JP4790025B2 - 分枝鎖アミノ酸生成能が改善した変異微生物及びそれを使用した分枝鎖アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
一観点で、本発明は微生物で、L−イソロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、L−ロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子及びD−パントテン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を弱化または欠失させて、L−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加するように変異させることを特徴とする、L−バリン高生成能を有する変異微生物の製造方法に関するものである。
実施例1:L−バリン高生成変異微生物の製作及びL−バリンの生成能測定
1−1:L−バリン高生成微生物の製作
1−1−1:pSacHR06の製作
染色体DNAの特定塩基または塩基の置換のためにバチルススブチリス来由のsacB相同組換え技法(Wohlleben等,J.Bacteriol.,1992年,第174巻,5462頁)を使用する目的でpSacHR06ベクターを製作した(図3)。図3は、pSacHR06ベクターを製作する過程を示したものである。
5'-gccgtcgacgctagcgcatgcacgcgtgtgcacccatgggacgtcctcactgactcgctgcgctc-3'
[配列番号2]pucorido
5'-ggctcacaacgtggctagcgacgtcgtgcacccatgggttccactgagcgtcagacc-3'
[配列番号3]sacBf
5'-actctctagacgcgggtttgttactgataa-3'
[配列番号4]sacBr
5'-gctagatatcaggatatcggcattttcttt-3'
1−1−2:lacI遺伝子の欠失
L−バリン生成微生物である大腸菌W3110(ATTC 39936)で配列番号5及び6のプライマーを使用したワンステップインアクティベーション方法(Warner等,PNAS,2000年,第6;97(12)巻,6640−6645頁)を使用して、lacオペロンのリプレッサーを暗号化する遺伝子で、ラクトース分解を担当するlacオペロンの転写を抑制する機能を有するlacI遺伝子を欠失させて、抗生剤耐性を除去した。
5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttagattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号6] lacI_1stdo:
5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgcacttaacggctgacatggg-3'
1−1−3:ilvHのフィードバック阻害の除去
味の素社が出願した特許(米国6,737,255 B2)を参考にして、アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムIIIをコードする遺伝子であるilvHの41番目塩基(G)と50番目塩基(C)をそれぞれAとTで置換し、大腸菌W3110(ATTC 39936)の染色体DNAは、公知された方法で分離及び精製した(Sambrook,等,Molecular cloning,2nd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,1989年)。
[配列番号8] ilvH2:5'-ggaaaaaaggccaatcacgcggaataacgcgtctgattcattttcgagtaag-3'
[配列番号9] ilvH3:5'-cttactcgaaaatgaatcagacgcgttattccgcgtgattggccttttttcc-3'
[配列番号10] ilvH4:5'-gctccgtcgaccagtttcacaattgccccttgcgtaaa-3'
1−1−4:ilvGMEDA及びilvBNオペロンのアッテネータのtacプロモーターへの置換
1−1−3で製作されたlacI遺伝子とilvHのフィードバック阻害が除去された大腸菌W3110で、アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムI及びIIの構成的な発現を誘導するために、アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムI及びIIをそれぞれ暗号化するilvBN及びilvGMEDAオペロンの転写調節機序に関与するアッテネータを、強力なプロモーターであるtacプロモーターに置換した。
[配列番号12] ilvGatt1r:5'-gctcggatccgaatgttgttcccttcctcgtagttcatcc-3'
[配列番号13] ilvGatt2f:5'-gactgaattcatgaatggcgcacagtgggtggtacatgcg-3'
[配列番号14] ilvGatt2r:5'-gctcctgcagtcaccgctggctaactggatatcttttggg-3'
