JPH05504482A

JPH05504482A - ヒトε免疫グロブリン固定ペプチドの細胞外部分及びそれに特異的な抗体

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Publication number: JPH05504482A
Application number: JP3504845A
Authority: JP
Inventors: チャン　ツェ　ウェン
Original assignee: タノックス　バイオシステムズ　インコーポレイテッド
Priority date: 1990-01-23
Filing date: 1991-01-23
Publication date: 1993-07-15
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: AU645783B2; ATE154637T1; GR3024563T3; EP0512064B1; CA2074089A1; JP3449712B2; DE69126607T2; EP0512064A1; SG70982A1; HK1002034A1; CA2074089C; AU7317991A; ES2107454T3; DK0512064T3; DE69126607D1; WO1991011456A1; EP0512064A4; AU5214893A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトε免疫グロブリン固定ペプチドの細胞外部分及びそれに特異的な抗体発明の背景外因性喘息、枯草熱及びある種の食品や薬剤に対するアレルギー反応のような直接型過敏症は、免疫グロブリンの１つのアイソタイプであるＩｇＥにより主に媒介される。ＩｇＥ媒介アレルギー反応において、アレルゲンはマスト細胞及び好塩基球の表面上のレセプターに結合したＩｇＥに結合する。アレルゲンの結合により表面ＩｇＥ分子が架橋し、それによってその下のＩｇＥのＦｃ部分に対するレセプター（ＦｃＥＲ）が架橋し、これがヒスタミン、アナフィラキシ−の遅延反応物質（ＳＲＡ）及びセロトニンのような薬理的媒介物質の放出のきっかけとなる。これらのマスト細胞及び好塩基球産物の放出が病理学的反応及びアレルギー徴候を引き起こす。

ＩｇＥは特定のクラスのＢ細胞により分泌され、また、該Ｂ細胞の表面上にも存在する。特定のアレルゲンに対して感作された個体中では、該アレルゲンに対して特異的なＩｇＥがこれらのＢ細胞によって継続的に産生される。それにもかかわらず、系中に分泌されたＩｇＥ（及びＩｇＥ産生Ｂ細胞）を持たない個体は正常に生きているように思われ、このことはＩｇＥが免疫応答に必須的でないことを示している。もっとも、ＩｇＥは寄生生物による感染と戦うために有用であるかもしれない。

従って、ＩｇＥ産生Ｂ細胞を抑制し又は枯渇させることによって分泌ＩｇＥを減少させることは、アレルギーの有用な治療方法であろう。ＩｇＥ産生Ｂ細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体（並びにその誘導体及び関連産物）は、このような抑制又は排除過程に用いることができるであろう。免疫系の調節、細胞溶解又は細胞障害機構は、モノクローナル抗体又はその誘導体若しくは関連産物により結合された細胞を抑制し又は破壊するために用いることができる。

ＩｇＥは好塩基球及びマスト細胞の表面上のＦｃεＲレセプターに非常に強く結合し、その会合定数Ｋａは約１ｘｌＯ”リットル１モルである。ＩｇＥが好塩基球及びマスト細胞により合成されないとしても、ＩｇＥとＦｃＥＲとの非常に強力で安定な会合は、ＩｇＥが最終的には常にこれらの細胞の表面上に存在し、露出していることを意味する。従って、Ｂ細胞上のＩｇＥを標的とする免疫治療剤は、このＩｇＥ及びその下のＦｃＥＲの架橋及びそれに伴うアレルギー反応の開始を回避するために、好塩基球及びマスト細胞上のＩｇＥと反応してはならない。

発明の概要免疫グロブリンは２つのペプチド鎖、すなわちＨ鎖及びＬ鎖から成る。ＩｇＨにおいては、Ｈ鎖はε鎖と示される。膜固定ペプチドは、免疫グロブリンのＨ鎖のＣ末端から延び、付随する免疫グロブリンを細胞膜表面に固定する。これらの膜固定ペプチドは、原形質膜に対する位置に基づき、３つの部分に分けられる。

中央部分は２５個の疎水性及び非帯電アミノ酸から成り、このことは、これらが膜の脂質二重層中に存在することを示唆している。Ｃ末端親水性部分は３〜２８個のアミノ酸から成り、このことはこれらが細胞内に存在することを示唆している。Ｎ末端に向かう部分は非常に酸性で親水性の約１３〜６７個のアミノ酸から成り、このことはこれらが原形質膜の細胞外表面上に存在することを示唆している。

これらのペプチドの細胞外部分は異なるアイソタイプのそれぞれについて固有のものである。従って、ε銀膜固定ペプチドの細胞外部分は、全体的に又は部分的に、ＩｇＥを産生ずるＢ細胞に固有のエピトープを形成している。しかしながら、この膜結合免疫グロブリンアイソタイプ特異的（ｍｉｇｉｓ）な細胞外エピトープは、分泌された、可溶性のＩｇＥ　（又はＦｃＥＲに結合したＩｇＥ上）には存在しない。なぜなら、Ｂ細胞の表面に結合したＩｇＥのみが、そのＨ鎖の一部として膜固定ペプチドを有するがらである。本発明の抗体及び他の免疫治療剤は、ＩｇＥ担持Ｂ細胞の表面上のｍ１ｇ１ｓエピトープに結合する。これらのＢ細胞は次いで多数の免疫機構により排除され又は制御される。これらの抗体及び他の免疫治療剤は、以下にさらに記載するように、生体内及び生体外アレルギー治療並びに診断に用いることができる。

これらの抗体又はその関連物質による治療が、結合型及び分泌型の両方のｒｇＥに共通なエピトープに結合する抗体又はその関連物質を用いる治療に比べて優れている１つの点は、後者は抗体−１ｇＥ免疫免疫物を形成するということである。免疫複合物は腎臓又は他の生理機能に問題をもたらすかもしれない。

代替的ｍＲＮＡスプライシングの故に、ヒトε鎖の膜固定領域中のペプチドをコートする少なくとも３つの異なるヌクレオチド配列が存在することが発見された。これら３種類のヌクレオチド配列によりコートされる推定アミノ酸配列もまた異なっており、このことはヒトε銀膜固定ペプチドの３つの異なるアイソフオームが存在することを示している。

アイソフオーム■の推定アミノ酸配列は、６７個のアミノ酸残基及びＮ末端に向かう１５個のアミノ酸ペプチド部分を有していることを示している。この１５個のアミノ酸部分は細胞外にあり、全体的に又は部分的にｍ１ｇ１ｓエピトープを形成するものと提案される。アイソフオーム■１は１１９のアミノ酸残基を有し、そのうちの６７アミノ酸はＮ末端に向かう細胞外部分を形成しているものと提案される。アイソフオームＩＩＩは４５個のアミノ酸残基を有し、分泌され、膜結合細胞外部分を有していない。

図面の簡単な説明図１は、ヒトε膜固定ペプチドの３つの異なる提案されるアイソフオーム（■、ＩＩ及びＩＩＩ）を創製する３つの異なるｍＲＮＡスプライシングを示す。”＊ ”はリーディングフレーム中の停止コドンを示す。ＣＨ４領域の末端にある、黒く塗りつぶした短い領域は分泌されたε鎖のＣ末端を表す。

図２Ａはヒトε鎖の膜固定ペプチドのアイソフオームＩのペプチドコードヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。下線を引いた部分が膜脂質二重層にわたると考えられる疎水性アミノ酸である。太字で示す領域が細胞表面外におそらく露出している部分である。

図２Ｂはヒトε鎖の膜固定ペプチドのアイソフオームＩ＋のペプチドコードヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。太字で示す部分がアイソフオームＩ＋に固有のアミノ酸配列を示す。

図２０は、ヒトε鎖の膜固定領域である、アイソフオームＩＩ＋のペプチドコードヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。太字で示す部分がアイソフオームＩ１１に固有のアミノ酸配列を示す。

図３Ａ及び図３Ｂはそれぞれ、ヒトε銀膜固定ペプチドを含むクローン並びに分泌された及び膜結合１ｇＥを含むクローンをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングするために用いることができるＤ　Ｎ　Ａプローブの位置を示す。

図４は、ＨＥ　Ｍ　７の種々のｍ１ｇ１ｓペプチドに対する結合を示す。結果は、ポリクローナルヒト血清１ｇＥ　（◇）又は合成ｍ１ｇ１ｓペプチド、すなわち、・ｍ１ｇ１ｓ−ａ、Ｘｍ１ｇ１ｓ−ｕ、０ｍ１ｇ１ｓ−７、Δｍ１ｇ１ｓ− ａ、若しくはワ”ｍ１ｇ１ｓ−δで被覆したマイクロタイタープレートを用いた３種類のＥＬＩＳＡの１つの代表例の２回の平均を示す。

図５Ｃは、蛍光フローサイトメトリーにより決定された、ＨＥＭ７のＩｇＥ分泌細胞に対する結合を示す。図５Ｂは、分泌１ｇＥに対するモノクローナル抗体ＣＶｋ性対照）であるＴＥＳ−１９の当量濃度（１０μｇ／ｍ　ｌ　）におけるＳＫ○−００７細胞への結合を示す。図５Ａは抗体を加えなかった対照を示す。

図６Ａは、ｆｌ々（７）ｉ１１度ニオケル、ＨＥＭ７のｌ　ｇＥ分ｔ、５Ｋｏ− ００７細胞への濃度依存的結合を示す。

図６３はｍ１ｇ１ｓ−εペプチドによるＨ　Ｅ　Ｍ７の５ＫＯ−００７細胞への結合の特異的阻害を示す。・ＨＥ　Ｍ　７とｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓ−εペプチド、ＯＨＥＭ７とｍ１ｇ１ｓ−γペプチド、△ＴＥＳ−１９とｍ１ｇ１ｓ−εペプチド。示した値は、３つの別々の測定結果の平均である。

図７は、膜結合１ｇＥとＨＥＭ７のウェスタン免疫プロッティング分析の結果を示す。分子量マーカーの相対的移動度は左側に示されており、膜結合ε及び分泌との位置が右側に示されている。ａ　ポリクローナル抗ε抗体によってプローブされた血清１　ｇＥ６ｂ　：　ＨＥＭ７によりプローブされた血清１ｇＥ０ｃ　ポリクローナル抗ε抗体によってプローブされた５ＫＯ−００７細胞の原形質膜。ｄＨＥＭ７によってプローブされた５ＫＯ−００７細胞の原形質膜。ｅ：１００μｇ／ｍｌのｍ１ｇ１ｓ−εペプチドの存在下においてＨＥＭ７によってプローブされた５ＫＯ−００７細胞の原形質膜。

好ましい態様並びに製造及び使用方法の詳細な説明１、ｍｌ　１ｓエピトープ　びに−び％　にお（るそれ゛のＢ細胞上の膜結合免疫グロブリ／は、同じＢ細胞によって合成された分泌可溶性免疫グロブリンとは、Ｂ細胞表面に該免疫グロブリンを固定する余分のペプチド部分を有している点で異なる。アミノ酸配列が決定されている異なる種からのＢ細胞上の膜結合免疫グロブリンは免疫グロブリンを膜に固定する余分のアイソタイプ特異的領域を有する。これらのペプチド領域は４１〜１３０のアミノ酸を有し、３つの部分に分けることができる。２５個の疎水性かつ非帯電アミノ酸からなる中央部分があり、これは細胞膜二重層中に位置するものと信じられる。３〜２８個のアミノ酸残基のＣ末端親水性部分があり、これは膜の原形質側（こ位置するものと信じられる。約１３〜６７個のアミノ酸残基のＮ末端に向う部分があり、二〇は非常に酸性で親水性であり、原形質膜の外側表面上に存在すると提案される。

細胞外部分の長さ並びにその親水性交び高度な帯電性は、この部分が露出され、抗体と接触可能であることを示している。免疫グロブリ／Ｈ鎖の膜結合領域の細胞外部分上に位置する抗原性エピトープを以下、ｍ１ｇ１ｓエピトープと言う。

ｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓエピトープは、いくつかのタイプのＩｇＥ媒介アレルギー疾患のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体系治療及び診断の開発を可能にする。

２、Ｂ　Δ　グロブリンの　ムペプチド数個の種からの１０種類の膜結合免疫グロブリンアミノ酸配列が先に決定されている。１ｓｈｉｄａ、Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、、　１：１１１７（１９８２）；　５ｔｅｅｎ、　Ｍ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、@ＪＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、　１７７：１９−３２（１９８４）：　Ｒｏｇｅｒｓ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．２６：１９−２７（１９８P）；　Ｙａｍａｗａｋｉ−Ｋａｔａｏｋａ、　Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１１Ｍ５Ａ、７９：２００８−２０１２　i１９８２）；Ｋａｍａｒｏｍｙ、　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　ｌｌ：６７７５−６７８５（１９８３）＋　ＲｏｇｅｒｓA　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．２０：３０３−３１２（１９８０）；　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、　Ｋ、Ｅ、、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．１３２：４９０−S９５　（１９８４）：　Ｃｈｅｎｇ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　２９６：４１０−４１５（＋９８２）参照。これらの配列は、膜固定ペプチドのある共通の特徴を示している。表１に示すように、そして上述したように、膜結合ペプチドは、原形質膜に対する位置に基づいて識別可能な３つの領域を有する。

