JP4764985B2 - 繊維状リン酸カルシウム - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、繊維状リン酸カルシウム、及びその製造方法に関する。本発明はまた、生体材料として、特に骨芽細胞や肝細胞などの各種細胞の培養基材として有利に用いることができる多孔質リン酸カルシウム成形体、及びその製造方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体の骨欠損部の修復方法として、骨欠損部に骨と同等の材料から形成された多孔質成形体を充填して、この成形体の気孔にて新しい骨組織を形成する方法が知られている。特に最近では、多孔質形成体の骨形成能を高めるために、あらかじめ生体外にて骨芽細胞を培養した多孔質成形体を骨欠損部に充填することも検討されている。また、生体の内臓の代替物として人工的に培養した細胞を利用する技術も知られている。例えば、多孔質成形体に肝細胞を培養し、これを人工肝臓として利用する技術が知られている。
【０００３】
特許文献１には、骨欠損部修復用の多孔質成形体の材料として有利に用いることができる炭酸含有水酸アパタイトホイスカー及びその製造方法が記載されている。この文献には、炭酸含有水酸アパタイトホイスカーは、ホイスカーの相互の絡合により、比較的大きな間隙（気孔）を形成することができるので、間隙に新生骨組織が侵入しやすく、ホイスカー及び新生骨組織が一体化して新しい骨の形成を促進すると記載されている。この文献には、カルシウム塩とリン酸塩とを含む水溶液を尿素の存在下にて加熱すると、リン酸八カルシウム（以下、ＯＣＰと略記することがある）のホイスカーが生成し、このＯＣＰホイスカーが加水分解して炭酸含有水酸アパタイトホイスカーが生成すると記載されている。また、ＯＣＰホイスカーを約１２００℃まで加熱すると、α−リン酸三カルシウム（以下、α−ＴＣＰと略記することがある）とα−二リン酸カルシウムとの混合物からなるホイスカーを得ることができると記載されている。
【０００４】
非特許文献１には、β−リン酸三カルシウム（以下、β−ＴＣＰと略記することがある）粉末から形成された多孔質成形体（人工骨）が記載されている。この文献には、β−ＴＣＰの多孔質形成体を骨組織中に充填すると、多孔質形成体を足場とした骨細胞の形成と多孔質成形体の生体への吸収とが進行し、多孔質形成体の充填部位が自家骨に経時的に置換すると記載されている。
【０００５】
非特許文献２には、骨細胞（骨芽細胞）の培養に適した繊維状の炭酸含有水酸アパタイトから形成された多孔質成形体が記載されている。この文献には、メジアン径約２５０μｍの連通気孔（マクロポア）と、繊維と繊維との間にできた微細な気孔（ミクロポア）とを有する多孔質成形体が記載されている。
【０００６】
非特許文献３には、肝細胞を培養した多孔質成形体を人工肝臓として利用する技術が記載されている。この文献では、多孔質成形体として平均孔径が約５００μｍ、空隙率が９０％のポリウレタン発泡体が用いられている。
【０００７】
【特許文献１】
特許２６９１５９３号公報
【非特許文献１】
入江洋之，「自家骨に置換する人工骨」，セラミックス，３８（２００３）Ｎｏ．１，ｐ．５５−５７
【非特許文献２】
M.Aizawa,H.Shinoda等、外７名，「Development and Biological Evaluation Apatite Fibre Scafford with Large Pore Size and High Porosity for Bone Regeneration"，Key Engineer Mater.，vol.240-242，647-650(2003)
【非特許文献３】
船津和守等、外３名，「ヒト臨床を目指したハイブリッド型人工肝臓補助システムの開発」，生体材料，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．６（１９９７），ｐ．３２２−３２９
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
骨細胞や肝細胞などの細胞の培養に用いる多孔質成形体には、細胞を成形体内部に取り込むための比較的大きな気孔（マクロポア）と細胞の培養に必要な培養液を内部に取り込むための比較的小さな気孔（ミクロポア）とが連続的に形成されていることが必要となる。この点、繊維状あるいはホイスカー状の炭酸含有水酸アパタイト、あるいはα−リン酸三カルシウムとα−二リン酸カルシウムとの混合物から形成した多孔質成形体は、β−リン酸三カルシウム粉末から形成した多孔質成形体やポリウレタン発泡体よりも有利である。
しかしながら、炭酸含有水酸アパタイトは、β−リン酸三カルシウムと比べて生体吸収性が低いという問題がある。また、α−リン酸三カルシウムとα−二リン酸カルシウムとの混合物では、α−二リン酸カルシウムが生体活性を示さず、また、炭酸含有水酸アパタイトよりも生体吸収性が低いという問題がある。
従って、本発明の課題は、生体吸収性が高い繊維状材料及びその製造方法を提供することにある。本発明の課題はまた、骨細胞や肝細胞などの各種細胞の培養に有利に用いることのできる、生体吸収性が高い多孔質成形体、及びその製造方法を提供することにもある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、α−リン酸三カルシウムの単一相、もしくはα−リン酸三カルシウムとβ−リン酸三カルシウムとの混合物、またはα−リン酸三カルシウムと水酸アパタイトとの混合物からなり、長さが６０〜２００μｍの範囲にあって、アスペクト比が２０〜１００の範囲にある繊維状リン酸カルシウムにある。
【００１１】
本発明の繊維状リン酸カルシウムは、例えば、下記の（１）又は（２）の方法により製造することができる。
（１）カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８〜３．０の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量が加水分解しないうちに加熱を止めることによって、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム及び水酸アパタイトの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程と、得られた繊維状リン酸カルシウムを１２００〜１５００℃の温度にて焼成することによりα−リン酸三カルシウムを生成させる工程とを含む方法。
（２）カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８以上１．６７未満の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量を加水分解させることによって、カルシウム欠損型の水酸アパタイトからなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程と、得られた繊維状リン酸カルシウムを１２００〜１５００℃の温度にて焼成することによりα−リン酸三カルシウムを生成させる工程とを含む方法。
【００１２】
本発明はまた、α−リン酸三カルシウムの単一相、もしくはα−リン酸三カルシウムとβ−リン酸三カルシウムとの混合物、またはα−リン酸三カルシウムと水酸アパタイトとの混合物からなり、長さが６０〜２００μｍの範囲にあって、アスペクト比が２０〜１００の範囲にある繊維状リン酸カルシウムの係合により形成された、直径が５０〜５００μｍの範囲にある気孔からなる連続気孔を有し、気孔率が９５〜９９％の範囲にあることを特徴とする多孔質リン酸カルシウム成形体にもある。
【００１３】
本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、例えば、下記の（１）又は（２）の方法により製造することができる。
（１）カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８〜３．０の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量が加水分解しないうちに加熱を止めることによって、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム及び水酸アパタイトの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程、得られた繊維状リン酸カルシウムと粒子径が５０〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料との混合物スラリを調製する工程、混合物スラリを吸引ろ過して、繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との板状形成体を得る工程、そして板状形成体を１２００〜１５００℃の温度にて焼成して、可燃性球状材料を焼却除去するとともにα−リン酸三カルシウムを生成させる工程を含む方法。
