JP4790025B2 - 分枝鎖アミノ酸生成能が改善した変異微生物及びそれを使用した分枝鎖アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、分枝鎖アミノ酸生成能が改善した変異微生物及びそれを使用した分枝鎖アミノ酸の製造方法に関するもので、より詳細には、Ｌ−イソロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子及びＤ−パントテン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を弱化または欠失させて、Ｌ−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子をその発現が増加するように変異させて収得したＬ−バリン生成能が改善した変異微生物、及びそれを使用したＬ−バリンの製造方法に関するものである。

現在は、大部分のアミノ酸が無作為突然変異化技法で製造された微生物によって生成されている。これら菌株は、正確な生理代謝特性の把握が難しくて、追加菌株改良が複雑で難しいという短所を有している。それで、特定遺伝子のみを欠失または増幅して必要なアミノ酸を生成するようにするラショナルデザイン技法が求められている。

一方、分枝鎖アミノ酸（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）というのは、９種の必須アミノ酸の中でバリン、ロイシン及びイソロイシンの３種を指称し、大部分のアミノ酸が肝臓で代謝されるのに比べて、分枝鎖アミノ酸は主に筋肉で代謝されて活動時にエネルギー源として使用されるアミノ酸をいう。

現在、分枝鎖アミノ酸のマーケットシェアは全体アミノ酸市場の約１％に過ぎないが、最近分枝鎖アミノ酸が活動時に筋肉の維持及び増量に重要な役割をすることが知られるようになり、非常に早い速度で増加している。特に、Ｌ−バリンの場合、高い還元力を有していて、乳牛のミルク生産能力を高めることが知られるようになり、飼料成分として有用に使用されている。現在まで大部分のＬ−バリンは、ブレビバックテリウム、コリネバックテリウムまたはセラチア属などの菌株から生成されてきたが、最近培養が容易で、分子生物学的技術が発達した大腸菌での生成が報告されている。特に、日本味の素社では無作為突然変異化技法でＬ−バリンに耐性を有する菌株を選別して、２３．４ｇ／ｌのＬ−バリン生成を報告した（米国特許６，７３７，２５５号）。

また、ラショナルデザイン（ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ）方法によるＬ−バリン生成微生物製造が最近、コリネバクテリウム・グルタミカムで報告されたが、二つの遺伝子（ｉｌｖＡ，ｐａｎＢ）を欠失させて、Ｌ−バリン生合成に関与するオペロン（ｉｌｖＢＮＣ）を増幅した後、ｉｌｖＮ遺伝子に存在するフィードバック阻害を除去して、１３０ｍＭのＬ−バリンを生成したという内容が発表された（Ｖｅｒｏｎｉｋａ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５年，第７１巻，２０７頁）。しかし、未だに大腸菌を使用してラショナルデザイン方法でＬ−バリンを生成した例は報告されたことがない。

多様なラショナルデザイン方法の中でインシリコシミュレーション方法、特に代謝回路を通じた分析及び予測技術は、最近、急速に増加するゲノム情報とともにその可能性を示している。特に、各微生物の代謝回路モデルが数学的モデル及び最適化技術などと結合して、遺伝子の除去または追加後に起きる代謝回路の反応を予測することが可能になってきている。また、代謝回路を使用した代謝流れ分析技法は、動的情報を必要としないにもかかわらず細胞の理想的な代謝流れを示し、実際的に細胞の行動を正確に描写して予測することができることが知られている。代謝流れ分析は、生化学反応式の質量数値と細胞造成情報のみを使用して、細胞が到達可能な理想的な代謝流れ空間を求めて、特定の目的関数を最適化方法を通じて最大化したり最小化したりすることを目的とする（細胞成長速度最大化または特定攝動による代謝調節の最小化など）。その他に代謝流れ分析は、一般的に菌株改良を通じて所望する代謝産物の特定遺伝子の致死性を確認するために使用することができ、これを使用して菌株内部の代謝回路特性を把握することができる。また、遺伝子の除去または追加によって起きる代謝回路の流れ変化などを予測するために、代謝流れ分析方法を応用した多様な研究が報告されている。

したがって、当業界では既存の無作為突然変異化技法とは異なり、特定遺伝子の欠失による代謝回路再構成及び必要遺伝子の増幅を通じたラショナルデザイン方法によって分枝鎖アミノ酸の高生成能を有する微生物、特に、Ｌ−バリン高生成能を有する大腸菌の開発が切実に求められている。

それで、本発明者等は、ラショナルデザイン方法によって分枝鎖アミノ酸、特に、Ｌ−バリン高生成能を有する微生物を開発するために鋭意努力した結果、Ｌ−バリン生合成オペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターを強力プロモーターに置換して、前記置換されたプロモーターを含むオペロンを組換えベクターに挿入した後、競争経路に関与する遺伝子であるｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ及びｐａｎＢなどが欠失した大腸菌に導入して、高効率のＬ−バリン生成能が画期的に増加することを確認して本発明を完成した。

結局、本発明の主な目的は、Ｌ−バリン高生成能変異微生物及びその製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は、前記変異微生物を使用したＬ−バリンの製造方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は微生物で、Ｌ−イソロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子及びＤ−パントテン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を弱化または欠失させて、Ｌ−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加するように変異させることを特徴とする、Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物の製造方法を提供する。

本発明は、また、前記方法で製作され、Ｌ−イソロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子及びＤ−パントテン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が弱化または欠失されて、Ｌ−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加するように変異されたことを特徴とする、Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物を提供する。

本発明は、また、（ａ）ｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ及びｐａｎＢが弱化または欠失；（ｂ）ｌａｃＩ遺伝子が欠失；（ｃ）ｉｌｖＨ遺伝子のフィードバック阻害が除去；（ｄ）ｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターが強力プロモーターに置換；（ｅ）ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤ遺伝子と強力プロモーターを含む発現ベクターが導入；及び（ｆ）配列番号４５の分枝鎖アミノ酸エクスポーター遺伝子が増幅または導入されていることを特徴とするＬ−バリン高生成能を有する変異微生物を提供する。

本発明は、また、（ａ）ｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ及びｐａｎＢが弱化または欠失；（ｂ）ｌａｃＩ遺伝子が欠失；（ｃ）ｉｌｖＨ遺伝子のフィードバック阻害が除去；（ｄ）ｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターが強力プロモーターに置換；（ｅ）ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤ遺伝子と強力プロモーターを含む発現ベクターが導入；及び（ｆ）ａｃｅＦ及びｐｆｋＡ遺伝子が弱化または欠失されていることを特徴とするＬ−バリン高生成能を有する変異微生物を提供する。

本発明は、また、（ａ）ｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ及びｐａｎＢが弱化または欠失；（ｂ）ｌａｃＩ遺伝子が欠失；（ｃ）ｉｌｖＨ遺伝子のフィードバック阻害が除去；（ｄ）ｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターが強力プロモーターに置換；（ｅ）ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤ遺伝子と強力プロモーターを含む発現ベクターが導入；及び（ｆ）ａｃｅＦ、ｐｆｋＡ及びｍｄｈ遺伝子が弱化または欠失されていることを特徴とするＬ−バリン高生成能を有する変異微生物を提供する。

本発明は、また、前記Ｌ−バリン生成高生成能を有する変異微生物を培養した後、前記微生物の培養液からＬ−バリンを回収することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造方法を提供する。

本発明の他の特徴及び具現例は、次の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲から、さらに明らかになるだろう。

発明の詳細な説明及び具体的な具現例
一観点で、本発明は微生物で、Ｌ−イソロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子及びＤ−パントテン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を弱化または欠失させて、Ｌ−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加するように変異させることを特徴とする、Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物の製造方法に関するものである。

他の観点で、本発明はＬ−イソロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子及びＤ−パントテン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が弱化または欠失されて、Ｌ−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加するように変異されたことを特徴とする、Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物に関するものである。

本発明において、前記微生物はバクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とし、好ましくは前記バクテリアは、コリネバックテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバックテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及び大腸菌からなる群から選択されることを特徴として、さらに好ましくは大腸菌であることを特徴とする。

本発明において、Ｌ−イソロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子は、ｉｌｖＡ（スレオニンデヒドラターゼを暗号化する遺伝子）であることを特徴とし、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子はｌｅｕＡ（２−イソプロピルマレイン酸シンターゼを暗号化する遺伝子）であることを特徴として、Ｄ−パントテン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子はｐａｎＢ（３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼを暗号化する遺伝子）であることを特徴とする。