表１　膜固定ペプチドの主要特徴伎び性質免疫グロブリ、　アミノ酸残基数クラス、・サブクラス　１　２　３　４マウスＩｇＥ２　１９　２５　２８　７２ラットＩｇＥ　１９　２５　２８　７２マウスＩｇＧ、　１８　２５　２８　７１マウスＩｇＧ２．　１８　２５　２８　７１マウスＩｇＧ、。　１８　２５　２８　７１マウスＩｇＧ、　１８　２５　２８　７１マウスＴｇＭ　１３　２５　３　４１ヒトＩｇＭ　１３　２５　３　４１ヒトＩｇＤ　２７　２５　３　５５マウスＩｇＤ　２６　２５　３　５４１　固定ペプチドの第１　（Ｎ末端）部分を示す。この部分は親水性で非常に酸性であり、細胞膜の外表面上に存在するものと提案される。

２　固定ペプチドの中央部分を示す。この部分は帯電していない疎水性残基から成り、膜指賀二重層中に横たわるものと提案される。

３　膜固定ペプチドの最終（Ｃ末端）部分を示す。この部分は親水性であり、細胞質中に存在するものと提案される。

４　示したそれぞれ異なる膜固定ペプチド中のアミノ酸残基の総数を示す。

最も短いｍ１ｇ１ｓペプチドは１３個のアミノ酸残基を有する（マウス及びヒト μ鎖）。表１参照。全ての免疫グロブリンのｍ１ｇ１ｓペプチドは、表２に示すように、はとんど全てが酸性残基である帯電アミノ酸残基の化工が高い。帯電アミノ酸残基及び極性親水性残基の比率は、ｍ１ｇ１ｓペプチドのアミノ酸組成の非常に高いパーセンテージを説明する（表３）。従って、全てのｍ１ｇ１ｓペプチドは露出しており、抗体によって接触可能な程度の十分な長さを有するものと提案される。

表２　ｍ１ｇ１ｓペプチドのアミノ酸配列２６　２１　１６　ＩＩ　６　１？　ウスＩ　ｇ　Ｅ　ＥＬＤＩＱ＝ＤＬＣＩＥ−ＥｖＥＧＥ４ＬＥＥラットＩ　ｇ　Ｅ　ＥＬＤＩＱ・ＤＬＣＴＥ４ＶＥＧＥ−ＥＬＥＥマウスマウｇ　Ｇ　、　ＧＬＱＬＤ・ＥＴＣＡＥ・へＱＤＧＥ−ＬＤＧマウマウ　ｇ　Ｇ　、、　ＧＬＤＬＤＪＶＣ，４Ｅ−，４ＱＤＧＥ４ＤＧマウスＩｇＧ、。　ＧＬＤＬＤ−ＤＩＣＡＥ・ＡＫＤＧＥ−ＬＤＧマウマウ　ｇ　Ｇ、　ＥＬＥＬＮ−ＧＴＣＡＥ−ＡＱＤＧＥ−ＬＤＧマウｘ　Ｉ　ｇ　Ｍ　ＥＧＥＶＮ・ＡＥＥＥＧ４ＥＮヒトＩ　ｇ　Ｍ　ＥＧＥＶＮ−ＡＥＥＥＧ−ＦＥＮヒトＩ　ｇ　Ｄ　ｙｕｎ・ｐＬＩＰＱ− ５ＫＤＥＮ−ｓＤＤｙｒ−ＴＦＤＤＶ−ＧＳマウスＩｇＤ　ＩＶＮＴＩ−ＱＨ３ＣＩ−４１ＤＥＱｓ−ＤＳＹＭＤ−ＬＥＥＥＮ−ＧＪ−ｘ丁余台表３　ｍ１ｇ１ｓペプチドの帯電アミノ酸残基及び極性、親水性アミノ酸残基の組成親水性残基酸性残基　塩基性残基　極性残基　親水性残基　の比率％アミノ酸残基数マウスＩｇＥ　１０　０　２　１２　６３ラットＩｇＥ１１０　０　２　１２　６３マウスＩｇＧ、　６　０　４　１０　５６マウス■ｇＧ、、　７　０　２　９　５０マウスＩｇＧ２ｂ７　１　１　９　５０マ＋７スＩｇＧ、　６　０　４　１０　５６マウスＩｇＭ　６　０　２　８　６１ヒトＩｇＭ　６　０　１　７　５４ヒトＩｇＤ　６　１　８　１５　５６マウスＩｇＤ　７　０．５　９　１６．５　６３酸性残基　Ｅ　（Ｇｌｕ’）　、Ｄ　（Ａｓｐ）塩基性残基　Ｋ　（Ｌｙｓ）　、Ｒ（Ａｒｇ）　、Ｈ（Ｈｉ　５）（Ｈｉ　ｓは部分的に帯り極性残基　Ｓ　（Ｓｅｔ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｉｎ）、Ｎ（Ａｓｎ）３　ヒトε　ｍｌ　ｌｓペプチドのアミノ　のヒトε鎖ｍ１ｇ１ｓペプチドに対応するＤ　Ｎ　Ａ配列を決定するために多くのよく確立された手法を適用することができる。１つの方法は、表面上にＩｇＥを発現しているヒトミエローマ細胞のｍＲＮ、Ａｖ４製物がら出発する方法である。この目的のために５ＫＯ−００７細胞を用いることができる。ｍＲＮＡｙ４製物がら、ラムダクローン又はプラスミドをクローニングヘクターとして採用することによりｃＤＮＡライブラリーを確立することができる。ｃＤＮＡライブラリーを構築するための好ましい方法は、インビトロゲン社（カリフォルニア州すンジエゴ）によって開発され、市販されているｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー構築システムキット、リブラリアンＩを用いる方法である。細胞からのＲＮＡの単離、逆転写、第２鎖合成、リンカーライゲーション、ｃＤＮＡのアガロースゲルサイジング、ＣＤＮＡを精製するためのエレクトロエリューンヨン、ベクターライゲーション及び大腸菌の形質転換の各工程を詳細に記載したマニュアルがついている。このライブラリーで用いられるベクターはｐＣＤＭ８である。

ｍ１ｇ１ｓペプチドを含むクローンをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする際に、いくつかのプローブを用いることができる。図３Ａに示すように、ライブラリーは、εｍＲＮＡ（膜結合部分を有さない）のほとんどの長さをカバーする１、ｌｋｂ長のＵ２６６ｃＤＮＡであるＤＮＡプローブＡでスクリーニングすることができる。分泌型及び膜結合型の両方を包含する陽性クローンは、更なるプローブを用いて識別することができる。プローブＢは、ＣＨ４領域の末端がヒトε銀膜結合ペプチドにおいてその端部が切り取られているという推定的事実を利用して開発された。この切り取りは、ＣＨ４領域及び膜結合領域の遺伝子部分が転移している時に起きる。Ｃ末端の欠失は、ＣＨ４領域を含む、ε及びμを包含する他の免疫グロブリンの膜結合型においても起きている。ヒトεＣＨ４領域のヌクレオチド配列に関する出版された情報から、最も可能性の高いスプライシングドナ一部位は停止コドンＴＧＡの７１塩基対５°側のイントラコドンＧＴである。もう１つのＧＴは、イントラコドンではなくスプライシングドナ一部位である可能性はより低いが、より末端近くにある（停止コドンの２４塩基対５゛側にある）。

プローブＢの特異的位置は図３Ａに示されている。プローブはε鎖遺伝子の分泌型のものと反応するが膜結合型ε鎖遺伝子とは反応しないであろう。

プローブＣ（図３Ｂ）の設計は、膜固定ペプチドの膜横断部分はこれまでに配列決定された全ての免疫グロブリン遺伝子において非常によく類似しているという知見に基づいて行われた。この膜横断部分中には、全ての免疫グロブリンにおいてほぼ完全に同一のペプチド部分ひいては対応コーディングＤＮＡ部分が存在する。表４に示すように、８つの組合せにおけるコンセンサスＤ　Ｎ　Ａ配列をプローブＣとして用いた。

表・１　膜固定ペプチドの膜横断ペプチド部分中の類似領域ＬｅｕＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ・マウスＩｇＥ　ＣＴＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＡＧラットＩｇＥ　ＣＴＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＡＧママウＩｇＧ、　ＣＴＣ− ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＡＧママウＩ　ｇＧ２□　ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＣＴＧ− ＣＴＣ−ＡＧママウＩ　ｇＧｌゎ　ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＡＧママウＩｇＧ、　ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＡＧママウＩｇＳｉ　ＣＴＣ− ＴＴＣ−ＣＴＣ−ＣＴＧ−ＡＧヒト＋ｇＭ　ＣＴＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＣＴＧ− Ａ、ＧヒトＩｇＤ”　ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＡＴＣ−ＣＴＣ−ＡＣマウスＩｇＤ”　ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＡＣコンセンサス　ＣＴ　−ＴＴＣ−ＣＴ　 −ＣＴ　−ＡＧ配列　ＣＣＣ（プローブＣ）Ｇ　ＧＧ＊　ヒト及びマウスＩｇＤは第５番目のアミノ酸残基にＴｈｒ　（ＡＣＸ）を有する。ヒトＩｇＤはまた第３番目のアミノ酸残基にＩＬｅ　（ＡＴＣ）を有する。これらはコノセン廿ス配列によってカバーされない変異である。

最も可能性の高いスプライシングドナ一部位ＧＴの上流部分であるプローブＤは３６塩基対から成る。二のプローブは分泌型及び膜結合型の両方のε鎖遺伝子と反応するはずである。

分泌型又は膜結合型のε遺伝子を含むクローンと４つのプローブとの反応性のパターンを表５にまとめた。

表５　ε遺伝子含有ｃＤＮ、ＡクローンとプローブＡ、Ｂ、Ｃ及びＤとの反応性膜結合ε鎖をクローニングするために必要なライブラリーのサイズは、ｍ　ＲＮＡの量に依存する。分泌型ＩｇＥが５ＫＯ−００７細胞のポＩＪＡ″ＲＮＡの０１％から成るとすると、陽性のクローンを９９％の確率で単離できるためにはライブラリーのサイズは、約５０００の独立した組換えクローンを含むサイズである。ＩｇＥを産生ずる、ラット免疫担当細胞腫ＩＲ２及びｌＲ１６２細胞では、 εの膜結合型のｍＲＮＡは分泌型のｍＲＮＡの２％以上であることが見出された。この膜結合／分泌型ε鎖の比率がヒ）ＩｇＥ産生５ＫＯ−００７細胞においても正しいとすると、膜結合ε鎖を単離するために必要なｃＤＮＡライブラリーのサイズは約２５万である。好ましい手法では、より多くのクローン（約百万）がスクリーニングされる。

ｃＤＮＡライブラリーを確立し、細胞性ＲＮＡ種を表すクローンをスクリーニングするという従来的方法に代えて、ｍＲＮＡを増幅して対応ＤＮＡを高い比率で産生ずるという手法を採ることもできる。ポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ　ＣＲ）増幅と呼ばれるこの方法は、数年前に確立され、試薬及び装置を含む完全なシステムが市販されている。１つの好ましいシステムはパーキンエルマーシータス社（コネチカノト州ノーワーク）によって提供され、ＧｅｎｅＡｍｐＤＮＡ増幅試薬キット及びＤ　Ｎ　Ａサーマルサイクラ−を包含する。

この手法に用いられる特定の試薬のいくつかはｃＤＮＡライブラリークローニングに用いられるものと同じである。ε銀膜固定ペプチドの配列は全く決定されていないので、戦略は分泌型及び膜結合型ε鎖の両方を増幅することである。２つのプライマーが用いられる。１つはオリゴｄＴ（２５〜３０ｍｅ　ｒ）であり、もう１つは図３に示すプローブＤに対応するオリゴマーである。プローブＤは最も可能性の高いスプライシングドナ一部位の５゛側に位置しており、従って、分彫型及び膜結合型の５ｍ　ＲＮ　Ａ及びＤ　Ｎ　Ａの両方をプライムする。十分に増幅した後、２つのＤＮＡ断片ボピュレーンヨ／をゲル電気分動により分離する。ε鎖の分ｙ・型はプローブＢとの反応性により識別される。精製されたＤＮＡは次いで配列決定される。

ＰＣＲ増幅はｃＤＮＡクロー二／グよりも効率的な手法であるように思われる。

なぜなら、ｍ１ｇ１ｓ−εペプチドをコートするｍＲＮＡは、ポリＡ’　ＲＮＡプール中にわずかしか存在しないからである。Ｕ２６６ε鎖ｃＤＮ、Ａ（Ｕ２６６は、５ＫＯ−００７と同一のｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを有する親セルライ／である）を用いて鋳型Ｄ　Ｎ　Ａとオリゴプライマーの間のい（っがの予ａ的アニーリ／グ条件を決定することができる。