（２）カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８以上１．６７未満の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量を加水分解させることによって、カルシウム欠損型の水酸アパタイトからなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程、得られた繊維状リン酸カルシウムと粒子径が５０〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料との混合物スラリを調製する工程、混合物スラリを吸引ろ過して、繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との板状形成体を得る工程、そして板状形成体を１２００〜１５００℃の温度にて焼成して、可燃性球状材料を焼却除去するとともにα−リン酸三カルシウムを生成させる工程を含む方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の繊維状リン酸カルシウムは、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）からなる。ＴＣＰは、α−ＴＣＰであってもよいし、β−ＴＣＰであってもよい。また、α−ＴＣＰとβ−ＴＣＰとの混合物であってもよい。
【００１５】
本発明の繊維状リン酸カルシウムでは、さらに水酸アパタイト（以下、ＨＡｐと略記することもある）を含んでいてもよい。α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ及びＨＡｐの生体吸収性は、一般に、α−ＴＣＰが最も高く、β−ＴＣＰが次に高く、そしてＨＡｐが最も低い値を示す。従って、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ及びＨＡｐの混合割合を調整することによって、繊維の生体吸収性を調節することができる。
【００１６】
繊維状リン酸カルシウムの組成は、その繊維状リン酸カルシウムのＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルにより確認することができる。繊維状リン酸カルシウムの各成分の含有量比は、各成分のＸ線回折ピーク強度の相対値により算出することができる。α−ＴＣＰの含有量には（０３４面）、β−ＴＣＰの含有量には（０２１０）面、そしてＨＡｐの含有量には（２１１）面のピーク強度を用いることできる。本発明の繊維状リン酸カルシウムは、Ｘ線回折ピーク強度から算出されたＴＣＰの含有量が５０％以上にあることが好ましく、６０％以上にあることがより好ましく、８０％以上にあることがさらに好ましい。
【００１７】
本発明の繊維状リン酸カルシウムは、長さが６０〜２００μｍに範囲にあることが好ましい。アスペクト比は、２０〜１００の範囲にあることが好ましい。
【００１８】
本発明の繊維状リン酸カルシウムは、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウム、もしくはカルシウム欠損型の水酸アパタイト［Ｃａ10-x（ＨＰＯ4）x(ＰＯ4)6-x（ＯＨ）2-x・ｎＨ2Ｏ、０＜ｘ≦１、ｎ＝０〜２．５、以下ＤＡｐと略記することがある］からなる繊維状リン酸カルシウムを焼成することによって製造することができる。上記のＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムもしくはＤＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムの焼成温度は、１２００〜１５００℃の範囲である。この温度範囲にて焼成すると、繊維形状を維持したままＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐ、もしくはＤＡｐが分解してα−ＴＣＰが生成する。焼成温度が１２００℃以下であると主としてβ−ＴＣＰが生成し、焼成温度が１２００℃を超えると主としてα−ＴＣＰが生成する傾向にある。焼成時間は、一般に１〜２０時間の範囲である。また、この焼成は、空気雰囲気下あるいは水蒸気雰囲気下で行なうことが好ましい。
【００１９】
ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムは、カルシウム塩とリン酸塩とを含む水溶液（反応原料液）を尿素の存在下にて加熱することによって製造することができる。反応原料液のカルシウム塩とリン酸塩との濃度の比は、ＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して、０．８〜３．０の範囲にあることが好ましく、１．０〜１．６７の範囲にあることがよりに好ましい。カルシウム塩としては、硝酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウムなどを用いることができる。特に、硝酸カルシウムが好ましい。リン酸塩としては、リン酸水素二アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸アンモニウム、又はこれらの水和物を用いることができる。特に、リン酸水素二アンモニウムが好ましい。
【００２０】
尿素は、沈殿剤として作用し、尿素の分解によって発生するアンモニアが反応原料液のｐＨを調整し、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムの均一な沈殿を生成させる機能を果たす。尿素の使用量は、リン酸塩０．１モルに対して、０．２〜１．０モルの範囲であることが好ましい。
【００２１】
反応原料液は、酸性水溶液であることが好ましい。酸としては、硝酸、塩酸、酢酸及び硫酸などを挙げることができる。特に、硝酸が好ましい。酸の濃度は、０．０１〜１．０モル／Ｌの範囲にあることが好ましく、０．０５〜０．５モル／Ｌの範囲にあることがより好ましい。
【００２２】
上記の反応原料液を加熱すると、ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物が生成する。この繊維状物を、反応原料液中でさらに加熱すると、ＯＣＰとＤＣＰＡとが加水分解してＨＡｐが生成する。この繊維状物中のＯＣＰとＤＣＰＡの全てがＨＡｐに加水分解しないうちに加熱を止めることによって、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムを製造することができる。反応原料液の加熱温度は、ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物が生成するまでは、７０℃以上９０℃未満の温度であることが好ましく、７０〜８５℃の温度であることがより好ましい。加熱時間は、反応原料液の濃度などにより異なるが、一般に１０〜２５時間の範囲である。ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物生成後の加熱温度は、９０〜１８０℃の範囲にあることが好ましく、９０〜１３０℃の範囲であることがより好ましい。この加熱時間は、一般に１０〜２５時間の範囲である。
【００２３】
ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムが生成したことは、その繊維状リン酸カルシウムのＸ線回折パターン、及び赤外線吸収スペクトルにより確認できる。ＯＣＰ、ＤＣＰＡ、及びＨＡｐの含有量比は、Ｘ線回折のピーク強度比から算出することができる。ＯＣＰの含有量にはミラー指数（０１０）面、ＤＣＰＡの含有量には（０２０）面、ＨＡｐの含有量には（２１１）面の強度を用いることができる。ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの含有量比は、ＯＣＰ：ＤＣＰＡ：ＨＡｐで、５〜９０：５〜５０：５〜５０であることが好ましい。
【００２４】
ＤＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムもまた、カルシウム塩とリン酸塩とを含む水溶液（反応原料液）を尿素の存在下にて加熱することによって製造することができる。カルシウム塩とリン酸塩との濃度の比が、ＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８以上１．６７未満の範囲（好ましくは、１．０〜１．３の範囲）にある反応原料液を、上記のＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムの製造と同様に加熱して、ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物を生成させ、この繊維状物を、反応原料液中でさらに加熱して、ＯＣＰとＤＣＰＡの全量を加水分解させるとＤＡｐが生成する。ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物生成後の加熱温度は、９０〜１８０℃の範囲にあることが好ましく、９０〜１３０℃の範囲であることがより好ましい。
この加熱時間は、一般に５０〜１００時間の範囲である。
【００２５】
ＤＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムが生成したことは、その繊維状リン酸カルシウムのＸ線回折パターン、赤外線吸収スペクトル、及びＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）により確認できる。ＤＡｐは、Ｘ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルがそれぞれＨＡｐと同じであって、ＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）が１．６７よりも低い値を示す。
【００２６】
次に、本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体について説明する。
本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、上記のＴＣＰからなる繊維状リン酸カルシウムの係合により形成される。本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、直径が５０〜５００μｍの範囲にある気孔（マクロポア）からなる連続気孔を含み、気孔率が９５〜９９％の範囲にある。マクロポアは、細胞を成形体内部に取り込むための導通路として、あるいは取り込んだ細胞の足場として作用する。マクロポアの直径は、培養対象とする細胞の種類などに適宜調製する。例えば、骨芽細胞の場合には、１００〜２００μｍの範囲にあることが好ましく、１００〜１５０μｍの範囲にあることがより好ましい。
【００２７】
本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、例えば、前記のＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウム、もしくはＤＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムと、粒子径が５０〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料との混合物スラリを調製する工程、混合物スラリを吸引ろ過して、繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との板状形成体を得て、この板状形成体を１２００〜１５００℃の温度にて焼成して、可燃性球状材料を焼却除去するとともにα−ＴＣＰを生成させることにより製造することができる。
【００２８】
可燃性球状材料は、８００〜１５００℃の温度に加熱したときの灰分が１質量％以下となるものであることが好ましい。このような可燃性球状材料の材料の例としては、ポリメタルクリレート、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびカーボンを挙げることができる。これらのうちで好ましいのはカーボンである。なお、可燃性球状材料は、真球であることが好ましいが、必ずしも真球である必要はなく、略球形状であればよい。
【００２９】
混合物スラリの溶媒には、水あるいは水とアルコールの混合溶液を用いることが好ましい。溶媒として水とアルコールの混合溶液を用いる場合、その比率は容積比で、通常は、水：アルコールが１：９９〜９９：１の範囲にあり、好ましくは２５：７５〜７５：２５の範囲にある。アルコールとしては、メタノール、エタノールなどの１価アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの２価アルコールを用いることができる。特に、エタノールが好ましい。
【００３０】
繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との使用量は、繊維状リン酸カルシウム１質量部に対して、１〜２０００質量部の範囲にあることが好ましく、１０〜１０００質量部の範囲にあることがより好ましい。
【００３１】
板状形成体の焼成により、可燃性球状材料を焼却除去されて、成形体に気孔ならびに気孔連続体が形成するとともに繊維状のＴＣＰが生成する。焼成時間は、板状形成体のサイズなどにより異なるが、一般に１〜２０時間の範囲である。
【００３２】
上記の多孔質リン酸カルシウム成形体の製造においては、混合物スラリに直径が１〜１０μｍの範囲にある可燃性微粒子材料を添加してもよい。この可燃性微粒子材料の添加により、多孔質リン酸カルシウム成形体に直径が１〜１０μｍの範囲にある気孔からなる連続気孔が形成される。この連続気孔は、細胞の培養液を内部に取り込むためのミクロポアとして作用する。可燃性微粒子材料としては、前記の可燃性球状材料と同じ材料のものを用いることができる。可燃性微粒子材料の使用量は、繊維状リン酸カルシウム１質量部に対して、１〜１０００質量部の範囲にあることが好ましく、１０〜５００質量部の範囲にあることがより好ましい。
【００３３】
多孔質リン酸カルシウム形成体は、上記の混合物スラリをスプレードライ法により乾燥して造粒粉末を得て、この造粒粉末から形成した形成体を焼成することによっても製造することもできる。
【００３４】
【実施例】
［参考例１］
（１）リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、リン酸水素カルシウム（ＤＣＰＡ）及び水酸アパタイト（ＨＡｐ）の混合物からなる繊維状リン酸カルシウムの製造
硝酸カルシウム四水和物、リン酸水素二アンモニウム、及び尿素を、硝酸カルシウム四水和物０．１モル／Ｌ、リン酸水素二アンモニウム０．１モル／Ｌ、尿素０．５モル／Ｌの濃度となるように０．１モル／Ｌの硝酸に溶解して、反応原料液を調製した。この反応原料液を、環流冷却器付きの反応容器に入れ、８０℃の温度で２４時間加熱した後、さらに９０℃の温度で２４時間加熱した。加熱終了後、反応容器内の生成物を取り出して、洗浄乾燥した。得られた生成物の形態を電子顕微鏡で観察したところ、繊維状であり、その長さは６０〜２００μｍの範囲であり、アスペクト比は２０〜１００の範囲であった。この生成物のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この生成物は、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物であることが確認された。また、ＯＣＰの（０１０）面のＸ線回折ピーク、ＤＣＰＡの（０２０）面のＸ線回折ピーク、及びＨＡｐの（２１１）面のＸ線回折ピーク強度の比から、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ、及びＨＡｐの含有量比を算出したところ、その値（ＯＣＰ：ＤＣＰＡ：ＨＡｐ）は８０：１５：５であった。
【００３５】
（２）多孔質リン酸カルシウム成形体の製造
上記の生成物を、水／エタノール混合溶液（１／１［体積／体積］）に懸濁して、濃度１ｇ／Ｌのスラリを調製した。このスラリに、粒子径が１５０μｍ以下のカーボンビーズ（ニカビーズ、日本カーボン（株）製）を、生成物／カーボンビーズが１／２０（質量／質量）となる量にて添加した後、充分に撹拌し、生成物とカーボンビーズとの混合物スラリを調製した。この混合物スラリを吸引ろ過して、固形分（生成物とカーボンビーズの混合物）を板状に形成した。次いで、この板状形成体を、水蒸気雰囲気下にて１０５０℃の温度で５時間焼成して、カーボンビーズを焼却除去した。
【００３６】
こうして得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体はβ−ＴＣＰの単一相から形成されていることが確認された。この成形体の表面状態を電子顕微鏡で観察したところ、長さが６０〜２００μｍ、アスペクト比が２０〜１００の繊維同士が焼結していることが確認された。また、この成形体の気孔率を測定したところ、その値は９８％であった。さらに、この成形体の細孔分布を水銀ポロシメータにより測定したところ、１００μｍ以上の比較的大きな気孔と１０μｍ以下の比較的小さな気孔とが形成されていることが確認された（図１）。
