JP4676484B2 - 臨床応用のための融合タンパク質の塩基配列決定及び遺伝子発現 - Google Patents

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Description

本発明は、融合タンパク質(FP)及びその遺伝コードの発現方法と遺伝子工学及び免疫学分野における用途に関し、特に、この融合タンパク質が抗アレルギー薬の有効成分として作用する場合の、その遺伝コードの発現方法と遺伝子工学及び免疫学分野における用途に関する。
アレルギー性疾患は、急性及び慢性疾患の6番目の主な原因である。この疾患は、30%〜60%で遺伝する可能性がある。アレルギー性鼻炎、喘息、アレルギー性皮膚炎、アレルギー関節炎、じんましん、アレルギー性ショック等は、一般的なアレルギー性疾患である。アレルギー性鼻炎は、目、鼻、副鼻腔に影響する。鼻詰り、鼻水、耳及び咽喉、後鼻腔、涙目、目のかゆみ、気管支炎を生じ、花粉症としても知られている。アレルギー性皮膚炎は、皮膚に影響し、かゆみを伴う発疹を生じる。接触皮膚炎としても知られている。喘息は、肺に影響し、息切れ又は喘鳴を生じる。食物アレルギーは、胃、及び他の内臓に影響し、また、全身に症状を生じる可能性がある。じんましんは、皮膚にじんましんを生じる症状である。特別な注意が必要なアレルギー反応は、過敏症であり、急激な、重度の、死に至る可能性のある体の様々な部位に作用する可能性がある症状を伴う。通常、症状は、アレルゲンへの暴露後非常に早く現れ、全身中の激しいかゆみ、全身の腫れ、呼吸困難を含み、生死に係わるショックに至る可能性さえある。中国人人口の約10%〜15%、アメリカ人人口の約20%がアレルギー性疾患を患っている。
今日、アレルギー性疾患の治療薬の大部分は、臨床症状のコントロールに主に使用され、ステロイドホルモン、抗ヒスタミン薬、充血軽減薬、ジソジウム・クロモグリケイト、及び気管支拡張薬が使用される。近年、米国食品医薬品局は、臨床実験での抗IgEモノクローナル抗体の使用を認可した。これらの薬は、様々な副作用がある。研究所、大学及び製薬会社が新しい抗アレルギー薬を追求している。
目下、アレルギー性疾患の治療薬は、臨床症状を調節するために主に使用され、ステロイドホルモン、抗ヒスタミン薬、充血軽減薬、及び気管支拡張薬が挙げられる。近年、米国食品医薬品局は、臨床実験での抗IgEモノクローナル抗体の使用を認可した。これらの薬は、様々な副作用がある。研究所、大学及び製薬会社は新しい抗アレルギー薬を追求している。
アレルギー反応のメカニズムは以下の通りである。すなわち、抗原(アレルゲン)が体内に侵入すると、肥満細胞及び好塩基球上に付着したIgG分子(細胞親和性抗体)と結合して細胞の免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を活性化し、細胞の生物活性物質の放出が促進されて、平滑筋の収縮、血管透過性の上昇、漿液の分泌等の臨床病理学的変化が起こる。ヒト肥満細胞及び好塩基球上の親和性IgEレセプター(FcεRI)は、この病理学的プロセスにおいて、アレルギー性疾患の主要な役割を果たす。一方、FcrRII阻害レセプターは、ヒト肥満細胞及び好塩基球上に発現している。IgG2分子がレセプターに同時に結合すると、重合が起こり免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)のリン酸化が誘発され、FcεRIの活性化シグナルが抑制される。最近の研究により、FcrRIIレセプターとFcεRIレセプターとが相互リンクすると、ヒト肥満細胞及び好塩基球中の阻害シグナルが誘導されて細胞中の活性経路がブロックされるため、活性化メディエーターの放出が抑制され、更に、アレルギー反応が抑制されることが示された。従って、アレルギー反応内の阻害シグナルをこのメカニズムによって活性化可能な融合タンパク質の開発は、抗アレルギー薬開発の新しいアプローチである。
アレルギー体質の特徴は、抗原(アレルゲン)提示後、持続的なIgE反応を維持する傾向である。抗原への初期暴露は、特定のIgE分子の産生を刺激し、この分子は肥満細胞表面の高親和性Fcレセプターに結合する。抗原へ再び暴露されると、抗原と膜結合IgE分子との相互結合により血管作用物質が放出し、くしゃみ、かゆみ、及び気管支痙攣の臨床症状を誘発する。免疫グロブリンレセプター(Fcレセプターともいう)は、肥満細胞の細胞表面レセプターであり、免疫グロブリンの定常部に結合し、抗原結合以外に様々な免疫グロブリン機能を仲介する。
