調節剤であるジアクリルアミド成分としてのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを０．６モル付加したことを除いては、実施例１１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が１０，７００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥＡブロック共重合体を製造した。
［実施例１９］
ＭＰＥＧ２０００を用いて製造されたＭＰＥＧ２０００−Ａ０．１モルを使用し、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート０．２モルに、生分解速度調節剤であるジアクリルアミド成分としてのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを０．８モル使用したことを除いては、実施例１６の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が１０，３００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥＡブロック共重合体を製造した。
［実施例２０］
ＭＰＥＧ２０００を用いて製造されたＭＰＥＧ２０００−Ａ０．１モルを使用し、アミン系の化合物としてのピペラジン１モルと、ジアクリルアミド化合物としてのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを１モルずつ付加し、分子量が１０，６００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＡブロック共重合体を製造した。
[比較例１〜２]
[比較例１]
ＭＰＥＧ２０００に代えて、ＭＰＥＧ４００を用いて製造されたＭＰＥＧ５００−Ａ０．１モルを使用したことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が８０００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
製造されたＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を用いてｐＨ変化による挙動を観察したところ、前記ブロック共重合体はミセルを形成できないことが確認された。これは、上述のように、特定のｐＨにおいて、親水性ブロックが短過ぎて親水性／疎水性による自己集合が起こらず、結果として、ミセルが形成され難いだけでなく、たとえミセルが形成されるとしても、水に溶解されて崩壊され易いことを裏付けるものである。
[比較例２]
ＭＰＥＧ２０００に代えて、ＭＰＥＧ６０００を用いて製造されたＭＰＥＧ６０００−Ａ０．１モルを使用したことを除いては、前記実施例１の方法と同様にして、分子量（Ｍｐ）が１４５００のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を製造した。
前記ＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体を用いてｐＨ変化による挙動を観察したところ、比較例２によるブロック共重合体は、前記比較例１と同様に、ミセルを形成できないことが確認された。これは、疎水性であるポリ（アミノ酸）の分子量に比べてブロックが長過ぎて親水性／疎水性のバランスが崩れ、特定のｐＨにおいてミセルが形成できずに沈殿することを意味するものである。
[実験例１．ｐＨ感受性のブロック共重合体の分子量の測定]
本発明に従い製造されたｐＨ感受性のブロック共重合体の分子量を測定するために、下記のようにして分析を行った。
実施例１〜１５に従い製造されたＭＰＥＧＡ−ＰＡＥ、ＭＰＥＧＡ−ＰＡＡ若しくはＭＰＥＧＡ−ＰＡＥＡブロック共重合体を使用し、これらの分子量の調節の可能性を調べるために、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ、Ｗａｔｅｒｓ社製）分析を行った。
先ず、実施例１〜５に従い製造されたＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体の分子量の分析を行ったところ、ＭＰＥＧ２０００−Ａを用いて最終的な共重合体の分子量を調節することは可能であるが（図１参照）、ＭＰＥＧ５０００−Ａを用いる場合、最終的な共重合体の分子量調節が容易ではないことが分かった（図２参照）。
