WO2020004358A1 - ３'，３'－ｃＧＡＭＰの水和物結晶 - Google Patents

３'，３'－ｃＧＡＭＰの水和物結晶 Download PDF

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Abstract

３'，３'－ｃＧＡＭＰは凍結乾燥品が一般的に知られているが、凍結乾燥品はその製造過程において凍結乾燥機が必要となり、大量生産のためにスケールアップをするにも自ずと限界がある。そこで凍結乾燥機のような特別な装置を使用することなく、かつ簡便に大量に取得できる結晶の開発が望まれていた。また、従来知られている凍結乾燥品あるいはエタノール沈殿物は高い吸湿性を示すことから、取扱い性や保存性に優れた結晶を提供することを課題とする。 本発明の３'，３'－ｃＧＡＭＰの水和物結晶は、アルカリ金属塩結晶であろうが、遊離酸結晶であろうが、いずれも既存の粉体と比べて低い吸湿性を示すことから様々な用途にて取り扱いやすく、医薬品原料等として有用である。

Description

３’，３’－ｃＧＡＭＰの水和物結晶
　本発明はアジュバントとして有用な物質であると考えられる３’，３’－Ｃｙｃｌｉｃ　ＧＭＰ－ＡＭＰ（３’，３’－ｃＧＡＭＰ）の水和物の結晶および当該結晶の製造法に関するものである。
　３’，３’－ｃＧＡＭＰは細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生増大に関与するシグナル伝達物質であり、近年になってアジュバント、抗ウイルス剤、抗がん剤としての応用が期待されている（特許文献１）。これまでに３’，３’－ｃＧＡＭＰの合成方法としては、たとえばＧｅｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓやＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅに由来する環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼによる合成法及び化学合成法などが知られている（非特許文献１，２，３）。
　現在、販売されている３’，３’－ｃＧＡＭＰは凍結乾燥品、もしくはエタノール沈殿物である。市販品の一部には結晶性固体（“ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｓｏｌｉｄ”）として販売されているものも存在するが、購入して分析した結果、いずれも不定形で、かつ押し潰した際には劈開せずに展延し、その際の外観は、例えば図１のようである。また、吸湿性が高く数分のうちに飴状化する。このため、市販の３’，３’－ｃＧＡＭＰ結晶性固体は、いずれも結晶でないことが明らかとなった。
再表２０１６－０７９８９９号公報
Ｍｉｎｇ　Ｃ．　Ｈａｍｍｏｎｄ，ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１６，１１３（７），１７９０－１７９５ Ｊｏｈｎ　Ｊ．　Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１２,１４９，　３５８－３７０ Ｄｉｎｓｈａｗ　Ｊ．　Ｐａｔｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，１５３（５），１０９４－１１０７
　３’，３’－ｃＧＡＭＰは凍結乾燥品が一般的に知られているが、凍結乾燥品はその製造過程において凍結乾燥機が必要となり、大量生産のためにスケールアップをするにも自ずと限界がある。そこで凍結乾燥機のような特別な装置を使用することなく、かつ簡便に大量に取得できる結晶の開発が望まれていた。また、従来知られている凍結乾燥品、あるいはエタノール沈殿物は高い吸湿性を示すことから、取扱い性や保存性に優れた結晶を提供することを課題とする。
　本発明者らは、３’，３’－ｃＧＡＭＰの結晶化に関して鋭意研究を重ねた結果、３’，３’－ｃＧＡＭＰの水和物結晶を初めて取得し、本発明を完成させた。
　本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰの水和物結晶は、アルカリ金属塩結晶であろうが、遊離酸結晶であろうが、いずれも既存の粉体と比べて低い吸湿性を示すことから様々な用途にて取り扱いやすく、医薬品原料等として有用である。なお、本明細書において吸湿性が低いとは、（Ａ）温度３０℃、湿度４３％条件下で１日間静置し、その後に（Ｂ）温度３０℃、湿度９３％条件下で３日間静置したときに、（Ｂ）終了時点の水分含量が２５％以下であり、（Ａ）終了時の水分含量との差分が±５％以内であることを指す。
　また、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰの水和物結晶のうち、アルカリ金属塩結晶は、３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液をｐＨ４～１１となるよう調整後、有機溶媒を添加するという簡便な方法によって、遊離酸結晶も、３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３まで低下させるという簡便な方法によって、いずれも調製可能である。
