JP4910085B2 - フラボン類の生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、フラボン類の生産方法に関するものであり、具体的には、ソバ（蕎麦）のスプラウト（芽生え）からフラボン類を高い収率で取得する方法に関するものである。

ソバにはルチン等の健康増進に寄与する成分が含まれていることはよく知られており、古くから健康に良い食品として多くの人に食されている。近年に至り、ソバのスプラウト（芽生え）に関する研究が行われ、ソバのスプラウトには、イソオリエンチン（ルテオリン６−Ｃ−グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン６−Ｃ−グルコシド）、ビテキシン、イソビテキシン等のフラボン類とルチン（フラボノール類）が含まれていることが報告されている。

例えば、下記の非特許文献１〜３には、ソバのスプラウト（芽生え）には、ルチンのほかに、オリエンチン、イソオリエンチン等のフラボン類が含有されており、これらのフラボン類はメタノール還流でソバのスプラウトから抽出できること等が記載されている。

しかしながら、従来知られた方法では、フラボン類の収率が低いため、この収率を向上させる方法の出現が期待されている。
渡辺満ら「ソバ地上部の生育ステージによる抗酸化能とフラボノイド組成の変動」 日本食品科学工学会誌、４９（２）、ｐ１１９−１２５、（２００２） 渡辺満ら「ソバ幼植物のフラボノイド組成」東北農業研究、ｐ２５７−２５８、（２００２） 渡辺満ら「ソバ芽生えのフェノール性化合物量に及ぼす光の影響」 日本食品科学工学会誌、５０（１）、ｐ３２−３４、（２００３）

したがって、本発明は、ソバのスプラウトから高い収率でフラボン類を取得する方法を提供することを目的とする。

本発明によれば、ソバのスプラウトから高い収率でフラボン類を取得するために、以下の方法が提供される。
（１）ソバのスプラウトからフラボン類を生産するに当たり、生育中のソバのスプラウトに紫外線照射を施し、スプラウトの葉を採取して、その葉を有機溶媒で抽出処理した後、得られた抽出物を有機酸で処理してフラボン類を得ることを特徴とするフラボン類の生産方法。
（２）紫外線照射を１〜６日間行うことを特徴とする上記（１）のフラボン類の生産方法。
（３）紫外線照射に先立ち、ソバのスプラウトを過酸化水素又は次亜塩素酸塩の水溶液を付与しつつ生育させることを特徴とする上記（１）のフラボン類の生産方法。
（４）採取したソバのスプラウトの葉を摺りつぶした状態で有機溶媒又はそれらの水溶液により処理してフラボン類含有成分を抽出することを特徴とする上記（１）のフラボン類の生産方法。
（５）抽出に使用する有機溶媒が、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルからなる群から選ばれた少なくとも１種の溶媒であることを特徴とする上記（４）のフラボン類の生産方法。
（６）抽出物を処理する有機酸が、酢酸、コハク酸、クエン酸、マレイン酸、マロン酸、グルクロン酸、ガラクロツロン酸、ギ酸、プロピオン酸、カフェ酸、アスコルビン酸、クマル酸、安息香酸、酒石酸、没食子酸、乳酸から選ばれた少なくとも１種のカルボン酸又はその水溶液であることを特徴とする上記（１）のフラボン類の生産方法。
（７）抽出物を処理する有機酸として、マロン酸を使用することを特徴とする上記（６）のフラボン類の生産方法。
（８）有機酸処理の際、６０〜１００℃で０．２〜２時間熱処理をすることを特徴とする上記（１）〜（７）のフラボン類の生産方法。

本発明方法によれば、ソバのスプラウトからフラボン類を従来よりも高収率で取得することが可能となる。具体的には、従来の方法にくらべて約２０％高い収率で、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ），ルテオリン８−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ８−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ），アピゲニン６−Ｃ−グルコシド（Ａｐｉｇｅｎｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）及びアピゲニン８−Ｃ−グルコシド（Ａｐｉｇｅｎｉｎ８−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）等のフラボン類を取得することができる。

これらのフラボン類は、抗酸化活性、抗腫瘍活性等、種々の生理機能を有することが報告されている。したがって、得られたフラボン類は、医薬品、健康食品、化粧品、食品添加剤等の用途において有効に利用できる。また、本発明によれば、試薬調製時の収率増大という利点も得られる。

