JP4791417B2 - 組織および臓器の治療および修復に用いるための幹細胞マトリックスの迅速な調製方法 - Google Patents
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Description
L. Germainら、2000, Medical & Biological Engineering & Computing, 38(2): 232-40 W.W. Minuthら、1998, Cell Tissue Res., 291(1): 1-11 G.K. Naughtonら、1999, Clin. in Plastic Surgery, 26(4): 579-86, viii F. Berthod および O. Damour, 1997, British Journal of Dermatology, 136: 809-816 J.F. Hansbroughら、1991, Surgery, 111(4): 438-446 F. Berthodら、1993, Biomaterials, 14(10): 749-754 F.A. Augerら、1988, Med. Biol. Eng. Compu., 36: 801-812 S.T. Boyce, 1996, Tissue Eng., 2: 255-266 O. Damourら、1997,「Cultured autologous epidermis for massive burn wounds: 15years of practice」、Rouabhia, M.(編):「Skin substitute production by tissue engineering: clinical and fundamental applications」、Landes, Austin, pp. 23-45
本発明の1つの面は、組織および臓器の修復に用いるための幹細胞マトリックス、特にバイオマトリックスを調製する方法を提供する。本発明によれば、他の細胞種(例えば、分化細胞または非幹細胞)ではなく幹細胞を用いる。さらに、使用の少し前または直前に幹細胞およびマトリックス材料を混合または配合し、それによって細胞とマトリックス材料との長期インキュベーションまたは培養の必要性を解消する。このため、本方法は迅速であり、幹細胞を基盤とするバイオマトリックス材料を必要時に調製することを可能にする。
本発明は、医学的または生理学的に許容されるマトリックス材料ならびに自家性および/または同種性の幹細胞、好ましくは筋肉由来の幹細胞を含む、組織および臓器の修復に用いるための幹細胞または前駆細胞マトリックスを調製する方法にかかわる。本発明は、幹細胞を、医学的または生理学的に許容されるマトリックス材料中に混合すること、例えば接種または播種すること、ならびに配合した幹細胞マトリックス組成物または製造物をほぼ直ちにインビボでの組織または臓器の治療および修復のために用いることにかかわる。
筋肉幹細胞/アルジネート被覆材組成物
筋肉幹細胞(MSC)をラット後肢筋肉からプレプレート法(国際公開公報第99/56785号を参照のこと)を用いて採取した。後期プレート(すなわち、PP5後、好ましくはPP6)細胞集団を入手した後に、LacZを含むレトロウイルスベクターによる形質導入を行った100,000個の細胞を、200μlのハンクス緩衝塩類溶液(HBSS;Gibco BRL, Grand Island, NY)中に使用のために懸濁化した。アルジネート(Alginate)(Johnson & Johnson Medical, Arlington, TX)の1cm2片を切り出してMSC懸濁液中に浸漬してアルジネート+MSC組成物を調製し、これを直ちにラット背側上部の1cm2の全層創傷欠損部の上に置いた。1週間後に、完全に治癒した創傷を採取して染色した。その結果、アルジネート+MSCによる治癒はアルジネートのみによる場合よりも美容の点で優れていることが示された。1週後の時点で、創傷は正常皮膚に完全に覆われていた。組織学的な検査によると、アルジネート+MSCは創傷閉鎖がより良好であり、深部創傷内部に線維化領域がみられた。さらに、真皮および上皮層には「新たな」真皮細胞および上皮細胞の形成がみられるように思われた。この種の所見は、本発明による創傷の修復に用いた場合に、MSCが秩序立った様式で、上皮細胞および真皮細胞の分化および発生を実際に行わせることを示している。