[配列番号15] ilvBatt1f:5'-gactcgtcgacagagatggtagggcggataa-3'
[配列番号16] ilvBatt1r:5'-gctcggatcccacactgtattatgtcaaca-3'
[配列番号17] ilvBatt2f:5'-gactgaattcatggcaagttcgggcacaac-3'
[配列番号18] ilvBatt2r:5'-gctcactgcagtgcgtcacgaatgctttctt-3'
1−1−5:ilvA、panB及びleuA遺伝子の欠失
1−1−4で収得されたlacI遺伝子とilvHのフィードバック阻害除去されてilvGMEDA及びilvBNオペロンアッテネータのtacプロモーターへの置換されたW3110で、ilvA、panB及びleuA遺伝子の欠失させるために、配列番号19ないし24プライマーを使用して前記1−1−2で言及したワンステップインアクティベーション方法(Warner等,PNAS,2000年,第6;97(12)巻,6640頁)によってilvA(イソロイシン生合成経路の一番目酵素であるスレオニンデヒドラターゼを暗号化する遺伝子)、panB(パントテン酸生合成に必要な酵素の中で3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼを暗号化する遺伝子)及びleuA(ロイシン生合成に必要な酵素の中で2−イソプロピルマレイン酸シンターゼを暗号化する遺伝子)などの遺伝子を欠失させた。
5'-atggctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgccgaatatttgattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号20] ilvA1stdo:
5'-ctaacccgccaaaaagaacctgaacgccgggttattggtttcgtcgtggccacttaacggctgacatggg-3'
[配列番号21] panB1stup:
5'-atgaaaccgaccaccatctccttactgcagaagtacaaacaggaaaaaaagattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号22] panB1stdo:
5'-ttaatggaaactgtgttcttcgcccggataaacgccggactccacttcagcacttaacggctgacatggg-3'
[配列番号23] leuA1stup:
5'-atgagccagcaagtcattattttcgataccacattgcgcgacggtgaacagattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号24] leuA1stdo:
5'-ttcagaacgtgcaccatggctttggcagatgactcgacaatatcggtagcacttaacggctgacatggg-3'
1−1−6:pKBRilvBNCEDベクターの製作
配列番号25ないし30のプライマーを使用してL−バリン生合成経路に必須な遺伝子、すなわち、ilvB(アセトヒドロキシ酸シンターゼI大サブユニットを暗号化する遺伝子)、ilvN(アセトヒドロキシ酸シンターゼI小サブユニットを暗号化する遺伝子)、ilvC(アセトヒドロキシ酸イソメロレラクターゼを暗号化する遺伝子)、ilvE(分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼを暗号化する遺伝子)及びilvD(ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを暗号化する遺伝子)などを順次にpKK223−3発現ベクター(Pharmacia Biotech)にクローニングして、pKKilvBNCEDベクターを収得して、シーケンシングで塩基配列を確認した。前記pKKilvBNCEDベクターをPciI及びSphI酵素で切断した9.0kb切片と、pBR322ベクターをPciI及びSphI酵素で切断した1.9kb切片をライゲーションしてpKBRilvBNCEDベクターを最終的に収得した(図4)。
[配列番号26] ilvBNr:5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'
[配列番号27] ilvCf:5'-agtgctgcagacgaggaatcaccatggctaac-3'
[配列番号28] ilvCrSX:5'-gctcctgcagtctagagctagcgagctcttaacccgc-3'
[配列番号29] ilvEDepfs:5'-actcgagctctttccacgtctgctcaatgaatat-3'
[配列番号30] ilvEDr:5'-tacgtctagattaaccccccagtttcgatttatc-3'
1−1−7:L−バリン生成微生物の製作
前記1−1−1ないし1−1−5の過程を通じてilvGMEDA及びilvBNオペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターがtacプロモーターに置換されて、ilvHのフィードバック阻害が除去されて、lacI、ilvA、panB及びleuA遺伝子が欠失された大腸菌W3110菌株に、前記1−1−6で製作したpKBRilvBNCEDベクターを導入してL−バリン生成微生物(Val+pKBRilvBNCED)を製作した。