ＭＰＥＧ５０００−Ａから得られる最終的な共重合体の分子量の調節の可能性を調べるために、ＭＰＥＧ−Ａとビスアクリレートの含量はそのままにしておき、ジアミンの含量のみを変えた実施例４、６〜９のＭＰＥＧＡ−ＰＡＥブロック共重合体に対する分子量の分析を行ったところ、たとえＭＰＥＧ５０００−Ａを用いるとしても、最終的な共重合体の分子量が調節可能であるだけでなく、ジ(di-)ブロック若しくはトリ(tri-)ブロックの構造を有する最終的な共重合体が調節可能であるということを確認することができた（図３参照）。実際に、ジアミンの添加量が１モルである場合、約１３，０００の分子量を有する共重合体が合成されたが、これは、分子量５０００のＭＰＥＧと分子量８０００であるＰＡＥが結合されたジブロック共重合体であると推定される。また、ジアミンの添加量が１．１モルに増えると、重合時にはモル比のバラツキにより分子量が低くなるべきであるにも拘らず、却って分子量が約１９，０００に増えていることが分かる。これより、ＭＰＥＧ−Ａ、ＰＡＥ、ＭＰＥＧ−Ａよりなるトリブロック共重合体が製造されたことが予測できる。しかしながら、ジアミンの添加量が１．３モル、１．５モルに増える場合、却ってブロック共重合体の分子量は低下するという現象を示したが、これは、モル比のバラツキが重合度に大きく影響するためであると認められる。
[実験例２．ｐＨ変化によるミセルの変化測定]
本発明に従い製造されたｐＨ感受性のブロック共重合体ミセルのｐＨ変化による挙動を観察するために、下記のようにして実験を行った。
実施例１〜４及び実施例１０に従い製造された種々の分子量のブロック共重合体を使用した。蛍光分析器によっては直接的にミセルの挙動変化を測ることができないため、疎水性の発光物質であるピレンを使用した。
１０−６Ｍのピレンを含有するｐＨ６．０のバッファー溶液を作製し、実施例１〜４及び実施例１０に従い製造された各共重合体を１ｍｇ／ｍＬの濃度に溶かした後、ｐＨ８．０へと溶液のｐＨを高めた。この後、５Ｍの塩酸水溶液を滴下してｐＨを５．５〜８．０の範囲に変え、次いで、蛍光分光器により、ミセルの濃度変化による放出エネルギーの変化を測定した。
先ず、分子量が２０００のポリエチレングリコールを用いて製造された実施例１、実施例２及び実施例３のブロック共重合体に対し、ｐＨ変化に応じた挙動変化を測定したところ、ポリ（β−アミノエステル）ブロック共重合体の分子量が増えるに伴い、ミセルが崩壊されるｐＨ範囲がやや異なってくることが分かった（図４参照）。これは、製造されたブロック共重合体内における疎水性のポリ（β−アミノエステル）ブロックと親水性のポリエチレングリコールブロックの分率の変化により、ｐＨ変化によるイオン化度がやや異なっていき、結果として、ミセルの挙動範囲が変わることを意味する。
また、実施例４及び実施例１０に従いそれぞれ別々のジアミン化合物を用いて製造された共重合体ミセルの挙動を測定したところ、実施例４の共重合体の方が、より狭いｐＨ範囲においてミセルの崩壊が起きることが分かった（図５参照）。これは、ピペラジンと４，４’−トリメチレンジピペリジンのイオン化傾向が異なることに起因する現象であると認められる。このため、４，４’−トリメチレンジピペリジンを使用する場合、ミセルの崩壊がより狭い範囲において起き、これにより、よりｐＨ変化に感受性のある物質として使用可能であることを確認することができた。
[実験例３．ブロック共重合体のｐＨによるミセル変化の測定]
本発明に従い製造されたｐＨ感受性のブロック共重合体ミセルの、特定のｐＨにおける変化を観察するために、下記のようにして実験を行った。
（３−１．ＣＭＣの測定）
実施例４に従い製造された共重合体に対し、ｐＨ７．０１，ｐＨ７．２４、ｐＨ７．４におけるＣＭＣを測定した。
実験の結果、本発明によるブロック共重合体は、ｐＨ７．４においては安定したミセルを形成している一方、ｐＨ７．０においては、ミセルが全く形成されていないことが確認できた（図６参照）。これは、低いｐＨ（ｐＨ７．０以下）において、ポリ（β−アミノエステル）に存在する３級アミンのイオン化度の増加によりＰＡＥの全体が水溶性に変わる結果、前記共重合体がミセルを形成できなくなり、その一方、ｐＨ７．４においては、ＰＡＥのイオン化度が低下して疎水性を示すことにより、自己集合によるミセルを形成することを意味する。
（３−２．ミセル寸法の測定）
実施例４に従い製造された共重合体に対し、ＤＬＳ（動的光散乱）を用い、ｐＨ８．０１，ｐＨ７．４２，ｐＨ７．２３、ｐＨ６．６８、ｐＨ６．３０におけるミセル寸法の変化を測定した。
実験の結果、ｐＨ７．０以上においては、一定の寸法を有するミセルが存在することが確認できたが（図７、図８及び図９参照）、ｐＨ７．０未満においては、ポリ（β−アミノエステル）が完全にイオン化されてミセルが全く形成されていないことが確認できた（図１０参照）。