膜結合部分をコードする遺伝子を含むＤＮＡクローンを得るための他の手法は、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーを用いる方法である。このヒトゲノムライブラリーの好ましい供給源はストラタジーン社（カリフォルニア州うンヨラ）によって提供されるヒト肺フィブロブラストＷＩ３８細胞を用いて構築される。遺伝子はラムダベクター中にあり、挿入ＤＮＡは平均１５キロ塩基対のサイズを有する。

クローンの同定は、Ｕ２６６ε鎖ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。膜固定ペプチドに対応する遺伝子部分の位ｌは、膜横断部分（図３及び表４のプローブＣ）の相同マウス遺伝子がら調製されたプローブを用いて決定することができる。膜固定ペプチドをコードする遺伝子部分の配列が次いで決定される。

３八　−ζ上」−の　ペプチド　コード　るＤ　Ｎ　Ａのヌクレオチドヒト膜結合と鎮の膜固定ペプチドをコードする部分を含むゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、上述のようにヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより決定した。アイソフオーム１．Ｉ＋及びＩＩＩの配列を、膜固定ペプチドの部分の推定アミノ酸配列と共に図２．Ａ、２Ｂ及び２ｃにそれぞれ示す。エクソンの割り当ては、スプライ／レグドナー及びアクセプターのヌクレオチドを同定しく図１に示すように）、出版されたマウス膜結合ε鎖の相同配列及び他のクラスの免疫グロブリンの相同配列と比較することにより行った。

アイソフォームエについては、ｍ１ｇ１ｓペプチドは、図２Ａに太字のアミン酸で示されるように、膜エクソン■によってコードされる最初の１５個のアミノ酸であると同定される。これは、膜横断領域を形成する２５個の疎水性アミノ酸（図２Ａで下線を引いた部分）に先立つ。ｍ１ｇ１ｓペプチドについての２つの可能な構造（アイソフオーム■）を下記に示す。

構造ＩＨＧｌｕ４ｅｕ・へｓｐ・Ｖａｌ・Ｃｙｓ・ｖａｌ・Ｇｌｕ−Ｇｌｕ・へ１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ・＾１ａ−Ｐｒｏ４ｒｐ構造Ｉ＋Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ｖａｌ　・Ｃｙｓ　−Ｖａｌ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ１ｕ４１ａ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ　＝Ｐｒｏ　４ｒｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ４ａｌ　−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ・、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ− Ｇｌｕ　・へ１ａ−Ｐｒｏ４ｒｐＪ−Ａ丁聚白３Ｂ、ｂ上ｉｎ！、固こチトの　々のフイノフ　−ム　コートするＤ　Ｎ　Ａのジ又２工工上配烈国際出願ＰＣＴ／ＵＳ　８８／′０４７０６号には、ヒトと鎖の膜結合領域の細胞外部分上に存在する抗原エピトープのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を決定する方法か記載されている。これらのエピトープはε　ｍｂ／ｅｃエピトープとして示されている。表面上にＩｇＥを発現するヒトミエローマセルラインのｍＲＮＡｙ４製物から出発する方法を含む、いくつかの方法が可能である。ｍ　ＲＮ　Ａはｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーを確立する際に用いることができ、このｃＤＮＡライブラリーは、次いでＤＮＡプローブを用いて、ε鎖領域の膜横断領域遺伝子部分をスクリーニングされる。

国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０４７０６号にも記載されているもう１つの方法は、ＰＣＲ法を用いてε膜横断領域のＤＮＡ配列を連続的に増幅し、精製する方法である。Ｄ　Ｎ　、Ａは次いで配列決定される。

国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０４７０６号に記載されているもう１つの方法は、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングする方法である。膜結合領域に対応する遺伝子部分は膜横断部分の相同マウス遺伝子がら調製されたプローブを用いて決定することができ、この部分の配列が次いで決定される。

本発明においては、膜結合１ｇＥを発現しているヒト細胞から単離されたｍＲＮＡから誘導されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａについてまずヌクレオチド配列決定が行われた。ヒトＩｇＥ発現ミエローマである市販の５ＫＯ−００７（、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能）を用いた。

ヒトε鎖の膜横断領域の同定及び特徴付けに関連するとみなされるｃＤＮＡのＤ　Ｎ　、Ａ部分を、以下にさらに記載するようにＰＣＨにより増幅した。

Ａ　キメラ■　Ｅ　るトランスフエフトーマのε鎖ゲノムの配列決定に先立ち、モノクローナル抗体とＢ細胞上の膜結合ＩｇＥとの反応性を決定する際に用いるために、ヒト／マウスキメラＩｇＥを分泌し、膜結合１ｇＥを発現するセルラインを生成させた。キメラε及びに遺伝子を構築するために、ヒトε及びにゲノムＤＮＡの定常領域並びにモノクローナル抗体ＢＡＴＩ　２３　（ＨＩＶ−１のＨＴＬＶ−ＩＩＩ　Ｂのｇｐ　１２０１：特異的）のＨ鎖及びＬ鎖のゲノムＤＮＡの可変領域を用いた。ＢＡＴ１２３の可変領域遺伝子は機能的Ｈ鎖及びＬ鎖部位から単離されており、キメラＢＡＴ１２３　（ｈｕγｌに）の生産のためのマウス／′ヒト（γ１／に）融合遺伝子の構築に用いた。国際出願ＰＣＴ／′ＵＳ８８１０１７９７参照。ヒトγ定常領域をＨ鎖発現ヘクター中のε定常領域に代えることにより、ＢＡＴ１２３から誘導される抗原結合領域を有するキメラＢＡＴ１２３　（ｈｕε、に）が同様な方法で生産された。

ヒト生殖系列ε定常領域を含むλファージを、ε鎖の定常領域（ＣＨＩ−４）を含む領域を表すプローブにより同定した。このファージから、ＣＨＩないしＣＨ４領域を含む６．４ｋｂのＤ　Ｎ　Ａ部分及び２．５ｋｂの３°　フランキング配列をｐＵＣ１９中にサブクローニングした。報告されているマウス及びラットのε位置の情報との類似性から、膜エクソンはε遺伝子の３′末端のｌｋｂのＳａｃ上断片中に位置するものと推測された。この１ｋｂＳａｃｌ断片をサブクローニングし配列決定し、あらゆる膜エクソン様配列の存在を確立した。

ε領域ＣＨＩないしＣＨ４及び膜エクソンを含む６．４ｋｂのＤＮＡ部分をＢＡＴ１２３Ｖ、遺伝子に結合し、キメラマウス／ヒトε遺伝子を得た。このキメラ ε遺伝子は、キメラに遺伝子と共にニレクトロポレーションにより５ｐ２１０細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は、ミコフェノール酸及びＧ４１８の存在下において、又ｌ１及びユ旦立遺伝子活性により選択された。この操作は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１７９７に記載のものと類似している。

安定な形質転換体が確立され、ＥＬＩＳＡによりＩｇＥ分泌を調べ、また、膜ＩｇＥ発現を調べた（蛍光フローサイトメトリーにより）。１つのクローン５Ｅ− ４４を更なる研究のために選択した。細胞濃度１０’（１／ｍ！の５Ｅ−４４細胞の培養上滑中の蓄積ＩｇＥ濃度は４０μｇ／ｍｌとした。

細胞表面上の免疫グロブリン発現を蛍光フローサイトメトリーにより試験するために、細胞を抗ヒトＩｇＥ抗体と共にインキユベートシ、フロレノセインで標識したヤギ（Ｆａｂ’）ｚ抗マウスＩｇＧで現像した。５ｐ２１０細胞、５ＫＯ− 〇〇７細胞及びキメラＩｇＥ発現細胞を次いで１％パラホルムアルデヒド中で固定し、カルターＥＰＩＣＳフローサイトメーター上で分析した。Ｓ　Ｐ　２１０細胞、５ＫＯ−００７細胞及びキメラＩｇＥ発現細胞の蛍光プロフィールはまた、−次染色抗体の非存在下においても調べられた。抗ヒトＩｇＥによる細胞表面染色は、５Ｅ−４４及び５ＫＯ−００７についてそれぞれ６０％及び５０％と見積もられた。

５Ｅ−４４細胞が膜エクソン１及び２の両方を発現していることを確認するために、制限酵素ＮＩＬ土を用いてｌｋｂのＳａｃ１部分を３つの部分に分離した。

膜エクソ／１及びその５゛　フランキング領域を含む２つの２５０ｂｐ断片はエクソン１に特異的なプローブとして用いた。エクソ／２及び３′非翻訳領域を含む４００ｂｐの断片はエクソン２プローブとして用いた。これらのプローブは、ノーイン分析において、細胞質ＲＮＡとハイブリダイズさせるために別々に用いられた。両方のプローブとも同様な結果をもたらし、５Ｅ−４４及び５ＫＯ−００７についてそれぞれ３０００及び３６００ヌクレオチド長のメソセージを明らかにした。５Ｅ−４４細胞は５ＫＯ−００７細胞よりも短い膜ＩｇＥメツセージを発現していると予想された。ｌｋｂのＳａｃ　Ｉ断片中に停止／ボリアデニレーンヨノ（ｔ／ｐＡ）ノブナルが存在しないので、キメラε遺伝子は又立上遺伝子構築物中に存在する５Ｖ４０−誘導ｔ　／　ｐ　Ａシグナルを発現のために用いた。５ＫＯ−００７膜１ｇＥメ、セージはおそらく、１ｋｂＳａｃ　Ｉ断片の３°末端の下流６００ｂｐ　（２つのメツセージのサイズの違いから見積った）に位置する内発性ε座ｔ　／　ｐ　、Ａ　／グナルを用いる正常な完全な転写物を表している。従って、ノーイン分析により、これらの細胞中でエクソン】及び２の両方とも転写されていることが示された。

同じノーザンブロノトはまた、ε　（ＣＨＩ〜４領域）プローブともハイブリダイズした。膜１ｇＥ特異的メツセージに特徴的な弱いバンドに加え、約２３００ヌクレオチド長の転写物が５Ｅ−４４及び５ＫＯ−００７の両方について認められｌこ。

キメラＢＡＴ１２３（ヒトε、に）が、ＢＡＴ　１２３又はキメラＢＡＴ　１２３（ｈｕγ１．に）と同程度の親和性定数でｇｐ１２０に結合したことを示すために結合阻害分析を用いた。ＢＡＴｌ　２３−ＨＲＰ複合物が、ＢＡＴ１２３自身、キメラＢＡＴ１２３　（ｈｕγｌ、に）及びキメラＢＡＴ　（ｈｕε１．　に）と競合的に固相ｇｐ１２０に結合することを調べる実験において、ＢＡＴ１２３中のマウスＣγｌをヒトＣγ１又はヒトεに代えても抗原結合親和性には有意に影響しグ　びヌクレオチド５Ｅ−４４に加え、ヒトε鎖を細胞表面上に発現しＵ２６６のサブクローンであるセルラインＳＫ○−００７をＡＴＣＣから入手した。Ｕ２６６は骨髄腫患者の血液試料から確立されたミエローマセルラインである。

５ｘ１０’個の５ＫＯ−００７細胞及び５Ｅ−４４細胞から全ＲＮＡをグアニジウムチオシアネート中に抽出した。第１鎖ｃＤＮＡをＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンシズ社、フロリダ州ピータースバーグ）により、製造者によって記載された手順に従って合成した。

オリゴｄＴプライマーを用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いでこれをＰＣＲの鋳型として用いてＣＨ４エクソンの３′末端及び膜エクソンをカバーする関連部分を増幅した。下記配列を有するいくつかのオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲに用いた。

ａｔ：　５’−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴ−３゜＃２：　５’−ＧＧ島４ＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧＴＧＧＣＣ−３’　（相補鎖を用いた）＃３：　５’−ＣＡ臥訂ＴＣＡＧＡＴＧＡＧ買ＣＡＴＣＴＧＣＣＧＴＧＣ−３’：４：　５’−ＧＣ臥訂ＴＣＧ＾ＴＧＣ＾Ｇ＾ＧＧＣＣＧＧＴＣＣＡＣＧ−３°　（相補鎖を用いた）：５５゛−＾ＧＧＧＡＣＴＧＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣ＾−３゛３６、５’−ＣＴＣＧＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴ−３’　（相補鎖を用いた）（下線を引いた配列は、他の研究に用いるために導入したＥｃ旦Ｒ１部位である。）ＰＣＲからの主産物は、直接配列決定し、また、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩベクターにクローニングした。側々のバンドから誘導されたいくつかのクローンについてヌクレオチド配列を決定した。ＰＣＲ産物の電気泳動パターン及びその配列データにより、予想外なことに、５ＫＯ−００７細胞及び５Ｅ４４細胞の両方の細胞中に、ＣＨ４領域から予め予想、されたｍｅ、１７ｉびｍｅ、２エクノ／のスプライシングから誘導されたもの以外のＲＮ　、Ａ挿が存在することが示された。プライマー＝１及び：２を用いた場合には、主たるＰＣＲ産物は、予想されたドナー及びアクセプタ一部位を用い、ｍｅ、１領域を残す（図１）　、ＣＨ４領域からｍｅ、２への直接的ＲＮＡスプライシングに起因する部分であった。