本発明で使用する、ソバのスプラウト（芽生え）とは、ソバの種子を培養液又は土壌に蒔き、発芽させ葉が出るまで生育させた幼植物体のことを言い、通常、３〜１０日間栽培されたものを指す。ソバは大きく生育するとフラボンの含有量が急激に減少し、ついには実質的に含まなくなるので、上記のごとく葉が出て間がない幼植物を使用する。

既に渡辺満らによって報告されているとおり、ソバのスプラウトは４種類のフラボン類を含んでいる。すなわち、ソバのスプラウトに含まれるフラボン類は、フラボン骨格に結合する置換基の位置により、以下の化学式で表されるルテオリン６−Ｃ−グルコシド（以下、Ｌ６ＣＧと略称）、ルテオリン８−Ｃ−グルコシド（以下、Ｌ８ＣＧと略称）、アピゲニン６−Ｃ−グルコシド（以下、Ａ６ＣＧと略称）及びアピゲニン８−Ｃ−グルコシド（以下、Ａ８ＣＧと略称）の４種類に区分される。
本発明は、ソバのスプラウトから、これらのフラボン類を、従来知られている方法よりも高い収率で生産する方法に係るものである。

＜生育中のソバ・スプラウトの培養液に対するストレス付与剤の添加＞
本発明の方法によれば、まず、ソバの種子を土壌又は培地に蒔き、暗所で育成して芽生えさせる。本発明で使用するソバの種類は限定されないが、ソバの中でもキタワセ等国産品種が好適である。本発明では、ソバのスプラウト（芽生え）の育成時に、過酸化水素又は次亜塩素酸塩の希薄水溶液を、直接スプラウトに散布するか、あるいは生育する土壌又は培地に添加することにより、スプラウトにストレスを与える。
これらの水溶液における過酸化水素、次亜塩素酸塩の濃度は、通常、０．０１〜５重量％が好ましい。該水溶液の付与量は、容器の大きさと播く種の量で変わるが、土壌又は培地が湿る程度でよい。

＜紫外線照射処理＞
上記のようにして約１日〜２日間生育した後、さらに生育中のスプラウトに、紫外線照射（ＵＶ照射）を行う。照射強度は０．５〜１００ルクスの範囲が適当である。このような照射は１日当たり０．１〜２０時間ずつ１〜６日間程度行うのが良い。

＜スプラウトの葉の採取＞
本発明方法では、生育中に以上のような処理を施したソバ・スプラウトの葉を採取し、採取した葉を容器に入れて後述する抽出用有機溶媒を添加し、該溶媒中で擦りつぶして磨砕する。

＜有機溶媒処置による抽出＞
その状態でしばらく静置して有機溶媒中に葉に含まれるフラボン類含有成分を抽出する。抽出に用いる有機溶媒としては、メタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトン又はそれらの水溶液が好適である。通常の場合、抽出時の温度は室温でよい。また、抽出時間は３分〜５分程度でよい。続いてフラッシュ程度の遠心分離の工程または濾過の工程に送り、抽出物（抽出した成分）と有機溶媒とを分離する。

＜有機酸処理＞
次に、抽出物を有機酸で処理する。ここで使用する有機酸としては、酢酸、コハク酸、クエン酸、マレイン酸、マロン酸、グルクロン酸、ガラクロツロン酸、ギ酸、プロピオン酸，カフェ酸、アスコルビン酸、クマル酸、安息香酸、酒石酸、没食子酸、乳酸から選ばれた少なくとも１種のカルボン酸が適当であり、中でもマロン酸又は酢酸が最適である。これらの有機酸は水溶液で用いることができ、通常、酸濃度１０〜３０重量％程度の水溶液として使用するのが好ましい。
有機酸による処理温度は、室温〜１００℃が採用されるが、一般に、処理温度が高い方が収率が高くなり、例えば酢酸水溶液では、５０〜９０℃が好適である。処理時間は１５〜２００分が好ましい

＜加熱処理＞
本発明方法では、上記有機酸処理の際、加熱処理してもよく、通常、その方が効果的である。この場合、好適な加熱温度は６０〜１００℃、加熱処理時間は０．２〜２時間である。

図１は、以上述べた一連の工程を例示するフローチャートである。ただし、図１は本発明方法の代表的なフローを示すものであって、本発明方法がこれのみに限定されるものではない。

