JP2005333855A - ピルビン酸の製造方法及びl−バリンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ピルビン酸生産能を有し、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を用いてピルビン酸を生産する。また、L−バリン生産能を有し、リボヌクレアーゼGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が欠損または弱化するように改変され、さらに、L−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌を用いてL−バリンを生産する。
【選択図】なし
Description
(1) ピルビン酸生産能を有し、リボヌクレアーゼ(RNase)Gの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にピルビン酸を生成蓄積させ、該培地又は菌体からピルビン酸を採取することを特徴とする、ピルビン酸の製造方法。
(2) 前記エシェリヒア属細菌が、RNaseGをコードする遺伝子が破壊されたことにより、RNaseGの活性が低下したエシェリヒア属細菌である、(1)のピルビン酸の製造方法。
(3) 前記エシェリヒア属細菌が、さらに、cra遺伝子の発現が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌である、(1)又は(2)のピルビン酸の製造方法。
(4) 前記エシェリヒア属細菌が、さらに、L−バリン耐性を有するエシェリヒア属細菌である、(3)のピルビン酸の製造方法。
(5) L−バリン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にL−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からL−バリンを採取することを特徴とする、L−バリンの製造方法。
(6) L−バリン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、RNaseGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、L−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にL−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からL−バリンを採取することを特徴とする、L−バリンの製造方法。
(7)前記エシェリヒア属細菌が、さらに、アセト乳酸シンターゼIIIをコードする遺伝子の発現が弱化されたエシェリヒア属細菌である、(5)または(6)のL−バリンの製造方法。
(8) 前記エシェリヒア属細菌が、さらに、アセト乳酸シンターゼIまたはアセト乳酸シンターゼIIをコードする遺伝子の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である、(5)〜(7)のいずれかのL−バリンの製造方法。
(9) RNaseGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、L−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌。
<1>ピルビン酸の製造方法
本願第1の発明のピルビン酸の製造方法は、ピルビン酸生産能を有し、RNaseGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にピルビン酸を生成蓄積させ、該培地又は菌体からピルビン酸を採取することを特徴とする方法である。
Gen. Microbiol.,53 ,363-381 ,(1968))。
10個、特に好ましくは2〜5個を意味する。
欠失型rngを、宿主染色体上のrngと置換するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性複製起点と変異型rngとアンピシリン等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを含む組換えDNAを調製し、この組換えDNAでエシェリヒア属細菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えDNAが染色体DNAに組み込まれた形質転換株が得られる。
が残った株を選択することによって、rngが破壊された株を取得することができる。
ゾールアラニンが挙げられる。また、正常型のilvGM遺伝子(GenBank Accession No. X04890)を形質導入することでもL-バリン耐性を付与することができる(Proc Natl Acad Sci USA Vol78,No.2, p922-925参照)。リボヌクレアーゼGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、L−バリン耐性が付与されたピルビン酸生産菌としては、例えば、実施例に示すようなエシェリヒア・コリB16株を挙げることができる。