これらの第１ラウンドＰＣＲ産物を鋳型として用い、プライマー＝３及び＃４を用いて第２ラウンドのＰＣＲを行うと、２つの主たる産物が観察された（図２Ａ及び図２Ｂ）。１つは、予想されたドナー及びアクセプタ一部位を用いた、ＣＨ４領域からｍｅ、１へのスプライシングに起因するものであり、もう１つはＣＨ４から先に同定されていないアクセプタ一部位である、二二上の５゛側１５６ｂｐの部位（このアクセプタ一部位とｍｅ、１との間の部分を工且一旦という）へのスプライシングに起因するものであった。しかしながら、プライマー＃３及び＃４を鋳型としてのＣＤＮＡに適用すると（第１ラウンドＰＣＲ）、主たる産物はＣＨ４領域からｍｅユへのスプライシングに起因する部分であった（図２Ｃ）。

他の組のプライマーを用いた更なるＰＣＲ実験もまた、ＣＨ４からｍｅ一旦へのスプライシングが観察されることを実証した。プライマー＃３及び＃６を用いると、主たる産物はＣＨ４領域からｍｅ工旦へのスプライシングを示し、里ニー且部分及びｍｅ、１部分の組合せ（ｍｅ、１’　領域と呼ばれる）が生成した。プライマー＃５及び：２を用いると、ｍｅ、１の３′末端の先に予想されたドナ一部位及びｍｅ、２の５°末端のアクセプタ一部位のスプライシングが確立された。これまでのところ、他のスプライシング組合せは見出されていない。従って、これらの分析は、膜ペプチドをコードする遺伝子部分中での代替的スプライシングから誘導されるε鎮のｍ　ＲＮ　Ａの少なくとも３つの型を明らかにした。すなわち、アイソフオームＩはＣＨ４−ｍｅ、ｌ−ｍｅ、２を含み、アイソ７ｔ− ムＩＩはＣＨ４−ｍｅ−１’　（用且−」グｍｅ、１）−ｍｅ、２を含み、アイソフオームＩＩＩはＣＨ４−ｍｅ、２°を含む。

Ｃ，／　二”ｆ’＞”ｆａ−ｈ’　ｌ二よるｍ　ＲＮ　Ａの５ＫＯ−００７細胞及び５Ｅ４４細胞からのＲＮ　Ａｉｌ製物中の特定のｍＲＮＡ種を同定するために、ｍＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法による実験も行った。旦旦−２、ｍｅ、１及びｍｅ、２部分中にコードされるｍ　ＲＮ　Ａに相補的な配列を有する！２ｐ−凛識プローブをＰＣＲにより調製し、上記部分を含むＲＮＡ種の存在を調べるためのノーインハイブリダイゼーションに用いた。これら３種のプローブはナイロン膜上で両方のセルラインからのｍＲＮＡとハイブリダイズすることが示された。５Ｅ４４細胞中に検出されたεｍＲＮＡ種は全て５ＫＯ−００７細胞中の対応種よりも小さかった。

アイソフオームＩＩ＋はアイソフオームＩ又はＩＩよりも実質的に小さく、電気泳動ゲル中でアイソフオームＩ及び／又は１１から分離されたので、ｍｅ、２プローブは２つのバンド、すなわち、ｍｅ、１’　（又はｍｅ、１）エクソンを有するものと有さない２つのバンドを示した。一方、ｍｅ、１プローブは、ゲル中で分離できないアイソフオームＩ及びＩＩの両方とはハイブリダイズし得るので、ノーザンブロ、ト分析によりアイソフオームｌＲＮＡの存在は確立されなかった。要するに、二重−２及びｍｅ、２プローブを用いた分析は、アイソフオームＩＩ及びＩＩＩのｍＲＮＡの存在を確信的に示唆する。さらに、バンドの強度から、これらのアイソフオームのｍ　ＲＮ　Ａ量及びその相対比率が５ＫＯ−００７細胞と５Ｅ４４細胞とでは異なることが示唆された。工且、旦及びｍｅ、１プローブを用いた実験結果は、アイソフオームＩ／１１　（組合せ）の量が５Ｅ４４細胞よりも５ＫＯ−００７細胞中に多いことを示している。ｍｅ、２プローブを用いた実験結果は、５ＫＯ−００７細胞ではアイソフオームＩ　／Ｉ＋とアイソフオームＩＩ＋の量が同程度であるのに対し、５Ｅ４４細胞ではアイソフオームＩＩ＋の量がアイソフオーム１／ＩＩの量よりも多いことを示唆した。

Ｄ、　ｍｅ、　びｍｅ、２”。　に・「　る　、され　アミノ　」ＰＣＲ増幅部分のヌクレオチド配列に基づき、対応するアイソフオームＩＩ及びＩＩＩのアミノ酸配列を推定し、アイソフオーム■のアミノ酸配列と比較した。アイソフオーム１１のリーディングフレームはアイソフオームＩと同じである。余分の５２アミノ酸（１ｍ２Ｂにおいて太字で示す）により、膜固定ペプチドの細胞外部分を、アイソフォームエ　（図２Ａ）の１５アミノ酸から全部で６７アミノ酸に延長する。ｍｅ、１　（１２２ｂｐ、３の倍数ではない）を省略すると、アイソフオームＩＩＩ中のｍｅ、２’　部分のリーディングフレームのシフトを引き起こしく図２Ｃ）、ペプチドコード配列が８１ｂｐ（２７アミノ酸をコート）がら１３４ｂｐ（４５アミノ酸をコード）に延長される。

アイソフす−ムＩＩＩの対応ペプチド（図２Ｃ）は、膜脂質二重層を横切ると考えられる２５個の疎水性アミノ酸（この部分はｍｅ、１によりコードされる）を含まない。このことは、アイソフオームＩＩ＋が分泌されるものであって、膜に結合されるものではないことを示唆している。

４　エユ」」−！ブチ白ご辻支盈区体凶固光アイソフオーム■、ＩＩ若しくはＩＩ＋若しくはその部分又はこれらのペプチドの免疫学的均等物のいずれかを含むペプチドを免疫原として用いることができる。

免疫原性ペプチドアミノ酸配列又はその均等配列がポリマーの繰り返し単位である場合には、免疫原性ペプチドに基づくポリマーもまた用いることができる。アイソフオームＩに基づく免疫原性ペプチドは上記したモノマー型でもダイマー型でもよい。アイソフオーム１１に基づく免疫原性ペプチドは上記したモノマー型でもダイマー型でもよい。

このような免疫原性ペプチド（以下、本発明のペプチドという）は、Ｆｍｏｃケミストリーを適用するＲ　ａ　Ｍ　Ｐ　Ｓ　／ステム（デュポン社製）を用いる方法のような従来法により合成することができる。あるいは、アイソフオーム■ 、ＩＩ又はＩＩ＋を含む組換えペプチド又は免疫グロブリンＨ鎖（若しくはその部分）を、これらのペプチドのコード配列を含む遺伝子部分を大腸菌中又は真核細胞中で発現させることにより生合成することもできる。

合成ペプチド部分を免疫原として用いる場合、例えばＢ型肝炎表面抗原若しくはコア抗原又は好ましくはキーホールリ／ペノトヘモンアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）等のタンパク質キャリアに結合することが通常より効果的である。ペプチド部分がりジン残基を欠くか又はリジン残基が部分の中央部にある場合には、Ｃ末端にリジン残基を加える二とが望ましい。Ｎ−末端は既にα−アミノ基を有しているので、修飾合成ペプチドは、結合のために利用可能な２つのアミン基を有するであろうキャリアク／バク質１分子当たり複数のペプチド分子を結合する二とができる。ＫＬＨを用いる場合、好ましいペプチド／ＫＬＨモル比は１ｏである。結合方法は非常によく確立されている。グルタルアルデヒド、ビス（スルフォスクンニミジル）スベレート又は好ましくは酒石酸ジスルホスクンニミジル（イリノイ州ピアスケミカル社のカタログ：：２１５７９．２０５９１）のような架橋剤を用いることができる。

これらのペプチドを免疫原として用い、以下に記載するプロトコールを用いてこれらのペプチドに特異的なモノクローナル抗体を得る二とかできる。ヒトε鎖のｍ１ｇ１ｓエピトープに対するモノクローナル抗体の調製方法の具体例は、以下及び優先権米国特許出願第０７５３１．７８７号（１９９０年６月１日出願）及び第０７４６８、７６６号（１９９０年１月２３日出願）に記載されている。

本発明の免疫原性ペプチドはまた、ウサギ、ヤギ、ラット若しくはマウス（又は他のヒトでさえ）を免疫するために用いて細胞外ｍ１ｇ１ｓ−とエピトープに対するポリクローナル抗体を調製することができる。本発明のペプチドと反応するモノクローナル抗体１こついて、特定のアイソタイプを担持する細胞と特異的に反応するものをさらにスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体を次いで生体投与することができる。しかしながら、本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般的に、合成ペプチドと反応するほとんど全ての抗体を含むが、これらの抗体はネイティブ分子に対して反応するとは限らない。合成ペプチドを免疫原として作製されたポリクローナル抗体が完全な細胞と反応し得るか否かは試験しなければならない。

モノクローナル抗体を調製する際、合成又は組換えペプチドを免疫及び抗体同定の両方に使用する必要はない。例えば、ミエローマ細胞と融合させるための牌細胞を調製するためにマウスを免疫する場合には、免疫原は、ＩｇＧ発現ＩＭ−９セルラインのような免疫グロブリン担持ミエローマ細胞であってもよいし、あるいはミエローマ細胞自身であってもよい。ヒト免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子でマウスミエローマ細胞をトランスフェクトすることにより開発され、その細胞表面上に膜結合免疫グロブリンを発現するトランスフエフトーマもまた免疫原として用いることができる。

免疫マウス又はラットの牌臓又はリンパ節からのリンパ球もまた、細胞外ｍ１ｇ１Ｓ−εエピトープに特異的なモノクロ−ナール抗体を分泌するハイブリドーマを調製するために用いることができる。好ましい融合プロトコールは免疫マウスの牌細胞とＮ５−１又はＳｐ２，１０細胞のような非分泌性マウスミエローマ細胞をポリエチレングリコールを用いて融合することである。

モノクローナル抗体を調製するための好ましい免疫プロトコールは、ＫＬＨと本発明の組換え又は合成ペプチ］・の結合体５０μｇを含むフロイントの完全アジュバントをそれぞれのマウスに注射することである。２週間後及び４週間後に、同じ量の抗原を含むフロイントの不完全アジュバントを皮下注射する。約６週間後、抗原を生理食塩水中に含む液を腹腔内注射することにより第４回目の免疫を行う。最後の注射から４日後にマウスを殺し、牌臓を採り出して、ミエローマ細胞と融合させるための単一細胞浮遊液を調製する。

同様なプロトコールを、ＩＭ−９細胞のような免疫グロブリン担持ヒトミエローマ細胞の原形質膜から単離された、精製ネイティブヒト膜結合免疫グロブリン（結合された膜固定ペプチド部分を有する）で免疫する場合にも用いることがで鼻る。ヒト免疫グロブリン担持細胞を免疫原として用いる場合には、２週間毎に１　ｘ　１０’細胞を腹腔内注射する。

ポリエチレングリコールによる融合操作並びにハイブリドーマのクローニング及び培養に関する他の種々の手法はよく確立されている。好ましい融合方法は、１（ｕｄｓｏｎ、　ｌ及びＨａｙ、Ｆ、Ｃ，（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、　ｐｐ、３０３−R１３．　１９８０、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｂｏｓｔｏｎ）により記載された周知のも＋１７）−ｃ’ある。

細胞外ｍｉ　ｇ　ｉ　ｓ−εエピトープと反応する七ツクローナル抗体を検索するためのハイブリドーマのスクリーニング（又はポリクローナル抗体の同定）は、合成ペプチドを固相抗原として用いた酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）により行うことができる。好ましい固相抗原は本発明のペプチドとウシ血清アルブミン又はオバルブミンのような、免疫原に用いたものとは異なるキャリアタンパク質との結合体である。本発明の特定のペプチド（１つのアイソフオームに対応する）に対して特異的なモノクローナル抗体は次いで、免疫蛍光フローサイトメトリー分析を用いてＢセルライノ又は該アイソフオームを発現するＢ細胞と特異的に結合するものを検索するためにスクリーニングされる。