＜単離・精製＞
以上詳述した方法により、Ｌ６ＣＧ、Ｌ８ＣＧ、Ａ６ＣＧ、Ａ８ＣＧのフラボン類が混在した組成物が得られる。この組成物はフラボン類の混合物であるためそのまま健康食品や化粧品等に原料として有効に使用され得るが、それぞれの化合物ごとに単離・生成する必要があるときは、例えば、以下の方法によって目的化合物ごとに分離精製することが出来る。
＜Ｌ６ＣＧ、Ｌ８ＣＧ、Ａ６ＣＧ、Ａ８ＣＧの単離精製＞
有機酸処理後の組成物を、ロータリーエバポレータでそれぞれ濃縮し、水に置換した抽出液１Ｌを、イオン交換樹脂（ＸＡＤ）がガラス管（内径１０ｃｍ、高さ２０ｃｍ）に充填されたカラムクロマトグラフィーにアプライする。水をカラム体積の２〜５倍程度流した後，溶離液に５０〜９０％メタノールを用いフラボンを回収した。回収フラクションを得たら濃縮し、フォトダイオードアレイ検出器を用いたＨＰＬＣによる分取を行い目的物質を得る。このときのＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−５Ｃ１８（２０ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）
移動相：水／メタノール＝７５／２５（ｖ／ｖ）
流速：８．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃

以下に、本発明方法の実施例を詳述する。ただし、本発明はこれらの実施例によってその範囲が限定されるものではない。
なお、実施例で使用したＨＰＬＣ分析の条件は以下のとおりである。

〔実施例１〕
本実施例では、ソバとして国内種のキタワセを使用した。
図１に示す手順で以下の操作を行った。まず、ソバ種子をストレス付与下、２日間暗所でスプラウトを栽培した。その際、ＵＶ照射を行う前に、ストレス付与剤として２％過酸化水素水、０．１％塩酸、０．１％次亜塩素酸を水の代りに、培地に与えた。次いで、毎日ＵＶ照射４時間ずつ、３日間照射を行い、トータルで５日間栽培を行った。このようにストレス付与及びＵＶ照射処理を実施した結果を図２〜図５に示す。これらの図より、ＵＶ照射によるストレスはフラボノイド含量の増大効果が大きく、特に、水＋ＵＶ照射、２％過酸化水素水＋ＵＶ照射、０．１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液＋ＵＶ照射のケースが優れていることが判る。

種蒔きから５日後に、スプラウトの葉を採取し、容器に入れて、メタノール、アセトン等の抽出用有機溶媒を添加し、磨砕して抽出した。抽出物を分離後、これに水添加のみの水処理、各種有機酸による処理（８０℃，２時間加熱）を行った。この際、有機酸として酢酸を使用する実験では、温度及び時間を変えて処理を行った。そして、各種処理後に、ＨＰＬＣでの分析を行った。
同じ処理をしたスプラウトに、各種の抽出溶媒で抽出を実施したときの結果を図６〜図７に示す。図６から、抽出溶媒のうち、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルが好適なことがわかる。また、上記の渡辺満らの報告にあるように通風乾燥メタノール還流による抽出も行ったが、図７に示すようにアセトン中に浸漬する場合よりも劣る結果となった。

また、同じ条件で抽出した抽出物に、各種の有機酸（ただし酢酸は除く）又はリン酸で処理を行ったときの結果を図８〜図１１に示し、酢酸水溶液（濃度２０重量％）で温度と時間を変えて処理した結果を図１２〜図１５に示す。なお、図１３〜図１５のグラフにおける凡例は図１２と同じである。
ここでは有機酸処理時の加熱条件として、８０℃、１２０分とし、有機酸１７種による検討を行った。リン酸以外の有機カルボン酸は、フラボン含量を増やすことが分かり、有機酸処理は有効であることが判った。このうち、マロン酸処理での増加率が最も高い結果となった。また、この試験より、有機酸の濃度はおおむね終濃度０．０５Ｍあれば、フラボン類が増加することが確認できた。

以上の一連の工程において、有機酸処理としてマロン酸処理を行ったときについて、有機酸処理前の各処理との組み合わせによる結果を図１６、図１７に示す。上段は一連の処理後のルテオリン８−Ｃ−グルコシド量を示す図であり、下段はルテオリン６−Ｃ−グルコシド量を示す図である。これらの図から、０．１％次亜塩素酸ナトリウムとＵＶ照射のストレスを与えた後、マロン酸処理を行ったときの増加量が一番高いことがわかる。すなわち、次亜塩素酸ナトリウム＋ＵＶにマロン酸処理した試験区が単にメタノールで抽出する場合に比べて約１．９倍と最大に増加した。