筋肉幹細胞/SIS組成物
単層SIS(Cook Biologic, Inc., Indianapolis, IN)をまずハンクス緩衝塩類溶液中にて37℃で1時間インキュベートした。100,000個の後期プレプレート(例えば、PP6)(M. Chancellorらに対する、国際公開公報第99/56785号;ならびに1999年4月30日に提出された米国特許出願第09/302,896号および2000年4月14日に提出された同第09/549,937号を参照のこと)ラットMSC細胞(Lac Zを含むレトロウイルスベクターによる形質導入を行ったもの)を、直径1cmの円形SISの上に載せて、MSC-SISマトリックス組成物を形成させた。このMSC-SISマトリックスを24ウェル培養プレートの中に置いた。続いて、37℃での細胞の生存性を評価するために、10%ウマ血清および10%ウシ胎仔血清を含むように添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY)の培地を毎日交換しながら、SISおよびMSCのさまざまな調製物をそれぞれ3日、1週間、および2週間インキュベートした。適当な間隔をおいて、SIS+MSCマトリックス配合物を回収し、切片化して染色した。すべての時点で、細胞の生存性は明らかであった。MSCはすべての時点で増殖および筋管形成(ミオシン重鎖染色により明らかとなる)を続けていた。これらの実験により、MSCがSIS上で増殖すること、およびSISがこれらの細胞に対して有毒でないことが確認された。後期プレプレート細胞は秩序立った集密様式で増殖した。
筋肉幹細胞/フィブリン糊組成物
プレプレート法を用いて(M. Chancellorらに対する、国際公開公報第99/56785号;ならびに1999年4月30日に提出された米国特許出願第09/302,896号および2000年4月14日に提出された同第09/549,937号を参照のこと)、後期プレプレート(PP6)からラットMSCを入手した。フィブリン糊はバクスターヘルスケア社(Baxter Healthcare Corporation)(Glendale, CA)から入手した。フィブリン糊は、FDAに承認された密封材であり、ヒトトロンビン、塩化カルシウム、ウシ線維素溶解阻害剤溶液およびヒト密封性タンパク質濃縮物から構成される。成分を使用前に配合し、針付きシリンジを用いて注入する。100,000個の細胞および0.5ccのフィブリン糊を同時に用いて、幹細胞およびフィブリン糊を障壁性挿入物を用いずにSIS上に接種した。1日後にこの系を回収し、切片化した。フィブリン糊およびMSCをSIS上に同時に速やかに配置することにより、MSCがSISとより迅速に接着しただけでなく、細胞の生存性も維持された。フィブリン糊はSISの生存性には影響を及ぼさなかった。この実験により、マトリックスおよび足場に対するより迅速な接着を可能にするためにフィブリン糊および幹細胞を用いることの実現可能性が示された。
筋肉幹細胞/動脈組成物
プレプレート法を用いて(M. Chancellorらに対する、国際公開公報第99/56785号;ならびに1999年4月30日に提出された米国特許出願第09/302,896号および2000年4月14日に提出された第09/549,937号を参照のこと)、ラットMSCを入手した。単層SISに対してMSCを接種した。インビトロで1日インキュベートした後に、MSC/SISマトリックス組成物を巻いて血管様管腔とした。長期間のインキュベーション(すなわち、2週間)後も細胞の生存性は損なわれておらず、血管様管腔の全体にわたって播種がみられた。
種々の浸透時間を用いた筋肉幹細胞/アルジネート被覆材