本発明において、前記Ｌ−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子をその発現が増加するように変異させるために、次の方法を使用することができる：（ａ）ｌａｃＩ（ｌａｃオペロンリプレッサーを暗号化する遺伝子）遺伝子の欠失；（ｂ）ｉｌｖＨ（アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩＩ）遺伝子のフィードバック阻害（ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）除去；（ｃ）ｉｌｖＧＭＥＤＡ（アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩ）及びｉｌｖＢＮ（アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ）オペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターを強力プロモーターに置換；及び（ｄ）強力プロモーターを含む発現ベクターの導入からなる群から選択されることを特徴とする。

本発明において、前記強力プロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴として、前記強力プロモーターを含む発現ベクターは、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤ遺伝子を含むベクターであることを特徴とし、前記発現ベクターは、ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤベクターであることを特徴とする。

本発明において、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｔｐｉＡ、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｅｐｔＢ、ｇｐｍＡ、ｇｐｍＢ、ｐｔｓＧ、ｍｄｈ、ｐｐｃ、ｐｇｉ、ｇｌｇＣ、ｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ、ｒｉｂＡ、ｆｏｌＥ及びａｃｋＡからなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を追加で弱化または欠失させることを特徴とし、好ましくは、ａｃｅＦ及びｐｆｋＡ遺伝子を追加で弱化または欠失させることを特徴とし、さらに好ましくは、ａｃｅＦ、ｐｆｋＡ及びｍｄｈ遺伝子を追加で弱化または欠失させることを特徴とする。

本発明において、分枝鎖アミノ酸エクスポーター遺伝子を追加で増幅または導入させることを特徴とし、前記分枝鎖アミノ酸エクスポーター遺伝子は、配列番号４３及び配列番号４４のアミノ酸配列を暗号化する塩基配列からなる群から選択されるいずれか一つ以上または、配列番号４５の塩基配列を有することを特徴とする。

本発明において、グローバルレギュレーターであるｌｒｐ遺伝子を追加で増幅または導入させることを特徴とし、前記ｌｒｐ遺伝子は配列番号４６の塩基配列を有することを特徴とする。

また他の観点で、本発明は（ａ）ｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ及びｐａｎＢが弱化または欠失；（ｂ）ｌａｃＩ遺伝子が欠失；（ｃ）ｉｌｖＨ遺伝子のフィードバック阻害が除去；（ｄ）ｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターが強力プロモーターに置換；（ｅ）ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤ遺伝子と強力プロモーターを含む発現ベクターが導入；及び（ｆ）配列番号４５の分枝鎖アミノ酸エクスポーター遺伝子が増幅または導入されていることを特徴とする、Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物に関するものである。

本発明において、前記Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物は、配列番号４６のｌｒｐ遺伝子が追加で増幅または導入されていることを特徴とする。

また他の観点で、本発明は（ａ）ｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ及びｐａｎＢが弱化または欠失；（ｂ）ｌａｃＩ遺伝子が欠失；（ｃ）ｉｌｖＨ遺伝子のフィードバック阻害が除去；（ｄ）ｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターが 強力プロモーターに置換；（ｅ）ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤ遺伝子と強力プロモーターを含む発現ベクターが導入；及び（ｆ）ａｃｅＦ及びｐｆｋＡ遺伝子が弱化または欠失されていることを特徴とする、Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物に関するものである。

本発明において、前記Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物は、配列番号４５の分枝鎖アミノ酸エクスポーター遺伝子が追加で増幅または導入されていることを特徴とし、配列番号４６のｌｒｐ遺伝子が追加で増幅または導入されていることを特徴とする。

また他の観点で、本発明は（ａ）ｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ及びｐａｎＢが弱化または欠失；（ｂ）ｌａｃＩ遺伝子が欠失；（ｃ）ｉｌｖＨ遺伝子のフィードバック阻害が除去；（ｄ）ｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターが強力プロモーターに置換；（ｅ）ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤ遺伝子と強力プロモーターを含む発現ベクターが導入；及び（ｆ）ａｃｅＦ、ｐｆｋＡ及びｍｄｈ遺伝子が弱化または欠失されていることを特徴とする、Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物に関するものである。

本発明において、前記Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物は、配列番号４５の分枝鎖アミノ酸エクスポーター遺伝子が追加で増幅または導入されていることを特徴とし、配列番号４６のｌｒｐ遺伝子が追加で増幅または導入されていることを特徴とする。

また他の観点で、本発明は前記Ｌ−バリン生成高生成能を有する変異微生物を培養した後、前記微生物の培養液からＬ−バリンを回収することを特徴とするＬ−バリンの製造方法に関するものである。

本発明では、Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物（Ｖａｌ）を製造するために、図１に示したように、大腸菌野生菌株Ｗ３１１０からＬ−バリン生合成に関与する酵素の活性を増加させて、Ｌ−イソロイシン生合成に関与する酵素、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素及びＤ−パントテン酸生合成に関与する酵素の活性を弱化または欠失させた。すなわち、Ｌ−バリン生合成オペロンのネーティブプロモーターを強力プロモーターに置換して、Ｌ−バリン生合成経路と競争関係にある経路に関与する遺伝子であるｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ及びｐａｎＢなどを欠失させて製作する。

また、前記製作された変異微生物のＬ−バリン生成能を高めるために、追加で欠失対象遺伝子を選定して製作したＬ−バリン高生成能を有する変異微生物（ＶＡＭＦ）は、図１に現示したように、大腸菌変異菌株ＶａｌからａｃｅＦ、ｍｄｈ及びｐｆｋＡを欠失させて製作する。

現在、大部分のアミノ酸生成微生物が無作為突然変異、または生合成経路の末端酵素の増幅等で製造されている。このような方法はそれぞれ、生成微生物に該当のアミノ酸の耐性を付与して、生合成酵素の濃度を高めることでアミノ酸生成効率を高める効果を有する。しかし、アミノ酸生合成に必要な前駆体の確保（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）に限界があるので、一定水準以上の生成能確保が不可能である。そのため、本発明では、Ｌ−バリンの前駆体確保を容易にするために細胞内代謝流れを調節することで高生成能のＬ−バリン生成微生物を製造することができた。細胞内代謝流れを最適化するために、インシリコシミュレーション方法を使用してピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｃｅＦ）、マレイン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｍｄｈ）、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（ｐｆｋＡ）などを欠失対象遺伝子に選定した。図２は、前記のように製作されたａｃｅＦ、ｍｄｈ及びｐｆｋＡ遺伝子を欠失させた変異微生物ＶＡＭＦの代謝回路を示したものである。

また、アミノ酸のエクスポーターは、該当のアミノ酸の生産に必須であり、特に、Ｌ−バリンの場合、大腸菌がその他菌株に比較してチャージ率が非常に低いので、生産能力を高めるためにはエクスポーターの増幅が要求される。しかし、現在まで大腸菌のＬ−バリンエクスポーターが明らかにされていないので、Ｌ−バリン生産効率向上に限界があった。

ニコール・ケンネルケネクト（Ｎｉｃｏｌｅ Ｋｅｎｎｅｒｋｎｅｃｈｔ）などは、コリネバクテリウム・グルタミカムでＬ−バリンを含めた分枝鎖アミノ酸のエクスポーターの役割をするタンパク質（ＢｒｎＦＥ）を報告した（Ｎｉｃｏｌｅ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００２年，第１８４巻，３９４７頁，米国６，８４１，３６０号Ｂ２）。また、エカテリナ・アレキサンドロブナ・タボリナ（Ｅｋａｔｅｒｉｎａ Ａｌｅｘｓａｎｄｒｏｖｎａ Ｔａｂｏｌｉｎａ）などは、前記同上タンパク質が大腸菌でもＬ−バリンのエクスポーターの役割をすることを報告した（米国特許２００５／０２３９１７５）。