以上の実施例により、ソバのスプラウト（芽生え）のフラボン含量を増加させる簡易な方法として、ソバ種子を２日間暗所栽培し、３日目から、ストレスとして、０．１％次亜塩素酸を与え、３〜５時間、３日間のＵＶ照射をし、トータル５日間栽培を行い、その後、マロン酸水溶液による有機酸処理を行い、８０℃で２時間の加熱処理を行った結果、１．９倍までに増加し、収率が大幅に向上することが確認された。

次に、本発明方法で生産されるルテオリン６−Ｃ−グルコシド精製品の抗酸化活性等の特性を調べた。その結果を次の表２にまとめて示す。なお、各測定は次のように実施した。

Ａ）脂質過酸化抑制効果
４％リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、試料１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。試料はササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対照として２０ｐｐｍトコフェロールを試料の代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
生じた過酸化脂質の過酸化物価（ＰＯＶ）を常法に従って測定し、抗酸化剤が無い状態のコントロールのＰＯＶを０％とし、試料の脂質過酸化抑制率を求めた。

Ｂ）ＤＰＰＨラジカル消去活性
安定なラジカルであるＤＰＰＨラジカルに対するラジカル消去活性について検討した。
０．５ｍＭのＤＰＰＨラジカル・エタノール溶液１００μｌ、試料１００μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。それぞれを下記条件のＥＳＲに供し、ラジカルの消去率を（１−試料値／ブランク値）×１００（％）として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：４０μＴ
Ｓｗｅｅｐ Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２００

Ｃ）スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）
ヒポキサンチンを基質とし、キサンチンオキシターゼ（ＸＯＤ）の反応によるスーパーオキシドアニオンラジカル発生系を用い、ＳＯＤ様活性を測定した。この測定では、原液ＤＭＰＯ（ラボテックＮＨ−６８７）１５μｌ、５ｍＭのＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ Ｈ−９３７７）５０μｌ、５．５ｍＭのＤＴＰＡ（同仁化学３４７−０１１４１）３５μｌ、試料５０μｌ、０．４Ｕ／ｍｌのＸＯＤ（ＳＩＧＭＡ Ｘ−４３７６）５０μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。それぞれを下記条件のＥＳＲに供し、スーパーオキシドアニオンラジカルの消去率を（１−試料値／ブランク値）×１００（％）として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：０．０７９ｍＴ
Ｓｗｅｅｐ Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２００

表２に示す結果から、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加えて、脂質過酸化物抑制活性に優れていることが確認された。

さらに、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドについて、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害効果を調べる目的で、一般に知られているＰＰＯ活性阻害剤、他のフラボノイド類との比較測定を行った。その測定方法は以下のとおりであり、測定結果は下掲の表３に示すとおりであった。
＜ＰＰＯ（褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ）阻害活性の測定＞
０．０５Ｍクロロゲン酸を基質とし酵素液としてタマネギ鱗茎より抽出・部分精製を行った酵素液を用いた。すなわち、１．３ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に１ｍＭ濃度、２ｍＭ濃度、１０ｍＭ濃度に調製した阻害剤を０．１ｍｌ、酵素液を０．１ｍｌ添加し混合、３０℃に１０分間予備加温後、０．０５Ｍクロロゲン酸基質溶液を０．１ｍｌ加え混合し、３０℃、３０分間加温後の波長４２０ｎｍにおける褐変度を求めた。阻害剤添加の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたものをコントロールとし、活性を１００％として阻害効果を相対活性で示した。

この結果、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、一般のＰＰＯ活性阻害剤や他のフラボノイド類と比べて卓越したＰＰＯ阻害活性を有し、少量の使用でも褐変を防止できることがわかった。従って、本発明方法によるルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、例えば、食品類の褐変防止剤として有効に利用することができる。

さらに、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド及び類似化合物について、ヒト胃ガン細胞及び白血病細胞の増殖抑制効果を測定した。その結果、図１８に示すとおり、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、卓越した高い増殖抑制効果を有することが確認された。