図１は、市販３’，３’－ｃＧＡＭＰ結晶性固体を展延した際の外観写真を示す。 図２は、３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶の結晶写真を示す。 図３は、３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶のＸ線回折スペクトルを示す。 図４は、３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶の赤外線吸収スペクトルを示す。 図５は、３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶の熱重量測定／示差熱分析結果を示す。 図６は、３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶の結晶写真を示す。 図７は、３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶のＸ線回折スペクトルを示す。 図８は、３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶の赤外線吸収スペクトルを示す。 図９は、３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶の熱重量測定／示差熱分析結果を示す。 図１０は、３’，３’－ｃＧＡＭＰ凍結乾燥品のＸ線回折スペクトルを示す。 図１１は、３’，３’－ｃＧＡＭＰ凍結乾燥品の赤外線吸収スペクトルを示す。 図１２は、３’，３’－ｃＧＡＭＰ凍結乾燥品の熱重量測定／示差熱分析結果を示す。
　本発明は、下記の構造式で示される３’，３’－ｃＧＡＭＰの水和物結晶を提供するものである。なお、本発明における「３’，３’－ｃＧＡＭＰ」とは、特に限定しない場合、下記に示すｃ［Ｇ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］のことを指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰの水和物結晶は、アルカリ金属塩結晶、遊離酸結晶でのいずれであってもかまわない。すなわち、上記化１中に示すＸは、アルカリ金属（Ｌｉ，Ｎａ，Ｋ，Ｒｂ，Ｃｓ，Ｆｒ）もしくは水素（Ｈ）でありうる。また、上記アルカリ金属塩結晶の中でも、ナトリウム塩結晶が特に特に好適である。以下、アルカリ金属塩結晶の場合の記載は、代表例として、ナトリウム塩結晶を例示し、説明する。
　本発明の水和物結晶は、カールフィッシャー法にて水分含量を測定すると、後述実施例に示すように、その水分含量は５．０～３０．０％であり、中でも５．０～２５．０％が好適である。すなわち、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰの水和物結晶には、３’，３’－ｃＧＡＭＰ１分子に対し２．０～１６．１分子の水分子が結合または付着しており、中でも２．０～１２．０分子が好適である。
　本発明のアルカリ金属塩結晶のうち、好ましい結晶であるナトリウム塩結晶を例示して説明すれば、ナトリウム塩結晶は、立方体結晶として得られる（図２参照）。
　また、本発明のナトリウム塩結晶をＣｕ－Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折装置で分析すると、後述実施例に示すように、回折角（２θ）が、９．３、１０．０、１１．７、１４．４、１７．３、１９．１、２０．３、２２．６、２３．３、２３．８、２４．３、２５．６、２８．２（°）付近に特徴的なピークを示す（図３参照）。
　なお一般に、粉末Ｘ線回折における回折角（２θ）は、５％未満の誤差範囲を含む場合があることから、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角が完全に一致する結晶のほか、ピークの回折角が５％未満の誤差で一致する結晶も、本発明のナトリウム塩結晶に包含される。例えば、粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）は、９．３±０．５、１０．０±０．５、１１．７±０．６、１４．４±０．７、１７．３±０．９、１９．１±１．０、２０．３±１．０、２２．６±１．１、２３．３±１．２、２３．８±１．２、２４．３±１．２、２５．６±１．３、２８．２±１．４（°）に特徴的なピークを有する。
　本発明のナトリウム塩結晶は、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３３２８、３２００、１６７７、１６２９、１６０４、１２２５、１２０９、１０７３、１０５２（ｃｍ－１）付近に特徴的なピークを有する（図４参照）。
　なお、赤外線吸収スペクトル測定では、一般に２（ｃｍ－１）未満の誤差範囲を含む場合があることから、上記数値と赤外線吸収スペクトルにおけるピークの位置が完全に一致する結晶のほか、ピークが２ｃｍ－１未満の誤差で一致する結晶も、本発明のナトリウム塩結晶に包含される。例えば、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３３２８±１．９、３２００±１．９、１６７７±１．９、１６２９±１．９、１６０４±１．９、１２２５±１．９、１２０９±１．９、１０７３±１．９、１０５２±１．９（ｃｍ－１）に特徴的なピークを有する。
　本発明のナトリウム塩結晶は、熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したとき、吸熱ピークを有さない（図５参照）。