これにより、本発明によるｐＨ感受性のブロック共重合体は、共重合体内に存在する両親媒性と、ｐＨ変化による可逆的な自己集合現象を通じて、高分子ミセルを形成及び崩壊可能であることが確認できた。
[実験例４．ブロック共重合体ミセルのｐＨによる生分解速度の評価]
本発明に従い製造されたｐＨ感受性のブロック共重合体ミセルの、特定ｐＨでの変化を観察するために、下記のようにして実験を行った。
実験には、主鎖にエステル基が存在して比較的に生体内の生分解速度が速いポリ（β−アミノエステル）を用いて製造された実施例４の共重合体と、主鎖にアミド基が存在して生体内の生分解速度が比較的に遅いポリ（アミドアミン）を用いて製造された実施例１１の共重合体を使用した。また、前記実施例１１の共重合体を構成する成分、例えば、アミン系の化合物、及び生分解速度調節剤であるポリ（アミドアミン）の含量及びこれらの組成比などを調節して得られた実施例１１〜実施例２０の共重合体を使用した。
前記共重合体に対し、それぞれｐＨ７．４における分子量の経時変化を測定した結果、実施例４によるブロック共重合体ミセルは３０時間が過ぎないうちに分子量が半分以上に減少され、これより、ミセルの生分解がやや速いのに対し、実施例１１によるブロック共重合体ミセルは生分解速度が遅いことが分かった（図１１参照）。さらに、実施例１１〜実施例２０のブロック共重合体ミセルを用いて測定した結果、前記ブロック共重合体ミセルを構成する成分の含量、及びこれらのモル比などを調節することにより、生体内においてミセルが種々の分解速度を示すように調節することが容易であることが確認できた（図１２参照）。このため、本発明によるｐＨ感受性のブロック共重合体は、ポリ（β−アミノ酸）の一種として、比較的に生体内の生分解速度が遅いポリ（アミドアミン）との共重合体を通じて、所望の生分解速度を容易に調節可能であるだけでなく、生分解速度を維持し続けるように工夫可能であることを確認することができた。
[産業上の利用可能性]
本発明によるブロック共重合体は、ｐＨに応じて水への溶解特性を有するものの、自己集合現象によりミセルを形成できないポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（β−アミノエステル）及びポリ（アミドアミン）化合物に、親水性ポリエチレングリコール系の化合物を重合させてｐＨ感受性のブロック共重合体を得ることにより、ｐＨ感受性を保有するだけでなく、自己集合現象により可逆的に高分子ミセルを形成することができ、これにより、体内ｐＨ変化に標的指向的な薬物輸送担体及び診断用途として使用することができる。
この発明は、最も実用的で好ましい実施例に関して記載するが、開示する実施例及び図面に限定されないことが理解されるべきである。一方、添付の請求項の精神及び範囲内で、種々の変更及び変化を包含することが意図される。
図１は、分子量が２０００のポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（ＭＰＥＧ−Ａ）とポリ（β−アミノエステル）を用いて製造された実施例１〜３のｐＨ感受性のブロック共重合体における、ＭＰＥＧ−Ａ（Ｍｎ＝２０００）のモル比の変化によるブロック共重合体の分子量の調節結果を示すグラフである。 図２は、分子量が５０００のＭＰＥＧ−Ａとポリ（β−アミノエステル）を用いて製造された実施例４及び５のｐＨ感受性のブロック共重合体における、ＭＰＥＧ−Ａ（Ｍｎ＝５０００）のモル比の変化によるブロック共重合体の分子量の調節結果を示すグラフである。 図３は、実施例４、６〜９に従い製造されたｐＨ感受性のブロック共重合体における、ジアミンのモル比の変化によるブロック共重合体の分子量の調節結果を示すグラフである。 図４は、実施例１〜３に従い製造されたブロック共重合体におけるｐＨ変化によるミセルの挙動の変化を示すグラフである。 図５は、ジアミン化合物としてピペラジン及び４，４’−トリメチレンジピペリジンをそれぞれ用いて製造された実施例４及び実施例１０のブロック共重合体におけるｐＨ変化によるミセルの挙動の変化を示すグラフである。 図６は、実施例４に従い製造されたブロック共重合体におけるｐＨ変化による臨界ミセル濃度（ＣＭＣ：critical micelle concentration）の変化を示すグラフである。 図７は、実施例４に従い製造されたブロック共重合体におけるｐＨ変化によるミセル寸法の変化を示すグラフであって、ｐＨ８．０１におけるミセル寸法を示すグラフである。 図８は、実施例４に従い製造されたブロック共重合体におけるｐＨ変化によるミセル寸法の変化を示すグラフであって、ｐＨ７．４２におけるミセル寸法を示すグラフである。 