本発明者等は、前記Ｌ−バリンエクスポーターを本発明で製造したＬ−バリン生成変異菌株で確認するために、ＹｇａＺＨタンパク質を暗号化するｙｇａＺＨオペロンをクローニングした。すなわち、大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型にして、大腸菌遺伝体配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用した重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）で、ｙｇａＺＨオペロンを増幅させた。前記増幅されたｙｇａＺＨ遺伝子をＮｃｏＩ／ＫｐｎＩで切断して、ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターにクローニングしてｐＴｒｃ９９ＡｙｇａＺＨを製作し、前記ｐＴｒｃ９９ＡｙｇａＺＨベクターをＢｓｐＨＩ／ＥｃｏＲＶで切断して収得した遺伝子切片を、同一酵素（ＢｓｐＨＩ／ＥｃｏＲＶ）で切断したｐＡＣＹＣ１８４に挿入して、ｙｇａＺＨ遺伝子を過発現させるための発現ベクターであるｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨを製作して、これを前記Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）に導入した場合、エカテリナ・アレキサンドロブナ・タボリナ（Ｅｋａｔｅｒｉｎａ Ａｌｅｘｓａｎｄｒｏｖｎａ Ｔａｂｏｌｉｎａ）などが提案した水準より、Ｌ−バリンの生成能が飛び抜けて増加することを確認した。

また、グローバルレギュレーターであるＬｒｐが、Ｌ−バリン生合成の重要なアイソエンザイムの一つであるアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩＩ酵素をコードするｉｌｖＩＨオペロンの発現を促進するという事実（Ｐｌａｔｋｏ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９０年，第１７２巻，４５６３〜４５７０頁）とＬ−バリンの吸収に関与するトランスポーターをコードするｌｉｖＪ遺伝子の発現を抑制するという事実（Ｈａｎｅｙ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９２年，第１７４巻，１０８−１１５頁）に基づいて本発明者等は、ｌｒｐ遺伝子の増幅がＬ−バリンの生成能を増加させると予想して、ｌｒｐ遺伝子をクローニングした。すなわち、大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型にして、大腸菌遺伝体配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用した重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）でｌｒｐ遺伝子を増幅させた。前記増幅されたｌｒｐ遺伝子をＮｃｏＩ／ＫｐｎＩで切断して、ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターにクローニングしてｐＴｒｃ９９Ａｌｒｐを製作し、前記ｐＴｒｃ９９ＡｌｒｐベクターをＢｓｐＨＩ／ＥｃｏＲＶで切断して収得した遺伝子切片を、同一酵素（ＢｓｐＨＩ／ＥｃｏＲＶ）で切断したｐＡＣＹＣ１８４に挿入してｌｒｐ遺伝子を過発現させるための発現ベクターであるｐＴｒｃ１８４ｌｒｐを製作して、これを前記Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）に導入した場合、Ｌ−バリンの生成能が増加することを確認した。

以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではないということは、当業界で通常の知識を有した者において自明であろう。

下記実施例では、大腸菌Ｗ３１１０由来のＬ−バリン生成微生物に欠失対象遺伝子を導入して、分枝鎖アミノ酸中、Ｌ−バリンを高濃度で製造する方法に対して記載したが、他の大腸菌及び微生物を使用して同一欠失対象遺伝子を導入して、それを使用してＬ−バリンを製造することと、Ｌ−バリンではないＬ−ロイシン及びＬ−イソロイシンを製造することも同様に当業界で通常の知識を有した者において自明であろう。

また、下記実施例では、大腸菌Ｗ３１１０から分離及び精製されたｙｇａＺＨを使用して、分枝鎖アミノ酸中、Ｌ−バリンを高濃度で製造する方法及びｙｇａＺＨを含むベクター製造方法に対して記載したが、他の大腸菌を使用してＬ−バリンエクスポーターを分離及び精製して、それを使用してＬ−バリンを製造することと、Ｌ−バリンではないＬ−ロイシン及びＬ−イソロイシンを製造することも同様に当業界で通常の知識を有した者において自明であろう。

また、下記実施例では、大腸菌来由Ｌ−バリンエクスポーター遺伝子を含む組換えベクターを、大腸菌Ｗ３１１０を基盤にして製造されたＬ−バリン生成微生物（ＷＬＧＢＨＡＢＡ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）に導入して形質転換微生物を製造する方法、及びＬ−バリンを収得する方法に対して記載したが、本発明の組換えベクターをバクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されたＬ−バリン生成能を有する宿主細胞に導入して製造される形質転換された微生物、及びそれらからＬ−バリンを収得することも当業界で通常の知識を有した者において自明であろう。

また、下記実施例では特定培地と培養方法のみを例示したが、文献に報告されたように（Ｌｅｅ等，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．，２００３年，第２６巻，６３頁；Ｌｅｅ等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２年，第５８巻，６６３頁；Ｌｅｅ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００３年，第２５巻，１１１頁；Ｌｅｅ等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００年，第５４巻，２３頁；Ｌｅｅ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００１年，第７２巻，４１頁）、乳清（ｗｈｅｙ）、ＣＳＬ（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｇｕｏｒ）などの糖化液と異なる培地を使用した場合や、硫加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養など多様な方法を使用することも当業界で通常の知識を有したる者において自明であろう。
実施例１：Ｌ−バリン高生成変異微生物の製作及びＬ−バリンの生成能測定
１−１：Ｌ−バリン高生成微生物の製作
１−１−１：ｐＳａｃＨＲ０６の製作
染色体ＤＮＡの特定塩基または塩基の置換のためにバチルススブチリス来由のｓａｃＢ相同組換え技法（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９２年，第１７４巻，５４６２頁）を使用する目的でｐＳａｃＨＲ０６ベクターを製作した（図３）。図３は、ｐＳａｃＨＲ０６ベクターを製作する過程を示したものである。

まず、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）ベクターのアンピシリンに対する耐性特性をカナマイシンに対する耐性特性に置換するために、ｐＵＣ１９ベクターをＮｄｅＩ及びＡｈｄＩで切断して得た１．５ｋｂ切片を、ｐＡＣＹＣ１７７ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をＳｔｕＩで切断して得た１．３ｋｂ切片とＤＮＡ縮合反応を遂行してｐＵＣ１９ＫＭベクターを得た。

次に、前記ｐＵＣ１９ＫＭベクターをＰｖｕＩＩで切断して得た２．５ｋｂ切片とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）ベクターをＰｖｕＩＩで切断して得た４００ｂｐ切片を縮合反応して、ｐＵＣ１９ＫＫＳベクターを得た。以後、前記ベクターにＤＮＡ複製起点の除去を容易いに可能にするために、配列番号１及び２のプライマーとｐＵＣ１９ベクター鋳型を使用してＰＣＲを遂行した。その結果、同一な切断酵素の認識部位を両端末にそれぞれ有していてＤＮＡ複製起点を有するＤＮＡ切片を獲得した。前記切片をＳａｌＩ及びＤｒａＩＩＩで切断して、ｐＵＣ１９ＫＫＳベクターをＳａｌＩ及びＤｒａＩＩＩで切断して得た１．５ｋｂ切片とＤＮＡ縮合反応してｐＵＣ１９Ｋベクターを得た。前記ｐＵＣ１９Ｋベクターにバチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓａｃＢ遺伝子を導入するためにバチルススブチリスのゲノミックＤＮＡ鋳型と配列番号３及び４のプライマーを使用してＰＣＲを遂行して、ｓａｃＢ遺伝子を有するＤＮＡ切片を合成し、前記合成されたＤＮＡ切片とｐＵＣ１９ＫベクターすべてをＸｂａＩ及びＳｐｅＩ酵素で切断して縮合し、ｓａｃＢ遺伝子を有する新しいベクターを製作してそれをｐＳａｃＨＲ０６と命名した。

ｐＳａｃＨＲ０６ベクターは、バチルススブチリス来由のｓａｃＢ遺伝子を有して制限酵素を使用して容易にＤＮＡ複製起点の除去と再縮合反応を遂行することができるので、ｓａｃＢポジチブセレクションに使用可能である。

[配列番号1]pucoriup
5'-gccgtcgacgctagcgcatgcacgcgtgtgcacccatgggacgtcctcactgactcgctgcgctc-3'
[配列番号2]pucorido
5'-ggctcacaacgtggctagcgacgtcgtgcacccatgggttccactgagcgtcagacc-3'
[配列番号3]sacBf
5'-actctctagacgcgggtttgttactgataa-3'
[配列番号4]sacBr
5'-gctagatatcaggatatcggcattttcttt-3'
１−１−２：ｌａｃＩ遺伝子の欠失
Ｌ−バリン生成微生物である大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ ３９９３６）で配列番号５及び６のプライマーを使用したワンステップインアクティベーション方法（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６；９７（１２）巻，６６４０−６６４５頁）を使用して、ｌａｃオペロンのリプレッサーを暗号化する遺伝子で、ラクトース分解を担当するｌａｃオペロンの転写を抑制する機能を有するｌａｃＩ遺伝子を欠失させて、抗生剤耐性を除去した。