本願第2の発明のL−バリンの製造方法は、L−バリン生産能を有し、かつRNaseGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌、または、L−バリン生産能を有し、かつRNaseGの活性が低下し、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、L−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にL−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からL−バリンを採取することを特徴とする方法である。
するL-バリン生産菌、あるいは、少なくともilvG、ilvM、ilvE及びilvDの各遺伝子を発現し、ilvGMEDAオペロンを含むDNA断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌も、本発明に好適に使用することができる。尚、ilvGMEDAオペロンは、L-バリン及び/又はL-イソロイシン及び/又はL-ロイシンによるオペロンの発現調節(アテニュエーション)を受けるので、生成するL-バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい(特開平8-47397)。
。さらに、第2の発明に用いる菌株は、cra遺伝子及び/又はrng遺伝子を改変することにより、ilvIH遺伝子の発現が低下したものや、MC1061株のようにilvIH遺伝子が本来的に欠失したものであってもよい。
アセト乳酸シンターゼIIをコードする遺伝子としては、ilvGM遺伝子(GenBank Accession No. X04890)を挙げることができる。また、AHAS活性を有するタンパク質をコードする限り、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることもできる。ストリンジェントな条件としては、例えば、60℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度で、1回より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下のものには限定されない。
rng(以下、cafAともいう)欠損株を、以下のように構築した。pXX557をBamHIとHindIIIで処理して得られる1.3kbのcat(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)遺伝子カセットを、T4 DNAポリメラーゼの処理によりその付着末端を平滑末端にした後、rng(=cafA)を含むプラスミドpMEL1(Journal of Bacteriology (1987) 169:4935-4940)上のrng遺伝子内のユニークBglII部位に挿入した。なお、pXX557は、pACYC184(ニッポンジーン)をHaeIIで処理して得られる1.3kbのcat遺伝子断片を、pUC9(German Collection of Microorganisms and Cell CulturesにDSM No.3421として登録されている)のHincII部位に挿入して得られたプラスミドである。得られたプラスミドpMEL1-cafA::catから、rng::catとその隣接領域を含む7.8kbのSalI断片をアガロース・ゲル電気泳動後に単離した。大腸菌 (Escherichia coli) K-12 recD 突然変異体株FS1576(国立遺伝学研究所にME9019として登録されている)を、上記の単離された線状DNAで形質転換させ、そして上記のrng::catを含有する線状DNAと染色体rng領域の間の相同的組換えにより形成されたクロラムフェニコール耐性コロニーを単離した。この株では、染色体上の野生型rng遺伝子がrng::catに置換されている。この株にP1ファージを感染させ、ファージライゼートを調製した後、これをMC1061株(E.coli Genetic Stock CenterにCGSC#: 6649として登録されている)またはMG1655株(国立遺伝学研究所にME9044として登録されている)に感染させた。クロラムフェニコール耐性を指標として形質導入体を選択し、取得したMC1061 rng::cat株およびMG1655 rng::cat株をそれぞれGM11株、GG11株と命名した。なお、MC1061株は、cra遺伝子が欠損している株である(Biochimical and Biophysical Research Communications 295 (2002) 92-97)。
実施例1で構築したGG11株、GM11株およびその親株を0.2%のグルコースと100μg/mlのL-ロイシンを含むM9最少培地(Na2HPO4・7H2O 12.8g, NH2PO4 3g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, MgSO4 2mM, CaCl2 0.1mMを1Lに含む)にそれぞれ接種し、30℃で振とう培養した。培養開始後4時間後に培養液を分取し、遠心分離により菌体を回収した後、22%の過塩素酸で菌体内ピルビン酸を抽出した。得られた抽出液を炭酸ナトリウムで中和した後、ピルビン酸を協和メディックス社のピルビン酸測定試薬デタミナーPAを用いて測定した。具体的には、界面活性剤を含むリン酸緩衝液にパーオキシダーゼ6.5単位/ml及びアスコルビン酸オキシダーゼ4.5単位/mlを溶解し、これに中和済みの抽出液を適量加えて、5分間37℃で恒温した。恒温した反応溶液にピルビン酸オキシダーゼ及びビス[3-ビス(4-クロロフェニル)メチル-4-ジメチル‐アミノフェニル]アミンを加え、5分間37℃で反応させ、750nmの吸光度を測定した。この測定値とピルビン酸の標準液により作成した検量線と比較することで培養液中のピルビン酸濃度を定量した。抽出されたピルビン酸は、抽出時の培養液のOD660で除することにより細胞内のピルビン酸濃度に換算した。表1に示すように、rng遺伝子欠損株では細胞内ピルビン酸濃度が上昇していることが示された。