　本発明のナトリウム塩結晶について、原子吸光光度法にて測定したときのナトリウム含量は３～９．５％ｗ／ｗである。すなわち、本発明のナトリウム塩結晶には、１～３分子のナトリウムが含まれうる。また、その中でも溶解時のｐＨが中性となる利便性の高さにおいて、５～７％ｗ／ｗ、すなわち２分子のナトリウムが含まれた結晶が好ましい。
　一方、本発明の遊離酸結晶は、八面体結晶として得られる（図６参照）。
　また、本発明の遊離酸結晶をＣｕ－Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折装置で分析すると、後述実施例に示すように、回折角（２θ）が、７．０、８．３、８．９、１５．１、１５．７、１８．２、１８．６、２０．０、２０．９、２６．５、２６．９（°）付近に特徴的なピークを示す（図７参照）。
　なお一般に、粉末Ｘ線回折における回折角（２θ）は、５％未満の誤差範囲を含む場合があることから、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角が完全に一致する結晶のほか、ピークの回折角が５％未満の誤差で一致する結晶も、本発明の遊離酸結晶に包含される。例えば、粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）は、７．０±０．４、８．３±０．４、８．９±０．４、１５．１±０．８、１５．７±０．８、１８．２±０．９、１８．６±０．９、２０±１．０、２０．９±１．０、２６．５±１．３、２６．９±１．３（°）に特徴的なピークを有する。
　本発明の遊離酸結晶は、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３１４６、１６８８、１６４５、１６０５、１２１８、１０５９（ｃｍ－１）付近に特徴的なピークを有する（図８参照）。
　なお、赤外線吸収スペクトル測定では、一般に２（ｃｍ－１）未満の誤差範囲を含む場合があることから、上記数値と赤外線吸収スペクトルにおけるピークの位置が完全に一致する結晶のほか、ピークが２ｃｍ－１未満の誤差で一致する結晶も、本発明の遊離酸結晶に包含される。例えば、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３１４６±１．９、１６８８±１．９、１６４５±１．９、１６０５±１．９、１２１８±１．９、１０５９±１．９（ｃｍ－１）に特徴的なピークを有する。
　本発明の遊離酸結晶は、熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したとき、２６０℃付近に吸熱ピークを有する（図９参照）。
　本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰの水和物結晶は、高速液体クロマトグラフィー法にて純度検定したとき、９７％以上、より好ましくは９９％以上の純度を有する。
　次に、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰの水和物結晶の調製法につき説明すれば、結晶化に用いる３’，３’－ｃＧＡＭＰは、酵素合成法や化学合成法など公知の方法によって合成すればよい。酵素合成を行うに当たっては既知の方法に従えばよく、たとえば非特許文献１，２に記載の方法を用いることができる。反応後、反応液中に生成した３’，３’－ｃＧＡＭＰは、活性炭や逆相クロマトグラフィーなどにより精製することができる。
　本発明のアルカリ金属塩結晶の取得は、ナトリウム塩結晶を例示して説明すれば、３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液をｐＨ４～１１となるよう調整し、有機溶媒を添加することにより、ナトリウム塩結晶を得ることができる。
　ナトリウム塩結晶化においては、より高い収率で結晶を得るため、（１）３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液を測定波長２６０ｎｍにおける吸光度ＯＤ２６０を５００～２０，０００とする工程、（２）３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液を５０～７０℃まで加熱する工程、（３）３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液に酸又は塩基を添加し、ｐＨを４～１１に調整する工程、（４）３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液に有機溶媒を添加する工程、（５）３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液を１～２０℃になるまで冷却する工程、を行うことが好ましい。
　上記工程（３）で使用する酸としては、塩酸、硫酸、硝酸を例示することができるが、これらに限定されない。使用する塩基としては、水酸化ナトリウムなどを例示することができるが、これらに限定されない。酸及び塩基を急激に添加することによるアモルファス化や急激な結晶析出を防ぐため、添加はゆっくり行うことが好ましい。
　上記工程（４）で使用する有機溶媒としては、メタノール、エタノール等の炭素数６以下のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等を例示することができるが、これらに限定されない。
　さらに、（２）と（３）の工程は同時に行うこともできる。同様に、（４）（５）の工程は同時に行うこともできる。