一般的に、最初に得られるｍ１ｇ１ｓ−ε特異的モノクローナル抗体はマウス由来であろうから、ヒトの治療において免疫原性又はアレルケン性を有するかもしれない。従って、キメラ抗体（動物の可変領域とヒトの定常領域を有する）を作製するか、または、ヒト発現ヘクター（ストラタジーン社、カリフォルニア州うジョラ）を用いてヒト抗体断片（Ｖｌ、ｌ、Ｖ、、ＦｖＳＦｄ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’Ｌ）を調製し、次いでキメラ抗体を調製する場合と同様な方法を用いて完全なヒト抗体を構築することが好ましい。さらに、定常領域の全部及び可変領域のほとんどがヒト由来であり、抗原結合部位のみが他のは乳動物由来である抗体を作製することもできる。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２７　（１９８８）参照。さらに、Ｈ鎖及びＬ鎖Ｆｖ領域が結合した単一ペプチド鎖抗体を作製することも可能である。Ｈｕｓｔｏｎ、　Ｊ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８５：５８７９−５８８３（１９８３）参照。完全に又は部分的にヒト由来の抗体は全て、哺乳動物由来の抗体よりも免疫原性が低く、断片及び単一鎖抗体は全抗体よりも免疫原性が低い。従って、これらのタイプの抗体は全て、免疫応答反応又はアレルギー反応を引き起こしにくい。なお、免疫応答は、投与された抗体が免疫応答を抑制する機能を果たす前に、これらの抗体を枯渇させ得る。

ｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓ−εに特異的なモノクローナル抗体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体媒介細胞溶解又は他の細胞溶解若しくは調節免疫機構により、ＩｇＥを発現するＢ細胞を低減させ又は排除するために用いることができる。

例えば、マウスＩｇＧ、、並びにヒトＩ　ｇ　Ｇ　ｌ及びＩｇＧ、のような特定のＩｇＧサブクラスの抗体は、あるＦｃレセプター担持會食リンパ球によって行われるＡＤＣＣを媒介することができる。このようなマウスＩｇＧ、、抗体、ヒトγ−１若しくはγ−３鎖を担持するキメラ抗体又はヒト１ｇＧ１若しくはＩ　ｇ　Ｇ　ｓの投与は、ＩｇＥ発現Ｂ細胞の低減調節又は溶解に用いることができる。これらの抗体は分泌型ＩｇＥ又は好塩基球若しくはマスト細胞の表面上に結合したＩｇＥとは結合しないであろう。

本発明のモノクローナル抗体はまた、細胞障害性細胞のための標的剤として用いることもできる。

本発明のモノクローナル抗体はまた、モノクローナル抗体と細胞障害性薬刑若しくはエフェクター物質とを結合することにより、細胞障害性薬剤やエフェクター物質を配給するためのキャリア剤として用いることもできる。毒素−抗体複合物は、ＩｇＥを産生するＢ細胞に結合してこれを直接殺すが、他のアイソタイプを生産するＢ細胞には結合しない。これらの毒素は細胞溶解剤又は細胞障害剤であり、細胞障害性ステロイド、ゲロニン、アブリノ、リジン、ンユードモナス毒素、ジフテリア毒素、ホークライード抗ウィルスペプチド、トリカセカム、放射性核種及び膜溶解酵素（例えば）すスフオリパーゼ）を包含する。

抗体とこれらの物質とは化学的又は遺伝子工学的手法により結合することができる。毒素−抗体複合物は単独で又は本発明の遊離の抗体と組合せて用いることができる。

本発明の抗体（並びに毒素との複合物、断片及び他の誘導体）は、好ましくは静脈内投与により全身投与することができる。これらは薬理的に許容できるあらゆる賦形剤と共に投与する二とができる。

他の治療方法として、ｍｉ　ｇｉ　ｓ−εエピトープに対して特異的な抗体が内発的に生体内で生産される、能動免疫を挙げることができる。これらの内発的に生産された抗体はｍ１ｇ１ｓ−εエピトープに結合し、付随するＢ細胞の破壊を引き起こす。このような抗体の生産は、本発明の免疫原性ｍ　ｉ　ｇ　ｉ　εペプチドを投与することにより、又はパラトープ特異的抗イデイオタイプ抗体を投与することにより誘起することができる。本発明の抗体のパラトープに対する抗イデイオタイプ抗体は、ｍ１ｇ１ｓ−とエピトープの内部イメージを有する。これらの抗イデイオタイプ抗体はｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓ−εエピトープに対する能動免疫及びｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓ−εエピトープに対する抗体の内発的産生を誘起するために用いることができる。このようなパラトープ特異的、抗イデイオタイプ抗体は、ＩｇＥ発現Ｂ細胞に対する抗体の形成を誘起するのに十分な免疫皇的量、轡２者に投与される。これらの抗イデイオタイプ抗体は、これらに対するあらゆる免疫応答を最少にするために、好ましくはキメラ抗体又はヒト抗体として投与される。これらはｖｌ、１１ＶＬ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ又はＦ　（ａ　ｂ’　）　ｒのようないずれの抗体断片であってもよい（これらはまたキメラ性又はヒト由来のものであってもよい）。

顆粒球コロニー刺激因子ＣＧＭ−Ｃ３ＦＩ）及び単球コロニー刺激因子（〜１− Ｃ３Ｆ）のようなある種の因子は、ＡＤＣＣを媒介する白血球を包含する、白血球の増殖を誘起することが知られている。インビトロの実験では、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＭ−Ｃ３Ｆは、腫瘍細胞上に発現される表面抗原に対して特異的なモノクローナル抗体によって媒介される腫瘍細胞上のＡＤＣＣ活性を補強することが示されている。本発明の特異的モノクローナル抗体、その複合物及びポリクローナル抗体の、ＩｇＥ発現Ｂ細胞を枯渇させる治療効果は、おそらく、ＡＤＣＣ活性を補強する因子と組合せることにより高められるであろう。

マクロファージ又は細胞障害性Ｔ細胞のような細胞障害性細胞を標的免疫グロブリン発現Ｂ細胞に引きつける抗体誘導体を作製することができる。これらの抗体誘導体は、細胞障害性細胞のレセプターに対する特異性と標的ＩｇＥ発現Ｂ細胞に対する特異性を有する二特異性抗体を包含する。このようなハイブリッドニ特異的抗体は、標的ｍ１ｇ１ｓ−εエピトープに抗原特異性を有する１つのＦａｂ部分と、ＣＤ３やＣＤ８のような細胞障害性細胞の表面抗原に特異性を有するもう１つのＦａｂ部分とを含み得る。本発明の二特異的抗体は、２つの特異性を有する単一抗体であってもよいし、２又はそれ以上の抗体又は抗体断片のへテロ複合体であってもよい。例えば、Ｃ，Ｒｅａｄｉｎｇ　、米国特許第４．４７４．８９３号及び４゜７１４、６８１号並びにＳｅｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４．６７６、９８０号参照。

本発明のモノクローナル抗体は生体に投与して用いることもできるが、生体外で用いることもできる。也者の循環液中のＩｇＥ担持Ｂ細胞を、本発明のモノクローナル抗体と複合した親和性マトリックス（固相に不動化した抗体）によって除去することができる。

本発明の抗体のもう１つの用途は、混合白血球ポピユレーション中の、特定のアイソタイプを担持するＢリンパ球の数及びその相対比率を測定するために用いることである。ｍ１ｇ１ｓ−ε特異的抗体は、細胞のＦｃレセプターを介して結合した分圧・型免疫グロブリンを担持する細胞とは反応しない。このような細胞はマクロファージ及び活性化Ｔ細胞を包含する。Ｂ細胞のプロフィールは個体のアレルギー状態を示すかもしれないし、更なるＩｇＥ担持Ｂ細胞の枯渇が望ましいか否かを示すかもしれない。同じ情報は、ＩｇＥ担持Ｂ細胞の大部分を枯渇させるのにどの程度の量の抗体が必要かを示すこともできる。この目的のために、細抱表面抗京を決定するために用いられている標準的なアッセイに抗体を用いる二とかできる。一般に、抗体は、抗体と試料中のＩｇＥ担持細胞との結合が可能な条件下で被検白血球試料と接触させられる。次いで細胞と抗体とが結合したが否がか調へられる。これは従来の細胞染色法により行うことができる。例えば、抗体の結合を検出するために蛍光標識した第２抗体を用いることができる。

モノクローナル抗体（及びポリクローナル抗体）は、さらに特徴づける二とができる。本発明の抗体か好塩基球に結合するが否かを決定するために蛍光分析を用いることかできる。免疫蛍光分析はまた、抗体がマスト細胞に結合するが否かを調べるために、及び本発明の抗体が５ＫＯ−００７Ｅエローマ細胞、ＩｇＥ担持Ｂ細胞及びヒト／マウスキメラＩｇＥ発現トランスフエクトーマと反応するか否かを決定するために用いることができる。ＨＥＭ７モノクローナル抗体がアイソフオームＩに結合するか否かの実験結果が図６に示されている。合成ｍ１ｇ１Ｓ −εペプチドと可溶性ＩｇＥとの反応性を測定するためにＥＬＩＳＡを用いることができる。

表６　ｍ１ｇ１ｓ−εペプチドに特異的な抗体と異なるＩｇＥ−含有標的との反応性反応−分析方法合成ｍ１ｇ１ｓ−εペプチド　−１−ＥＬＩＳＡ可溶性１ｇＥ　−ＥＬＩＳＡＳＫＯ−００７Ｅエローマ細胞　士　免疫蛍光染色Ｈ丁循白５　動二犬験本発明の物質及び方法は、動物モデル系を用いて試験することができる。最も関連の深い系は以下の２つである。

Ａ、！ｆＪ＝アカゲザルモデルｔ：）ｍｉｇｉｓペプチドに特異的な本発明のモノクローナル抗体及びその関連物質（これらのいくつかについてはさらに後述する）は、種々のＩｇＥ媒介アレルギー（下記６項参照）を治療するために用いられることを意図している。これらのアレルギーのうち、外因性喘息は重大なものである。喘息を研究するための実験モデル系がアカゲザルを用いて確立されている。

線虫アスカリス・スーム（Ａｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍ）に感染したアカゲザルの一部はカイチュウの抽出物に対して過敏症になる。これらの感受性サルにカイチュウ抗原を含む液を噴霧すると、喘息に似た呼吸障害を呈する。Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　Ｒ，、Ｊ、　Ｃ１１ｎｉ」工窄出−五　５８６−５９３（１９７６）。

本発明の種々の物質を、噴口、／アカゲザルモデル系を用いて試験することができる。カイチュウ感受性サルに実験処置又は対照処置を施し、以下のことを調べた。

（ａ）カイチュウ攻撃後の噴口、徴候が弱まるか。

（ｂ）循環１ｇＥが減少するが。

（ｃ）循環ＴｇＥ担持Ｂ細胞が減少するか。

（ｄ）好塩基球上のＩｇＥ密度が減少するか。

Ｂ・ヱヱ丞天ヱ匹系マウスはアレルギー徴候を自然に発達させることが知られていない。しかしながら、ＩｇＥ担持Ｂ細胞及びＩｇＥを枯渇させることによる意図する治療の薬理学的機構を示すために、マウスは優れたモデルとなり得る。

細胞外マウスε鎖ｍ１ｇ１ｓペプチドは既に配列決定されている。１ｓｈｉｄａ、　Ｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、ｌ：１１１７−１１２３（１９８２）。１９個ノアミノ酸配列ハ次ノトオリテする。

Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−八５ｐ４ｅｕ−Ｇ１ｎ・へ５ｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　・Ｇｌｕ　・Ｇｌｙ　・Ｇｌｕ　・fＩ　ｕ　・Ｌｅｕ　・Ｇｌｕ・ｌｕこのペプチドは、Ｃ末端１こＬｅｕ−Ｌｙｓ残基をさらに有するものを包含する、いくつかの形懇に合成される。

このペプチド及びこれとＫ　Ｌ　Ｈとの複合物を用いてウサギ及びヤギを免疫する。抗血清を回収する。該ペプチド（Ｌｅｕ−Ｌｙｓを付加したもの）又はウシ血清アルブミンに結合された該ペプチドを結合したセファロース４Ｂカラムを用いて、抗原特異的抗体を精製する。正常なマウスに精製抗体（又はその関連物質）、前記ペプチド（Ｌｅｕ−Ｌｙｓを付加したもの）又はウシ血清アルブミンに結合した前記ペプチドを静脈内又は腹腔的投与する。マウスは好ましくはキーホールリンベットヘモシアニンのようなキャリアタンパク質に結合されたマウスｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓ−εで免疫される。これらの処置の後、多量のＩｇＥを誘起することが知られている寄生虫二ノボストロッジラス・プランリエンンス（Ｎｉ　ｏｓｔｒｏｎ　１ｕｓ′ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）をマウス１コ略染させることもある。５ｎａｐｐｅｒ、Ｃ，ｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、１０２：５ｌ−７５（１９８８）。調べるべき屯は以下の点を包含する。

（ａ）循環液中の全ＩｇＥが減少するか。

（ｂ）ＩｇＥ担持Ｂ細胞数が減少するか。

（ｃ）好塩基球の表面上のＩｇＥ密度が減少するか。

（ｄ）マウスｍ１ｇ１ｓ−εペプチドに特異的なＩｇＭ及びｒｇＧが異なる効果を引き起こすか。この試験の目的は、ＩｇＥ担持Ｂ細胞の枯渇に対するＡＤＣＣの効果を謂へることである。ＩｇＧはＡＤＣＣを媒介することが知られているがＴｇＭはそうではない。