1−2:L−バリンの生成能測定
前記1−1で製作されたL−バリン生成微生物(Val+pKBRilvBNCED)をアンピシリン(ampicillin)、クロラムフェニコール(chloramphenicol)各50μg/ml及び30μg/mlが添加されたLB平板培地で選別した。この形質転換菌株を5g/lグルコースを含むLB培地30mlに接種して、31℃で24時間前培養を遂行した。その後、蒸留水1リットル当たりグルコース50g 、KH2PO4 4g 、(NH4)2SO4・7H2O 15g 、MnSO4・5 H2O 20mg、MgSO4・7 H2O 2g、CaCO3 30g、酵母抽出物2g、L−イソロイシン262mg、L−ロイシン262mg、D−パントテン酸ヘミカルシウム塩425μg 、希金属溶液(蒸留水1リットル当たりFeSO4・7H2O 10g、CaCl2 1.35g、ZnSO4・7H2O 2.25g、MnSO4・4 H2O 0.5g、CuSO4・5H2O 1g、(NH4)6Mo7O24・4 H2O 0.106g、Na2B4O7・10 H2O 0.23g、35%HCl 10mlを含む)5mlの成分を有しKOHでpHを8.0で合わせた培地30mlを含んだ250mlバッフルフラスコに、前記前培養液1mlを接種して、31℃で250rpmで48時間培養した。
前記1−1で製作されたL−バリン生成微生物(Val+pKBRilvBNCED)のL−バリン生成能をさらに向上させるために、インシリコシミュレーション方法を使用して、代謝流れをL−バリン生成に合うように最適化するために導入する欠失対象遺伝子を選定した。本実施例のインシリコシミュレーション方法は、本出願人の特許(WO2006/107127)に記載された方法を参考にして各遺伝子の組み合わせ(combination)に対して複合遺伝子変異菌株(multi−gene mutant)に対するシミュレーションを実施して予測されたL−バリン生産速度を比較して一番高い候補遺伝子をスクリーニングした。
2−1:Val菌株に基づいた代謝回路の構築
本発明では、L−バリンを生成するための大腸菌変異微生物の新しい代謝流れ分析システムを構築した。前記システムは、大腸菌の代謝回路を大部分含んでいて、実施例1で製作されたL−バリン生成微生物(Val+pKBRilvBNCED)の培地条件を代謝回路上にすべて反映した。前記構築した代謝回路を使用して遺伝子一つまたはそれ以上の組み合わせを作って、そのような候補遺伝子を代謝流れ分析を使用してL−バリンを生成しようとする対象菌株でシミュレーション上に不活性化させた時、比増殖速度と有用物質の形成収率を予測して効率が一番高い遺伝子をスクリーニングした。
2−2:複合遺伝子変異微生物のシミュレーション
前記2−1のように構築された代謝回路を数学的に表現するためにすべての代謝産物、該代謝産物の代謝経路及び前記代謝経路での化学量論マトリックス(stoichiometric matrix)(Sij,j番目反応でi番目代謝産物の時間による化学量論係数)を使用して、代謝流れベクター(νj,j番目代謝反応の代謝流れ)を計算することができ、時間による代謝産物濃度Xの変化はすべての代謝反応の流れの合計で現わすことができる。また、時間によるXの変化量が一定であると仮定すると、すなわち準正常状態仮定下で、時間による代謝産物濃度の変化量は、下の数式1で定義することができる。
各遺伝子の組み合わせに対して、複合遺伝子変異微生物に対するシミュレーションを実施しようとすると、多様な組み合わせの突然変異に対するシミュレーションを遂行しなければならない。まず、インシリコ遺伝子ノックアウトシミュレーションを使用して単一遺伝子を欠失する場合、L−バリン生成速度が一番高い遺伝子群を捜し出した(表2)。前記シミュレーションは、http://mbel.kaist.ac.kr/を通じてダウンロードすることができるMetaFluxNetを使用して遂行した(Lee等,Bioinformatics,2003年,第19巻,2144頁)。
実施例3:aceF、pfk及びmdhの追加欠失及びL−バリン生成能測定
3−1:aceF、mdh及びpfkAの追加欠失
前記1−1−7で製作されたL−バリン生成微生物で、前記実施例2で選定された欠失対象遺伝子を欠失させて高性能L−バリン生成微生物(VAMF+pKBRilvBNCED)を製作した。
5'-ttgaagccgaacagtcgctgatcaccgtagaaggcgacaaagcctctatggattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号32] aceF1stdo:
5'-aaggagagagaaatcggcagcatcagacgcggcacgaactctttaccattcacttaacggctgacatggga-3'
[配列番号33] mdh1stup:
5'-atgaaagtcgcagtcctcggcgctgctggcggtattggccaggcgcttgcgattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号34] mdh1stdo:
5'-ttacttattaacgaactcttcgcccagggcgatatctttcttcagcgtatcacttaacggctgacatggga-3'