　遊離酸結晶化では、３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３、好ましくはｐＨ１．５～２．０まで低下させることで、遊離酸結晶を得ることができる。
　また、遊離酸結晶化においては、より高い収率で結晶を得るため、（１）３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液の測定波長２６０ｎｍにおける吸光度ＯＤ２６０が１０～１５,０００となるよう調整する工程、（２）３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液を５０～７０℃まで加熱する工程、（３）３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３まで低下させる工程、（４）３’，３’－ｃＧＡＭＰ水溶液を１～２０℃になるまで冷却する工程、を行うことが好ましい。
　上記工程（３）で使用する酸としては、塩酸、硫酸、硝酸などを例示することができるが、これらに限定されない。酸を急激に添加することによるアモルファス化や急激な結晶析出を防ぐため、添加はゆっくり行うことが好ましい。
　さらに、（２）（３）の工程は同時に行うこともできる。もしくは、（３）（４）の工程を同時に行うこともできる。
　上記製法によって得られた３’，３’－ｃＧＡＭＰ結晶は、濾取した後に乾燥させることで、製品とすることができる。乾燥させる際には、減圧乾燥等の方法を適宜利用することができる。
　以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。
（実施例１）３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶の製造
　公知の方法に従って、酵素的に３’，３’－ｃＧＡＭＰを合成し、精製を行った。精製して得られたＯＤ２６０が６２００、ｐＨ８．５の３’，３’－ｃＧＡＭＰ溶液（１０ｍＬ）を、インキュベーターにて３０℃に加温し、撹拌しながらゆっくりとエタノール１２ｍＬを添加した。そこにｐＨ８．５に調整した３’，３’－ｃＧＡＭＰ溶液にエタノールを重層して得られた種結晶 ２０ｍｇを加えて種結晶が溶けないことを確認した。
　種結晶添加の後、液温が５℃になるまで冷却し、結晶を析出させた。このようにして析出した結晶はメンブレンフィルター（３μｍ）にて濾取し、湿結晶を得た。湿結晶は１時間、３０℃乾燥して、乾燥結晶０．９６ｇを得た。
　上記実施例１で調製した３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶に対する機器分析の結果を示す。
（機器分析）
（Ａ）純度検定
　実施例１より得られた３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶の純度を、高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果、３’，３’－ｃＧＡＭＰ純度は９９．７％であった。なお、高速液体クロマトグラフィー法は以下の条件で行った。
（条件）
　カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（ＹＭＣ社製）
　溶出液：０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＴＥＡ－Ｐ（ｐＨ６．０）＋アセトニトリル５％
　検出法：ＵＶ２６０ｎｍによる検出
　また、当該結晶を６０℃にて保管し、安定性試験を実施したが、３’，３’－ｃＧＡＭＰの分解は見られず、高温条件下であっても非常に安定であった。
（Ｂ）結晶形
　実施例１で調製した３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶の代表的な写真を図２に示す。図２に示すように、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶は立方体結晶形を示した。
（Ｃ）水分
　実施例１で調製した３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶について、乾燥直後の結晶の水分含量をカールフィッシャー法により測定した結果、水分含量は７．９％であった。すなわち、乾燥直後の本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶では、３’，３’－ｃＧＡＭＰ１分子に対し３～４分子の水分子が結合又は付着していることが明らかとなった。また、水分含量を安定させるため、４３％湿度で１日保管した結晶の水分含量を、同様に測定した結果、水分含量は１８．１％であった。すなわち、４３％湿度で１日保管した本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶では、３’，３’－ｃＧＡＭＰ１分子に対し７～８分子の水分子が結合又は付着していることが明らかとなった。
（Ｄ）粉末Ｘ線回折
　本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶ついて、Ｘ線回折装置Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ ＭＰＤ（スペクトリス）を用い、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した。
　（測定条件）
ターゲット：Ｃｕ
Ｘ線管電流：４０ｍＡ
Ｘ線管電圧：４５ｋＶ