実施例1で構築したGM11株を0.2%のグルコースを含むM9最少培地にL-ロイシンを100μg/ml添加した培地にて培養を実施したところ、著しい生育の遅延が認められた。そこで、本発明者らは、検討した結果、L-スレオニンまたはL-イソロイシンを添加することで生育が回復することを見出した。この結果から、GM11株ではcra変異に加えて、rng変異が導入されることにより細胞内のL-バリン濃度が上昇し、その結果L-イソロイシンの生合成が抑制されることにより最少培地での生育遅延が認められると推測した。例えば、アセト乳酸合成酵素IをコードするilvBN、アセト乳酸合成酵素IIIをコードするilvIHはL-バリンでフィードバックインヒビションを受けることが知られている。そこで、次に発明者らは、最少培地でGM11株の成育改善株を分離すれば、L-イソロイシンの生合成経路のL-バリンによるフィードバックインヒビションが解除された株が分離でき、生育の遅延を解消できると考え、生育改善株の分離を試みた。具体的には、0.2%のグルコースおよびL-ロイシン100μg/mlを含むM9プレート上にGM11株を約2×107cellsとなるように希釈して塗布、30℃で3日間培養し、自然突然変異で出現した良好に生育するコロニーを3株分離した。この生育改善株のうち1株をB6株と命名した。
実施例3で取得したB6株のL−バリンの感受性を、0.2%のグリセロールおよび100μg/mlのL-ロイシンを含む、M9最少培地に各所定量のL-バリンを添加したプレートでの生育を指標に確認した。その結果、親株であるMC1061ならびにそのrng変異株であるGM11では6.25μg/mlのL-バリンを含む培地では生育できなかったのに対し、B6株では100μg/mlのL-バリンを含む培地でも生育可能であった(図1)。したがって、GM11株の生育改善株として取得されたB6株は、L-バリン耐性が付与された株であることが明らかとなった。
なお、MC1061株を0.2%のグルコースおよびLeu 100μg/ml, Val 10μg/mlを含むM9プレートに2×107cellsとなるように希釈して塗布、30℃で4日培養後、自然突然変異により生育してきた4クローンを分離した。そのうち3クローンは25μg/ml以上のL-バリン存在下でも生育した。これらの株にrng変異を導入したところ、B6株同様にM9最少培地にロイシンのみを添加した培地で生育可能であることが確認できた。このように、常法に従ってL-バリン耐性株を分離し、それにrng変異を導入してもB6株と同様の生育改善株を得ることができる。
実施例3で取得したB6株およびその親株であるMC1061株を、0.2%のグルコースおよび100μg/mlのL-ロイシンを含むM9最少培地にそれぞれ接種し30℃で培養した。培養開始後16時間目の培養液を分取し、培養液中のピルビン酸を協和メディックス社のピルビン酸測定試薬デタミナーPAを用いて測定した。界面活性剤を含むリン酸緩衝液にパーオキシダーゼ6.5単位/ml及びアスコルビン酸オキシダーゼ4.5単位/mlを溶解し、これに培養液を遠心分離して得た遠心上清を適量加えて、5分間37℃で恒温した。恒温した反応溶液にピルビン酸オキシダーゼ及びビス[3-ビス(4-クロロフェニル)メチル-4-ジメチル‐アミノフェニル]アミンを加え、5分間37℃で反応させ、750nmの吸光度を測定した。この測定値とピルビン酸の標準液により作成した検量線と比較することで培養液中のピルビン酸濃度を定量した。表2に示すように、MC1061株に比しB6株ではピルビン酸蓄積量が約11倍に向上していることが示された。このデータと表1のデータを合わせて考えると、L−バリン耐性の付与によりさらにピルビン酸蓄積が向上したことがわかった。
MC1061株およびB6株を0.2%のグルコースを含むM9培地にL-ロイシンおよびL-イソロイシンをそれぞれ100μg/mlとなるように添加した培地にて30℃で培養した。菌を接種後24時間目の培養液を分取し、適当に希釈した後、日立アミノ酸アナライザーL-8500を用いてL-バリンの生成量を分析した。表3に示すように、MC1061株では約40mg/LのL-バリンを蓄積したのに対し、B6株では約90mg/LのL-バリンを蓄積した。このことから、B6株では顕著にL-バリン生産能が向上していることが示された。
上述したように、MC1061株ではcra遺伝子が欠損しているため、本発明者らは、cra変異がL-バリン生合成に影響を与えている可能性を考えた。そうであれば、cra遺伝子を導入することにより、GM11株で認められた最少培地での生育の遅延が相補されるはずである。これを確認するためにまずcra遺伝子のクローニングを行った。GW10株(Molecular and General Genetics 253(1997)515-519)より常法により染色体DNAを抽出し、この染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号1、2に示す合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行い、cra遺伝子を含む1.1kbの増幅断片を得た。このプライマーには制限酵素BamHIの認識部位が付加されているため、この増幅産物をBamHIで完全分解し、pMW218(日本ジーン)のBamHI部位に挿入し、目的の構成のプラスミドをpCRA1とした。次に、このプラスミドでGM11株を形質転換し、Km耐性を指標に形質転換体を取得した。得られた形質転換体GM11/pCRA1をM9プレートにスポットしたところ、図2に示すようにL-スレオニンまたはL-イソロイシンの栄養要求性は消失していた。GM11で認められたL-スレオニンまたはL-イソロイシンの要求性は、rng変異とcra欠損の組み合わせにより生じる表現型であることが示された。
