JP2008056574A

JP2008056574A - 結晶アスコピロンｐの製造法

Info

Publication number: JP2008056574A
Application number: JP2006232511A
Authority: JP
Inventors: Tomonami Kawano; 智波川野; Kazuhiro Yoshinaga; 一浩吉永
Original assignee: Nihon Starch Co Ltd
Current assignee: Sunus Co Ltd
Priority date: 2006-08-29
Filing date: 2006-08-29
Publication date: 2008-03-13

Abstract

【課題】ＡＰＰおよび水を含む混合物から容易に結晶ＡＰＰを製造すること。
【解決手段】ＡＰＰおよび水を含む混合物から結晶ＡＰＰを析出させることを特徴とする、結晶ＡＰＰの製造法。
【選択図】なし

Description

本発明は結晶アスコピロンＰ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）の製造方法に関する。

図1に示した構造式で表されるアスコピロンＰは、１９７８年にセルロースの熱分解によって生成することが初めて報告され（非特許文献１参照）、その後、¹Ｈ−ＮＭＲおよび¹³Ｃ−ＮＭＲ、赤外線分光法（ＩＲ）により構造が解析され、三次元構造が明らかにされた。
アスコピロンＰ（以下、ＡＰＰという）は、抗酸化能、変色防止能（特許文献１参照）、さらに抗菌能（特許文献２、特許文献３参照）を有することが報告されており、昨今、その非常に高い機能性に期待が高まっている物質である。また自然界ではある種の真菌類が生産することも報告されている（非特許文献２参照）。
また、最近では、ＡＰＰが抗腫瘍作用を有することが報告されている（特許文献４参照）。

ＡＰＰの高い機能性が開示されるにつれ、ＡＰＰの大量調製方法や、高純度化、粉末化の技術開発が切望されるようになってきている。ＡＰＰは水溶液中では極めて不安定な物質であるため、例え冷凍保存であっても長期間の保存は好ましくない。また更に、取扱いのし易さ等を考慮すると、やはり製品形態として粉末状製品が望まれる。しかしこれまでそれらの技術情報については殆ど開示されていない。
ＡＰＰの調製方法に関してはいくつかの報告がある。非特許文献１で報告されている、セルロースを熱分解し調製する方法は、ＡＰＰの収率が原料であるセルロースに対して僅か１．４％程度と低く、さらに、その後の精製では、非常に複雑な分離工程が必要なため、工業的な生産において、該方法は現実的ではない。

また、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下、１，５−ＡＦという）を強アルカリ条件下にすると、多数の化合物が生成し、その化合物が生成される過程の中間物質の一つがＡＰＰであることが報告されている（非特許文献３参照）。しかし、この条件下ではＡＰＰは中間体として生成するだけで、その反応によりＡＰＰを効率良く調製する方法に関しては記述されていない。
ＡＰＰは真菌類のＰｅｚｉｚａｌｅｓ目（例えば、ＰｉｃａｒｉａｌｅｉｏｃａｒｐａおよびＡｎｔｈｒａｃｏｂｉａｍｅｌａｌｏｍａ）ならびにＴｕｂｅｒａｌｅｓ目（例えばＴｕｂｅｒｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｕｍ）の菌体抽出液と１，５−ＡＦを反応させ生合成できることも報告されているが、この方法によるＡＰＰの調製はミリグラム単位でしか行われていない。この調製方法は、かなりの手間や時間を要するにも関わらず低収率であり、効率も悪いため、産業上利用できるものではなかった。

最近では、酵素を用いたＡＰＰの生産方法に関して、生産条件を詳細に設定した方法（特許文献５、特許文献６および特許文献７参照）、あるいは、グルコースを出発物質として化学合成によりＡＰＰを調製する方法（非特許文献４参照）についても報告されている。しかし、これらには、生成したＡＰＰを含む混合物からＡＰＰを分離精製する方法として、クロマトグラム分離や、有機溶媒を使用してＡＰＰを抽出する方法が開示されているだけである。さらに結晶化方法については、上記先行文献のなかでも酢酸エチルやヘキサン等の有機溶媒を使用して晶出させることに関して報告されているだけである。
一方、本発明者らは、１，５−ＡＦを加熱することにより容易にＡＰＰを製造する方法を見出し、特許出願している（特許文献８参照）。
前述のとおりＡＰＰの様々な機能性が明らかになっており、産業上の利用が期待されている。ＡＰＰは水溶液状態で保存すると徐々に水和しアスコピロンＴへ変換する。従って、水溶液状態では長期保存に適さないため、安定性を高めるために粉末品が望まれる。さらに、医薬品用途では高純度の標品が要求されるため、結晶状のＡＰＰが切望されている。
特表２００２−５４０２４８特表２００４−５０９６３４特表２００４−５０９９０８特開２００５−１５４４２５ＷＯ０３／０３８０８４ＷＯ０３／０３８０８５ＷＯ０３／０３８１０７ＷＯ０５／０４９５９９Ｓｈａｆｉｚａｄｅｈ，Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．６７，４３３−４４７（１９７８）Ｍ．−Ａ．Ｂａｕｔｅ，ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，４１−４５（１９９３）Ａｈｍａｎｄ，Ｔ．，ＰｈＤＴｈｅｓｉｓ，ＴｈｅＳｗｅｄｉｓｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ（１９９５）Ｓ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ．，ｅｔａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６，５６９−５７８（２００２）