MSCを、組織または臓器部位での適用および使用の1分、5分、1時間、6時間または12時間前にアルジネートの小片(1〜2cm2)に浸透させる効果を評価するための実験を行った。MSCをアルジネートに浸透させる時間が長いほどアルジネートが軟化し、アルジネートの溶解が生じることが明らかになった。アルジネートの軟化はそれが含水して間もなく始まり、最終的には浸透期間が6時間以内で溶解の証拠が認められた。これらの試験の結果から、MSCを医療提供場所で即時的または短期的に浸透させるだけで、生理的な結果が首尾良く得られることが示された。
アルジネートに浸透させた筋肉細胞と線維芽細胞との比較
筋肉幹細胞(MSC)をアルジネートと組み合わせたものの創傷治癒における有効性を、線維芽細胞をアルジネートと組み合わせたものの有効性と比較するための実験を行った。皮膚全層に及ぶ1cm2の創傷を、麻酔ラットの胴体上部の背側に作製した。実験はすべて、アルジネートに筋肉幹細胞または線維芽細胞を即時的に浸透させることによって行った。100,000個の後期プレートMSC細胞(すなわち、PP6。M. Chancellorらに対する、国際公開公報第99/56785号;ならびに1999年4月30日に提出された米国特許出願第09/302,896号および2000年4月14日に提出された同第09/549,937号を参照のこと)および100,000個の初期プレート(すなわち、PP1)細胞を、アルジネートの2つの1cm2片に対して用いた。2つの皮膚全層創傷を作製した後に、2つの1cm2アルジネート片にPP1細胞またはPP6 MSC細胞を5秒間浸透させた。続いて、この系を創傷欠損部の上に直接配置して縫合した。これらの実験の結果により、MSC-アルジネート配合物による創傷治癒の方が美容の点で優れることが示された。これに対して、線維芽細胞-アルジネート組成物では治癒の外観は変化しなかったが、対照(アルジネートのみ)よりも治癒は迅速であった。このため、本発明によれば、創傷の治癒の改善をもたらすために、細胞とアルジネートマトリックス材料との長期間のインキュベーションは必要でない。
インビトロ筋肉幹細胞/SIS組成物
後期プレプレートMSC(例えば、PP6。M. Chancellorらに対する、国際公開公報第99/56785号;ならびに1999年4月30日に提出された米国特許出願第09/302,896号および2000年4月14日に提出された同第09/549,937号を参照のこと)のSIS生体足場(コラーゲンが1層および4層のSISの両方)に対する接着性および存続性を評価するための実験を行った。その結果から、後期プレプレートMSC(すなわち、PP6)の接着性が初期プレプレート細胞(すなわち、PP1〜4)よりも優れることが示された。
筋肉幹細胞はSISの生体力学的特性を変化および改善させる
本実施例で行った実験から、上記の実施例の記載のようにして単離した筋肉幹細胞(MSC)は、SISの再構築をもたらし、本来のSISと比べて生体力学特性を変化させることが示された。SIS(およびMSC+SISマトリックス)の生体力学特性を、二軸試験を用いて評価した。二軸試験に関しては、当業者に既知の方法を用い、両側が2つの滑車システムに連結された4個の細いフックを用いて、算出した応力をSISの全四方から加えた。加えた応力により、SIS試料の内部に歪みが生じる。データを分析し、材料の弾性、クリープおよびコンプライアンスなどの生体力学的特性を容易に得ることができる。二軸試験によれば、本来のSIS(すなわち、筋肉幹細胞を含まないSIS)は、縦方向と比べて横方向/断面弾性の低下を示した。これに対して、MSCとSISとの配合物を含む組成物では、SISの横方向/断面方向の弾性も増加し、縦方向とほぼ等しくなった。本試験は、インビトロの培養皿で10日および20日間培養したSIS+MSCを用いて行った。このため、これらの結果は、MSCによるSISの能動的な再構築の証拠を示している。
E=(λ2−1)÷2
面積歪み=(U1×U2−1)×100
(ここで、U1:X1軸方向の延伸;U2:X2軸方向の延伸)
SIS足場中に組み入れた筋肉幹細胞(MSC)の収縮性