[配列番号5] lacI_1stup:
5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttagattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号6] lacI_1stdo:
5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgcacttaacggctgacatggg-3'
１−１−３：ｉｌｖＨのフィードバック阻害の除去
味の素社が出願した特許（米国６，７３７，２５５ Ｂ２）を参考にして、アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩＩをコードする遺伝子であるｉｌｖＨの４１番目塩基（Ｇ）と５０番目塩基（Ｃ）をそれぞれＡとＴで置換し、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ ３９９３６）の染色体ＤＮＡは、公知された方法で分離及び精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９年）。

すなわち、配列番号７及び８と９及び１０のプライマーと、大腸菌Ｗ３１１０ゲノミックＤＮＡ鋳型を使用してそれぞれＰＣＲを遂行した後、収得された二つのＰＣＲ切片を同一濃度で混ぜて鋳型にして、配列番号７及び１０をプライマーに使用してオーバーラッピングＰＣＲを遂行した。前記のような方法で得た１２８０ｂｐのＰＣＲ切片をＰｓｔＩ及びＳａｌＩ酵素で切断して、やはり、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩ酵素で切断したｓａｃＢ相同組換え用ベクターであるｐＳａｃＨＲ０６に挿入した後、シーケンシングして、ｉｌｖＨの４１番目塩基（Ｇ）と５０番目塩基（Ｃ）がそれぞれＡとＴに置換されたことを確認した。

前記収得したベクターをＮｈｅＩ酵素で切断して、複製起点を欠失させた後、セルフライゲーションさせて、前記１−１−２で製作したｌａｃＩ遺伝子が欠失された大腸菌Ｗ３１１０コンピテント細胞（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）にエレクトロポレーションした。次に、ｓａｃＢポジチブセレクション（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９２年，第１７４巻，５４６２頁）方法によってフィードバック阻害が除去された菌株を収得した。

[配列番号7] ilvH1:5'-gactctgcagggtgatcgagactctttggcggttgac-3'
[配列番号8] ilvH2:5'-ggaaaaaaggccaatcacgcggaataacgcgtctgattcattttcgagtaag-3'
[配列番号9] ilvH3:5'-cttactcgaaaatgaatcagacgcgttattccgcgtgattggccttttttcc-3'
[配列番号10] ilvH4:5'-gctccgtcgaccagtttcacaattgccccttgcgtaaa-3'
１−１−４：ｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータのｔａｃプロモーターへの置換
１−１−３で製作されたｌａｃＩ遺伝子とｉｌｖＨのフィードバック阻害が除去された大腸菌Ｗ３１１０で、アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩ及びＩＩの構成的な発現を誘導するために、アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩ及びＩＩをそれぞれ暗号化するｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの転写調節機序に関与するアッテネータを、強力なプロモーターであるｔａｃプロモーターに置換した。

まず、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンアッテネータの置換のために、配列番号１１及び１２と１３及び１４を、それぞれ一対のプライマーと大腸菌Ｗ３１１０ゲノミックＤＮＡ鋳型を使用してＰＣＲを遂行した後、ＰＣＲ切片、ｉｌｖＧａｔｔ１及びｉｌｖＧａｔｔ２をそれぞれ収得した。前記収得された二つのＰＣＲ切片を、それぞれＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ酵素で切断してｐＫＫ２２３−３ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の該当の酵素切断部位にクローニングした後、シーケンシングで塩基配列を確認した後、ＳａｌＩ及びＰｓｔＩ酵素で切断した部位を前記ｐＳａｃＨＲ０６ベクターの該当の酵素切断部位にクローニングして、前記フィードバック阻害除去と同一な方法で、アッテネータを含むネーティブプロモーターをｔａｃプロモーターに置換した。

ｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータ除去のために、配列番号１５及び１６と１７及び１８をそれぞれ一対のプライマーに使用して、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡアッテネータ除去と同一な方法でＰＣＲ及びクローニングした後、前記でｉｌｖＧＭＥＤＡアッテネータが除去された大腸菌Ｗ３１１０コンピテント細胞にエレクトロポレーションした。その結果、ｉｌｖＢＮアッテネータを含むネーティブプロモーターをｔａｃプロモーターに置換することができた。

[配列番号11] ilvGatt1f：5'-gactgtcgacctaacttattggctgtaagctgttctgaggcc-3'
[配列番号12] ilvGatt1r：5'-gctcggatccgaatgttgttcccttcctcgtagttcatcc-3'
[配列番号13] ilvGatt2f：5'-gactgaattcatgaatggcgcacagtgggtggtacatgcg-3'
[配列番号14] ilvGatt2r：5'-gctcctgcagtcaccgctggctaactggatatcttttggg-3'
[配列番号15] ilvBatt1f：5'-gactcgtcgacagagatggtagggcggataa-3'
[配列番号16] ilvBatt1r：5'-gctcggatcccacactgtattatgtcaaca-3'
[配列番号17] ilvBatt2f：5'-gactgaattcatggcaagttcgggcacaac-3'
[配列番号18] ilvBatt2r：5'-gctcactgcagtgcgtcacgaatgctttctt-3'
１−１−５：ｉｌｖＡ、ｐａｎＢ及びｌｅｕＡ遺伝子の欠失
１−１−４で収得されたｌａｃＩ遺伝子とｉｌｖＨのフィードバック阻害除去されてｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンアッテネータのｔａｃプロモーターへの置換されたＷ３１１０で、ｉｌｖＡ、ｐａｎＢ及びｌｅｕＡ遺伝子の欠失させるために、配列番号１９ないし２４プライマーを使用して前記１−１−２で言及したワンステップインアクティベーション方法（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６；９７（１２）巻，６６４０頁）によってｉｌｖＡ（イソロイシン生合成経路の一番目酵素であるスレオニンデヒドラターゼを暗号化する遺伝子）、ｐａｎＢ（パントテン酸生合成に必要な酵素の中で３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼを暗号化する遺伝子）及びｌｅｕＡ（ロイシン生合成に必要な酵素の中で２−イソプロピルマレイン酸シンターゼを暗号化する遺伝子）などの遺伝子を欠失させた。

すなわち、１−１−４で製作されたｌａｃＩ遺伝子が除去されて、ｉｌｖＨのフィードバック阻害が除去され、ｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータを含んだ本来のプロモーターが、強力な転写活性を有するｔａｃプロモーターに置換された大腸菌Ｗ３１１０コンピテント細胞で前記遺伝子３種の欠失を誘導した。

[配列番号19] ilvA1stup:
5'-atggctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgccgaatatttgattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号20] ilvA1stdo:
5'-ctaacccgccaaaaagaacctgaacgccgggttattggtttcgtcgtggccacttaacggctgacatggg-3'
[配列番号21] panB1stup:
5'-atgaaaccgaccaccatctccttactgcagaagtacaaacaggaaaaaaagattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号22] panB1stdo:
5'-ttaatggaaactgtgttcttcgcccggataaacgccggactccacttcagcacttaacggctgacatggg-3'
[配列番号23] leuA1stup:
5'-atgagccagcaagtcattattttcgataccacattgcgcgacggtgaacagattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号24] leuA1stdo:
5'-ttcagaacgtgcaccatggctttggcagatgactcgacaatatcggtagcacttaacggctgacatggg-3'
１−１−６：ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤベクターの製作
配列番号２５ないし３０のプライマーを使用してＬ−バリン生合成経路に必須な遺伝子、すなわち、ｉｌｖＢ（アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ大サブユニットを暗号化する遺伝子）、ｉｌｖＮ（アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ小サブユニットを暗号化する遺伝子）、ｉｌｖＣ（アセトヒドロキシ酸イソメロレラクターゼを暗号化する遺伝子）、ｉｌｖＥ（分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼを暗号化する遺伝子）及びｉｌｖＤ（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを暗号化する遺伝子）などを順次にｐＫＫ２２３−３発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にクローニングして、ｐＫＫｉｌｖＢＮＣＥＤベクターを収得して、シーケンシングで塩基配列を確認した。前記ｐＫＫｉｌｖＢＮＣＥＤベクターをＰｃｉＩ及びＳｐｈＩ酵素で切断した９．０ｋｂ切片と、ｐＢＲ３２２ベクターをＰｃｉＩ及びＳｐｈＩ酵素で切断した１．９ｋｂ切片をライゲーションしてｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤベクターを最終的に収得した（図４）。

