JP4813903B2 - アスコピロンｐの効率的な製造方法 - Google Patents

Description

本発明はアスコピロンＰ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）の効率的な製造方法に関する。

アスコピロンＰ（構造式：図１）は、１９７８年にセルロースの熱分解により生成することが初めて報告され（Ｓｈａｆｉｚａｄｅｈ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．６７，４３３−４４７（１９７８）参照）、その後、^１Ｈ−ＮＭＲおよび^１３Ｃ−ＮＭＲ、赤外線分光法（ＩＲ）により構造が解析され、三次元構造が明らかにされた。
アスコピロンＰ（以下、ＡＰＰという）は、抗酸化能、抗菌能さらに褐色変化防止能を有することが報告されており（ＷＯ００／５６８３８、ＷＯ０２／２６０６０、ＷＯ０２／２６０６１参照）、昨今、その非常に高い機能性に期待が高まっている物質である。また自然界ではある種の真菌類が生産することも報告されている（Ｍ．−Ａ．Ｂａｕｔｅ，ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，４１−４５（１９９３）参照）。

ＡＰＰの調製方法に関してはいくつかの報告がある。セルロースの熱分解による方法では、ＡＰＰの収率が原料であるセルロースに対して僅か１．４％程度と低く、さらに、その後の精製に非常に複雑な分離工程が必要なため、工業的な生産には本方法は現実的ではない。また、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下、１，５−ＡＦという）を強アルカリ条件下にすると、多数の化合物が生成し、その化合物が生成される過程の中間物質の一つがＡＰＰであることが報告されている（Ａｈｍａｎｄ，Ｔ．，ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅ Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ（１９９５）参照）。しかし、この条件下ではＡＰＰは中間体であり、その反応をＡＰＰで停止させる方法やＡＰＰの調製法に関しては記述されていない。
ＡＰＰは真菌類のＰｅｚｉｚａｌｅｓ目（例えば、Ｐｉｃａｒｉａ ｌｅｉｏｃａｒｐａおよびＡｎｔｈｒａｃｏｂｉａ ｍｅｌａｌｏｍａ）ならびにＴｕｂｅｒａｌｅｓ目（例えばＴｕｂｅｒ ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｕｍ）の菌体抽出液を１，５−ＡＦに作用させ生合成できることも報告されているが、この方法はミリグラム単位での調製しか行われていない。この調製方法は、かなりの手間や時間を要するにも関わらず低収率であり、効率も悪いため、産業上利用できるものではなかった。

最近では、酵素を用いたＡＰＰの生産方法として、生産条件を詳細に設定した方法が特許出願されている（ＷＯ０３／０３８０８５、ＷＯ０３／０３８１０７、ＷＯ０３／０３８０８４参照）。しかし、この方法では酵素反応に長時間を要するうえ、酵素生産にも時間を費やす必要がある。
一方、１，５−ＡＦは、澱粉などのα−１，４−グルカンをα−１，４−グルカンリアーゼで分解することによって調製できる糖質であり、安価に大量に生産できる。この糖質については抗菌剤（特開２００１−８９３７７号公報参照）、抗酸化剤（特表平９−５０５９８８号公報参照）および着色剤（特開２００２−２７９４５号公報参照）としての利用について既に提案されている。

本発明の目的は、ＡＰＰの効率的な製造方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
本発明者らは、１，５−ＡＦおよびＡＰＰについて鋭意研究を重ねた結果、１，５−ＡＦを高温で一定時間加熱することにより、容易にＡＰＰを調製できることを発見し、その究明事実に基づき本発明に到達した。

すなわち、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、１，５−ＡＦをｐＨ２ないし７未満で１００℃〜２５０℃の温度で、加熱することを特徴とする、ＡＰＰの製造方法によって達成される。
さらに、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、１，５−ＡＦを抗酸化剤の共存下で加熱することを特徴とする、ＡＰＰの効率的な製造方法によって達成される。
本発明法によれば、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース溶液をｐＨ１０以下の条件下において、加熱することで、アスコピロンＰを従来の方法よりも非常に効率良く、かつ安価に製造することが可能である。

アスコピロンＰ（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）の構造式である。 １，５−ＡＦ水溶液を１２５℃、１３５℃、１４５℃、１５５℃でそれぞれ加熱した際の加熱時間とＡＰＰ生成率の関係である。 １，５−ＡＦ水溶液をｐＨ調整後加熱処理した際のＡＰＰ生成率の比較である。 １，５−ＡＦ水溶液（ｐＨ３．４）を１２０℃の温度で加熱した際の加熱時間とＡＰＰ生成率の関係である。 １，５−ＡＦ水溶液（ｐＨ３．４）を１５０℃の温度で加熱した際の加熱時間とＡＰＰ生成率の関係である。 １，５−ＡＦ水溶液（ｐＨ３．４）を１７０℃の温度で加熱した際の加熱時間とＡＰＰ生成率の関係である。 １，５−ＡＦ水溶液にアスコルビン酸１％を添加して加熱した際のＡＰＰ生成率である。