【００３７】
［実施例２］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を水蒸気雰囲気下にて１２００℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体はβ−ＴＣＰとα−ＴＣＰとの混合物から形成されていることが確認された。この成形体のβ−ＴＣＰとα−ＴＣＰとの含有量比を、Ｘ線回折パターンから読み取ったβ−ＴＣＰの（０２１０）面のピーク強度とα−ＴＣＰの（０３４）面のピーク強度との比から算出したところ、その値（β−ＴＣＰ：α−ＴＣＰ）は６０：４０であった。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００３８】
［実施例３］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を水蒸気雰囲気下にて１３００℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、α−ＴＣＰの単一相から形成されていることが確認された。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００３９】
［参考例２］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を空気雰囲気下にて１０５０℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、β−ＴＣＰの単一相から形成されていることが確認された。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００４０】
［実施例５］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を空気雰囲気下にて１２００℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、α−ＴＣＰとβ−ＴＣＰの混合物から形成されていることが確認された。この成形体のβ−ＴＣＰとα−ＴＣＰとの含有量比をＸ線回折パターンから読み取ったβ−ＴＣＰの（０２１０）面のピーク強度とα−ＴＣＰの（０３４）面のピーク強度との比から算出したところ、その値（β−ＴＣＰ：α−ＴＣＰ）は１０：９０であった。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００４１】
［実施例６］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を空気雰囲気下にて１３００℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、α−ＴＣＰの単一相から形成されていることが確認された。
【００４２】
［参考例３］
（１）カルシウム欠損型の水酸アパタイト（ＤＡｐ）からなる繊維状リン酸カルシウムの製造
前記参考例１と同じ組成の反応原料液を、８０℃の温度で２４時間加熱した後、さらに９０℃の温度で７２時間加熱した。得られた生成物の形態を電子顕微鏡で観察したところ、繊維状であり、その長さは６０〜２００μｍの範囲であり、アスペクト比は２０〜１００の範囲であった。生成物のカルシウムとリンとのモル比（Ｃａ／Ｐ）、Ｘ線回折、及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この生成物は、Ｃａ／Ｐが１．５７のＤＡｐの単一相であることが確認された。
【００４３】
（２）多孔質リン酸カルシウム成形体の製造
上記の生成物を、水／エタノール混合溶液（１／１［体積／体積］）に懸濁して、濃度１ｇ／Ｌのスラリを調製した。このスラリに、粒子径１５０μｍ以下のカーボンビーズ（ニカビーズ、日本カーボン（株）製）を、生成物／カーボンビーズが１／２０（質量／質量）となる量にて添加した後、充分に撹拌し、生成物とカーボンビーズとの混合物スラリを調製した。この混合物スラリを吸引ろ過して、固形分（生成物とカーボンビーズの混合物）を板状に形成した。次いで、この板状形成体を、水蒸気雰囲気下にて１１００℃の温度で５時間焼成して、カーボンビーズを焼却除去した。
【００４４】
こうして得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、β−ＴＣＰとＨＡｐとの混合物から形成されていることが確認された。この成形体のβ−ＴＣＰとＨＡｐとの含有量比をＸ線回折パターンから読み取ったβ−ＴＣＰの（０２１０）面のピーク強度とＨＡｐの（２１１）のピーク強度との比から算出したところ、その値（β−ＴＣＰ：ＨＡｐ）は５０：５０であった。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００４５】
［実施例８］
前記参考例３（２）の板状形成体の焼成温度を水蒸気雰囲気下にて１２００℃とした以外は、参考例３と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、α−ＴＣＰとＨＡｐとの混合物から形成されていることが確認された。この成形体のα−ＴＣＰとＨＡｐとの含有量比をＸ線回折パターンから読み取ったα−ＴＣＰの（０２１０）面のピーク強度とＨＡｐの（２１１）のピーク強度との比から算出したところ、その値（α−ＴＣＰ：ＨＡｐ）は５０：５０であった。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明のリン酸三カルシウムからなる繊維状リン酸カルシウムは、従来の水酸アパタイトホイスカーと比べて生体吸収性が高いので、生体内の骨欠損部に充填した際の自家骨との置換が進行し易い。また、本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、細胞を内部に取り込むための気孔（マクロポア）と細胞の培養に必要な培養液を内部に取り込むための気孔（ミクロポア）とが連続的に形成されているので、骨細胞や肝細胞などの各種細胞の培養に有利に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本参考例１にて製造した成形体の細孔分布を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、繊維状リン酸カルシウム、及びその製造方法に関する。本発明はまた、生体材料として、特に骨芽細胞や肝細胞などの各種細胞の培養基材として有利に用いることができる多孔質リン酸カルシウム成形体、及びその製造方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体の骨欠損部の修復方法として、骨欠損部に骨と同等の材料から形成された多孔質成形体を充填して、この成形体の気孔にて新しい骨組織を形成する方法が知られている。特に最近では、多孔質形成体の骨形成能を高めるために、あらかじめ生体外にて骨芽細胞を培養した多孔質成形体を骨欠損部に充填することも検討されている。また、生体の内臓の代替物として人工的に培養した細胞を利用する技術も知られている。例えば、多孔質成形体に肝細胞を培養し、これを人工肝臓として利用する技術が知られている。
【０００３】
特許文献１には、骨欠損部修復用の多孔質成形体の材料として有利に用いることができる炭酸含有水酸アパタイトホイスカー及びその製造方法が記載されている。この文献には、炭酸含有水酸アパタイトホイスカーは、ホイスカーの相互の絡合により、比較的大きな間隙（気孔）を形成することができるので、間隙に新生骨組織が侵入しやすく、ホイスカー及び新生骨組織が一体化して新しい骨の形成を促進すると記載されている。この文献には、カルシウム塩とリン酸塩とを含む水溶液を尿素の存在下にて加熱すると、リン酸八カルシウム（以下、ＯＣＰと略記することがある）のホイスカーが生成し、このＯＣＰホイスカーが加水分解して炭酸含有水酸アパタイトホイスカーが生成すると記載されている。また、ＯＣＰホイスカーを約１２００℃まで加熱すると、α−リン酸三カルシウム（以下、α−ＴＣＰと略記することがある）とα−二リン酸カルシウムとの混合物からなるホイスカーを得ることができると記載されている。
【０００４】
非特許文献１には、β−リン酸三カルシウム（以下、β−ＴＣＰと略記することがある）粉末から形成された多孔質成形体（人工骨）が記載されている。この文献には、β−ＴＣＰの多孔質形成体を骨組織中に充填すると、多孔質形成体を足場とした骨細胞の形成と多孔質成形体の生体への吸収とが進行し、多孔質形成体の充填部位が自家骨に経時的に置換すると記載されている。