25個のMDSC/SIS調製物および25個のSISのみの対照調製物を37℃で1、4、または8週間インキュベートした。続いて試験片を、37℃のクレブス溶液(mmol/L単位で、NaCl、113;KCl、4.7;CaCl2、1.25;MgSO4、1.2;NaHCO3、25;KH2PO4、1.2、およびグルコース、11.5)5mlを入れ、95%O2および5%CO2の混合ガスを満たした温度制御式の水浴中にマウントした。TBM4歪みゲージ増幅器と組み合わせた歪みゲージ変換素子を用いて、等尺性収縮の頻度および振幅を測定し、データ収集プログラム(Windaq, DATAQ Instruments Inc. Akron, OH)を用いてコンピュータに記録した。60分間の平衡化期間をおいた後に、電場刺激(10Hz、150ボルト、0.5ms、60秒)を水浴中に加えた。サクシニルコリン(S-Chol)(4、10、および20μM);カルバコール(10および20μM);KCl(7%、1M);EGTAを加えたCa++非含有クレブス溶液(200μM);または蒸留水のそれぞれを30分間隔で逐次的に水浴に加えることにより、薬理学的な評価を行った。試験片の収縮の頻度、振幅およびパターンを各群間で比較した。
ラットにおけるMSC/SIS尿道下スリング留置の有効性
雌性ラットにおけるMDSC/SIS尿道下スリング留置の有効性を評価するために、腹圧性尿失禁(SUI)の両側近位坐骨神経離断(PSNT)モデルを用いた。両側陰部神経離断または陰部神経破砕のいずれによっても排尿行動パターンが変化し、尿道横紋筋萎縮という顕著な組織学的変化が生じる。SISスリング留置に関する初期試験では、坐骨神経の比較的近位レベル(陰部神経の分岐前)での離断を用い、これを垂直チルトテーブルおよび漏出時圧(LPP)に関する膀胱内圧クランプ法と組み合わせた。
Claims (12)
- レシピエントにおける創傷の修復における使用のための筋肉由来幹細胞バイオマトリックスを調製する方法であって、以下の段階を含む方法:
a)レシピエントのための医療提供場所において生理学的に許容される吸収性のマトリックス材料を供給する段階;
b)該レシピエントのための医療提供場所において筋肉由来幹細胞調製物を供給する段階であって、該医療提供場所において前記筋肉由来幹細胞調製物が前記生理学的に許容される吸収性のマトリックス材料とは別個に供給される、段階;
c)幹細胞マトリックスを形成させるために、該医療提供場所において該筋肉由来幹細胞調製物を該生理学的に許容される吸収性のマトリックス材料と混合する段階;および
d)該レシピエントにおける創傷の修復に用いる前に、約12時間未満にわたって段階(c)の幹細胞マトリックスをインビトロでインキュベートする段階。 - 筋肉由来幹細胞がレシピエントに対して自家性である、請求項1記載の方法。
- 筋肉由来幹細胞がレシピエントに対して同種性である、請求項1記載の方法。
- 幹細胞の均一または不均一な集団をマトリックス材料と混合する、請求項1記載の方法。
- 筋肉由来幹細胞が成体、胚、または胎児起源の筋組織から得られたものである、請求項1記載の方法。
- 筋肉由来幹細胞が骨格筋由来である、請求項1記載の方法。
- 筋肉由来幹細胞マトリックスに収縮能がある、請求項1記載の方法。
- 約2.5×103〜約1×106個の幹細胞をマトリックス材料中に沈着させるために、筋肉由来幹細胞を生理学的に許容されるマトリックス材料中に導入する、請求項1記載の方法。
- 約5×103〜約1×106個の幹細胞をマトリックス材料中に沈着させるために、筋肉由来幹細胞を生理学的に許容されるマトリックス材料中に導入する、請求項8記載の方法。
- マトリックス1cm2当たり約1×105個の幹細胞を沈着させるために、筋肉由来幹細胞を生理学的に許容されるマトリックス材料中に導入する、請求項1記載の方法。
- 創傷の修復のために用いる筋肉由来幹細胞を生物性接着剤を用いてマトリックス材料に付着させる、請求項1記載の方法。
- 筋肉由来幹細胞がマトリックス材料の生体力学的特性を変化させる、請求項1記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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