JP4667533B1

JP4667533B1 - 新規オリゴ糖及びその製造方法

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Publication number: JP4667533B1
Application number: JP2010204236A
Authority: JP
Inventors: 昭山森; 秀紀岡田; 直樹川添; 徳夫塩見; 秀一小野寺; 敬司上野
Original assignee: 大高酵素株式会社
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2030-09-13
Also published as: JP2012056918A

Abstract

【課題】新規な構造を持つオリゴ糖を提供すること、並びに新規なオリゴ糖を製造する方法を提供する。
【解決手段】新規オリゴ糖は、下記式（１）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドである。
【化１】

Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースを用い、酵素が存在しない条件下で、加熱して反応させて前記式（１）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを生成させ、反応物中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得する。具体的には、Ｄ−グルコースおよびＤ−フルクトースの混合物に対して水を添加することなく固相で１００℃以上２００℃以下で加熱して反応させ、次いで反応物に水を添加し溶解させて、β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有する水溶液とし、該水溶液からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得する。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規オリゴ糖及びその製造方法に関し、詳しくはショ糖のフルクトース部分がβ−フルクトピラノースで２←→１結合している新規オリゴ糖に関する。

また本発明は、グルコースとフルクトースの共存下において、酵素反応を利用することなく加熱条件下で反応させて、新規オリゴ糖であるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを製造する方法に関する。

フルクトースとグルコースが２←→１結合しているオリゴ糖としてショ糖（スクロース）が知られている。ショ糖は、β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２←→１）−α−Ｄ−グルコピラノシドと表されるが（非特許文献１）、ショ糖のβ−Ｄ−フルクトフラノース部分が、β−Ｄ−フルクトピラノース、また、ショ糖のα−Ｄ−グルコピラノシド部分が、β−Ｄ−グルコピラノシドとなった二糖類、即ち、β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドについては知られておらず、またその製造方法も知られていない。

「生化学辞典」（第２版）６８６頁、１９９２年２月５日株式会社東京化学同人発行

本発明は、新規な構造を持つオリゴ糖を提供すること、並びに新規なオリゴ糖を製造する方法を提供することを課題とする。

本発明は、糖質材料としてＤ−グルコースとＤ−フルクトースを用い、酵素反応を利用することなく、加熱して反応させて、反応物中の新規オリゴ糖について検索し、分離しＴＯＦ−ＭＳ分析およびＮＭＲ分析した結果、いかなる標品とも一致しない未知のオリゴ糖を検出した。

本発明の新規オリゴ糖は、次式（１）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシド（略語として「β−Ｆｐ２−１βＧ」と呼ぶことがある。）である。

本発明の新規オリゴ糖の製造方法は、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースを用い、酵素が存在しない条件下で、加熱して反応させて前記式（１）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを生成させ、反応物中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得することを特徴とする。

さらに一つの具体的な本発明のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造方法は、前記のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造方法において、Ｄ−グルコースおよびＤ−フルクトースの混合物に対して水を添加することなく固相で加熱して反応させ、次いで反応物に水を添加し溶解させて、β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−βーＤ−グルコピラノシドを含有する水溶液とし、該水溶液からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得することを特徴とする。

本発明のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造方法において加熱反応させる際の温度条件は、１００℃以上２００℃以下となる条件が好ましい。

本発明の前記式（１）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドは、新規化合物として有用である。

本発明のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造方法は、新規化合物の製造方法として有用である。

糖１について加熱処理済糖混合溶液を活性炭カラムにかけて、蒸留水で溶出した画分をＯＤＳ−８０Ｔｓカラムに供したチャートを示す図である。糖１についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの結果のチャートを示す図である。糖１について１次元プロトンＮＭＲの結果のチャートを示す図である。糖１について１次元カーボンＮＭＲの結果のチャートを示す図である。糖１について２次元ＮＭＲとしてＣＯＳＹの結果のチャートを示す図である。糖１について２次元ＮＭＲとしてＥ−ＨＳＱＣの結果のチャートを示す図である。糖１について２次元ＮＭＲとしてＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹの結果のチャートを示す図である。糖１について２次元ＮＭＲとしてＨＭＢＣの結果のチャートを示す図である。

本発明のβ−Ｆｐ２−１βＧの製造に用いるＤ−グルコースには、 β−Ｄ−グルコース、無水のＤ−グルコース、 1 水和物のＤ−グルコース、アノマー混合のＤ−グルコースの何れでもよい。Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトースには市販のものが好適に利用できる。また、本発明で利用可能なＤ−グルコース、Ｄ−フルクトースの形態は、粉末状或いは顆粒の状態でもよい。

本発明において使用する水には、反応条件を厳密にする目的で精製水を用いることが好ましい。精製水には、ミリＱ水、蒸留水或いはイオン交換水を用いることができる。

β−Ｆｐ２−１βＧを含有する水溶液の製造の好ましい実施の態様として、次の方法を示す。

（本発明のオリゴ糖を含有する水溶液の製造方法)
粉末状または顆粒状のＤ−グルコースとＤ−フルクトースを三角フラスコにとり混合し、水を添加しない状態で、１００℃以上２００℃以下、好ましくは１１０℃以上１８０℃以下、最も好ましくは１２０℃以上１６０℃以下に加熱する。加熱反応時の温度が１００℃未満であるとβ−Ｆｐ２−１βＧの十分な製造はされず、また２００℃を超えるとカラメル化は進み、 β−Ｆｐ２−１βＧの製造効率が落ちるため好ましくない。