【０００５】
非特許文献２には、骨細胞（骨芽細胞）の培養に適した繊維状の炭酸含有水酸アパタイトから形成された多孔質成形体が記載されている。この文献には、メジアン径約２５０μｍの連通気孔（マクロポア）と、繊維と繊維との間にできた微細な気孔（ミクロポア）とを有する多孔質成形体が記載されている。
【０００６】
非特許文献３には、肝細胞を培養した多孔質成形体を人工肝臓として利用する技術が記載されている。この文献では、多孔質成形体として平均孔径が約５００μｍ、空隙率が９０％のポリウレタン発泡体が用いられている。
【０００７】
【特許文献１】
特許２６９１５９３号公報
【非特許文献１】
入江洋之，「自家骨に置換する人工骨」，セラミックス，３８（２００３）Ｎｏ．１，ｐ．５５−５７
【非特許文献２】
M.Aizawa,H.Shinoda等、外７名，「Development and Biological Evaluation Apatite Fibre Scafford with Large Pore Size and High Porosity for Bone Regeneration"，Key Engineer Mater.，vol.240-242，647-650(2003)
【非特許文献３】
船津和守等、外３名，「ヒト臨床を目指したハイブリッド型人工肝臓補助システムの開発」，生体材料，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．６（１９９７），ｐ．３２２−３２９
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
骨細胞や肝細胞などの細胞の培養に用いる多孔質成形体には、細胞を成形体内部に取り込むための比較的大きな気孔（マクロポア）と細胞の培養に必要な培養液を内部に取り込むための比較的小さな気孔（ミクロポア）とが連続的に形成されていることが必要となる。この点、繊維状あるいはホイスカー状の炭酸含有水酸アパタイト、あるいはα−リン酸三カルシウムとα−二リン酸カルシウムとの混合物から形成した多孔質成形体は、β−リン酸三カルシウム粉末から形成した多孔質成形体やポリウレタン発泡体よりも有利である。
しかしながら、炭酸含有水酸アパタイトは、β−リン酸三カルシウムと比べて生体吸収性が低いという問題がある。また、α−リン酸三カルシウムとα−二リン酸カルシウムとの混合物では、α−二リン酸カルシウムが生体活性を示さず、また、炭酸含有水酸アパタイトよりも生体吸収性が低いという問題がある。
従って、本発明の課題は、生体吸収性が高い繊維状材料及びその製造方法を提供することにある。本発明の課題はまた、骨細胞や肝細胞などの各種細胞の培養に有利に用いることのできる、生体吸収性が高い多孔質成形体、及びその製造方法を提供することにもある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、α−リン酸三カルシウムの単一相、もしくはα−リン酸三カルシウムとβ−リン酸三カルシウムとの混合物、またはα−リン酸三カルシウムと水酸アパタイトとの混合物からなり、長さが６０〜２００μｍの範囲にあって、アスペクト比が２０〜１００の範囲にある繊維状リン酸カルシウムにある。
【００１１】
本発明の繊維状リン酸カルシウムは、例えば、下記の（１）又は（２）の方法により製造することができる。
（１）カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８〜３．０の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量が加水分解しないうちに加熱を止めることによって、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム及び水酸アパタイトの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程と、得られた繊維状リン酸カルシウムを１２００〜１５００℃の温度にて焼成することによりα−リン酸三カルシウムを生成させる工程とを含む方法。
（２）カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８以上１．６７未満の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量を加水分解させることによって、カルシウム欠損型の水酸アパタイトからなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程と、得られた繊維状リン酸カルシウムを１２００〜１５００℃の温度にて焼成することによりα−リン酸三カルシウムを生成させる工程とを含む方法。
【００１２】
本発明はまた、α−リン酸三カルシウムの単一相、もしくはα−リン酸三カルシウムとβ−リン酸三カルシウムとの混合物、またはα−リン酸三カルシウムと水酸アパタイトとの混合物からなり、長さが６０〜２００μｍの範囲にあって、アスペクト比が２０〜１００の範囲にある繊維状リン酸カルシウムの係合により形成された、直径が５０〜５００μｍの範囲にある気孔からなる連続気孔を有し、気孔率が９５〜９９％の範囲にあることを特徴とする多孔質リン酸カルシウム成形体にもある。
【００１３】
本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、例えば、下記の（１）又は（２）の方法により製造することができる。
（１）カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８〜３．０の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量が加水分解しないうちに加熱を止めることによって、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム及び水酸アパタイトの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程、得られた繊維状リン酸カルシウムと粒子径が５０〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料との混合物スラリを調製する工程、混合物スラリを吸引ろ過して、繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との板状形成体を得る工程、そして板状形成体を１２００〜１５００℃の温度にて焼成して、可燃性球状材料を焼却除去するとともにα−リン酸三カルシウムを生成させる工程を含む方法。
（２）カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８以上１．６７未満の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量を加水分解させることによって、カルシウム欠損型の水酸アパタイトからなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程、得られた繊維状リン酸カルシウムと粒子径が５０〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料との混合物スラリを調製する工程、混合物スラリを吸引ろ過して、繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との板状形成体を得る工程、そして板状形成体を１２００〜１５００℃の温度にて焼成して、可燃性球状材料を焼却除去するとともにα−リン酸三カルシウムを生成させる工程を含む方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の繊維状リン酸カルシウムは、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）からなる。ＴＣＰは、α−ＴＣＰであってもよいし、β−ＴＣＰであってもよい。また、α−ＴＣＰとβ−ＴＣＰとの混合物であってもよい。
【００１５】
本発明の繊維状リン酸カルシウムでは、さらに水酸アパタイト（以下、ＨＡｐと略記することもある）を含んでいてもよい。α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ及びＨＡｐの生体吸収性は、一般に、α−ＴＣＰが最も高く、β−ＴＣＰが次に高く、そしてＨＡｐが最も低い値を示す。従って、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ及びＨＡｐの混合割合を調整することによって、繊維の生体吸収性を調節することができる。