本発明の製造方法で用いられる１，５−ＡＦは、例えば、紅藻オゴノリから抽出・精製したα−１，４−グルカンリアーゼと澱粉あるいは澱粉分解物を反応させることにより調製可能である。
かくして調製された１，５−ＡＦ含有溶液は、さらに分離・精製を行い、例えば、１，５−ＡＦ含量９９％以上の高純度溶液とすることができる。また、特に分離・精製を行わずに、例えば、１，５−ＡＦ含量４０％の溶液をそのまま使用してもよい。
加熱条件とＡＰＰの生成率の関係は、１，５−ＡＦ溶液を加熱して得られた溶液について、ＡＰＰ生成率を調べて求めることができる。
ＡＰＰ生成率は以下の要領で算出する。
減圧下で乾燥させたＡＰＰを用いて調製した標準溶液について表１に記載の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行い、得られたクロマトグラムにおけるＡＰＰのピーク面積を基に、測定試料（本発明の製法で製造したＡＰＰ含有溶液）のＨＰＬＣクロマトグラムにおけるＡＰＰのピーク面積より生成されたＡＰＰ量を算出する。ＡＰＰ生成率は加熱処理に使用した１，５−ＡＦの量に対して得られたＡＰＰの生成量の重量％を算出することで求められる。

本発明におけるＡＰＰの製造法では、１，５−ＡＦ溶液をｐＨ２ないし７未満の条件下で１００〜２５０℃の温度で加熱する。ｐＨがそれより高くてもＡＰＰは生成されるが、多数の副産物が生成する為、ＡＰＰの分離、精製が非常に困難となる。好ましい条件としては、ＡＰＰの安定性等を考慮すると、より好ましくはｐＨ２ないし４である。
本発明のＡＰＰ製造法における加熱条件としては、１２０℃以上の温度が好ましく、より好ましくは１４０〜２５０℃である。また、加熱時間は加熱温度や加熱方法によっても異なるが、例えば１００℃以上で１秒〜２４時間であり、好ましくは１２０℃以上で１秒〜５時間、より好ましくは、１４０〜２５０℃で１秒〜２時間程度である。
加熱方法としては、各種加熱機器が挙げられる。例えば、加熱機器として加圧蒸気殺菌器、ジェットクッカー、オイルバス等があり、その加熱媒体としては、各種のオイル、蒸気、過熱水蒸気等がある。
１，５−ＡＦを溶解する溶媒としては、例えば、水あるいは水と水混和性有機溶媒との混合物を挙げることができる。水混和性有機溶媒としては、例えば、炭素数１〜３の低級アルコール等が挙げられる。
溶媒中における１，５−ＡＦの濃度は、例えば０．１〜９０重量％とすることができる。

また、本発明者らは、ＡＰＰが抗酸化剤共存下で安定化する傾向があることを見出した。従って、１，５−ＡＦ溶液に他の抗酸化剤を添加して加熱処理を行うことで更に効率よくＡＰＰを製造することができる。他の抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸、エチレンジアミン四酢酸およびそれらの塩類、トコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、ポリフェノール類が挙げられるが、なかでもアスコルビン酸、エリソルビン酸、エチレンジアミン四酢酸およびそれらの塩類が好ましい。
かくして、上述の方法によって得られたＡＰＰ含有溶液よりＡＰＰを精製するためには、例えば、クロマトグラフィーにより分離精製を行うことができる。分離精製後、凍結乾燥により得られたＡＰＰ粉末について、電子衝撃イオン化法による質量分析法を用いて分析したところ、ｍ／ｚ１４４に分子イオン（Ｍ^＋）が観測された。また、同じ試料を重水に溶解し、^１Ｈ−ＮＭＲ法および^１３Ｃ−ＮＭＲ法を用いて分析したところ、表２に記載された結果が得られた。これらの質量分析とＮＭＲの値は既に報告されているＡＰＰのそれらの値（Ｍ．−Ａ．Ｂａｕｔｅ，ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，４１−４５（１９９３）参照）と一致し、本発明の方法で製造された物質が図１に記載の構造を有し、ＡＰＰであることが確認された。

本発明の製造方法により得られたアスコピロンＰは、食品工業、医薬品工業、化学工業などで利用可能である。利用方法としては、例えば、アスコピロンＰを食品の原料または製品に添加することが可能である。また、別の方法として、製品に１，５−ＡＦを添加し、食品の製造工程中に本発明方法を実施することも可能である。例えば、食品の製造工程では往々にして、調理、殺菌などの加熱処理工程が存在する。従って、食品原料に予め１，５−ＡＦを添加しておき、本発明の条件にて加熱することで、食品中でのアスコピロンＰの製造が行われる。
以下、実施例により本発明を更に詳述する。本発明は、これらによって何ら限定されるものではない。