[配列番号35] pfkA1stup:
5'-atgattaagaaaatcggtgtgttgacaagcggcggtgatgcgccaggcatgattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号36] pfkA1stdo:
5'-ttaatacagttttttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgctcacttaacggctgacatggga-3'
3−2:L−バリンの生成能測定
前記3−1で製作されたL−バリン生成微生物(Val+pKBRilvBNCED)をアンピシリン、クロラムフェニコール各50μg/ml及び30μg/mlが添加されたLB平板培地で選別した。この形質転換菌株を5g/lグルコースを含むLB培地30mlに接種して、31℃で24時間前培養を遂行した。その後、蒸留水1リットル当たりグルコース50g 、KH2PO4 4g 、(NH4)2SO4・7H2O 15g 、MnSO4・5 H2O 20mg、MgSO4・7 H2O 2g、CaCO3 30g、酵母抽出物2g、L−イソロイシン262mg、L−ロイシン262mg、D−パントテン酸ヘミカルシウム塩425μg 、希金属溶液(蒸留水1リットル当たりFeSO4・7H2O 10g、CaCl2 1.35g、ZnSO4・7H2O 2.25g、MnSO4・4 H2O 0.5g、CuSO4・5H2O 1g、(NH4)6Mo7O24・4 H2O 0.106g、Na2B4O7・10 H2O 0.23g、35%HCl 10mlを含む)5mlの成分を有しKOHでpHを8.0で合わせた培地30mlを含んだ250mlバッフルフラスコに、前記前培養液1mlを接種して、31℃で250rpmで48時間培養した。VAMF菌株には、酢酸ナトリウム3g/lを添加した。
4−1:大腸菌のygaZHオペロンを含む組換えベクター(pTrc184ygaZH)の製作
大腸菌W3110(ATTC 39936)の染色体DNAを公知された方法で分離及び精製した(Sambrook等,Molecular cloning,2nd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,1989)。前記精製された遺伝体配列を鋳型にして、配列番号37及び38をプライマーに使用して、95℃で20秒間変性、55℃で30秒間アニーリング、72℃で1分20秒間伸張を一周期にして、総24周期反復しながらPCRを遂行して、PCR切片を収得した。
[配列番号38] ygaZHr:5'-gctcggtaccttatataatcgccatcactt-3'
前記増幅されたPCR切片(ygaZH遺伝子)をNcoI及びKpnIで切断して、pTrc99A発現ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)にクローニングしてpTrc99AygaZHを製作して、前記pTrc99AygaZHベクターをBspHI及びEcoRVで切断して収得した遺伝子切片を、同一酵素(BspHI及びEcoRV)で切断したpACYC184(New England Biolabs)に挿入して、ygaZH遺伝子を発現させるための発現ベクターであるpTrc184ygaZHを製作した(図6)。
4−2:組換えベクター(pTrc184ygaZH)のL−バリン生成微生物への導入
実施例1で製作されたL−バリン生成微生物Val+pKBRilvBNCEDに、前記4−1で製作されたベクターpTrc184ygaZHを導入して、組換え大腸菌(Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZH)を製作した。
4−3:L−バリンの生成能測定
前記4−2で製作されたL−バリン生成大腸菌(Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZH)を、アンピシリン、クロラムフェニコール各50μg/ml及び30μg/mlが添加されたLB平板培地で選別した。この形質転換菌株を5g/lグルコースを含むLB培地30mlに接種して、31℃で24時間前培養を遂行した。その後、蒸留水1リットル当たりグルコース50g 、KH2PO4 4g 、(NH4)2SO4・7H2O 15g 、MnSO4・5 H2O 20mg、MgSO4・7 H2O 2g、CaCO3 30g、酵母抽出物2g、L−イソロイシン262mg、L−ロイシン262mg、D−パントテン酸ヘミカルシウム塩425μg 、希金属溶液(蒸留水1リットル当たりFeSO4・7H2O 10g、CaCl2 1.35g、ZnSO4・7H2O 2.25g、MnSO4・4 H2O 0.5g、CuSO4・5H2O 1g、(NH4)6Mo7O24・4 H2O 0.106g、Na2B4O7・10 H2O 0.23g、35%HCl 10mlを含む)5mlの成分を有しKOHでpHを8.0で合わせた培地30mlを含んだ250mlバッフルフラスコに、前記前培養液1mlを接種して、31℃で250rpmで48時間培養した。
5−1:大腸菌のlrp遺伝子を含む組換えベクター(pTrc184lrp)の製作