【００１６】
繊維状リン酸カルシウムの組成は、その繊維状リン酸カルシウムのＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルにより確認することができる。繊維状リン酸カルシウムの各成分の含有量比は、各成分のＸ線回折ピーク強度の相対値により算出することができる。α−ＴＣＰの含有量には（０３４面）、β−ＴＣＰの含有量には（０２１０）面、そしてＨＡｐの含有量には（２１１）面のピーク強度を用いることできる。本発明の繊維状リン酸カルシウムは、Ｘ線回折ピーク強度から算出されたＴＣＰの含有量が５０％以上にあることが好ましく、６０％以上にあることがより好ましく、８０％以上にあることがさらに好ましい。
【００１７】
本発明の繊維状リン酸カルシウムは、長さが６０〜２００μｍに範囲にあることが好ましい。アスペクト比は、２０〜１００の範囲にあることが好ましい。
【００１８】
本発明の繊維状リン酸カルシウムは、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウム、もしくはカルシウム欠損型の水酸アパタイト［Ｃａ10-x（ＨＰＯ4）x(ＰＯ4)6-x（ＯＨ）2-x・ｎＨ2Ｏ、０＜ｘ≦１、ｎ＝０〜２．５、以下ＤＡｐと略記することがある］からなる繊維状リン酸カルシウムを焼成することによって製造することができる。上記のＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムもしくはＤＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムの焼成温度は、１２００〜１５００℃の範囲である。この温度範囲にて焼成すると、繊維形状を維持したままＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐ、もしくはＤＡｐが分解してα−ＴＣＰが生成する。焼成温度が１２００℃以下であると主としてβ−ＴＣＰが生成し、焼成温度が１２００℃を超えると主としてα−ＴＣＰが生成する傾向にある。焼成時間は、一般に１〜２０時間の範囲である。また、この焼成は、空気雰囲気下あるいは水蒸気雰囲気下で行なうことが好ましい。
【００１９】
ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムは、カルシウム塩とリン酸塩とを含む水溶液（反応原料液）を尿素の存在下にて加熱することによって製造することができる。反応原料液のカルシウム塩とリン酸塩との濃度の比は、ＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して、０．８〜３．０の範囲にあることが好ましく、１．０〜１．６７の範囲にあることがよりに好ましい。カルシウム塩としては、硝酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウムなどを用いることができる。特に、硝酸カルシウムが好ましい。リン酸塩としては、リン酸水素二アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸アンモニウム、又はこれらの水和物を用いることができる。特に、リン酸水素二アンモニウムが好ましい。
【００２０】
尿素は、沈殿剤として作用し、尿素の分解によって発生するアンモニアが反応原料液のｐＨを調整し、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムの均一な沈殿を生成させる機能を果たす。尿素の使用量は、リン酸塩０．１モルに対して、０．２〜１．０モルの範囲であることが好ましい。
【００２１】
反応原料液は、酸性水溶液であることが好ましい。酸としては、硝酸、塩酸、酢酸及び硫酸などを挙げることができる。特に、硝酸が好ましい。酸の濃度は、０．０１〜１．０モル／Ｌの範囲にあることが好ましく、０．０５〜０．５モル／Ｌの範囲にあることがより好ましい。
【００２２】
上記の反応原料液を加熱すると、ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物が生成する。この繊維状物を、反応原料液中でさらに加熱すると、ＯＣＰとＤＣＰＡとが加水分解してＨＡｐが生成する。この繊維状物中のＯＣＰとＤＣＰＡの全てがＨＡｐに加水分解しないうちに加熱を止めることによって、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムを製造することができる。反応原料液の加熱温度は、ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物が生成するまでは、７０℃以上９０℃未満の温度であることが好ましく、７０〜８５℃の温度であることがより好ましい。加熱時間は、反応原料液の濃度などにより異なるが、一般に１０〜２５時間の範囲である。ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物生成後の加熱温度は、９０〜１８０℃の範囲にあることが好ましく、９０〜１３０℃の範囲であることがより好ましい。この加熱時間は、一般に１０〜２５時間の範囲である。
【００２３】
ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムが生成したことは、その繊維状リン酸カルシウムのＸ線回折パターン、及び赤外線吸収スペクトルにより確認できる。ＯＣＰ、ＤＣＰＡ、及びＨＡｐの含有量比は、Ｘ線回折のピーク強度比から算出することができる。ＯＣＰの含有量にはミラー指数（０１０）面、ＤＣＰＡの含有量には（０２０）面、ＨＡｐの含有量には（２１１）面の強度を用いることができる。ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの含有量比は、ＯＣＰ：ＤＣＰＡ：ＨＡｐで、５〜９０：５〜５０：５〜５０であることが好ましい。
【００２４】
ＤＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムもまた、カルシウム塩とリン酸塩とを含む水溶液（反応原料液）を尿素の存在下にて加熱することによって製造することができる。カルシウム塩とリン酸塩との濃度の比が、ＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８以上１．６７未満の範囲（好ましくは、１．０〜１．３の範囲）にある反応原料液を、上記のＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムの製造と同様に加熱して、ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物を生成させ、この繊維状物を、反応原料液中でさらに加熱して、ＯＣＰとＤＣＰＡの全量を加水分解させるとＤＡｐが生成する。ＯＣＰとＤＣＰＡとの混合物からなる繊維状物生成後の加熱温度は、９０〜１８０℃の範囲にあることが好ましく、９０〜１３０℃の範囲であることがより好ましい。
この加熱時間は、一般に５０〜１００時間の範囲である。
【００２５】
ＤＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムが生成したことは、その繊維状リン酸カルシウムのＸ線回折パターン、赤外線吸収スペクトル、及びＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）により確認できる。ＤＡｐは、Ｘ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルがそれぞれＨＡｐと同じであって、ＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）が１．６７よりも低い値を示す。
【００２６】
次に、本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体について説明する。
本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、上記のＴＣＰからなる繊維状リン酸カルシウムの係合により形成される。本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、直径が５０〜５００μｍの範囲にある気孔（マクロポア）からなる連続気孔を含み、気孔率が９５〜９９％の範囲にある。マクロポアは、細胞を成形体内部に取り込むための導通路として、あるいは取り込んだ細胞の足場として作用する。マクロポアの直径は、培養対象とする細胞の種類などに適宜調製する。例えば、骨芽細胞の場合には、１００〜２００μｍの範囲にあることが好ましく、１００〜１５０μｍの範囲にあることがより好ましい。