６　上又旦産工犯胞■這訳拍研徐Ｊ力１ΣΩしＬ巳１庄乙に土ヱニ塁冶遼ｍ１ｇ１ｓ−εエピトープに特異的な抗体はＩｇＥ産生Ｂ細胞の表面上のＩｇＥに結合するが、好塩基球及びマスト細胞上のＩｇＥとは結合しない。二のＩｇＥ担持細胞タイプによる異なる結合性が抗体の治療用途の基礎を与える。

従来の抗１ｇＥ抗体はマスト細胞及び好塩基球の表面上のＩｇＥに結合し、アレルギーの要理的媒介物質の放出を引き起こす。本発明の抗体が治療効果を発揮するため１こは、本発明の抗体はこれらの細胞上のＩｇＥと結合してはならない。

ｍ１ｇ１ｓ−εエピトープｊこ特異的な抗体はヒト及び他の動物（例えばイヌ、ネコ及びウマ）におけるＩｇＥ媒介アレルギーの治療に用いることができる。抗体は、いくつかの態様で治療に用いる二とができる。すなわち、免疫機能を媒介するエフェクター剤として、エフェクター物質を配給するための、毒素又は細胞障害剤のキャリア剤として、又は細胞障害性細胞の標的剤として用いることができる。

Ａ　Ｉ　Ｅ　、　に　・な　体マウスＩｇＧ２ａ並びにヒトＩ　ｇ　Ｇ　１及びＩｇＧ３のようなあるＩｇＧサブクラスの抗体は、ＡＤＣＣ１補体媒介細胞溶解又は他の細胞溶解性若しくは調節免疫機構により、ＩｇＥ担持Ｂ細胞を減少させ又は排除するために用いることができる。これらの抗体は免疫機能を媒介するエフェクター剤として又は細胞障害性細胞のための標的誘導剤として用いることができる。抗体は好ましくは静脈内投与により、遊離の抗体として、ＩｇＥ媒介アレルギーに苦しむ叡者に対し、ＩｇＥ産生細胞を実質的に排除し、従ってＩｇＥを実質的に排除するのに十分な両全身的に投与される。

抗体はまた経鼻的に投与することができる。鼻腔の内側及び気管はマスト細胞が集まっている領域である。これらの組織の脈管外に存在するＩｇＥ産生Ｂ細胞及び遊離ＩｇＥは、体内の他の部分にあるＩｇＥ産生Ｂ細胞及びＩｇＥよりも好塩基球及びマスト細胞に接触しやすいかもしれない。経鼻投与（例えば、経鼻スプレー）は、これらの領域に比較的高濃度の治療抗体を配給し、より迅速でより効果的な結果を達成するために用いることができるかもしれない。抗体はまた、経眼投与することもできる。

本発明のモノクローナル抗体はヒトに対して治療的に用いることができ、対応するｍ１ｇ１ｓエピトープに対する関連モノクローナル抗体は、イヌ、ネコ及びウマのような他の哺乳動物において治療的に用いることができる。ヒトにおける治療用途のためには、キメラ抗体を包含する、ヒト又はヒト化抗体（及び断片）が好ましい。ヒト及びヒト化抗体は非ヒト抗体よりもヒト中において免疫原性が低い。従って、特に繰り返し又は長期間の投与が必要な場合に、生体内投与により適している。

本発明の抗体を用いた免疫治療は、従来の脱感受止免疫治療と組合せて用いることかできる。例えば、アレルゲンによる脱感受止を、上記した好ｍ１ｇ１ｓ−ｉｐｕｓｉ抗体又は抗体−毒素複合物を投与してＩｇＥ産生細胞を実質的に排除することと組合せて行うことができる。

脱感受止は、アレルゲン／免疫原に対するＩｇＧ産生を誘起する。このようなＩｇＧ産生の誘起は、ＩｇＥ産生Ｂ細胞が実質的に枯渇する場合に最も効果的であり得る。抗体治療と脱感受止治療の組合せは魅力的である。なぜなら、ＩｇＥ産生Ｂ細胞は抗ｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓ抗体によって一時的に（数週間ないし数か月）のみ枯渇され、最終的には再び増えてくるが、脱感量化効果ははるかに長く持続し得るアレルギー治療におけるｍ１ｇ１ｓ−ε特異的モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又は抗体−免疫毒素複合物の旧療効果は、ｃＭ−Ｃ３Ｆ（顆粒球コロニー刺激因子）又はＭ−Ｃ５Ｆ（圭球コロニー刺激因子）のようなＡＤＣＣ補強活性を有する因子と抗体治療とを組合せる二とにより高められるはずである。

ｃ、Ｘ　Ｅ　−に　・なｍ１ｇ１ｓ−εエピトープに特異的な抗体は上記免疫毒素の１又は２以上と組合せることができ、それによってＩｇＥ産生Ｂ細胞を特異的に標的にする抗体−免疫毒素複合物が形成される。この免疫毒素は単独で又は遊離の抗ｍ１ｇ１ｓ抗体と組合せて用いることができる。

Ｄ　体外治療ｍ１ｇ１ｓ−ε特異的モノクローナル抗体を生体内治療に用いることができるが、これらはまた体外治療に用いることもできる。アレルギー患者の循環液中のＩｇＥは、本発明のモノクローナル抗体を結合した親和性マトリックス（固相に不動化された抗体）によって除去することができる。抗体は親和性カラムから漏れて腎者の循環液中に入るかもしれないので、本発明のモノクローナル抗体は、好塩基球及びマスト細胞からのヒスタミン放出を誘起する他の抗体よりも好ましい。

７　聡斯月途本発明の抗体の他の用途は、混合白血球ポピユレーション中のＩｇＥ担持Ｂリンパ球の数及び相対化工を測定するために用いることである。ｍ１ｇ１ｓ特異的抗体は、細胞のＦｃレセプターを介して分泌型免疫グロブリンを担持している細胞とは反応しない。このような細胞はマクロファー７及び活性化Ｔ細胞を包含する。Ｂ細胞のプロフィールは個体の免疫状態を示し得る。同じ情報はまた、特定のアイソタイプを担持するＢ細胞か種瘍化している場合に、これらのＢ細胞の大部分を枯渇させるのにどの程度の量の抗体が必要かを示し得る。この目的のために、細胞表面抗原を決定するために用いられる標準的アッセイに抗体を用いることができる。一般に、抗体は、抗体が試料中のアイソタイプ担持細胞と結合できる条件下において白血球試料と接触させられる。次いで細胞が抗体と結合したかを調べる。これは従来の細胞染色方法により行うことができ、例えば、蛍光標識した第２抗体を用いて抗体の結合を検出することができる。

本発明を次いで実施例によりさらに例示する。

実施例１　ｍ１ｇ１ｓ−εエピトープとモノクローナル抗体との反応性の確認ｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓ−εに対する２つの異なるモノクローナル抗体を作製した。作製方法は以下の通りである。

Ａ　旦りおヒ」±五　Ｅ４６−１３−１の膜結合１ｇＨに固有のエピトープであって分泌型ＩｇＥ（アイソフオームＩ）には存在しないエピトープに対するモノクローナル抗体を先に詳述した、ハイブリドーマ作製の常法により作製した。上述した５Ｅ−４４トランスフエクトーマ細胞を免疫原として用いてＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを免疫した。１ｍＭのマイトマイシンＣで３７℃で３０分間処理した５Ｅ−４４細胞を１ｘｌＯ’個ずつ２週間毎に３回腹腔内注射した。

融合ウェルの最初のスクリーニングのために、二重化したヒトｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓ−εペプチドＧ１１」化ｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ｃｙｓ・〜’ａｌ−Ｇ１ｕ− Ｇｌｕ−八１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕａへ１ａ−Ｐｒｏ−Ｔｒ垂■d ＬＩＳＡのためのコーティング抗体として用いた。陽性のクローンを、他のペプチド及び５Ｅ−４４細胞並びに対照セルラインを用いて更なるアッセイにおいて特徴づけた。

２つの融合実験の結果である数千の融合ウェルから、１つのハイブリドーマクローノＥ４６−１３−３がｍ１ｇ１ｓ−εペプチド（表７）に対して特異性を有することか見出された（表７）。

表７ＥＬＩＳＡにおけるモノクローナル抗体Ｅ４６−１３−３のヒトｍ１ｇ１ｓ−ｓペプチドに対する特異的結合固相抗原（２μｇ／ｍｌ）　４５０ｎｍにおける吸光度ｍ１ｇ１ｓ−εペプチドーオバルブミン　２７０７ＨＩＶ−１ペプチド０−オバルブミン　００１１ｍｉｇｉｓ−εペプチド−ＫＬＨ２，７７３ＨＩＶ−１ペプチド−ＫＬＨ０，００２ＫＬＨ０，００５＊：ＨＩＶ−１ペプチドは、ＨＩＶ−１（７）ＨＴＬＶ−１１１Ｂのｇｐ１２０の部分を構成する１　５ｍｅ　ｒのペプチドであった。このペプチドはＢＡＴ　１２３モノクローナル抗体と反応性を有する。

Ｅ４６−１３−３及び他のモノクローナル抗体をさらに、トランスフエフトーマ５Ｅ−４４の親セルラインであるＳｐ２／Ｑを包含する種々の対照セルラインに対する反応性と５Ｅ−４４に対する反応性を比較すべく分析した。対照の中には、細胞表面上にＩｇＧ及びＣＤ２３を発現するＩＭ−９セルライン及び表面上にＩｇＡを発現するＤＡＫ　Ｉ　Ｋ　Ｉセルラインが包含されていた。試験はＦＩＴＣ−ヤギー抗マウスＩｇＧを用い、ＥＰＩＣＳシステムを用いたフローサイトメトリー分析により行った。結果（下記表８に示す）は、Ｅ４６−１３−３が５Ｅ−４４を特異的に染色することを示した。

Ｊ−（千４．６表８　Ｅ４６−１３−３の生細胞染色試験隆性細皿Ω正抹剋細胞　Ｅ４６−１３−３　対照モノクローナ　抗ＩｇＥモノクル抗体　ローナル抗体５Ｅ４４　３９．　５　５８．　１　（抗１ｇＥ）　５８．ｌ５ｐ２１０　２．　６　３．　６ μＭ−９１，４８５，１（抗１ｇＧ）　ＯＩｇＥ被覆ＩＭ−９０８４，３（抗１ｇＧ）　６０．６ＤＡＫＩＫＩ”　１，１　８２．０　（抗ＩｇＡ）　０＊・ＩＭ−９はヒトＩｇＧ発現リンパ芽球セルライン、ＤＡＫＩＫＩはヒトＩｇＧ発現リンパ芽球セルラインである。両方ともＡＴＣＣより入手した。

Ｂ　モノクローナル　ＨＥＭ７のＣ末端にリジン残基をさらに含む５種類のヒト免疫グロブリンＨ鎮アイソタイプ（ｍｉｇｉｓ−とを含む）全てのｍ１ｇ１ｓペプチドを合成した。これらのｍ１ｇ１ｓペプチドとキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；シグマ社製）又はオバルブミン（シグマ社製）との複合物を、これら１ｍｇ／ｍｌずっと００４％グルタルアルデヒド（シグマ社製）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　、ｐＨ７４中で４℃、１６時間架橋させ、次いでＰＢＳに対して透析することにより調製した。この条件下で、９０％以上のペプチドが架橋した。

次いで、１００μｇのｍ１ｇ１ｓ−ε−ＫＬＨを含むフロイントのアジュバントを４回皮下及び腹腔内投与し、次いでマイトマイシンＣ（シグマ社製）処理（２０ｍｇ／ｍｌで２０時間）した５Ｅ４４マウスミエローマ細胞（細胞表面上にヒトＩｇＥを発現する）を２回腹腔内投与した。ポリエチレングリコール（カーポワソクス、フィッシャー社製）を用いて牌細胞を５ｐ２１０細胞と融合した。

増殖するハイブリッドの上清を、ｍ１ｇ１ｓ＝εオバルブミンとの反応性についてスクリーニングした。次いで、陽性のウェルについて、細胞表面１ｇＥと結合する能力を間接的免疫蛍光フローサイトメトリーにより試験した。

ＨＥＭ７ハイブリドーマはこれらのアッセイにおいて特異性を示す抗体を分泌しており、限界希釈法によりサブクローニングした。培養上清からの抗体はプロティンＡ（レプリケシ社製）親和性クロマトグラフィーにより精製した。