走査範囲：２θ＝４．０～４０．０°
前処理：めのう製乳鉢を用いて粉砕
　図３および表１に示すように、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶は、回折角（２θ）が、９．３、１０．０、１１．７、１４．４、１７．３、１９．１、２０．３、２２．６、２３．３、２３．８、２４．３、２５．６、２８．２（°）付近に特徴的なピークを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（Ｅ）赤外線吸収スペクトル
　本発明３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶について、フーリエ変換赤外分光光度計Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｏｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ 　Ｅｌｍｅｒ）を用いてＡＴＲ（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　Ｔｏｔａｌ　Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ、減衰全反射）法によって赤外線吸収スペクトルを測定した。
　本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶は、３３２８、３２００、１６７７、１６２９、１６０４、１２２５、１２０９、１０７３、１０５２（ｃｍ－１）付近に特徴的なピークを有していた。これらの結果を図４に示す。
（Ｆ）示差走査熱量分析
　熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したところ、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶は、吸熱ピークを有しなかった（図５）。
（Ｇ）ナトリウム含量
　実施例１で調製した３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩結晶について、原子吸光光度法を用いてナトリウム含量を測定した。その結果６．２％ｗ／ｗであり、２分子のナトリウムが含まれることが明らかとなった。
（実施例２）３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶の製造
　公知の方法に従って、酵素的に３’，３’－ｃＧＡＭＰを合成し、精製を行った。精製して得られたＯＤ２６０が１６８の３’，３’－ｃＧＡＭＰ溶液（３６０ｍＬ）を、インキュベーターにて６０℃に加温し、撹拌しながら１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液をゆっくり加え、ｐＨ１．５となるように調製した。
　塩酸溶液添加の後、液温が５℃になるまで冷却し、結晶を析出させた。このようにして析出した結晶はグラスフィルター（１７Ｇ３）にて濾取し、湿結晶を得た。湿結晶は３０℃、１時間乾燥して、乾燥結晶１．６３ｇを得た。
　上記実施例２で調製した３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶に対する機器分析の結果を示す。
（機器分析）
（Ａ）純度検定
　実施例より得られた３’，３’－ｃＧＡＭＰ結晶の純度を、高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果、３’，３’－ｃＧＡＭＰ純度は９９．５％であった。なお、高速液体クロマトグラフィー法は以下の条件で行った。
（条件）
　カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（ＹＭＣ社製）
　溶出液：０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＴＥＡ－Ｐ（ｐＨ６．０）＋アセトニトリル５％
　検出法：ＵＶ２６０ｎｍによる検出
　また、当該結晶を６０℃にて保管し、安定性試験を実施したが、３’，３’－ｃＧＡＭＰの分解は見られず、高温条件下であっても非常に安定であった。
（Ｂ）結晶形
　実施例２で調製した３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶の代表的な写真を図６に示す。図６に示すように、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶は八面体結晶形を示した。
（Ｃ）水分測定
　実施例２で調製した３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶について、水分含量を安定させるため、４３％湿度で１日保管したのち、当該結晶の水分含量をカールフィッシャー法により測定した。その結果、水分含量は２４．７％であった。すなわち、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶では、３’，３’－ｃＧＡＭＰ１分子に対し１２～１３分子の水分子が結合又は付着していることが明らかとなった。　
（Ｄ）粉末Ｘ線回折
　本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶ついて、Ｘ線回折装置Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ ＭＰＤ（スペクトリス）を用い、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した。