【００２７】
本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、例えば、前記のＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物からなる繊維状リン酸カルシウム、もしくはＤＡｐからなる繊維状リン酸カルシウムと、粒子径が５０〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料との混合物スラリを調製する工程、混合物スラリを吸引ろ過して、繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との板状形成体を得て、この板状形成体を１２００〜１５００℃の温度にて焼成して、可燃性球状材料を焼却除去するとともにα−ＴＣＰを生成させることにより製造することができる。
【００２８】
可燃性球状材料は、８００〜１５００℃の温度に加熱したときの灰分が１質量％以下となるものであることが好ましい。このような可燃性球状材料の材料の例としては、ポリメタルクリレート、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびカーボンを挙げることができる。これらのうちで好ましいのはカーボンである。なお、可燃性球状材料は、真球であることが好ましいが、必ずしも真球である必要はなく、略球形状であればよい。
【００２９】
混合物スラリの溶媒には、水あるいは水とアルコールの混合溶液を用いることが好ましい。溶媒として水とアルコールの混合溶液を用いる場合、その比率は容積比で、通常は、水：アルコールが１：９９〜９９：１の範囲にあり、好ましくは２５：７５〜７５：２５の範囲にある。アルコールとしては、メタノール、エタノールなどの１価アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの２価アルコールを用いることができる。特に、エタノールが好ましい。
【００３０】
繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との使用量は、繊維状リン酸カルシウム１質量部に対して、１〜２０００質量部の範囲にあることが好ましく、１０〜１０００質量部の範囲にあることがより好ましい。
【００３１】
板状形成体の焼成により、可燃性球状材料を焼却除去されて、成形体に気孔ならびに気孔連続体が形成するとともに繊維状のＴＣＰが生成する。焼成時間は、板状形成体のサイズなどにより異なるが、一般に１〜２０時間の範囲である。
【００３２】
上記の多孔質リン酸カルシウム成形体の製造においては、混合物スラリに直径が１〜１０μｍの範囲にある可燃性微粒子材料を添加してもよい。この可燃性微粒子材料の添加により、多孔質リン酸カルシウム成形体に直径が１〜１０μｍの範囲にある気孔からなる連続気孔が形成される。この連続気孔は、細胞の培養液を内部に取り込むためのミクロポアとして作用する。可燃性微粒子材料としては、前記の可燃性球状材料と同じ材料のものを用いることができる。可燃性微粒子材料の使用量は、繊維状リン酸カルシウム１質量部に対して、１〜１０００質量部の範囲にあることが好ましく、１０〜５００質量部の範囲にあることがより好ましい。
【００３３】
多孔質リン酸カルシウム形成体は、上記の混合物スラリをスプレードライ法により乾燥して造粒粉末を得て、この造粒粉末から形成した形成体を焼成することによっても製造することもできる。
【００３４】
【実施例】
［参考例１］
（１）リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、リン酸水素カルシウム（ＤＣＰＡ）及び水酸アパタイト（ＨＡｐ）の混合物からなる繊維状リン酸カルシウムの製造
硝酸カルシウム四水和物、リン酸水素二アンモニウム、及び尿素を、硝酸カルシウム四水和物０．１モル／Ｌ、リン酸水素二アンモニウム０．１モル／Ｌ、尿素０．５モル／Ｌの濃度となるように０．１モル／Ｌの硝酸に溶解して、反応原料液を調製した。この反応原料液を、環流冷却器付きの反応容器に入れ、８０℃の温度で２４時間加熱した後、さらに９０℃の温度で２４時間加熱した。加熱終了後、反応容器内の生成物を取り出して、洗浄乾燥した。得られた生成物の形態を電子顕微鏡で観察したところ、繊維状であり、その長さは６０〜２００μｍの範囲であり、アスペクト比は２０〜１００の範囲であった。この生成物のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この生成物は、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ及びＨＡｐの混合物であることが確認された。また、ＯＣＰの（０１０）面のＸ線回折ピーク、ＤＣＰＡの（０２０）面のＸ線回折ピーク、及びＨＡｐの（２１１）面のＸ線回折ピーク強度の比から、ＯＣＰ、ＤＣＰＡ、及びＨＡｐの含有量比を算出したところ、その値（ＯＣＰ：ＤＣＰＡ：ＨＡｐ）は８０：１５：５であった。
【００３５】
（２）多孔質リン酸カルシウム成形体の製造
上記の生成物を、水／エタノール混合溶液（１／１［体積／体積］）に懸濁して、濃度１ｇ／Ｌのスラリを調製した。このスラリに、粒子径が１５０μｍ以下のカーボンビーズ（ニカビーズ、日本カーボン（株）製）を、生成物／カーボンビーズが１／２０（質量／質量）となる量にて添加した後、充分に撹拌し、生成物とカーボンビーズとの混合物スラリを調製した。この混合物スラリを吸引ろ過して、固形分（生成物とカーボンビーズの混合物）を板状に形成した。次いで、この板状形成体を、水蒸気雰囲気下にて１０５０℃の温度で５時間焼成して、カーボンビーズを焼却除去した。
【００３６】
こうして得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体はβ−ＴＣＰの単一相から形成されていることが確認された。この成形体の表面状態を電子顕微鏡で観察したところ、長さが６０〜２００μｍ、アスペクト比が２０〜１００の繊維同士が焼結していることが確認された。また、この成形体の気孔率を測定したところ、その値は９８％であった。さらに、この成形体の細孔分布を水銀ポロシメータにより測定したところ、１００μｍ以上の比較的大きな気孔と１０μｍ以下の比較的小さな気孔とが形成されていることが確認された（図１）。
【００３７】
［実施例２］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を水蒸気雰囲気下にて１２００℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体はβ−ＴＣＰとα−ＴＣＰとの混合物から形成されていることが確認された。この成形体のβ−ＴＣＰとα−ＴＣＰとの含有量比を、Ｘ線回折パターンから読み取ったβ−ＴＣＰの（０２１０）面のピーク強度とα−ＴＣＰの（０３４）面のピーク強度との比から算出したところ、その値（β−ＴＣＰ：α−ＴＣＰ）は６０：４０であった。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００３８】
［実施例３］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を水蒸気雰囲気下にて１３００℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、α−ＴＣＰの単一相から形成されていることが確認された。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００３９】
［参考例２］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を空気雰囲気下にて１０５０℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、β−ＴＣＰの単一相から形成されていることが確認された。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００４０】
［実施例５］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を空気雰囲気下にて１２００℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、α−ＴＣＰとβ−ＴＣＰの混合物から形成されていることが確認された。この成形体のβ−ＴＣＰとα−ＴＣＰとの含有量比をＸ線回折パターンから読み取ったβ−ＴＣＰの（０２１０）面のピーク強度とα−ＴＣＰの（０３４）面のピーク強度との比から算出したところ、その値（β−ＴＣＰ：α−ＴＣＰ）は１０：９０であった。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００４１】