[配列番号25] ilvBNf：5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'
[配列番号26] ilvBNr：5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'
[配列番号27] ilvCf：5'-agtgctgcagacgaggaatcaccatggctaac-3'
[配列番号28] ilvCrSX：5'-gctcctgcagtctagagctagcgagctcttaacccgc-3'
[配列番号29] ilvEDepfs：5'-actcgagctctttccacgtctgctcaatgaatat-3'
[配列番号30] ilvEDr：5'-tacgtctagattaaccccccagtttcgatttatc-3'
１−１−７：Ｌ−バリン生成微生物の製作
前記１−１−１ないし１−１−５の過程を通じてｉｌｖＧＭＥＤＡ及びｉｌｖＢＮオペロンのアッテネータを含むネーティブプロモーターがｔａｃプロモーターに置換されて、ｉｌｖＨのフィードバック阻害が除去されて、ｌａｃＩ、ｉｌｖＡ、ｐａｎＢ及びｌｅｕＡ遺伝子が欠失された大腸菌Ｗ３１１０菌株に、前記１−１−６で製作したｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤベクターを導入してＬ−バリン生成微生物（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）を製作した。
１−２：Ｌ−バリンの生成能測定
前記１−１で製作されたＬ−バリン生成微生物（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）各５０μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌが添加されたＬＢ平板培地で選別した。この形質転換菌株を５ｇ／ｌグルコースを含むＬＢ培地３０ｍｌに接種して、３１℃で２４時間前培養を遂行した。その後、蒸留水１リットル当たりグルコース５０ｇ 、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ 、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １５ｇ 、ＭｎＳＯ_４・５ Ｈ_２Ｏ ２０ｍｇ、ＭｇＳＯ_４・７ Ｈ_２Ｏ ２ｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ、酵母抽出物２ｇ、Ｌ−イソロイシン２６２ｍｇ、Ｌ−ロイシン２６２ｍｇ、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム塩４２５μｇ 、希金属溶液（蒸留水１リットル当たりＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ_２ １．３５ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２．２５ｇ、ＭｎＳＯ_４・４ Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ １ｇ、（ＮＨ_４）６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４ Ｈ_２Ｏ ０．１０６ｇ、Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０ Ｈ_２Ｏ ０．２３ｇ、３５％ＨＣｌ １０ｍｌを含む）５ｍｌの成分を有しＫＯＨでｐＨを８．０で合わせた培地３０ｍｌを含んだ２５０ｍｌバッフルフラスコに、前記前培養液１ｍｌを接種して、３１℃で２５０ｒｐｍで４８時間培養した。

前記培地を採取して、それから生成されるＬ−バリンの濃度をＨＰＬＣで測定した。その結果、表１に示したように、Ｗ３１１０野生菌株では生成されなかったＬ−バリンが本発明のＬ−バリン生成微生物（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）では、３．７３ｇ／ｌの濃度で生成された。前記の結果から、本発明のアッテネータを含むネーティブプロモーターの強力ｔａｃプロモーターへの置換、競争遺伝子欠失が、Ｌ−バリンの生成性向上に重要な役割をするということが分かった。

実施例２：インシリコシミュレーション方法による欠失対象遺伝子選定
前記１−１で製作されたＬ−バリン生成微生物（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）のＬ−バリン生成能をさらに向上させるために、インシリコシミュレーション方法を使用して、代謝流れをＬ−バリン生成に合うように最適化するために導入する欠失対象遺伝子を選定した。本実施例のインシリコシミュレーション方法は、本出願人の特許（ＷＯ２００６／１０７１２７）に記載された方法を参考にして各遺伝子の組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に対して複合遺伝子変異菌株（ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ ｍｕｔａｎｔ）に対するシミュレーションを実施して予測されたＬ−バリン生産速度を比較して一番高い候補遺伝子をスクリーニングした。
２−１：Ｖａｌ菌株に基づいた代謝回路の構築
本発明では、Ｌ−バリンを生成するための大腸菌変異微生物の新しい代謝流れ分析システムを構築した。前記システムは、大腸菌の代謝回路を大部分含んでいて、実施例１で製作されたＬ−バリン生成微生物（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）の培地条件を代謝回路上にすべて反映した。前記構築した代謝回路を使用して遺伝子一つまたはそれ以上の組み合わせを作って、そのような候補遺伝子を代謝流れ分析を使用してＬ−バリンを生成しようとする対象菌株でシミュレーション上に不活性化させた時、比増殖速度と有用物質の形成収率を予測して効率が一番高い遺伝子をスクリーニングした。
２−２：複合遺伝子変異微生物のシミュレーション
前記２−１のように構築された代謝回路を数学的に表現するためにすべての代謝産物、該代謝産物の代謝経路及び前記代謝経路での化学量論マトリックス（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ）（Ｓ_ｉｊ，ｊ番目反応でｉ番目代謝産物の時間による化学量論係数）を使用して、代謝流れベクター（ν_ｊ，ｊ番目代謝反応の代謝流れ）を計算することができ、時間による代謝産物濃度Ｘの変化はすべての代謝反応の流れの合計で現わすことができる。また、時間によるＸの変化量が一定であると仮定すると、すなわち準正常状態仮定下で、時間による代謝産物濃度の変化量は、下の数式１で定義することができる。

（ここで、Ｓ・ν：時間によるＸの変化量、Ｘ：代謝産物の濃度、ｔ：時間）
各遺伝子の組み合わせに対して、複合遺伝子変異微生物に対するシミュレーションを実施しようとすると、多様な組み合わせの突然変異に対するシミュレーションを遂行しなければならない。まず、インシリコ遺伝子ノックアウトシミュレーションを使用して単一遺伝子を欠失する場合、Ｌ−バリン生成速度が一番高い遺伝子群を捜し出した（表２）。前記シミュレーションは、ｈｔｔｐ：／／ｍｂｅｌ．ｋａｉｓｔ．ａｃ．ｋｒ／を通じてダウンロードすることができるＭｅｔａＦｌｕｘＮｅｔを使用して遂行した（Ｌｅｅ等，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００３年，第１９巻，２１４４頁）。

すなわち、表２に示したように、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｔｐｉＡ、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｅｐｔＢ、ｇｐｍＡ、ｇｐｍＢ、ｐｔｓＧ、ｍｄｈ、ｐｐｃ、ｐｇｉ、ｇｌｇＣ、ｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ、ｒｉｂＡ、ｆｏｌＥ及びａｃｋＡからなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を欠失させる場合、単一遺伝子を欠失する場合にも実施例１で製作された基準菌株であるＬ−バリン生成微生物（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）に比較してＬ−バリン生成速度が顕著に高くなることが分かった。

本発明者は、前記遺伝子の最適組み合わせを捜し出して、Ｌ−バリン生成速度及び生成効率をさらに高めようと、報告されている順次的な（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）複合遺伝子シミュレーション方法を使用して（Ｓｅｇｒｅ等，ＰＮＡＳ，２００２年，第９９巻，１５１１２−１５１１７頁）、複合遺伝子変異微生物に対するシミュレーションを実施した。すなわち、単一遺伝子欠失によって予測されたＬ−バリン生成速度を比較して一番高い候補遺伝子をスクリーニングした（表２）。

すなわち、一番目シミュレーション上でスクリーニングされた候補遺伝子をシミュレーション上で不活性化させた状態で、また他の単一遺伝子欠失によって予測されたＬ−バリン生成速度を比較して一番高い候補遺伝子をスクリーニングして、このように決定された候補遺伝子もシミュレーション上で不活性化させた状態で、次の単一遺伝子欠失によるＬ−バリン生成速度を比較して、最高のＬ−バリン収率を示す組み合わせをスクリーニングした（表２及び図５）。