　（測定条件）
ターゲット：Ｃｕ
Ｘ線管電流：４０ｍＡ
Ｘ線管電圧：４５ｋＶ
走査範囲：２θ＝４．０～４０．０°
前処理：めのう製乳鉢を用いて粉砕
　図７および表２に示すように、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶は、回折角（２θ）が、７．０、８．３、８．９、１５．１、１５．７、１８．２、１８．６、２０．０、２０．９、２６．５、２６．９（°）付近に特徴的なピークを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（Ｅ）赤外線吸収スペクトル
　本発明３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶について、フーリエ変換赤外分光光度計Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｏｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ 　Ｅｌｍｅｒ）を用いてＡＴＲ（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　Ｔｏｔａｌ　Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ、減衰全反射）法によって赤外線吸収スペクトルを測定した。　
　本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶は、３１４６、１６８８、１６４５、１６０５、１２１８、１０５９（ｃｍ－１）付近に特徴的なピークを有していた。これらの結果を図８に示す。
（Ｆ）示差走査熱量分析
　熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したところ、本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶は、約２６０℃付近に特徴的な吸熱ピークを示した（図９）。
（参考例）３’，３’－ｃＧＡＭＰの凍結乾燥品の製造
　３’，３’－ｃＧＡＭＰ遊離酸結晶５００ｍｇを１０ｍＬの水に懸濁した後、１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ溶液でｐＨ８．５に調整することによって懸濁した３’，３’－ｃＧＡＭＰ結晶を溶解した。
　溶解した３’，３’－ｃＧＡＭＰ溶液を適宜希釈した後、凍結乾燥を行うことにより３’，３’－ｃＧＡＭＰのナトリウム塩の凍結乾燥品を得た。
　上記参考例で調製した３’，３’－ｃＧＡＭＰ凍結乾燥品に対する機器分析の結果を示す。
（機器分析）
（Ａ）純度検定
　参考例より得られた３’，３’－ｃＧＡＭＰ凍結乾燥品の純度を、高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果、３’，３’－ｃＧＡＭＰ純度は９９．７％であった。なお、高速液体クロマトグラフィー法は以下の条件で行った。
（条件）
　カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（ＹＭＣ社製）
　溶出液：０．１Ｍ　ＴＥＡ－Ｐ（ｐＨ６．０）＋アセトニトリル５％
　検出法：ＵＶ２６０ｎｍによる検出
（Ｂ）粉末Ｘ線回折
　本発明の３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム凍結乾燥品について、Ｘ線回折装置Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ ＭＰＤ（スペクトリス）を用い、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した。
　（測定条件）
ターゲット：Ｃｕ
Ｘ線管電流：４０ｍＡ
Ｘ線管電圧：４５ｋＶ
走査範囲：２θ＝４．０～４０．０°
前処理：めのう製乳鉢を用いて粉砕
　図１０に示すように、３’，３’－ｃＧＡＭＰ凍結乾燥品は、ピークを示さない。
（Ｃ）赤外線吸収スペクトル
　本発明３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム凍結乾燥品について、フーリエ変換赤外分光光度計Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｏｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ 　Ｅｌｍｅｒ）を用いてＡＴＲ（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　Ｔｏｔａｌ　Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ、減衰全反射）法によって赤外線吸収スペクトルを測定した。
　３’，３’－ｃＧＡＭＰ凍結乾燥品は、３３１９、３１９４、１６３７、１６００、１２３５、１２１８、１０７２、１０５５（ｃｍ－１）付近に特徴的なピークを有していた。これらの結果を図１１に示す。
（Ｄ）示差走査熱量分析
　熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したところ、３’，３’－ｃＧＡＭＰ凍結乾燥品は、吸熱ピークを示さなかった（図１２）。