図９は、実施例４に従い製造されたブロック共重合体におけるｐＨ変化によるミセル寸法の変化を示すグラフであって、ｐＨ７．２３におけるミセル寸法を示すグラフである。 図１０は、実施例４に従い製造されたブロック共重合体におけるミセル寸法の変化を示すグラフであって、ｐＨ６．３〜８．０範囲におけるミセル寸法の変化を示すグラフである。 図１１は、実施例４及び実施例１１に従い製造されたブロック共重合体における分子量の経時変化を示すグラフであって、ｐＨ７．４における分子量を示すグラフである。 図１２は、実施例１１〜実施例１５に従いそれぞれ製造されたブロック共重合体における分子量の経時変化を示すグラフであって、ｐＨ７．４における分子量を示すグラフである。 図１３は、実施例１６〜実施例２０に従いそれぞれ製造されたブロック共重合体における分子量の経時変化を示すグラフであって、ｐＨ７．４における分子量を示すグラフである。

Claims (7)

  1. 共重合により得られ、かつ下式によって表されるｐＨ感受性のブロック共重合体：
    Ｒ‐Ｏ‐Ｄｘ‐ＣＯ‐ＣＨＲ’‐ＣＨ２‐［Ｅ‐Ｆ］ｙ‐
    ［式中、
    Ｒは、水素原子若しくは炭素原子数１〜６のアルキル基であり、及び
    Ｒ‐Ｏ‐Ｄｘ‐ＣＯ‐ＣＨＲ’‐ＣＨ２‐はポリエチレングリコール系のブロックに相当し、及びＲ’は水素若しくはＣＨ３であり、及び‐［Ｅ‐Ｆ］ｙ‐はｐＨ感受性のブロックに相当し、
    ここで、Ｄはオキシエチレンユニットであり、及びｘは、１０,０００以下の自然数であり、Ｄｘは５００〜５,０００の分子量を有し、
    Ｅは、３−メチルピペラジン、４−（ビス）ピペラジン、ピペラジン、及び４，４’−トリメチレンジピペリジンよりなる群から選択される少なくとも１種のアミン化合物に基づき、
    Ｆは、エチレングリコールジアクリレート、１,４−ブタンジオールジアクリレート、１,３−ブタンジオールジアクリレート、１,６−ヘキサンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオネートジアクリレート、１，７−ヘプタンジオールジアクリレート、１，８−オクタンジオールジアクリレート、１，９−ノナンジオールジアクリレート及び１，１０−デカンジオールジアクリレートよりなる群から選択される少なくとも１種のビスアクリレート化合物、並びに／あるいは、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミドよりなる群から選択される少なくとも１種のビスアクリルアミド化合物に基づき、並びに
    ｙは、１０，０００以下の自然数であり、及び
    ここで、前記ビスアクリレート若しくはビスアクリルアミド化合物と、アミン化合物が、１：０．５〜２．０のモル比で使用され、及び
    前記ｐＨ感受性のブロック共重合体が、１，０００〜２０，０００の分子量を有し、かつ前記ポリエチレングリコール系のブロック及び前記ｐＨ感受性のブロックを、５〜９５重量％：５〜９５重量％の比で含む。］。
  2. 前記ブロック共重合体中の前記ｐＨ感受性のブロックがｐＨ７．０以下においてイオン化される３級アミン基を含むものであることを特徴とする、請求項１に記載のｐＨ感受性のブロック共重合体。
  3. 前記ブロック共重合体が、ｐＨ７．２〜７．４の範囲においてミセルを形成し、ｐＨ６．５〜７．０の範囲においては形成されたミセルが崩壊することを特徴とする、請求項１または２に記載のｐＨ感受性のブロック共重合体。
  4. （ａ）請求項１乃至３のいずれか一項に記載のブロック共重合体と、
    （ｂ）前記ブロック共重合体に封入可能な生理活性物質
    を含む、高分子ミセル型の薬物組成物。
  5. 前記高分子ミセルの直径が、１０〜１，０００ｎｍの範囲であることを特徴とする、請求項４に記載の高分子ミセル型の薬物組成物。
  6. 薬物輸送用の担体若しくは疾病診断用の担体の製造のための、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のブロック共重合体の使用。
  7. アクリレート末端基またはメタクリレート末端基を有するポリエチレングリコール、少なくとも１種のアミン化合物、及び少なくとも１種のビスアクリレート化合物及び／または少なくとも１種のビスアクリルアミド化合物を共重合反応させてブロック共重合体を得る工程を含むことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のブロック共重合体の製造方法。
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