本発明の目的は、
結晶アスコピロンＰの製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。

本発明者らは、１，５−ＡＦおよびＡＰＰについて鋭意研究を重ねた結果、ＡＰＰの結晶を容易に析出させる方法を見出し、その究明事実に基づいて本発明に到達した。
従来のＡＰＰの結晶化方法では、酢酸エチルやヘキサン等の有機溶媒を使用し、水を全く含まない溶媒からＡＰＰを析出させていたのに対し、本発明の結晶化方法は水を含むことを必須条件としており、全く異なる製法である。
ＡＰＰは水溶液中では非常に不安定であり、他の物質に変性しやすいことが報告されているが、本発明者らは、敢えてこのような状態から結晶を容易に且つ大量に析出させる技術を見出した。
すなわち、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、ＡＰＰおよび水を含む混合物から結晶ＡＰＰを析出させることを特徴とする、結晶ＡＰＰの製造法によって達成される。

本発明の方法によれば、ＡＰＰおよび水を含む混合物から容易に結晶ＡＰＰを製造することが可能である。

本発明の結晶化方法では、結晶化の原液として、ＡＰＰおよび水を含んで成る混合物を使用する。ＡＰＰおよび水以外に含まれるものとしては特に制限されない。当該結晶化原液は、好ましくは、ＡＰＰの過飽和溶液であって、結晶ＡＰＰが析出すればよい。ちなみに、純度９８．３％のＡＰＰ結晶の水１００ｇに対する溶解度は、２４℃のとき１０１ｇ、５０℃のとき４９５．４ｇであった。
ＡＰＰの製造方法自体は特に限定されないが、上述の特許文献８の方法に従って、１，５−ＡＦに加熱処理を施すことによって以下の如く調製することが可能である。
ＡＰＰの原料となる１，５−ＡＦはオゴノリなどの紅藻から抽出・精製したα−１，４−グルカンリアーゼを澱粉あるいは澱粉分解物に作用させることにより得ることができる。

かくして調製された１，５−ＡＦは、本発明の製造法で使用する場合は、未分解の原料を含むもの（例えば、１，５−ＡＦ純度４０％標品など）であってもよい。また、さらにカラムクロマトグラム分離により、デキストリンやブドウ糖などの他の成分を除去して得られる標品、例えば、１，５−ＡＦ純度９０％以上の高純度品であってもよい。
ＡＰＰを加熱誘導させるための１，５−ＡＦ溶液の加熱条件としては、例えば１００℃以上で１秒〜２４時間であり、好ましくは１２０℃以上で１秒〜５時間、より好ましくは、１４０℃〜２５０℃で１秒〜２時間程度とすることができる。また、加熱する際、１，５−ＡＦ溶液はｐＨ１０以下であることが好ましい。ｐＨがそれより高くともＡＰＰの生成は認められるが、同時に多数の副産物も生成するため、ＡＰＰ含有量が低く、結果的に製造効率等を考慮すると本発明の結晶化方法にはあまり適さない。好ましいｐＨ条件としては、２以上７未満である。
上述のようなＡＰＰの製造法においては、１，５−ＡＦ溶液の加熱条件によってＡＰＰの生成率も異なる。従って、最終的に結晶化の効率を上げるためにも、１，５−ＡＦからＡＰＰを生成させた後、カラムクロマト分離等によってある程度他の成分を除去してＡＰＰの含有量を高めておくことが望ましい。

本発明の結晶化方法において使用される結晶化原液は、ＡＰＰの純度が例えば３０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上であればよい。また、該溶液のＢｘはＡＰＰの純度によっても異なるが、例えば、Ｂｘ１０〜９５、好ましくはＢｘ２５〜９０、より好ましくはＢｘ４０〜８５であればよい。
ＡＰＰの純度の分析方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー分析を用いることができる。表１に記載の条件で測定した場合、グルコースが１０．８分付近に溶出されるとき、ＡＰＰは２４．４分付近に溶出される。