実施例１
１，５−ＡＦ（純度９９％）を水に溶解して濃度１０％の水溶液を調製し、加圧加熱殺菌器を用いて１２５℃、１３５℃、１４５℃、１５５℃でそれぞれ加熱し、各温度における加熱時間とＡＰＰ生成率の関係を調べた。その結果、図２に示すように、これらの加熱条件で１，５−ＡＦからＡＰＰが生成すること、さらに加熱温度１２５℃から１５５℃の範囲では１５５℃が最も生成率が高いことが明らかとなった。また、過度に加熱を行うと、一旦生成されたＡＰＰが分解し、結果的に収率が低減することも判った。以上の結果から、１，５−ＡＦを高温で一定時間加熱することにより、短時間で効率良くＡＰＰを調製できることが明らかとなった。

実施例２
濃度１０％の１，５−ＡＦ水溶液を下記表３に記載のｐＨ調整剤でｐＨ１〜１３まで調整した試料を１２１℃、３０分間オートクレーブで加熱し、ＡＰＰ生成に対するｐＨの影響を調べた。結果を図３に示す。

試験結果より、ｐＨ条件がＡＰＰの生成に大きく影響し、特に酸性条件下で効率よく生成されることが明らかとなった。

実施例３
抗酸化剤の共存下で１，５−ＡＦを加熱した。濃度１０％の１，５−ＡＦ（純度９９％）水溶液に表４に記載の濃度で抗酸化剤を添加し、加圧加熱殺菌器を用いて１４５℃で１５分間加熱したところ、抗酸化剤を添加したほうがＡＰＰ生成率が高くなった。

実施例４
酢酸緩衝液を用いてｐＨ３．０に調整した濃度１０％の１，５−ＡＦ水溶液をオートクレーブにて１２１℃で３０分間、６０分間それぞれ加熱しＡＰＰ生成率を確認した。その結果を表５に示す。

実施例５
酢酸緩衝液を用いてｐＨ３．４に調整した濃度１０％の１，５−ＡＦ溶液をステンレス製の耐圧容器に充填し、１２０℃、１５０℃、１７０℃のオイルバス中でそれぞれ一定時間加熱した後、ＡＰＰ生成率を確認した。結果を図４、５および６に示した。図６の結果のとおり、１７０℃、５分間の加熱で約３５％のＡＰＰが生成された。また、それぞれの加熱温度において適した加熱時間があり、効率のよい加熱条件が明らかとなった。

実施例６
酢酸緩衝液を用いてｐＨ３．０に調整した濃度３０％の１，５−ＡＦ水溶液をステンレス製の耐圧容器に入れ１６０℃、１８０℃および２００℃のオイルバス中でそれぞれ３分間加熱してＡＰＰを調製した。その結果を表６に示す。

実施例７
酢酸緩衝液を用いてｐＨ３．５に調整した濃度１０％の１，５−ＡＦ水溶液に抗酸化剤を表７に記載の濃度で添加し、ステンレス製の耐圧容器に入れ密閉し、１２５℃のオイルバス中で、３０分間加熱し、ＡＰＰを調製した。その結果、アスコルビン酸を添加したものは、無添加区の約２倍のＡＰＰが生成された。

実施例８
濃度１０％の１，５−ＡＦ水溶液と濃度１０％の１，５−ＡＦ水溶液にアスコルビン酸を１％添加したものをステンレス製の耐圧容器に入れ、１８０℃のオイルバス中で３〜１５分間加熱した。その時のＡＰＰ生成率を図７に示す。アスコルビン酸添加区で３分間加熱した場合、１，５−ＡＦの約４０％がＡＰＰに変換されており最も生成率が高かった。

実施例９
市販のルゥを使用して、カレーを調理した。１，５−ＡＦを０．１％添加し、真空パックした後１３５℃、５分間加熱殺菌した。冷却後、カレーの中のＡＰＰ含有量を測定したところカレー全体の０．０１％含まれていることが判った。

Claims (6)

1. １，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの水溶液をｐＨ２ないし７未満で１００℃〜２５０℃の温度で加熱することを特徴とする、アスコピロンＰの製造方法。
2. 加熱を１４０〜２５０℃の温度で行う請求項１に記載の方法。
3. 加熱を１秒ないし２４時間行う請求項１に記載の方法。
4. ｐＨが２ないし４である請求項１に記載の方法。
5. 加熱を抗酸化剤の存在下で行う請求項１に記載の方法。
6. 抗酸化剤が、アスコルビン酸、エリソルビン酸、エチレンジアミン四酢酸およびそれらの塩類よりなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項５に記載の方法。

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