IgE分子と結合するFcレセプター(免疫グロブリンの一種)は、免疫系の多種類の細胞に見出される。現在IgEとして知られているFcレセプターは、多数鎖高親和性レセプター(FcεRI)、及び低親和性レセプター(FcεRII)の二種類がある。IgE分子は、これらのFcレセプターを介して抗体として生物学的反応を仲介する。肥満細胞、好塩基球、ランゲルハンス細胞の表面に発現した高親和性FcεRIレセプターは、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属し、レセプター発現及び情報伝達に必要とされるα‐鎖、β‐鎖及び2つのジスルフィド結合γ‐鎖からなる四量体構造を有する。レセプターのα‐鎖は、IgEのH鎖の第3の定常領域の遠位部と相互作用する。ヒトFcεRIレセプターの結合に関わるヒトIgE分子の特異的な領域は、6つのアミノ酸Arg‐408、Ser‐411、Lys‐415、Glu‐452、Arg‐465及びMet‐469を含むものとして同定されている。相互作用は、結合定数約10 10 −1 と極めて特異的である。
好酸球、白血球、Bリンパ球、及び血小板等の炎症細胞表面に発現する低親和性FcεRIIレセプターは、免疫グロブリンスーパーファミリーから進化したものではないが、2、3の動物群と実質的に相同であり、細胞質内NH 末端の膜貫通型鎖からなる。低親和性レセプター(FcεRII(CD23))は、現在のところ2つの形態FcεRIIa及びFcεRIIbを有し、どちらもクローン化及び塩基配列決定されている。2つの形態は、N‐末端細胞質領域だけが異なり、細胞外ドメインは同一である。サイトカインIL‐4による誘導でFcεRIIaは通常B細胞に発現し、FcεRIIbはT細胞、B細胞、単球、及び好酸球に発現する。
高親和性FcεRIレセプターを介して、IgEは、アナフィラキシーショックの深刻な生理条件に加えて、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、重度の食物アレルギー、慢性じんましん、血管性浮腫を含む数々の急性及び慢性アレルギー反応に重要な役割をする。抗原特異的IgE分子に対する多価抗原結合は、特に、肥満細胞、又は好塩基球の表面のFcεRIレセプターに結合し、複雑に連続したシグナル伝達事象を活性化して、急性及び後期アレルギー反応に寄与する多数の血管作用及び前炎症性メディエーターが放出される。
Bリンパ球の表面に見られる低親和性FcεRIIレセプター(CD23)の機能は、FcεRIレセプターの機能よりも確立されていない。重合状態のFcεRIIレセプターは、IgE分子に結合し、この結合は、B細胞から産生される抗体の型(類)を調整する役割を果たし得る。
ヒトIgG分子の定常領域に結合するFcγレセプターは、3つのグループがこれまで細胞表面で同定されている。これらは、FCγRI(CD64)、FCγRII(CD32)及びFCγRIII(CD16)であり、これらはすべて、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属する。3つのFCγレセプターは、多数の様々なアイソフォームを有する。
刺激FcεRIレセプターに加えて、肥満細胞、及び好塩基球もまた、抗体機能を負に調節するよう作用するFcγRIIbレセプターと言われる、免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を有する抑制性低親和性レセプターを共発現する。FcγRIIbレセプターは、抑制性免疫レセプタースーパーファミリー(IRS)に属し、免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を有する免疫レセプター、及び他の様々な細胞応答を負に調節する構造及び機能が類似する抑制性レセプターの増殖因子ファミリーである。IRSメンバー(例えば、FcγRIIレセプター)と活性化レセプター(例えば、FcεRIレセプター)との共凝集は、特徴的なITIMチロシンのリン酸化反応に続いて、SH2領域含有タンパク質チロシンホスファターゼSHP‐1及びSHP‐2、及びSH2領域含有ホスファターゼSHIP及びSHIP‐2が漸増する。共凝集の結果として、FCγRIIbと細胞レセプターとの共凝集、及びT細胞レセプターと活性化レセプター(FCεRI及びサイトカイン等)との共凝集により立証されるような細胞活性化を阻害可能であることが挙げられる。喘息、アレルギー性鼻炎、及び重度の食物アレルギー反応の主な要因は、肥満細胞及び好塩基球から放出された誘発されたIgEを促進するメディエーターである。肥満細胞又は好塩基球FcεRIレセプターと多価抗原との相互反応は、β−及びγ−FcεRIサブユニットの細胞質尾部における免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)のチロシンリン酸化作用により、Sykを介して下流シグナル伝達を始める。肥満細胞、及び好塩基球もまた、FcγRIIbレセプターを発現し、細胞質尾部内に単独保存された免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含む。研究により、FcεRIへのFcγRIIbの凝集が、FcεRIに会合するLyn及びFcεRIシグナル伝達阻害によるFcγRIIb ITIMチロシンの迅速なチロシンリン酸化に繋がることが示されている。この仮説は、ヒト好塩基球にFcεRI及びFcγRIIbレセプターを直接架橋するヒトIg FCγ−Fcε融合タンパク質を使用する実験にサポートされている。