また、Ｂｘの値は、例えば、市販の屈折計を使用して測定することができる。

本発明の結晶化方法において、結晶化原液から結晶ＡＰＰを析出させる際の適切な温度条件は、当該溶液のＢｘ値やＡＰＰの純度により異なるが、例えば−１０〜９０℃、好ましくは０〜８０℃、より好ましくは０〜６０℃であり、結晶化後の分蜜時の作業効率や、ＡＰＰの安定性等を考慮すると、５〜４５℃であることが特に好ましい。この際、結晶原液の温度を下降させ過飽和状態を保ちながら、より効率的に結晶化を行うこともできる。
本発明の方法において、必要に応じて、例えば、途中、結晶化原液を濃縮しながら過飽和状態を保つ方法を取入れることもできる。また、より効率的に結晶化を行うために、結晶化原液に種結晶を共存させることもできる。
本発明における種結晶としては、例えば、ＡＰＰ結晶自体、あるいはＡＰＰ結晶が混合したマスキットを用いることができる。また、種結晶を共存させる方法としては特に制限されないが、例えば、結晶化原液に該種結晶を添加する工程をとることもできるが、予め結晶が混合しているマスキットの状態のものを結晶化原液として使用することもできる。

さらに、結晶をマスキットより分蜜して得られた母液を使用して再度上述の種結晶を共存させて結晶ＡＰＰを製造することも可能である。
本発明の方法により析出したアスコピロンＰの結晶は、マスキットより分蜜後、乾燥工程を経て粉末品として得ることができる。
分蜜方法は、ＡＰＰ結晶を採取できればよく、通常用いられる方法をとることができ特に制限されない。例えば、マスキットをバスケット型遠心脱水機に供し、結晶ＡＰＰと蜜（母液）とを分離し、必要に応じて冷水を噴霧して洗浄することも可能である。
本発明の製造方法により得られた結晶アスコピロンＰは、食品工業、医薬品工業、化学工業など様々な分野において利用可能である。

以下、実施例により本発明を更に詳述する。本発明は、これらによって何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、Ｂｘは、（株）アタゴ社製のデジタル屈折計を使用して測定した。また、ＡＰＰの純度は上述の高速液体クロマトグラフィー分析を用いて測定した。

実施例１
１，５−ＡＦ水溶液（Ｂｘ１０、純度８０％）を１９０℃で２分間加熱した。この溶液をカラムクロマト分離に供し、溶出液を分画した。各画分を分析しＡＰＰを主要成分として含む画分を回収し濃縮した。その結果、Ｂｘ６５、純度９０％のＡＰＰ水溶液が得られ、これを結晶化原液とした。
この結晶化原液５４０ｇを１Ｌ容のセパラブルフラスコに入れ、２５℃で１時間保持した後、種結晶としてＡＰＰ結晶を２ｇ添加した。この溶液をゆっくりと撹拌しながら２５℃から５℃まで２４時間かけて冷却した。
フラスコの中は結晶を含んだ溶液となり、この溶液を遠心脱水機（株式会社コクサン製、Ｈ−１１２型）に投入し、１０分間回転させて（５，０００ｒｐｍ／ｍｉｎ）分蜜し、結晶および母液を回収した。これを減圧乾燥機（３５℃）で一晩乾燥させ、１０７ｇの結晶を得た。

かくして得られた結晶のＡＰＰの純度は９９．４％であった。ちなみに、母液中のＡＰＰ純度は８５％であった。得られた結晶について、高分解熱重量測定法を用いて、室温〜４００℃までの加熱減量挙動を調べた。装置はTA Instruments社製のTGA2950を、雰囲気は窒素気流８０ｍｌ／分で、最大昇温速度は５℃／分で、試料量は約１０ｍｇを蓋にピンホールを空けたアルミ二ウム製の容器に入れ行なった。その結果を表２に示す。試料は１６０℃付近でほぼ等温的な加熱減量を１段階経た後に、やや複雑な加熱減量曲線を示し、約２００℃以上で緩やかな重量減少を示した。

次にAPP結晶の元素分析を行った。測定はＣ、Ｈ、Ｎ測定はスズ箔容器に試料を包み込んだ後、微量電子天秤で秤量し、元素分析装置VARIO EL ＩＩＩで、燃焼炉温度９５０℃、還元炉温度５００℃、ヘリウム流量２００mL／分、酸素流量３０mL／分燃焼時間９０秒で行った。O測定は、スズ箔容器に試料を包み込んだ後、微量電子天秤で秤量し、元素分析装置CＨＮ−O−Rapidで、分解炉温度１，１３０℃、混合ガス流量１００ｍｌ／分（窒素／水素：９６／４）で測定した。その結果を表３に示す。