図５は、順次処理方式を使用して三番目までの欠失によるＬ−バリン生成速度と細胞成長速度間の関係を図示したもので、その具体的な値は下の表２に示した。

表２に示したように、目的の代謝回路に該当する遺伝子組み合わせを詳しく見た結果、単一遺伝子欠失時にも基本菌株より高い生成速度を示し、ａｃｅＥ及びａｃｅＦ及びｌｐｄＡを欠失させた変異微生物のＬ−バリン生成速度が一番高いことが分かった。順次的シミュレーションのための遺伝子は、ａｃｅＥ及びａｃｅＦ及びｌｐｄＡ遺伝子中で、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの役割をする遺伝子中で酵素活性が一番高い（Ｌｅｅ等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００４年，第６５巻，５６−６０頁）ことが知られているａｃｅＦ遺伝子を一番目遺伝子欠失対象に選択した。

この中で遺伝子欠失シミュレーションは、ａｃｅＦを基本にして、他の候補遺伝子を追加で欠失させた時をシミュレーションした。その結果、表２に示したように、ａｃｅＦとｔｐｉＡ欠失時に最高のＬ−バリン生成速度を示した。しかし、ｔｐｉＡ遺伝子を欠失させる場合、表２に示したように、細胞成長速度が大きく減少することが予測されて、二番目にＬ−バリン生成速度が速いｐｆｋＡ及びＢを候補遺伝子に決定し、その中の６−ホスホフルクトキナーゼ−１の活性中で９０％を占めているｐｆｋＡを最終二番目欠失対象遺伝子に選択した（Ｄａｌｄａｌ Ｆ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８３年，第１６８巻，２８５−３０５頁）。

最終的にａｃｅＦとｐｆｋＡを基本にして三重遺伝子欠失シミュレーション結果、ｍｄｈ欠失時に最高のＬ−バリン生成速度を示したので、三番目遺伝子欠失対象にｍｄｈを選択した。一方、追加的な遺伝子欠失シミュレーションでＬ−バリン生成速度を高める候補群を捜すことはできるが、表２の予測成長速度が遺伝子欠失によって減少したので、追加的な遺伝子欠失シミュレーションは実施しなかった。それで、前記インシリコシミュレーション結果を土台に最終的にａｃｅＦ及びｐｆｋ及びｍｄｈを欠失対象遺伝子に選定した。
実施例３：ａｃｅＦ、ｐｆｋ及びｍｄｈの追加欠失及びＬ−バリン生成能測定
３−１：ａｃｅＦ、ｍｄｈ及びｐｆｋＡの追加欠失
前記１−１−７で製作されたＬ−バリン生成微生物で、前記実施例２で選定された欠失対象遺伝子を欠失させて高性能Ｌ−バリン生成微生物（ＶＡＭＦ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）を製作した。

配列番号３１ないし３６プライマーを使用して実施例１で開示したワンステップインアクティベーション方法（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６；９７（１２）卷，６６４０頁）によって、ａｃｅＦ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼを暗号化する遺伝子）、ｍｄｈ（マレイン酸デヒドロゲナーゼを暗号化する遺伝子）及びｐｆｋＡ（ホスホフルクトキナーゼを暗号化する遺伝子）などの遺伝子を欠失させた。すなわち、実施例１−１−５で製作された大腸菌Ｗ３１１０変異微生物で前記遺伝子３種を欠失させた後、実施例１−１−６で製作されたｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤベクターを導入して高性能Ｌ−バリン生成微生物（ＶＡＭＦ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）を製作した。

[配列番号31] aceF1stup:
5'-ttgaagccgaacagtcgctgatcaccgtagaaggcgacaaagcctctatggattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号32] aceF1stdo:
5'-aaggagagagaaatcggcagcatcagacgcggcacgaactctttaccattcacttaacggctgacatggga-3'
[配列番号33] mdh1stup:
5'-atgaaagtcgcagtcctcggcgctgctggcggtattggccaggcgcttgcgattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号34] mdh1stdo:
5'-ttacttattaacgaactcttcgcccagggcgatatctttcttcagcgtatcacttaacggctgacatggga-3'
[配列番号35] pfkA1stup:
5'-atgattaagaaaatcggtgtgttgacaagcggcggtgatgcgccaggcatgattgcagcattacacgtcttg-3'
[配列番号36] pfkA1stdo:
5'-ttaatacagttttttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgctcacttaacggctgacatggga-3'
３−２：Ｌ−バリンの生成能測定
前記３−１で製作されたＬ−バリン生成微生物（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）をアンピシリン、クロラムフェニコール各５０μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌが添加されたＬＢ平板培地で選別した。この形質転換菌株を５ｇ／ｌグルコースを含むＬＢ培地３０ｍｌに接種して、３１℃で２４時間前培養を遂行した。その後、蒸留水１リットル当たりグルコース５０ｇ 、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ 、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １５ｇ 、ＭｎＳＯ_４・５ Ｈ_２Ｏ ２０ｍｇ、ＭｇＳＯ_４・７ Ｈ_２Ｏ ２ｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ、酵母抽出物２ｇ、Ｌ−イソロイシン２６２ｍｇ、Ｌ−ロイシン２６２ｍｇ、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム塩４２５μｇ 、希金属溶液（蒸留水１リットル当たりＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ_２ １．３５ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２．２５ｇ、ＭｎＳＯ_４・４ Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ １ｇ、（ＮＨ_４）６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４ Ｈ_２Ｏ ０．１０６ｇ、Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０ Ｈ_２Ｏ ０．２３ｇ、３５％ＨＣｌ １０ｍｌを含む）５ｍｌの成分を有しＫＯＨでｐＨを８．０で合わせた培地３０ｍｌを含んだ２５０ｍｌバッフルフラスコに、前記前培養液１ｍｌを接種して、３１℃で２５０ｒｐｍで４８時間培養した。ＶＡＭＦ菌株には、酢酸ナトリウム３ｇ／ｌを添加した。

前記培地を採取して、それから生成されるＬ−バリンの濃度をアミノ酸分析機（Ｓｙｋａｍ Ｓ４３３；Ｓｙｋａｍ ＧｍｂＨ、Ｅｒｅｓｉｎｇ，ドイツ）で測定した。その結果、表３に示したように、欠失対象遺伝子の欠失導入前の生成微生物で３．７３ｇ／ｌの濃度を示し、欠失対象遺伝子（ａｃｅＦ、ｍｄｈ及びｐｆｋＡ）を追加欠失させたＬ−バリン生成微生物で生成されたＬ−バリンの濃度は、４．２２ｇ／ｌで、欠失対象遺伝子の欠失を導入しないＬ−バリン生成微生物（３．７３ｇ／ｌ）に比較して約１３．１％増加した。このような結果から、欠失対象遺伝子導入による代謝流れ操作がＬ−バリンの生成能向上に重要な役割をするということが分かった。

実施例４：Ｌ−バリン生成微生物に大腸菌のｙｇａＺＨオペロンを含む組換えベクターの導入及びＬ−バリンの生成能測定
４−１：大腸菌のｙｇａＺＨオペロンを含む組換えベクター（ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨ）の製作
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ ３９９３６）の染色体ＤＮＡを公知された方法で分離及び精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）。前記精製された遺伝体配列を鋳型にして、配列番号３７及び３８をプライマーに使用して、９５℃で２０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分２０秒間伸張を一周期にして、総２４周期反復しながらＰＣＲを遂行して、ＰＣＲ切片を収得した。

[配列番号37] ygaZHf：5'-actaccatggaaagccctactccaca-3'
[配列番号38] ygaZHr：5'-gctcggtaccttatataatcgccatcactt-3'
前記増幅されたＰＣＲ切片（ｙｇａＺＨ遺伝子）をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで切断して、ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にクローニングしてｐＴｒｃ９９ＡｙｇａＺＨを製作して、前記ｐＴｒｃ９９ＡｙｇａＺＨベクターをＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＶで切断して収得した遺伝子切片を、同一酵素（ＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＶ）で切断したｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に挿入して、ｙｇａＺＨ遺伝子を発現させるための発現ベクターであるｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨを製作した（図６）。
４−２：組換えベクター（ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨ）のＬ−バリン生成微生物への導入
実施例１で製作されたＬ−バリン生成微生物Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤに、前記４−１で製作されたベクターｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨを導入して、組換え大腸菌（Ｖａｌ＋ｐＫＢｒｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨ）を製作した。
４−３：Ｌ−バリンの生成能測定
前記４−２で製作されたＬ−バリン生成大腸菌（Ｖａｌ＋ｐＫＢｒｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨ）を、アンピシリン、クロラムフェニコール各５０μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌが添加されたＬＢ平板培地で選別した。この形質転換菌株を５ｇ／ｌグルコースを含むＬＢ培地３０ｍｌに接種して、３１℃で２４時間前培養を遂行した。その後、蒸留水１リットル当たりグルコース５０ｇ 、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ 、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １５ｇ 、ＭｎＳＯ_４・５ Ｈ_２Ｏ ２０ｍｇ、ＭｇＳＯ_４・７ Ｈ_２Ｏ ２ｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ、酵母抽出物２ｇ、Ｌ−イソロイシン２６２ｍｇ、Ｌ−ロイシン２６２ｍｇ、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム塩４２５μｇ 、希金属溶液（蒸留水１リットル当たりＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ_２ １．３５ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２．２５ｇ、ＭｎＳＯ_４・４ Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ １ｇ、（ＮＨ_４）６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４ Ｈ_２Ｏ ０．１０６ｇ、Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０ Ｈ_２Ｏ ０．２３ｇ、３５％ＨＣｌ １０ｍｌを含む）５ｍｌの成分を有しＫＯＨでｐＨを８．０で合わせた培地３０ｍｌを含んだ２５０ｍｌバッフルフラスコに、前記前培養液１ｍｌを接種して、３１℃で２５０ｒｐｍで４８時間培養した。