精製したモノクローナル抗体ＨＥ　Ｍ　７について、ｍ１ｇ１ｓ−εペプチド及び膜結合１ｇＥとの特異的結合性を調べた。他の４つのＨ鎖アイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇ＋））のｍ１ｇ１ｓペプチドをも合成し、ＨＥ　Ｓｉ　７とこれらのペプチドとの反応性を調べた。これらのｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓペプチドは少なくとも１３アミノ酸の長さを有し、明らかに親水性で、６又は７個の酸性アミノ酸を含む。これらのｍ１ｇ１ｓペプチドは大きな異質性を示す。もっともｍ１ｇ１ｓ−μ及びｍ１ｇ１ｓ−γはｍ１ｇ１ｓ−εに最も相同的である。

ＥＬＩＳＡにおいて、マイクロタイタープレート（イムロン２、ダイナチック社製）を１！ｉｇ／ｍｌのｍ１ｇ１ｓ−εペプチド含有ＰＢＳ、又はｍ１ｇ１ｓ− μ、ｍ１ｇ１ｓ−７、ｍ１ｇ１ｓ−α、ｍ１ｇ１ｓ−δペプチド若しくはｍ１ｇ１ｓ−とペプチド−オバルブミン複合物若しくはヒト血清ＩｇＥ（ヴエントレ。

クス社製）若しくは他の血清タンパク質（ジャクソンイムノリサーチ社製）で１６時間、２２℃で被覆した。ＰＢＳ中に５％脱脂ドライミルク（カーネーション社製）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０１／グマ社製）を含むブロッキング緩衝液でプレートを２２℃で１時間処理し、後プロノキノグを行った。パーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（カーケガードアンドベリー社製）並びに１０μｇ／ｍｌＴＭＢ（シグマ社製）及び０．００３６％過酸化水素を含み０．７Ｍ硫酸で酸性化されたテトラメチルベンジジン（Ｔ　Ｍ　Ｂ　）基質溶液を用い、次いでＥＴ−ＩＳＡプレートリーダー（バイオチク社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定することによりネズミ科動物抗体との結合性（２２℃、１時間）を検出した。

ＨＥ　Ｍ　７は、ｍ１ｇ１ｓ−εペプチドに結合することが示され、１１００ｎ／ｍｌ抗体濃度において最大結合に達する。ＨＥＭ７は、他の４つのアイソタイプのｍ１ｇ１ｓペプチドとは測定可能な程度には結合しなかった（図４）。さらに、ＨＥＭ７は１０μｇ７’ｍｌの濃度でさえ、ヒト血清から精製された可溶性の分泌１ｇＥとは結合しなかった（図４）。また、５Ｅ４４細胞の上清から精製したＩｇＥ並びに他のヒト免疫グロブリ／及び血清物質と反応しなかった（データ示さず）。

精製ＨＥ　Ｓｉ　７モノクローナル抗体のＩｇＥ担持５ＫＯ−００７細胞との結合能も免疫蛍光フローサイトメトリー分析により試験した。

免疫蛍光フローサイトメトリーアッセイは次のように実施した。種々のヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞培養物及び他のヒト血液セルラインをＡ　Ｔ　ＣＣから入手した。末梢血を静脈穿刺により成人ボランティアから得、Ｆｉｃｏｌｌ −ｐａｑｕｅ　（ファルマシア社製）を用いて単核細胞を単離した。培養細胞を抗体で染色し、蛍光をフローサイトメトリー（ＥＰＩＣ３−Ｖ、カルターダイアグノンス社製）により定量した。末梢血リンパ球及び単球をその光散乱性により分類した。表面マーカーの存在は、ＩｇＥ　（ＨＰ６０２９）　、ＩｇＧ　（ＨＰ６０４６）　、Ｉ　ｇＭ　（ＨＰ６０８１）　、Ｉ　ｇＤ　（ＪＡＩ　１）又はＩｇＡ　（２Ｄ７）（全てザイメッド社製）に対して特異的なモノクローナル抗体試薬及び他の白血球マーカー（ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５及びＣＤ２３）（ベクトンーデイソキンソン社製）を用いて確認した。

ｍ１ｇ１ｓペプチドによるＨＥＭ７と５ＫＯ−００７細胞との結合阻害も調べた。これらのアッセイは、細胞を混合物に加える前にモノクローナル抗体ＨＥＭ７又はＴＥＳ−１９（３０μｇ／ｍｌ）とｍ１ｇ１ｓペプチドを水中で１時間プレインキュベーションすること１こより行った。

図５Ａ〜５Ｃに示すフローサイトメトリープロフィールに示されるように、ＨＥＭ７は５ＫＯ−００７細胞（Ａ　Ｔ　ＣＣより入手）と結合することができた。

ＨＥＭ７モノクローナル抗体を用いたＳＫ○−００７細胞のこの免疫蛍光染色ヒストグラムから、全５ＫＯ−００７細胞ポピユレーシヨンの蛍光がより高いレベルにンフトしたことがわかる。このことは、全ての細胞がＨＥＭ７と反応性を有することを示している。免疫蛍光染色は、陽性対照として用いた、ヒトＩｇＥに特異的なモノクローナル抗体であるＴＥＳ−１９で観察されるのと同程度である。

ＨＥ　Ｍ　７と５ＫＯ−００７との最大結合は１０−３０μｇ／ｍｌで達成される（図６Ａ）。さらに、ＨＥＭ７の５ＫＯ−００７細胞への結合は、存在する抗体とほぼ同モル濃度である、１μｇ／ｍｌのｍ１ｇ１ｓ−εペプチドによりほぼ完全に阻害される（図６Ｂ）。対照的に、ｍ１ｇ１ｓ−γペプチドは１０００倍の濃度でさえＨＥＭ７結合を実質的に阻害しなかった。また、ｍ１ｇ１ｓ−εペプラドは、ＴＥＳ−１９モノクローナル抗体の５ＫＯ−００７細胞への結合を阻害しなかった。

また、ｉ（Ｅ　Ｍ　７について、他の表面免疫グロブリンを担持するヒト細胞との結合能を試験した。試験した種々のヒトセルラインの中で、ＩｇＭ７は５ＫＯ −００７細胞及び膜結合ＩｇＥを担持する関連Ｕ２６６細胞と結合することができたが、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ又はＩｇＡを発現するＢ細胞ラインとは結合できなかった。このモノクローナル抗体はまた、Ｔ細胞ライン、単球様セルライン及び末梢血単核細胞を包含する試験した他のいずれの細胞とも結合しなかった（表９）。

表９モノクローナル抗体ＨＥＭ７と種々のヒト細胞タイプ１との反応性細胞タイプ　表面マーカー　陽性細胞（％）ＳＫＯ−００７（ミエローマセルライン）　ＩｇＥ　４６Ｕ２６６Ｂ１　（ミエローマセルライン）　ＩｇＥ　２２μＭ　−９（Ｂ　’Ｊ　ンハ芽球ライン）　ＩｇＧ　。

ＲＰＭＩ　］　７８８　（Ｂリンパ芽球ライン＞　ＩｇＭ、ＩｇＤ　２ＤＡＫＩＫＴ　（Ｂ’Ｊンパ芽球ライン）　ＩｇＡ　。

ＣＣＲＦ−ＣＥＭ　ＣＴリッパ芽球ライン）　ＣＤ４、Ｆｃ７Ｒ０Ｕ−９３７（単球様セルライン）　ＣＤ２３　０末梢血リッパ球　ＣＤ４５　０末ｍ血ｉ球　ＣＤ４５、ＣＤ１４　３＊反応性は、Ｌ述したように、フローサイトメトリー法を用いた間接免疫蛍光染色により定量的に測定した。陽性細胞のパーセントは、ＩｇＭ７と１０μｇ／ｍｌでインキュベーションした後、一定の閾値を越える蛍光レベルを有する細胞のパーセントの増加を陰性対照モノクローナル抗体を用いた場合のこれらの細胞のパーセントと比較して測定した。示した値は３回の実験からの１つの代表である。５％未満の陽性細胞の値は測定誤差範囲内である。

破砕した５ＫＯ−００７細胞から単離した原形質膜分画を用いたウエスタンブロノティ／グ分析によって、ＨＥ　Ｍ　７の膜結合１ｇＥに対する特異的結合をさらに調べた。ウェスタンイムノプロｌティングは次のようにして行った。

精製ポリクローナルヒト血清ＩｇＥ中のタンパク質（０１μｇ、ヴエントレックス社製）及び５ＫＯ−００７細胞からの原形質膜分画（２５μｇ）を１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロース上にエレクトロプロットした。フィルターを２５μｇ／ｍｌのパーオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗ヒトε 鎖と共に、又は２５μｇ／ｍｌのＨＥ　Ｍ　７と共にインキュベートし、次いでパーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ及び膜エンハンサー基質（酵素結合抗体及び基質はカーケガードアンドベリー社製）を作用させた。分子量マーカーはバイオラド社製であった。

ヤギ抗ヒトＩｇＥ（ε鎖特異性）は約８０ｋＤａ　（分子量）の領域中に２つのバンドを示した。ＩｇＭ７は分子量の大きい方のバンドとのみ反応した（図７）。これらの結果は、原形質膜調製物には分子量が低い（８０ｋＤａ）分泌されたＩｇＥが混入しており、濃い方のバンドはヤギ抗ヒトεにより染色されたものであって、ＩｇＭ７は、膜固定部分を余分に有するが故に分子量がより大きい（８７ｋＤａ）ε鎖の膜結合型とのみ反応したことを示唆している。ここでも、ＩｇＭ７とニトロセルロース膜中での特異的タンパク質とのイムノブロッティング反応はｍ　ｉ　ｇ　ｉ　ｓ−εペプチドによって阻害された（図７のカラムｅ参照）。ポリクローナルヒト血清由来１ｇＥのイムノプロットはＩｇＭ７と反応性を示さず（カラムｂ）、原形質膜分画のイムノプロットもＩｇＧを分泌する対照セルライン（ＩＭ−９）との反応性を示さなかった。

ＩｇＭ７が、４人から採取したヒト末梢血好塩基球からのヒスタミン放出を引き起こすか否かについても調べた。それぞれのアッセイは、種々の濃度のＴＥＳ− １７モノクローナル抗体（白血球からのヒスタミン放出を誘起するヒトＩｇＥに特異的なモノクローナル抗体）及びＩｇＭ７を用いて行った。ヒトＩｇＥ（これもまたヒスタミン放出を誘起する）に対するポリクローナル抗体は、ＴＥＳ−１７に加え、更なる陽性対照として働いた。ヤギ好マウスＩｇＧをい（っかの試験においてエノハノサーとして加えた。

エノハ／サーか存在するか否かにかかわらず、ＩｇＭ７はモノクローナル抗体量依存的にヒスタミン放出を引き起こさなかった。

実施例ＩＩ　生体内にアイ、ノフォームＩＩが存在し、それが膿に結合していることの確認予想さ［るアイソフオーム１１は、Ｃε４と、ＨＥ〜１７により結合される１５アミノ酸部分との間に５２の更なるアミノ酸を有する。この５２アミノ酸部分の６〜４０番目の残基に対応する３６アミノ酸の合成ペプチドに特異的なモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を調製した。ＥＬＩＳＡ及びイムノプロットの両方において、抗体は細胞溶解物からのＩｇＥと反応したが、細胞培養上清からのＩｇＥとは反応しなかった。このことはアイソフオーム１１が細胞上に存在し、分泌されないことを示している。さらに、イムノプロット上において、ＩｇＭ７により認識される１５アミノ酸バンドは３６アミノ酸部分に対する抗体により認識されるバンドと共に亦動した。

実施例ＩＩ＋　アイソフオームＩｌｌ　ｍＲＮＡ及びペプチドの生体内での存在の確認Ａ、Ｐρに匹ス湊ふ上貞二球史凹玄ユニ且Ｎ込９猷アイソフオームＩＩＩ　ｍＲＮＡがヒト末梢血リンパ球により生産されたことを確認するために実験を行った。

記載を簡素化するために、ＣＨ４−ｍｇ＝　２　’　スプライシング（上でアイソフオームＩＩ＋と示した）によるｍ　ＲＮ　、Ａによってコードされる予想されるε鎖を以下ではε、と表示し、分泌型ＩｇＥの従来のε鎖（上でアイソフオームＩと示した）をと１と表示する。■又は２の！：、鎖を有するＩｇＥ分子をＩ　ｇＥ、と表示し、ε鎮のみを含むＩｇＥ分子をＩｇＥ、と表示する。

血清ＩｇＥａ度が約１μｇ／”ｍｌ　（平均の約１０〜２０倍）であるアレルギーρ者からＰＢＭＣを単離し、これらの細胞からの全ＲＮＡを調製した。第１鎖ＣＤＮＡ鋳型が精製された後、一対のプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマーの１つはＣＨ４領域中に位置し、他の１つは工立−１領域中に位置する。

ＰＣＲで増幅した産物はゲル電気泳動により分析し、主たるバンド中のＤＮＡをサブクロー二／グし、そのヌクレオチド配列を決定した。

５ＫＯ−００７細胞及び５Ｅ４４細胞のＲＮ　Ａから誘導されたｃＤＮＡ鋳型を用いたＰＣＲの主たる産物はε、ｍＲＮ、Ａの部分であった。同じ部分はまた、ヒトＰＢｓｉｃ調製物からのｃＤＮ、Ａを用いた場合の主たる産物でもあった。