加熱時間は好ましくは１０分から９０分間、さらに好ましくは２０分から６０分間加熱処理し、精製水を添加後溶解し、濾過してβ−Ｆｐ２−１βＧを生成した糖溶液を得ることができる。濾過は、ディスポーサブル０．４５μｍあるいは０．２２μｍフィルター（例えば、孔径０．４５μｍあるいは０．２２μｍのＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓＣｅｌｌｕｌｏｓｅＡｃｅｔａｔｅ）で濾過してβ−Ｆｐ２−１βＧを含有する水溶液とすることができる。このβ−Ｆｐ２−１βＧを含有する水溶液は、 −４℃以下（好ましくは−８０℃以下）のフリーザーで凍結させることにより保存できる。

（糖サンプル溶液の製造）
Ｄ−グルコース３０ｇとＤ−フルクトース３０ｇを３００ｍｌの三角フラスコに入れ混合し、アルミホイルで蓋をし、水を添加することなく予め１５５℃に温めておいた電気炉で１時間加熱した。加熱後、反応物にＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて総量が３００ｍＬとなるように溶解させることにより糖サンプル溶液を得た。

（未知の糖１の分離）
前記糖サンプル溶液の製造工程で得られた糖サンプル溶液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィー（４．８ｃｍ×３６ｃｍ）に添加し、画分１（約５００ｍＬ）、画分２（約６００ｍＬ）、画分３（約２０００ｍＬ）の総量３１００ｍＬの水で溶出させ、溶出させたサンプルは、それぞれ減圧濃縮装置を用いて濃縮した。

それぞれ濃縮したサンプルについて、ＨＰＬＣ装置（デュアルポンプ（ＤＰ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、検出器（ＲＩ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製））、オーブン（ＣＯ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、インテグレータ（Chromatocorder 21 ：商品名、東ソー株式会社製）、カラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５ｃｍ×２：商品名、東ソー株式会社製）、溶出（Ｈ₂Ｏ、０．４ｍＬ／ｍｉｎ）、カラム温度（室温）、注入量（１００μＬ）を行った。以後この分析条件を「ＨＰＬＣ条件−Ａ」とする。その結果、水で溶出させた画分３の中に、未同定ピーク（１７分頃）が検出していることが認められたため、この目的のピークを糖１とした。図１にクロマトグラフィーのチャートを示す。

目的のピーク糖１について、ＨＰＬＣ条件−Ａを行い２５回分取した。ただし、得られた画分については単一になっていない場合は、ＨＰＬＣ装置（デュアルポンプ（ＤＰ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、検出器（ＲＩ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製））、オーブン（ＣＯ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、インテグレータ（Chromatocorder 21 ：商品名、東ソー株式会社製）、カラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５ｃｍ×２）：商品名、東ソー株式会社製）＋ＯＤＳ−１００Ｖｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５ｃｍ×２）：商品名、東ソー株式会社製）、溶出（Ｈ₂Ｏ、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）、カラム温度（室温）、注入量（１００μＬ）を繰り返し行い精製した。得られた分取液を凍結濃縮乾燥し、２．２ｍｇの糖１の凍結乾燥物を得た。

（糖１の化学構造の決定）
前記工程において分離、精製した糖１について、以下の機器分析を行い、その化学構造を以下のように決定した。分離した糖１のＴＯＦ−ＭＳ分析の結果、得られたピークは３６５の（Ｍ＋Ｎａ）イオンピークを与えた（糖１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの結果のチャートを図２に示す）。

次に、糖１について１次元プロトンＮＭＲ、１次元カーボンＮＭＲ、並びに２次元ＮＭＲとしてＣＯＳＹ、Ｅ−ＨＳＱＣ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣを行った。それらのチャートを図３〜図８に示す。また、糖１のケミカルシフトを表１に示す。

以上の結果から糖１は、前記式（１）で表される新規化合物であるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドと決定した。

本発明のオリゴ糖は、食品素材、医薬品素材の用途としての利用が期待できる。

Claims

次式（１）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシド。
Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースを用い、酵素が存在しない条件下で、１００℃以上２００℃以下で加熱して反応させて次式（１）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを生成させ、反応物中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得することを特徴とするβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造方法。
請求項２に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造方法において、
Ｄ−グルコースおよびＤ−フルクトースの混合物に対して水を添加することなく固相で１００℃以上２００℃以下で加熱して反応させ、次いで反応物に水を添加し溶解させて、β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有する水溶液とし、該水溶液からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得することを特徴とするβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造方法。
前記加熱する際の温度条件は、１１０℃以上１８０℃以下である請求項２又は３に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造方法。
前記Ｄ−グルコースおよびＤ−フルクトースが粉末状または顆粒状である請求項２乃至４のいずれか１項に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２←→１）−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造方法。