本発明の目的は、遺伝子及びその遺伝子がコードする、抗アレルギー活性を有する融合タンパク質を提供することである。
本発明で使用される融合タンパク質は、FP4と称され、配列番号2のアミノ酸配列を有する機能タンパク質若しくは配列番号2から由来のタンパク質、又は配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸を一つ以上増減することによって得られるすべての置換物である。
配列番号2のアミノ酸配列のFP4融合タンパク質は、554アミノ酸を含む(図1)。FP4構造は、3つの部分からなる:A領域(Fcε)(N末端から1〜300番目のアミノ酸)、B領域(Fcγ)(N末端から318〜554番目のアミノ酸、及びC領域(ヒンジ)(N末端における301〜317番目のアミノ酸)。これらの中で、A領域は、ヒト免疫グロブリンIgEに由来し、IgEレセプターのリガンドである(FCεRI)。B領域は、ヒト免疫グロブリンIgGに由来し、IgGレセプターのリガンドである(FcγRII)。C領域は、ヒト免疫グロブリンIgGに由来し、ねじれ構造である。
融合タンパク質FP4は、次の配列を有する。
1)配列番号1:DNA配列
2)配列番号2:アミノ酸配列
3)配列番号1で表されるDNA配列と95%を超える相同性を有し、且つ、同じ機能タンパク質配列をコードするDNA配列。
配列1のDNA配列は、1665塩基対からなる。読み枠は、5末端で始まる1番目の塩基対から1665番目の塩基対までである。
本発明の遺伝子を含有する、発現ベクター、キャリア、及び細胞株も本発明の特許権保護下にある。
FP4の一対のプライマーでの増幅もまた、本発明の保護の拡張で保護される。
本発明の第2の目的は、融合タンパク質FP4の発現方法を提供することである。
本発明で導入されるFP4の発現方法は、融合タンパク質FP4を発現する陽性クローンを得るためにFP4遺伝子をSP2/0細胞にトランスフォーメーションすることである。
発現ベクターは、通常の方法を使用して構築され、FP4遺伝子がpSecTagベクターにクローニングされる。
本発明の第3の目的は、有効成分が融合タンパク質FP4である抗アレルギー薬を提示することである。
必要に応じて、上記の薬に1つ又は複数のキャリアを加えることができる。これらのキャリアは、薬学的な仕様の希釈剤、賦形剤、助剤、結合剤、湿潤剤、粉末化医薬製剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸収キャリア、及び潤滑剤等が挙げられる。必要であれば、また、香料添加剤、及び甘味剤も添加可能である。
本発明の薬は、いくつか方法があるが、特に、静脈内注射、皮下注射、又は皮膚に直接塗布して使用可能である。鼻内噴霧として、及び喉、口、皮膚、又は膜吸入器も使用可能である。更に、この薬は、鼻用水性懸濁液、点眼液、又は点耳液として適用可能である。更に、直腸ゲル、錠剤、粉末、丸薬、カプセル、液剤、オイルクリーム、クリーム、及び様々な他の形態で使用可能である。上記の方法は、正確な用量を決定するために従来の方法で薬学的に調製可能である。
上記の全ての薬は、概して、用量が0.01〜1ug/kg/日、及び治療期間が10〜20日間である。
実施例1:融合タンパク質FP4の発現
図2に示すように、融合タンパク質FP4の発現方法は、以下の工程を含む。ヒト末梢血からのBリンパ球を精製する工程;及び、ゲノムDNAを特異的に直接分離して以下の通りに通常の処理を行う工程。
P1(Fcε):5’-GTGGCCCAGCCGGCCTTCACCCCGCCCACCGTGAAG-3’;
P2(Fcε):5’-GTGGATCCTTTACCGGGATTTACAGACAC-3’;
P3(Fcγ):5’-GGGGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3’;
P4(Fcγ):5’-GTGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。
ポリメラーゼ連鎖反応によりFcε及びFcγ遺伝子を増幅し、Fcε及びFcγのPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動した。図3に結果を示す。Fcε DNA PCR産物は、1155bpであり、Fcγ DNA PCR産物は、928bpである。PCR産物は、pCR4−TOPOベクター(インビトロジェン カリフォルニア州)に直接クローニングした。ライゲーション後、FPEFc−ε及びFPGFc−γを得て、ヌクレオチド配列分析を行った。