GM11株およびGM11/pCRA1株よりRNAを抽出し、ilvBN遺伝子断片をプローブとしてノーザンハイブリザイゼーションを行ったところ、GM11/pCRA1株ではilvBN mRNAの発現量が顕著に抑制されていた(図3)。なお、プローブには、MG1655の染色体DNAを鋳型として、配列番号3および配列番号4に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い調製したilvBN遺伝子断片を用いた。このことからcra変異の効果はilvBN遺伝子(アセト乳酸合成酵素I)の過剰発現によるL-バリン合成の亢進にあるといえる。
Biochimical and Biophysical Research Communications 295(2002) 92-97で記載されているように、MC1061株ではcra遺伝子の一部が欠失しているが、cra遺伝子とilvIH遺伝子は染色体上近傍に位置する(図4)。一方、MC1061はaraD-leuCの領域が欠損しているとされていたが(非特許文献:Journal of Molecular Biology 138(1980)179-207)、本発明者らはMC1061株ではaraD-craまでが欠損しているのが正しいと推測した。そこで、MC1061より抽出した染色体をEcoRI、またはEcoRIとSpeIで完全分解し、サザンハイブリダイゼーションを行った(図5)。なお、プローブには、MG1655の染色体を鋳型として、配列番号1、配列番号2に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、cra遺伝子の部分配列を含むDNA断片を用いた。その結果、MC1061株では、leuO遺伝子に存在しているはずのSpeI部位が存在しないことが示された(図5)。この結果ならびにMC1061で認められているcra遺伝子の部分欠失から、MC1061株ではaraD-craまでが連続して欠損しており、ilvIH遺
伝子も欠損していることが示された。
Claims (9)
- ピルビン酸生産能を有し、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にピルビン酸を生成蓄積させ、該培地又は菌体からピルビン酸を採取することを特徴とする、ピルビン酸の製造方法。
- 前記エシェリヒア属細菌が、リボヌクレアーゼGをコードする遺伝子が破壊されたことにより、リボヌクレアーゼGの活性が低下したエシェリヒア属細菌である、請求項1に記載のピルビン酸の製造方法。
- 前記エシェリヒア属細菌が、さらに、cra遺伝子の発現が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌である、請求項1又は2に記載のピルビン酸の製造方法。
- 前記エシェリヒア属細菌が、さらに、L−バリン耐性を有するエシェリヒア属細菌である、請求項3に記載のピルビン酸の製造方法。
- L−バリン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にL−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からL−バリンを採取することを特徴とする、L−バリンの製造方法。
- L−バリン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、リボヌクレアーゼGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、L−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にL−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からL−バリンを採取することを特徴とする、L−バリンの製造方法。
- 前記エシェリヒア属細菌が、さらに、アセト乳酸シンターゼIIIをコードする遺伝子の発現が弱化されたエシェリヒア属細菌である、請求項5または6に記載のL−バリンの製造方法。
- 前記エシェリヒア属細菌が、さらに、アセト乳酸シンターゼIまたはアセト乳酸シンターゼIIをコードする遺伝子の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である、請求項5〜7のいずれか一項に記載のL−バリンの製造方法。
- リボヌクレアーゼGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、L−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌。
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