大腸菌W3110(ATTC39936)の染色体DNAを公知された方法で分離及び精製した(Sambrook等,Molecular cloning,2nd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,1989年)。前記精製された遺伝体配列を鋳型にして、配列番号39及び40をプライマーに使用して、95℃で20秒間変性、55℃で30秒間アニーリング、72℃で1分20秒間伸張を一周期にして、総24周期反復しながらPCRを遂行して、PCR切片を収得した。
[配列番号40] lrpr:5'-gctcggtaccttagcgcgtcttaataacca-3'
前記増幅されたPCR切片(lrp遺伝子)をNcoI及びKpnIで切断して、pTrc99A発現ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)にクローニングしてpTrc99Alrpを製作して、前記pTrc99AlrpベクターをBspHI及びEcoRVで切断して収得した遺伝子切片を、同一酵素(BspHI及びEcoRV)で切断したpACYC184(New England Biolabs)に挿入してlrp遺伝子を発現させるための発現ベクターであるpTrc184lrpを製作した(図7)。
5−2:組換えベクター(pTrc184lrp)のL−バリン生成微生物への導入
実施例1で製作されたL−バリン生成微生物Val+pKBRilvBNCEDに、前記5−1で製作されたベクターpTrc184lrpを導入して、組換え大腸菌(Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZH)を製作した。
5−3:L−バリンの生成能測定
前記5−1で製作されたL−バリン生成大腸菌(Val+pKBRilvBNCED+pTrc184lrp)を、アンピシリン、クロラムフェニコール各50μg/ml及び30μg/mlが添加されたLB平板培地で選別した。この形質転換菌株を5g/lグルコースを含むLB培地30mlに接種して、31℃で24時間前培養を遂行した。その後、蒸留水1リットル当たりグルコース50g、KH2PO4 4g、(NH4)2SO4・7H2O 15g、MnSO4・5 H2O 20mg、MgSO4・7 H2O 2g、CaCO3 30g、酵母抽出物2g、L−イソロイシン262mg、L−ロイシン262mg、D−パントテン酸ヘミカルシウム塩425μg、希金属溶液(蒸留水1リットル当たりFeSO4・7H2O 10g、CaCl2 1.35g、ZnSO4・7H2O 2.25g、MnSO4・4 H2O 0.5g、CuSO4・5H2O 1g、(NH4)6Mo7O24・4 H2O 0.106g、Na2B4O7・10 H2O 0.23g、35%HCl 10mlを含む)5mlの成分を有しKOHでpHを8.0で合わせた培地30mlを含んだ250mlバッフルフラスコに、前記前培養液1mlを接種して、31℃で250rpmで48時間培養した。
6−1:大腸菌のygaZHオペロンとlrp遺伝子を同時に含む組換えベクター(pTrc184ygaZHlrp)の製作
大腸菌W3110(ATTC39936)の染色体DNAを公知された方法で分離及び精製した(Sambrook,等,Molecular cloning,2nd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,1989年)。前記精製された遺伝体配列を鋳型にして、配列番号41及び42をプライマーに使用して、95℃で20秒間変性、55℃で30秒間アニーリング、72℃で1分20秒間伸張を一周期にして、総24周期反復しながらPCRを遂行して、PCR切片を収得した。
[配列番号42] lrpacrp:5'-atctctgcaggttccgtgttagcgcgtctt-3'
前記増幅されたPCR切片(lrp遺伝子)をBamHI及びPstIで切断した後、前記4−1で製作されたベクターpTrc184ygaZHを同一酵素(BamHI及びPstI)で切断して収得したpTrc184ygaZHの遺伝子切片に挿入して、ygaZHオペロンとlrp遺伝子を同時に含む組換えベクターpTrc184ygaZHlrpを製作した(図8)。
6−2:組換えベクター(pTrc184ygaZHlrp)のL−バリン生成微生物への導入
実施例1で製作されたL−バリン生成微生物Val+pKBRilvBNCEDに、前記6−1で製作されたベクターpTrc184ygaZHlrpを導入して、組換え大腸菌(Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)を製作した。
6−3:L−バリンの生成能測定
前記6−2で製作されたL−バリン生成大腸菌(Val+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)を、アンピシリン、クロラムフェニコール各50μg/ml及び30μg/mlが添加されたLB平板培地で選別した。この形質転換菌株を5g/lグルコースを含むLB培地30mlに接種して、31℃で24時間前培養を遂行した。その後、蒸留水1リットル当たりグルコース50g、KH2PO4 4g、(NH4)2SO4・7H2O 15g、MnSO4・5 H2O 20mg、MgSO4・7 H2O 2g、CaCO3 30g、酵母抽出物2g、L−イソロイシン262mg、L−ロイシン262mg、D−パントテン酸ヘミカルシウム塩425μg、希金属溶液(蒸留水1リットル当たりFeSO4・7H2O 10g、CaCl2 1.35g、ZnSO4・7H2O 2.25g、MnSO4・4 H2O 0.5g、CuSO4・5H2O 1g、(NH4)6Mo7O24・4 H2O 0.106g、Na2B4O7・10 H2O 0.23g、35%HCl 10mlを含む)5mlの成分を有しKOHでpHを8.0で合わせた培地30mlを含んだ250mlバッフルフラスコに、前記前培養液1mlを接種して、31℃で250rpmで48時間培養した。