前記培地を採取して、それから生成されるＬ−バリンの濃度をアミノ酸分析機で測定した。その結果、表４に示したようにＶａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤと比較して、エクスポーターを導入させたＶａｌ＋ｐＫＢｒｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨの場合、Ｌ−バリンの生成が増加するということが分かった。

前記のような結果から、ｙｇａＺＨ遺伝子の過発現がＬ−バリンの生成性向上に重要な役割をするということが分かった。

実施例５：Ｌ−バリン生成微生物に大腸菌のｌｒｐ遺伝子を含む組換えベクターの導入及びＬ−バリンの生成能測定
５−１：大腸菌のｌｒｐ遺伝子を含む組換えベクター（ｐＴｒｃ１８４ｌｒｐ）の製作
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを公知された方法で分離及び精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９年）。前記精製された遺伝体配列を鋳型にして、配列番号３９及び４０をプライマーに使用して、９５℃で２０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分２０秒間伸張を一周期にして、総２４周期反復しながらＰＣＲを遂行して、ＰＣＲ切片を収得した。

[配列番号39] lrpf：5'-actgccatggtagatagcaagaagcgcc-3'
[配列番号40] lrpr：5'-gctcggtaccttagcgcgtcttaataacca-3'
前記増幅されたＰＣＲ切片（ｌｒｐ遺伝子）をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで切断して、ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にクローニングしてｐＴｒｃ９９Ａｌｒｐを製作して、前記ｐＴｒｃ９９ＡｌｒｐベクターをＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＶで切断して収得した遺伝子切片を、同一酵素（ＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＶ）で切断したｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に挿入してｌｒｐ遺伝子を発現させるための発現ベクターであるｐＴｒｃ１８４ｌｒｐを製作した（図７）。
５−２：組換えベクター（ｐＴｒｃ１８４ｌｒｐ）のＬ−バリン生成微生物への導入
実施例１で製作されたＬ−バリン生成微生物Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤに、前記５−１で製作されたベクターｐＴｒｃ１８４ｌｒｐを導入して、組換え大腸菌（Ｖａｌ＋ｐＫＢｒｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨ）を製作した。
５−３：Ｌ−バリンの生成能測定
前記５−１で製作されたＬ−バリン生成大腸菌（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｌｒｐ）を、アンピシリン、クロラムフェニコール各５０μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌが添加されたＬＢ平板培地で選別した。この形質転換菌株を５ｇ／ｌグルコースを含むＬＢ培地３０ｍｌに接種して、３１℃で２４時間前培養を遂行した。その後、蒸留水１リットル当たりグルコース５０ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １５ｇ、ＭｎＳＯ_４・５ Ｈ_２Ｏ ２０ｍｇ、ＭｇＳＯ_４・７ Ｈ_２Ｏ ２ｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ、酵母抽出物２ｇ、Ｌ−イソロイシン２６２ｍｇ、Ｌ−ロイシン２６２ｍｇ、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム塩４２５μｇ、希金属溶液（蒸留水１リットル当たりＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ_２ １．３５ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２．２５ｇ、ＭｎＳＯ_４・４ Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ １ｇ、（ＮＨ_４）６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４ Ｈ_２Ｏ ０．１０６ｇ、Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０ Ｈ_２Ｏ ０．２３ｇ、３５％ＨＣｌ １０ｍｌを含む）５ｍｌの成分を有しＫＯＨでｐＨを８．０で合わせた培地３０ｍｌを含んだ２５０ｍｌバッフルフラスコに、前記前培養液１ｍｌを接種して、３１℃で２５０ｒｐｍで４８時間培養した。

前記培地を採取して、それから生成されるＬ−バリンの濃度をアミノ酸分析機で測定した。その結果、表５に示したようにＶａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤと比較して、ｌｒｐ遺伝子を導入させたＶａｌ＋ｐＫＢｒｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｌｒｐの場合、Ｌ−バリンの生成が増加することが分かった。

前記のような結果から、ｌｒｐ遺伝子の過発現がＬ−バリンの生成性向上に重要な役割をするということが分かった。

実施例６：Ｌ−バリン生成微生物に大腸菌のｙｇａＺＨオペロンとｌｒｐ遺伝子を同時に含む組換えベクターの導入及びＬ−バリンの生成能測定
６−１：大腸菌のｙｇａＺＨオペロンとｌｒｐ遺伝子を同時に含む組換えベクター（ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐ）の製作
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを公知された方法で分離及び精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９年）。前記精製された遺伝体配列を鋳型にして、配列番号４１及び４２をプライマーに使用して、９５℃で２０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分２０秒間伸張を一周期にして、総２４周期反復しながらＰＣＲを遂行して、ＰＣＲ切片を収得した。

[配列番号41] lrpacfb：5'-atgcggatccgaacagtgatgtttcagggt-3'
[配列番号42] lrpacrp：5'-atctctgcaggttccgtgttagcgcgtctt-3'
前記増幅されたＰＣＲ切片（ｌｒｐ遺伝子）をＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断した後、前記４−１で製作されたベクターｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨを同一酵素（ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩ）で切断して収得したｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨの遺伝子切片に挿入して、ｙｇａＺＨオペロンとｌｒｐ遺伝子を同時に含む組換えベクターｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐを製作した（図８）。
６−２：組換えベクター（ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐ）のＬ−バリン生成微生物への導入
実施例１で製作されたＬ−バリン生成微生物Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤに、前記６−１で製作されたベクターｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐを導入して、組換え大腸菌（Ｖａｌ＋ｐＫＢｒｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐ）を製作した。
６−３：Ｌ−バリンの生成能測定
前記６−２で製作されたＬ−バリン生成大腸菌（Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐ）を、アンピシリン、クロラムフェニコール各５０μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌが添加されたＬＢ平板培地で選別した。この形質転換菌株を５ｇ／ｌグルコースを含むＬＢ培地３０ｍｌに接種して、３１℃で２４時間前培養を遂行した。その後、蒸留水１リットル当たりグルコース５０ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １５ｇ、ＭｎＳＯ_４・５ Ｈ_２Ｏ ２０ｍｇ、ＭｇＳＯ_４・７ Ｈ_２Ｏ ２ｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ、酵母抽出物２ｇ、Ｌ−イソロイシン２６２ｍｇ、Ｌ−ロイシン２６２ｍｇ、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム塩４２５μｇ、希金属溶液（蒸留水１リットル当たりＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ_２ １．３５ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２．２５ｇ、ＭｎＳＯ_４・４ Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ １ｇ、（ＮＨ_４）６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４ Ｈ_２Ｏ ０．１０６ｇ、Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０ Ｈ_２Ｏ ０．２３ｇ、３５％ＨＣｌ １０ｍｌを含む）５ｍｌの成分を有しＫＯＨでｐＨを８．０で合わせた培地３０ｍｌを含んだ２５０ｍｌバッフルフラスコに、前記前培養液１ｍｌを接種して、３１℃で２５０ｒｐｍで４８時間培養した。

前記培地を採取して、それから生成されるＬ−バリンの濃度をアミノ酸分析機で測定した。その結果、表６に示したようにＶａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ、Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨ、Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｌｒｐ、Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐと比較して、ｙｇａＺＨオペロンとｌｒｐを同時に導入させたＶａｌ＋ｐＫＢｒｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐの場合、Ｌ−バリンの生成が増加することが分かった。