［実施例６］
前記参考例１（２）の板状形成体の焼成温度を空気雰囲気下にて１３００℃とした以外は、参考例１と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、α−ＴＣＰの単一相から形成されていることが確認された。
【００４２】
［参考例３］
（１）カルシウム欠損型の水酸アパタイト（ＤＡｐ）からなる繊維状リン酸カルシウムの製造
前記参考例１と同じ組成の反応原料液を、８０℃の温度で２４時間加熱した後、さらに９０℃の温度で７２時間加熱した。得られた生成物の形態を電子顕微鏡で観察したところ、繊維状であり、その長さは６０〜２００μｍの範囲であり、アスペクト比は２０〜１００の範囲であった。生成物のカルシウムとリンとのモル比（Ｃａ／Ｐ）、Ｘ線回折、及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この生成物は、Ｃａ／Ｐが１．５７のＤＡｐの単一相であることが確認された。
【００４３】
（２）多孔質リン酸カルシウム成形体の製造
上記の生成物を、水／エタノール混合溶液（１／１［体積／体積］）に懸濁して、濃度１ｇ／Ｌのスラリを調製した。このスラリに、粒子径１５０μｍ以下のカーボンビーズ（ニカビーズ、日本カーボン（株）製）を、生成物／カーボンビーズが１／２０（質量／質量）となる量にて添加した後、充分に撹拌し、生成物とカーボンビーズとの混合物スラリを調製した。この混合物スラリを吸引ろ過して、固形分（生成物とカーボンビーズの混合物）を板状に形成した。次いで、この板状形成体を、水蒸気雰囲気下にて１１００℃の温度で５時間焼成して、カーボンビーズを焼却除去した。
【００４４】
こうして得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、β−ＴＣＰとＨＡｐとの混合物から形成されていることが確認された。この成形体のβ−ＴＣＰとＨＡｐとの含有量比をＸ線回折パターンから読み取ったβ−ＴＣＰの（０２１０）面のピーク強度とＨＡｐの（２１１）のピーク強度との比から算出したところ、その値（β−ＴＣＰ：ＨＡｐ）は５０：５０であった。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００４５】
［実施例８］
前記参考例３（２）の板状形成体の焼成温度を水蒸気雰囲気下にて１２００℃とした以外は、参考例３と同じ操作を行なって成形体を製造した。得られた成形体のＸ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、この成形体は、α−ＴＣＰとＨＡｐとの混合物から形成されていることが確認された。この成形体のα−ＴＣＰとＨＡｐとの含有量比をＸ線回折パターンから読み取ったα−ＴＣＰの（０２１０）面のピーク強度とＨＡｐの（２１１）のピーク強度との比から算出したところ、その値（α−ＴＣＰ：ＨＡｐ）は５０：５０であった。また、この成形体の気孔率は９８％であった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明のリン酸三カルシウムからなる繊維状リン酸カルシウムは、従来の水酸アパタイトホイスカーと比べて生体吸収性が高いので、生体内の骨欠損部に充填した際の自家骨との置換が進行し易い。また、本発明の多孔質リン酸カルシウム成形体は、細胞を内部に取り込むための気孔（マクロポア）と細胞の培養に必要な培養液を内部に取り込むための気孔（ミクロポア）とが連続的に形成されているので、骨細胞や肝細胞などの各種細胞の培養に有利に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本参考例１にて製造した成形体の細孔分布を示す図である。
Claims (7)
- α−リン酸三カルシウムの単一相、もしくはα−リン酸三カルシウムとβ−リン酸三カルシウムとの混合物、またはα−リン酸三カルシウムと水酸アパタイトとの混合物からなり、長さが６０〜２００μｍの範囲にあって、アスペクト比が２０〜１００の範囲にある繊維状リン酸カルシウム。
- カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８〜３．０の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量が加水分解しないうちに加熱を止めることによって、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム及び水酸アパタイトの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程と、得られた繊維状リン酸カルシウムを１２００〜１５００℃の温度にて焼成することによりα−リン酸三カルシウムを生成させる工程とを含む請求項１に記載の繊維状リン酸カルシウムの製造方法。
- カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８以上１．６７未満の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量を加水分解させることによって、カルシウム欠損型の水酸アパタイトからなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程と、得られた繊維状リン酸カルシウムを１２００〜１５００℃の温度にて焼成することによりα−リン酸三カルシウムを生成させる工程とを含む請求項１に記載の繊維状リン酸カルシウムの製造方法。
- α−リン酸三カルシウムの単一相、もしくはα−リン酸三カルシウムとβ−リン酸三カルシウムとの混合物、またはα−リン酸三カルシウムと水酸アパタイトとの混合物からなり、長さが６０〜２００μｍの範囲にあって、アスペクト比が２０〜１００の範囲にある繊維状リン酸カルシウムの係合により形成された、直径が５０〜５００μｍの範囲にある気孔からなる連続気孔を有し、気孔率が９５〜９９％の範囲にある多孔質リン酸カルシウム成形体。
- 細胞培養用である請求項４に記載の多孔質リン酸カルシウム成形体。
- カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８〜３．０の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量が加水分解しないうちに加熱を止めることによって、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム及び水酸アパタイトの混合物からなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程、得られた繊維状リン酸カルシウムと粒子径が５０〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料との混合物スラリを調製する工程、混合物スラリを吸引ろ過して、繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との板状形成体を得る工程、そして板状形成体を１２００〜１５００℃の温度にて焼成して、可燃性球状材料を焼却除去するとともにα−リン酸三カルシウムを生成させる工程を含む請求項４に記載の多孔質リン酸カルシウム成形体の製造方法。
- カルシウム塩とリン酸塩とをＣａとＰとのモル比（Ｃａ／Ｐ）に換算して０．８以上１．６７未満の範囲となる量にて含む水溶液を尿素の存在下にて７０℃以上９０℃未満の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムとの混合物からなる繊維状物を生成させ、次いで、この繊維状物を９０〜１８０℃の温度で加熱して、リン酸八カルシウムとリン酸水素カルシウムの全量を加水分解させることによって、カルシウム欠損型の水酸アパタイトからなる繊維状リン酸カルシウムを生成させる工程、得られた繊維状リン酸カルシウムと粒子径が５０〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料との混合物スラリを調製する工程、混合物スラリを吸引ろ過して、繊維状リン酸カルシウムと可燃性球状材料との板状形成体を得る工程、そして板状形成体を１２００〜１５００℃の温度にて焼成して、可燃性球状材料を焼却除去するとともにα−リン酸三カルシウムを生成させる工程を含む請求項４に記載の多孔質リン酸カルシウム成形体の製造方法。
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