7−1:組換えベクター(pTrc184ygaZHlrp)の高性能L−バリン生成微生物への導入
実施例2で製作された高性能L−バリン生成微生物VAMF+pKBRilvBNCEDに、前記6−1で製作されたベクターpTrc184ygaZHlrpを導入して、組換え大腸菌(VAMF+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)を製作した。
7−2:L−バリンの生成能測定
前記7−1で製作されたL−バリン生成大腸菌(VAMF+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)を、アンピシリン、クロラムフェニコール及びカナマイシンが、各50μg/ml、30μg/ml 及び40μg/mlが添加されたLB平板培地で選別した。前記形質転換菌株及びVal+pKBRilvBNCED、VAMF+pKBRilvBNCED、Val+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp菌株を5g/lグルコースを含む200mlのLB培地に接種して、31℃で24時間前培養を遂行した。その後、蒸留水1リットル当たりグルコース20g、KH2PO4 2g、(NH4)2SO4・7H2O 20g、MgSO4・7 H2O 0.4g、NaCl 1.6g、酵母抽出物2g、L−イソロイシン262mg、L−ロイシン262mg、D−パントテン酸ヘミカルシウム塩425μg、希金属溶液(蒸留水1リットル当たりFeSO4・7H2O 10g、CaCl2 1.35g、ZnSO4・7H2O 2.25g、MnSO4・4 H2O 0.5g、CuSO4・5H2O 1g、(NH4)6Mo7O24・4 H2O 0.106g、Na2B4O7・10 H2O 0.23g、35%HCl 10mlを含む)5mlの成分で構成された培地1.8リットルを含んだ6.6リットル発酵器(Bioflo 3000,New Brunswick Scientific Co.,Edison,NJ,米国)に前記前培養液を接種して、31℃で培養した。pHは、25%(v/v)NH4OHの自動供給によって6.0に維持され、溶存酸素濃度(dissolved oxygen concentration)は空気を1vvm(air volume/working volume/minute)で供給しながら撹拌速度を1000rpmまで自動調節することで飽和空気(air saturation)の40%以上に維持した。VAMF菌株には、酢酸ナトリウム3g/lを添加した。
Claims (4)
- 大腸菌で、
(a)スレオニンデヒドラターゼをコードするilvA遺伝子、2−イソプロピルマレイン酸シンターゼをコードするleuA遺伝子及び3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするpanB遺伝子を欠失させて、
(b)L−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるため、
(i)lacオペロンリプレッサーをコードするlacI遺伝子を欠失、
(ii)アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムIIIをコードするilvH遺伝子の41番目塩基(G)と50番目塩基(C)をそれぞれAとTに置換してフィードバック阻害(feedback inhibition)を除去、
(iii)アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムIをコードするilvGMEDAオペロンのアテニュエータ及びアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムIIをコードするilvBNオペロンのアテニュエータをtacプロモーターに置換、及び
(iv)ilvB、ilvN、ilvC、ilvE及びilvD遺伝子をすべて含む発現ベクターを導入させて、
(c)配列番号45の分岐鎖アミノ酸エクスポーター(exporter)遺伝子を含む発現ベクター及び配列番号46のlrp遺伝子を含む発現ベクターを導入させて、
(d)aceF、pfkA及びmdh遺伝子を欠失させることを特徴とする、L−バリン高生成能を有する変異大腸菌の製造方法。 - 前記大腸菌が、大腸菌W3110であることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
- 請求項1の方法で作製されることを特徴とする、L−バリン高生成能を有する変異微生物。
- 請求項3のL−バリン生成高生成能を有する変異微生物を培養した後、前記微生物の培養液からL−バリンを回収することを特徴とする、L−バリンの製造方法。
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