ヌクレオチド配列が正しいことを確認した後、Fcε遺伝子をSfiI−BamHI(NEW ENGLAND BIOLABS)で切断した。Fcγ遺伝子はBamHI−NotIで切断した。その間にpSecTag発現ベクター(インビトロジェン カリフォルニア州)をSfiI−NotIで切断し、Fcε及びFcγをpSecTagFP4にライゲーションした。挿入配列は図1と同じであることを確認した。pSecTagFP4ベクターを、マウス骨髄腫SP2/0細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。ゼオシン(R)で選別後、陽性クローンを酵素免疫測定法(ELISA)によりスクリーニングした(マウス抗ヒトIgEでプレートをコーティングし、クローンの上清を添加し、そしてヤギ抗ヒトIgE−APコンジュゲートを添加する)。FP4タンパク質を高度に発現する陽性クローンを得た。
FBS RPMI 1640培地(インビトロジェン カリフォルニア州)10%を使用して陽性クローンを37℃、CO5%で15日間培養した。上清を2000rpmで遠心分離して回収し、抗ヒトIgEアフィニティーカラムを使用してFP4タンパク質を精製した(マウス抗ヒトIgEをCNBr-activated Sepharose 4B(ファルマシア)に結合)。
実施例2:FP4及びFcεRIレセプター結合実験
1×10個のCHO3D10細胞を、精製したFP45μgと4℃で1時間インキュベートし、FITCラベル抗ヒトIgE(カルタグ カリフォルニア)5μlを加え、フローサイトメトリーで分析した。図4に結果を示した。FP4タンパク質はFcεRIレセプターに結合し、CHO3D10のFITC陽性を示す。図4において、SSC−Hは、細胞質の粒状度、FSC−Hは細胞の大きさ、FL2−HはPE、及びFL1−HはFITCである。
実施例3:FP4及びFcγRIIレセプター結合実験
1×10個のHMC‐1細胞を、精製したFP4タンパク質5μgと4℃で1時間インキュベートし、FITCラベル抗ヒトIgG(カルタグ カリフォルニア州)5μlを加え、フローサイトメトリーで分析した。結果はFP4タンパク質がFcγRIIレセプターに結合した。HMC‐1細胞はFITC陽性を示し(図5)、SSC−Hは、細胞質の粒状度、FSC−Hは細胞の大きさ、FL2−HはPE、及びFL1−HはFITCである。
実施例4:in vitroFP4タンパク質機能実験
ヒト末梢血からのヒト好塩基球を分離精製した。精製した好塩基球(1×10)を、特異的ヒト抗NP−IgE(セロテック)1〜10μgと37℃で2時間インキュベートし、NP−BSAを2μg加えた。ヒスタミン放出をELISAで測定した。結果は、FP4タンパク質が用量依存的にヒト好塩基球でのヒスタミン放出を有意に阻害した(図6)。Hu IgEは、ヒトIgE、NS IgEは非特異的ヒトIgE、NP−BSAはアレルゲン、+は付加、−は付加なしを表す。
実施例5:in vivoFP4タンパク質機能実験
ヒトFcεRIα鎖トランスジェニックマウス(カリフォルニア大学サンディエゴ校)に、ヒト抗NP−IgE(セロテック)を皮内注射し、4時間後にNP−BSA 100μg+Evans blue(シグマ)染料1%を静脈注射した。アレルギー反応が起これば、血管から染料が漏れるため皮膚が局所的に青く変色する。同量の融合タンパク質(FP4)を加えた場合、アレルギー反応は完全に阻止され、皮膚が局所的に青く変色しなかった(図6)。この実験結果により、FP4タンパク質がin vivoでアレルギー反応が阻止することが更にわかった。
本発明において、融合タンパク質FP4の構成成分は、ヒト免疫グロブリンに由来する。従って、該タンパク質は人体に薬として入り、抗原を有さない(異種タンパク質免疫源)。融合タンパク質FP4 C領域(ヒンジ)は融通が利き、容易に回転し、及びFcεRIとFcγRIIとを結合可能である等の特徴を得るため、細胞を刺激してシグナル送信を阻止し、細胞の様々な活発な生物学的粒子の放出を阻害して、アレルギー反応の発生を防止する。上記実験の全ての結果は、アレルギー反応を防止するために、融合タンパク質FP4が、好塩基球顆粒細胞表面の脂肪細胞又はFc_RIとFc_RIIとを効果的に結合可能である。本発明の融合タンパク質FP4は、IgEアクセプターの機能を阻止するためにIgEモノクローナル抗体を得るだけでなく、より重要なことはシグナル抑制により細胞のシグナル変換経路内のアレルギー反応が始まることである(細胞シグナル伝導系抑制系内でのアレルギー反応の開始はより重要である)。更に、細胞のアレルギー反応の抑制を強化し、アレルギー性疾患治療に不可欠な役割を果たす。
図1は、FP4の分子構造である。 図2は、FP4のクローニングのフローチャートである。 図3Aは、FcεPCR産物の電気泳動分析結果である。 図3Bは、FcγPCR産物の電気泳動分析結果である。 図4は、FP4のFcεRIレセプターへの結合能力のフロー分析である。 図5は、FP4のFcγRIIレセプターへの結合能力のフロー分析である。 図6は、ヒト好塩基球でヒスタミン放出を阻害したFP4タンパク質を示す。 図7は、遺伝子導入マウスでアレルギー反応を阻止したFP4融合タンパク質を示す。

Claims (10)

  1. 配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質及び、