次に得られた試料をアルミニュム製試料ホルダーに詰め、室温にて広角X線回折法（２θ―θスキャン法）で測定した。測定条件を以下に示す。

広角X線回折法（２θ―θスキャン法）
（１）X線発生装置理学電機（株）製 RU-200R（回転対陰極型）
X線源：CuＫα線
（湾曲結晶モノクロメーター）
出力：５０Kv 200mM
（２）ゴニオメーター理学電機（株）製２１５５Ｓ２型
スリット系：１°−１°−０．１５ｍｍ−０．４５ｍｍ
検出器：シンチレーションカウンター
（３）計数記録装置理学電機（株）製 RINT-1400型
（４）スキャン方式２θ／θ連続スキャン
（５）測定範囲（２θ）５〜８０°
（６）測定ステップ（２θ）０．０２°
（７）スキャン速度２°／分

測定の結果、広角X線回折パターン（生データ）を図２に示す。その結果、試料の広角X線回折パターンにはシャープな回折ピークが複数本観察され、試料が結晶構造を有していることが確認できた。

実施例２
実施例１の結晶化によって得られた母液を濃縮し、Ｂｘ７０、純度８５％のＡＰＰ水溶液が得られ、これを結晶化原液とした。
この結晶化原液３００ｇを１Ｌ容のセパラブルフラスコに入れ、２５℃で１時間保持した後、種結晶としてＡＰＰ結晶を２ｇ添加した。この溶液をゆっくりと撹拌しながら２５℃から５℃まで２４時間かけて冷却した。
フラスコの中は結晶を含んだ溶液となり、この溶液を実施例１と同様の方法で分蜜し、結晶および母液を回収した。これを減圧乾燥機（３５℃）で一晩乾燥させ、結晶６８ｇを得た。当該結晶のＡＰＰ純度は９９．５％であった。

実施例３
実施例２の結晶化によって得られた母液をさらに濃縮し、Ｂｘ８０．６、純度６９．６％のＡＰＰ水溶液が得られ、これを結晶化原液とした。
この結晶化原液１５５ｇを１Ｌのセパラブルフラスコに入れ、２５℃から５℃まで２４時間かけて冷却した。
フラスコの中は結晶を含んだ溶液となり、この溶液を実施例１および２と同様の方法で分蜜し、結晶および母液を回収した。これを減圧乾燥機（３５℃）で一晩乾燥させ、３６ｇの結晶を得た。当該結晶のＡＰＰ純度は９８．７％であった。

実施例４
ＡＰＰ純度８１．０％、Ｂｘ７３．２のＡＰＰ水溶液２５０ｇを結晶化原液として、１Ｌ容のセパラブルフラスコに入れ、３０℃に保持し、種結晶としてＡＰＰ結晶を４ｇ添加した。この溶液をゆっくりと攪拌しながら３０℃から７℃まで７０時間かけて冷却した。
フラスコの中は結晶を含んだ溶液となり、この溶液を実施例１に記載の遠心脱水機で分蜜後、結晶を回収し、減圧乾燥器（３５℃）で乾燥させた。乾燥後の結晶として、純度９９．５％のものが５５ｇ得られた。

実施例５
ＡＰＰ純度７０％、Ｂｘ８４．５のＡＰＰ水溶液を１５℃で一定時間保持すると、結晶が析出した。この結晶含有溶液を種結晶としてＡＰＰ溶液（純度８７．５％、Ｂｘ７７．１）２１２ｇに１５ｇ混合し、１Ｌ容のセパラブルフラスコに投入し、３８℃で保持した後、ゆっくり攪拌しながら３８℃から３４℃まで４８時間かけて冷却した。こうして得られた結晶含有溶液を上述に記載の遠心脱水機で分蜜後、結晶を回収し、減圧乾燥機で乾燥させた。かくして純度９８％の結晶が３６ｇ得られた。

アスコピロンＰの構造式アスコピロンＰの広角Ｘ線回折パターン

Claims

アスコピロンＰを含む水溶液からアスコピロンＰの結晶を析出せしめることを特徴とする、結晶アスコピロンＰの製造方法。
温度０〜６０℃の条件下で析出せしめる請求項１に記載の製造方法。
アスコピロンＰを含む水溶液のアスコピロンＰの純度が３０％以上である、請求項１に記載の製造方法。
アスコピロンＰを含む水溶液のＢｘが１０以上である請求項１に記載の製造方法。
アスコピロンＰを含む水溶液に種結晶の存在下で析出せしめる請求項１に記載の製造方法。