前記のような結果から、ｙｇａＺＨオペロンとｌｒｐ遺伝子の同時過発現がＬ−バリンの生成性向上に重要な役割をすることが分かった。

実施例７：ａｃｅＦ、ｐｆｋＡ及びｍｄｈが追加欠失された高性能Ｌ−バリン生成微生物（ＶＡＭＦ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ）に大腸菌のｙｇａＺＨオペロンとｌｒｐ遺伝子を同時に含む組換えベクターの導入及びＬ−バリンの生成能測定
７−１：組換えベクター（ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐ）の高性能Ｌ−バリン生成微生物への導入
実施例２で製作された高性能Ｌ−バリン生成微生物ＶＡＭＦ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤに、前記６−１で製作されたベクターｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐを導入して、組換え大腸菌（ＶＡＭＦ＋ｐＫＢｒｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐ）を製作した。
７−２：Ｌ−バリンの生成能測定
前記７−１で製作されたＬ−バリン生成大腸菌（ＶＡＭＦ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐ）を、アンピシリン、クロラムフェニコール及びカナマイシンが、各５０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ 及び４０μｇ／ｍｌが添加されたＬＢ平板培地で選別した。前記形質転換菌株及びＶａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ、ＶＡＭＦ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ、Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐ菌株を５ｇ／ｌグルコースを含む２００ｍｌのＬＢ培地に接種して、３１℃で２４時間前培養を遂行した。その後、蒸留水１リットル当たりグルコース２０ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ２ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２０ｇ、ＭｇＳＯ_４・７ Ｈ_２Ｏ ０．４ｇ、ＮａＣｌ １．６ｇ、酵母抽出物２ｇ、Ｌ−イソロイシン２６２ｍｇ、Ｌ−ロイシン２６２ｍｇ、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム塩４２５μｇ、希金属溶液（蒸留水１リットル当たりＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ_２ １．３５ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２．２５ｇ、ＭｎＳＯ_４・４ Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ １ｇ、（ＮＨ_４）６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４ Ｈ_２Ｏ ０．１０６ｇ、Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０ Ｈ_２Ｏ ０．２３ｇ、３５％ＨＣｌ １０ｍｌを含む）５ｍｌの成分で構成された培地１．８リットルを含んだ６．６リットル発酵器（Ｂｉｏｆｌｏ ３０００，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，米国）に前記前培養液を接種して、３１℃で培養した。ｐＨは、２５％（ｖ／ｖ）ＮＨ_４ＯＨの自動供給によって６．０に維持され、溶存酸素濃度（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）は空気を１ｖｖｍ（ａｉｒ ｖｏｌｕｍｅ／ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ）で供給しながら撹拌速度を１０００ｒｐｍまで自動調節することで飽和空気（ａｉｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）の４０％以上に維持した。ＶＡＭＦ菌株には、酢酸ナトリウム３ｇ／ｌを添加した。

前記培地中のグルコースをグルコース分析器（モデル２７００ ＳＴＡＴ，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｏｈｉｏ，米国）で測定して、グルコースがすべて消耗した時に前記培地を採取して、それから生成されるＬ−バリンの濃度をアミノ酸分析機で測定した。その結果、表７に示したようにＶａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ菌株にａｃｅＦ、ｐｆｋＡ及びｍｄｈの追加欠失を導入した時のＬ−バリンの生成増加効果（４５．５％）より、Ｖａｌ＋ｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤ＋ｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐ菌株にａｃｅＦ、ｐｆｋＡ及びｍｄｈの追加欠失を導入した時のＬ−バリンの生成増加効果（１２６．７％）が、ずっと大きいことが分かる。

前記のような結果から、ａｃｅＦ、ｐｆｋＡ及びｍｄｈの追加欠失による代謝流れ調節効果が、エクスポーター（ｙｇａＺＨオペロン）とグローバルレギュレーター（ｌｒｐ遺伝子）の同時過発現時にさらに上昇することが分かった。また、ａｃｅＦ、ｐｆｋＡ及びｍｄｈの追加欠失による代謝流れ調節効果とエクスポーター（ｙｇａＺＨオペロン）、グローバルレギュレーター（ｌｒｐ遺伝子）の同時過発現効果がお互いにシナジー効果を発生して、Ｌ−バリン生成増加にさらに効果的であることが分かった。

以上で詳しく説明して立証したように、本発明のＬ−バリン高生成能を有する変異微生物の製造方法は、既存の無作為突然変異技法とは異なり、特定遺伝子の欠失による代謝回路再構成及び必要遺伝子の増幅を通じたラショナルデザイン方法によって、分枝鎖アミノ酸の高生成能を有する微生物を効果的に提供することができ、本発明による変異微生物は、部位特異的突然変異方法と代謝流れ操作によって分枝鎖アミノ酸を高効率で生成することができる。特に、分枝鎖アミノ酸の中でＬ−バリンを高効率で生成することができ、本発明の変異微生物はＬ−バリンの産業的生成微生物として有用である。

以上で、本発明内容の特定部分を詳しく記述したように、当業界の通常の知識を有した者において、このような具体的技術は単に好ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されるのではないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義される。

大腸菌野生菌株Ｗ３１１０から目的遺伝子のみを操作してＬ−バリン生成微生物を製作して、前記生成微生物に欠失対象遺伝子の欠失を導入する過程を示した図である。 大腸菌Ｌ−バリン生成微生物からａｃｅＦ、ｍｄｈ及びｐｆｋＡ遺伝子を欠失させた変異微生物ＶＡＭＦの代謝回路を示した図である。 ｓａｃＢ相同組換えベクターｐＳａｃＨＲ０６の製作過程及び遺伝子地図を示した図である。 ｉｌｖＢＮＣＥＤ遺伝子を含む組換えベクターｐＫＢＲｉｌｖＢＮＣＥＤの製作過程及び遺伝子地図を示した図である。 インシリコシミュレーション結果を示した図で、Ａは一番目遺伝子欠失による細胞成長速度とＬ−バリン生成速度との関係、Ｂは二番目遺伝子欠失による細胞成長速度とＬ−バリン生成速度との関係及びＣは三番目遺伝子欠失による細胞成長速度とＬ−バリン生成速度との関係を図示したものである。 ｙｇａＺＨ遺伝子を含む組換えベクターｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨの遺伝子地図を示した図である。 ｌｒｐ遺伝子を含む組換えベクターｐＴｒｃ１８４ｌｒｐの遺伝子地図を示した図である。 ｙｇａＺＨ遺伝子とｌｒｐ遺伝子を同時に含む組換えベクターｐＴｒｃ１８４ｙｇａＺＨｌｒｐの遺伝子地図を示した図である。

Claims (4)

1. 大腸菌で、
   （ａ）スレオニンデヒドラターゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子、２−イソプロピルマレイン酸シンターゼをコードするｌｅｕＡ遺伝子及び３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするｐａｎＢ遺伝子を欠失させて、
   （ｂ）Ｌ−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるため、
   （ｉ）ｌａｃオペロンリプレッサーをコードするｌａｃＩ遺伝子を欠失、
   （ｉｉ）アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩＩをコードするｉｌｖＨ遺伝子の４１番目塩基（Ｇ）と５０番目塩基（Ｃ）をそれぞれＡとＴに置換してフィードバック阻害（ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を除去、
   （ｉｉｉ）アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩをコードするｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのアテニュエータ及びアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩをコードするｉｌｖＢＮオペロンのアテニュエータをｔａｃプロモーターに置換、及び
   （ｉｖ）ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤ遺伝子をすべて含む発現ベクターを導入させて、
   （ｃ）配列番号４５の分岐鎖アミノ酸エクスポーター（ｅｘｐｏｒｔｅｒ）遺伝子を含む発現ベクター及び配列番号４６のｌｒｐ遺伝子を含む発現ベクターを導入させて、
   （ｄ）ａｃｅＦ、ｐｆｋＡ及びｍｄｈ遺伝子を欠失させることを特徴とする、Ｌ−バリン高生成能を有する変異大腸菌の製造方法。
2. 前記大腸菌が、大腸菌Ｗ３１１０であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
3. 請求項１の方法で作製されることを特徴とする、Ｌ−バリン高生成能を有する変異微生物。
4. 請求項３のＬ−バリン生成高生成能を有する変異微生物を培養した後、前記微生物の培養液からＬ−バリンを回収することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造方法。

Images