    前記配列番号2で表されるアミノ酸配列に由来し、且つ、前記配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と同じ抗アレルギー活性を有し、且つ、前記配列番号2で表されるアミノ酸配列に対する一つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって生成されるタンパク質
    のいずれかであることを特徴とする融合タンパク質。
  2. 配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する請求項1に記載の融合タンパク質。
  3. 融合タンパク質コード遺伝子であって、
    1)配列番号1で表されるDNA配列、
    2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、及び
    3)配列番号1で表されるDNA配列と90%を超える同一性を有し、且つ、前記配列番号1で表されるDNA配列にコードされるタンパク質と同じ抗アレルギー活性を有するタンパク質をコードするDNAのDNA配列
    のいずれか1つのDNA配列を有することを特徴とする融合タンパク質コード遺伝子。
  4. 前記融合タンパク質コード遺伝子が、配列番号1で表されるDNA配列からなる遺伝子であることを特徴とする請求項3に記載の融合タンパク質コード遺伝子。
  5. 請求項3に記載の融合タンパク質コード遺伝子を含有する、発現ベクター及び細胞株。
  6. 請求項3に記載の融合タンパク質コード遺伝子を増幅するための一対のプライマー。
  7. 請求項1に記載の融合タンパク質を発現させる方法であって、
    融合タンパク質コード遺伝子を含む発現ベクターをSP2/0細胞にトランスフォーメーションして陽性クローンを得る工程と、
    該陽性クローンを培養して融合タンパク質FP4を発現させる工程と
    を含み、
    該融合タンパク質コード遺伝子は
    1)配列番号1で表されるDNA配列、
    2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、及び
    3)配列番号1で表されるDNA配列と90%を超える同一性を有し、且つ、前記配列番号1で表されるDNA配列にコードされたタンパク質と同じ抗アレルギー活性を有するタンパク質をコードするDNAのDNA配列
    のいずれか1つのDNA配列を有することを特徴とする融合タンパク質を発現させる方法。
  8. 前記融合タンパク質コード遺伝子を含む発現ベクターが、発現ベクターpSecTagへの前記融合タンパク質コード遺伝子のライゲーションによって得られる請求項7に記載の方法。
  9. 請求項1に記載の融合タンパク質を有効成分とした抗アレルギー薬。
  10. 抗アレルギー治療用薬剤の調製への請求項1に記載の融合タンパク質の使用。
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US10293059B2 (en) * 2015-04-09 2019-05-21 Cornell University Gene therapy to prevent reactions to allergens
CN104922670A (zh) * 2015-05-06 2015-09-23 武汉奥斯梅得生物医药有限公司 融合免疫蛋白在制备治疗多发性硬化症药物中的应用
CN107383200B (zh) * 2016-05-17 2021-04-09 深圳先进技术研究院 鼠源抗人IgE单克隆抗体的制备方法及其应用
CN111454366B (zh) * 2019-01-21 2023-06-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种融合蛋白及其应用
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CN116410327A (zh) * 2021-12-31 2023-07-11 祝道成 一种融合蛋白及其制备方法和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7265208B2 (en) * 2001-05-01 2007-09-04 The Regents Of The University Of California Fusion molecules and treatment of IgE-mediated allergic diseases
EP1487480B1 (en) * 2001-05-01 2015-10-07 The Regents of The University of California Fusion molecules for treatment of immune diseases
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