（実施例３）上記実施例１及び２にて得られた結晶と参考例にて得られた凍結乾燥品を、飽和硝酸カリウム溶液を充填して温度３０℃、湿度９３％に保持したデシケーター中に３日間静置した。静置前後の水分含量をカールフィシャー法で比較した。得られた結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３に示す通り、本発明に属する３’，３’－ｃＧＡＭＰ結晶は、既存の凍結乾燥品と比べて耐湿性に優れていることが分かる。

Claims (6)

  1. ３’,３’－Ｃｙｃｌｉｃ　ＧＭＰ－ＡＭＰの水和物結晶。
  2. カールフィッシャー法にて測定したときの水分が５～３０％である、請求項１に記載の結晶。
  3. アルカリ金属塩結晶である、請求項１または２に記載の水和物結晶。
  4. ３’,３’－Ｃｙｃｌｉｃ　ＧＭＰ－ＡＭＰ水溶液のｐＨ４～１１に調整し、有機溶媒を添加し、析出する結晶を取得する工程からなる、請求項１から３のいずれか１項に記載のアルカリ金属塩結晶の製造法。
  5. 遊離酸結晶である、請求項１または２に記載の水和物結晶。
  6. ３’,３’－Ｃｙｃｌｉｃ　ＧＭＰ－ＡＭＰ水溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３まで低下させ、析出する結晶を取得する工程からなる、請求項５記載の遊離酸結晶の製造法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN106190999A (zh) * 2015-05-10 2016-12-07 聊城市奥润生物医药科技有限公司 环二核苷酸cGAMP的高效制备方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016079899A1 (ja) 2014-11-20 2016-05-26 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 異なる核酸アジュバントの組み合わせによる、新規Ｔｈ１誘導性アジュバントおよびその用途
CN106190999A (zh) * 2015-05-10 2016-12-07 聊城市奥润生物医药科技有限公司 环二核苷酸cGAMP的高效制备方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids and Related Reagents", TCI, vol. L3014, 2016, pages 1 - 13 , XP055766965 *
DINSHAW J. PATEL ET AL., CELL, vol. 153, no. 5, 2013, pages 1094 - 1107
GAO, J. ET AL.: "Identification and characterization of phosphodiesterases that specifically degrade 3'3'-cyclic GMP-AMP", CELL, vol. 25, no. 5, May 2015 (2015-05-01), pages 539 - 550, XP055666700, ISSN: 1001-0602 *
HYODO, M. ET AL.: "Synthesis of cyclic bis(3'-5') diguanylic acid (c-di-GMP) analogs", TETRAHEDRON, vol. 62, no. 13, 2006, pages 3089 - 3094, XP025001725, ISSN: 0040-4020, DOI: 10.1016/j.tet.2006.01.025 *
JOHN J. MEKALANOS ET AL., CELL, vol. 149, 2012, pages 358 - 370
KELLENBERGER, C. A. ET AL.: "RNA-Based Fluorescent Biosensors for Live Cell Imaging of Second Messengers Cyclic di-GMP and Cyclic AMP-GMP", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 135, no. 13, 2013, pages 4906 - 4909, XP055449779, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ja311960g *
MING C. HAMMOND ET AL., PNAS, vol. 113, no. 7, 2016, pages 1790 - 1795
WANG, C. ET AL.: "Synthesis of All Possible Canonical (3'-5'-Linked) Cyclic Dinucleotides and Evaluation of Riboswitch Interactions and Immune- Stimulatory Effects", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 139, no. 45, 15 November 2017 (2017-11-15), pages 16154 - 16160, XP055666696, ISSN: 0002-7863 *

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