本発明によれば、ソバのスプラウトからフラボン類を採取するときの収率が増大できるので、フラボンの生産方法として有用である。そして、本発明の方法により得られるフラボン類は抗酸化作用があるため、医薬品、健康食品、化粧品等の材料として有効に利用される。特に、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、卓越した褐変防止効果、増殖抑制効果も有するので、これらの特性を生かした各用途にも有効に利用することができる。

本発明方法の代表的なフローチャート 生育中のソバのスプラウトに対する処理による採取したスプラウト中のルテオリン８−Ｃ−グルコシド（Ｌ８ＣＧ）の含量を無処理の場合との相対値で示すグラフ 生育中のソバのスプラウトに対する処理による採取したスプラウト中のアピゲニン８−Ｃ−グルコシド（Ａ８ＣＧ）の含量を無処理の場合との相対値で示すグラフ 生育中のソバのスプラウトに対する処理による採取したスプラウト中のルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌ６ＣＧ）の含量を無処理の場合との相対値で示すグラフ 生育中のソバのスプラウトに対する処理による採取したスプラウト中のアピゲニン６−Ｃ−グルコシド（Ａ６ＣＧ）の含量を無処理の場合との相対値で示すグラフ 抽出に使用した有機溶媒と抽出したフラボン量を示すグラフ 抽出に使用した有機溶媒と抽出したフラボン量をメタノールに対する相対値で示すグラフ 抽出分を各種の酸で処理したときのＬ８ＣＧの量を示すグラフ 抽出分を各種の酸で処理したときのＬ６ＣＧの量を示すグラフ 抽出分を各種の酸で処理したときのＡ８ＣＧの量を示すグラフ 抽出分を各種の酸で処理したときのＡ６ＣＧの量を示すグラフ ２０％酢酸処理によるＬ８ＣＧ含量の温度及び時間依存を示すグラフ ２０％酢酸処理によるＡ８ＣＧ含量の温度及び時間依存を示すグラフ ２０％酢酸処理によるＬ６ＣＧ含量の温度及び時間依存を示すグラフ ２０％酢酸処理によるＡ６ＣＧ含量の温度及び時間依存を示すグラフ 有機酸としてマロン酸を使用したときの各前処理との組み合わせによるＬ８ＣＧの増収効果を総合的に示すグラフ 有機酸としてマロン酸を使用したときの各前処理との組み合わせによるＬ６ＣＧの増収効果を総合的に示すグラフ ルテオリン６−Ｃ−グルコシド及び類似化合物について、ヒト胃ガン細胞及び白血病細胞の増殖抑制効果を測定した結果を示すグラフ

Claims (8)

1. ソバのスプラウトからフラボン類を生産するに当たり、生育中のソバのスプラウトに紫外線照射を施し、スプラウトの葉を採取して、その葉を有機溶媒で抽出処理した後、得られた抽出物を有機酸で処理してフラボン類を得ることを特徴とするフラボン類の生産方法。
2. 紫外線照射を１〜６日間行うことを特徴とする請求項１記載のフラボン類の生産方法。
3. 紫外線照射に先立ち、ソバのスプラウトを過酸化水素又は次亜塩素酸塩の水溶液を付与しつつ生育させることを特徴とする請求項１記載のフラボン類の生産方法。
4. 採取したソバのスプラウトの葉を摺りつぶした状態で有機溶媒又はそれらの水溶液により処理してフラボン類含有成分を抽出することを特徴とする請求項１記載のフラボン類の生産方法。
5. 抽出に使用する有機溶媒が、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルからなる群から選ばれた少なくとも１種の溶媒であることを特徴とする請求項４記載のフラボン類の生産方法。
6. 抽出物を処理する有機酸が、酢酸、コハク酸、クエン酸、マレイン酸、マロン酸、グルクロン酸、ガラクロツロン酸、ギ酸、プロピオン酸、カフェ酸、アスコルビン酸、クマル酸、安息香酸、酒石酸、没食子酸、乳酸から選ばれた少なくとも１種のカルボン酸又はその水溶液であることを特徴とする請求項１記載のフラボン類の生産方法。
7. 抽出物を処理する有機酸として、マロン酸を使用することを特徴とする請求項６記載のフラボン類の生産方法。
8. 有機酸処理時に、６０〜１００℃で０．２〜２時間熱処理をすることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のフラボン類の生産方法。
   

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