オートラジオグラフィーにより、ｍｅ、２部分に対応する！２ｐ−標識ＤＮＡプローブはε２部分とハイブリダイズした。これはまた、膜結合ε鎖ｍ　ＲＮ　、Ａの２つのアイソフオームから誘導された２つの部分に対応する他の２つのバンドともノ）イブリダイズした。これらのバンドからクローニングしたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列決定によりこの結論が確認された。

Ｂ　ヒトＩ　Ｅ　゛、セルラインの　のと　のｍｅ、２’　部分に対応し、Ｃ末端にリジン残基をさらに有する３３アミノ酸からなるペプチドを合成した。このペプチドは次の配列を有していた。

５ＨＡＡＧＥＡＰＤＬＰＲＬＨＱＲＰＰＡＰＲＬＡＡＧＨ３Ｒ３ＴＲＰＳｒＥ２Ｔペプチド」と名づけられたこのペプチドをＫＬＨと結合し、上記した標準的プロトコールに基づいてマウスを免疫するために用いた。Ｅ２Ｔペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を作製した。イムノプロットにより調べたところ、これらのモノクローナル抗体はまたε２に結合した。

ＫＬＨと結合したＥ２Ｔペプチドはまた、ウサギを免疫するために用いた。Ｅ２Ｔに対して特異的な得られた抗体を、Ｅ２Ｔが結合したアガロースビーズの小さなカラムにより親和性を利用して精製した。この精製抗Ｅ２Ｔ抗体を西洋ワサビパーオキシダーゼに結合し、これをアガロースビーズに結合した。これらの種々の試薬を次いでε２鎖及びＩｇＥ２を検出すべくＥＬＩＳＡ及びイムノブロソティノグアッセイに用いた。抗Ｅ２Ｔ抗体を固相免疫吸着剤として用い、ヒト■ｇＥに対するパーオキ／ダーゼ標識ヤギ抗体をトレーサーに用いたＥＬＩＳＡにおいて、ε２鎖は５Ｅ４４細胞の培養上清中に検出され、５ＫＯ−００７細胞の培養上清中にもより少ない量検出された。この物質は、Ｓ　Ｐ　２１０細胞及びＣＡＧｌ−５１−４細胞の培養液中には存在しなかった。

５Ｅ４４細胞によって分ｌ、されるキメラＩｇＥ　（ε、に）のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域並びに抗原特異性はＣＡＧＩ−５１−４細胞により分泌されるキメラＩｇＧ（γ１、に）のそれらと同一であるので、５Ｅ４４細胞及び５ＫＯ−００７細胞の培養液からのε２又はＩｇＥ２の固相への結合は可変領域に起因するものではない。５Ｅ４４細胞の培養上滑中のε鎖は無関係の抗原に特異的なウサギ抗体とは結合しなかった。

抗Ｅ２Ｔ抗体が膜結合ε鎖（７ε１鎖、′と表示）と反応する可能性を、組換えら鎮に対する結合を試験することにより調べた。ＣＨ２領域がら膜固定ペプチドに延びる組換えε、は大腸菌中で生産され、親和性カラムにより精製された。

ＥＬＩＳＡにより、ε１鎖に反応するモノクローナル抗体Ｅｌｌ−４−７０及び膜固定ペプチドの細胞外の１５アミノ酸部分に対して特異的なモノクローナル抗体ＨＥＭ７は組換えε、に結合したが、抗Ｅ２Ｔ抗体は結合しなかった。これらの結果は、Ｅ２Ｔと同じエクソンによってコードされるが異なるリーブイングツし・−ムを用いる、ε、の細胞質部分は抗Ｅ２Ｔ抗体と反応性を有さす、抗Ｅ２Ｔ抗体と反応性を有する、５Ｅ４４細胞の培養上滑中のε鎖は、細胞の原形質膜から脱落したかもしれないεゆではないことを示している。

Ｃウェスタンプロ　ト　び　によ　■　」」」（社）創出ＩｇＥのＣＨ領領域対して特異的であると推測されるモノクローナル抗体ＴＥＳ−６１を用いた親和性カラムにより、５Ｅ４４細胞により培養液中に分泌されるＴｇＥを精製した。精製したＩｇＥを還元剤で処理し、又は処理することなくゲル電気非動にかけ、ニトロセルロースフィルター上にトランスプロットし、試験すべき種々の抗体と反応させた。非還元性ゲルから転写されたプロットにおいて、西洋ワサビパーオキシダーゼ凛識ヤギ抗ヒトＩｇＥ及び抗Ｅ２Ｔ抗体の両方とも約２００ｋＤａのバンドを染色した。このことは、ＩｇＥ分子中に５２鎖が単一鎖としてではなく存在することを示している。さらに、還元条件下及び非還元条件下の両方において、抗Ｅ２Ｔは、ヤギ抗ヒトＩｇＨにより染色されるパントの最も大きな分子量のバンドの物質と反応した。

虫等当業者はここに記載した本発明の特定の具体例の多くの均等物を認識し、又は定型的な実験を超えないものを用いて確認することができるであろう。これらの均等物は以下の請求の範囲に包含されることを意図する。

Ｆｉｇ、　２Ａアイゾフォ値Ｉ　・石ＴＡ・ＡＡＴ（ＣＣりＡＧ（Ｔ’Ｇ−ＧＡＣ・ＮＰＥＬＤＧＴＧ−ＴＧＣ−ＧＴＧ−ＧＡＧ−ＧＡＧＧＣＣ（３ＡＧ（３ＧＣりＡＧ−ＧＣＧ−ＣＣＧＴＧＧＶ　ＣＶ　Ｅ　Ｅ　Ａ　Ｅ　Ｇ　Ｅ　Ａ　Ｐ　’ｗＶＡＣＧ− ＴＧＧ　・ＡＣＣ−ＧＧＣ（Ｔ’ＣＴＧＣ−ＡＴＣ−ＴｒＣ−ＧＣＣ−ＧＣＡ− ＣＴＣ−ＴＴＣ・ＣＴＧ（ＴＣ−ＡＧＣ（；ＴＧ−ＡＧＣＴ’ＡＣ−ＡＧＣ（３ＣＣ−ＧＣＣ−ＣＴＣ−ＡＣＧ−ＣＴ″Ｃ・■八ＬＭＶＱＲＦＬＳＡＴ　ＲＱＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧ−ＡＣＣ’ｒＣＣＣＴＣＧＡＣ’ｒＡＣ・ＡＣＣ・ＡＡＣりＴＣ・Ｇ　ＲＰＱ　ＴＳＬＤＹＴＮＶＣＴ’Ｃ−ｃＡＧ−ＣＣＣ−ＣＡＣ（：ｙＣＣＴＡＧ・ＬＱＰＨＡ” Ｆｉｇ、　２ＢＶＮ　ＰＧＬ　ＡＧＧＣ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−ＣＡＧ−ＴＣＣ（ＡＧＡＧＧ−ＧＣＣＣＣＧ −ＧＡＴ−ＡＧＧ・ＧＧＳＡＱＳ　Ｑ　ＲＡＰ　ＤＲＧＴＧ、ＣＩ’Ｃ−ＴＧＣ−ＣＡＣ−ＴＣＣ−ＧＧＡ−ＣＡＧ−ＣＡＧ（：ＡＧ −ＧＧＡ（ＴＧ（：ＣＧ　・Ｖ　ＬＣＨ５Ｇ　ＱＱＱＧ　ＬＰＡＧＡ、ＧＣＡ、ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＧＧＣ−ＴＣＴ−ＧＴＣＣＣＣ−ＣＡＣ（：ＣＣ（：ＧＣ’ｒＧＣ・ＲＡＡ　ＧＧＳ　ＶＰＨＰＲＣＣＡＣ，ＴＧＴ、ＧＧＡ、ＧＣＣりＧＧ・ＡＧＧ−ＧＣＴ−ＧＡＣ’ｒＧＧＣＣＡりＧＴ（：ＣＣＨＣＧ　ＡＧＲＡＤＷＰＧＰＦｉｇ、　２ＣＶＮ　ＰＧＡ　ＡＧＴＴ−ＣＣＴＣＴＣ−ＡＧＣ−ＣＡＣ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＧＧ−ＧＡＧ−ＧＣＣ−ＣＣＡ−ＧＡＣ−ＶＰＬＳＨＡＡ　ＧＥ　Ａ　ＰＤＣｒＣＣＣｒ（ｌ：ＧＡ（ｒＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＣＣｒＣＣＡ（ｙＣＣＣＣＡＣＧＣ・ＬＰＲＬＨＱＲＰＰ　ＡＰＲＣＴＡ−ＧＣＣ−ＧＣＧ−ＧＧＣ−ＣＡＣ−ＴＣＡＣＧＣ’ＴＣＣ−ＡＣＣ−ＡＧＧＣＣＣ−ＡＧＣ・ＬＡ　ＡＧＨ８Ｒ８Ｔ　ＲＰＳＴＴＴ−ＴｒＣ−ＴＣｒ−ＧＣＣ−ＡＧＣ−ＧＣＣ’ｌ”ＧＡ・ＦＦ５ＡＳＡ” ＋５０八ｍじＳ（する吸材、０１　０．１　１．０　１０　１００　１０００ａｂｃｄｅＦｉｇ・７要約書Ｂ細胞膜に免疫グロブリンを固定する領域の細胞外部分に付随する抗原エピトープが開示されている。工ｇＥについては、前記エピトープはＴｇＥ担持Ｂｍ胞上に存在するが、好塩基球及び分泌された可溶型のＩｇＨには存在しない。該エピトープは治療及び診断に用いることができる。例えば、ＩｇＨの固定領域に付随するエピトープに特異的な抗体又は免疫毒素はＩｇＥ担持リンパ球を選択的に破壊し又は減少させ、それによってＩｇＥ媒介アレルギー反応がブロックされる。

膜エクソン領域中の異なるｍＲＮＡスプラインングに起因するヒトε鎖のＣ末端部分の３つの異なるアイソフオームが開示されており、その１つは分泌型で膜に結合されない。

国際調査報告 −一２．−８−＋＾ｗｗｈ−ｓｗ−ｍ、ＰＣＴ／ＵＳ９＋１０（１４９１Ｔ、Ｃｌａｉｍｓ１−１１．１５−４Ｑａｎｄ１５−４Ｑａｎｄ２４ｄｒａ＋Ｃ１ｏｎａｌａｒ＋ｒｉｂｏｄ１１＋ｓ、ｈｙｂｒｔｄＯ＋＋＋ａＩ４．＋−ｈｉ懺ｑｒｉｒ−ａｎｔｉｂｃｘｉｉｅｓ、ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃａｎｔ、１ｌｘｉｉｅｓ＋、ｃｈｉ＋＋＋ｅｒｉｃ　ａｎｔｉ−ｉｄｉｎｔｙｐｉｃ　ａｎｔｉｋｘｘｌｉｅｓ　ａｎｄ　ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｔ盾■奄氏磨B Ｃ１ａｓＦＩｐｓ　５３０．４３５ａｎｄ　４２４　５ｕｈｃｌａｓ＋＋ｅ＊　＋３Ｒ７ａｎｄ　３８９１，２４０．２７　ａｎｄＴｌ、　Ｃｌａｌｍｓ　１２ −１４　ｄｒａｗｎ　ｒ−ｏ　ｊｓｏｌａｔｅｄ　ＤＮＡ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ、ｓ　ａｎｄ　ａｔｒａｎｓｆｆｅｃｔｅｄ　ｍｙｅｌｏ＊ａ、　Ｃ１ａｓｓｅｓ　５３６　ａｎｄ　４３５．　５ｕｂｒ：１ａｓｓｅｓ　２７　ａｎｄ２４Ｇ、２．　ｒ＋＝ｓｐｅｃいｖｅｌｙ。

ＴＩＴ、　Ｃｌａｉｍｓ　２０　ａｎｄ　２１　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｂｔｏｐｐｓｃｉｆ（ｃ　＋ａｎｌｐｃｕ１ｅ　ａｎｔｌｈｉ８ｐｅｃｉ［ｉｃ　ａｎＬｉｂｃｘｌｙ、　Ｃ１ａｓｓ　５３０．５ｕｂｃｌａｓｓ　３８７゜ＴＶ、Ｃｌａｉｍｓ２５−２７．２Ｑ／２７．３０．３２／３１ａｎｃ１３５ｄｒａｗｎｔｎｐｐｐｔｉｄｐｓ、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｆｒａｇ＋ｍｅｎｔｓ、ａｎｄ　＋５ｏｎｎｃｌｏｎａ１．　Ｃｈｉｙ−ｒｉi ａｎｄ　ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｊｙｐｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｐｓ、　Ｃ１ａｓｓｅｓ　５３６　＾ｎ（１５コ０．　引出ＣＬｑｔａｓ＊ｓｐ＠ｐｔｉｄｅ、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ＠　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｆｒａｇ＋＋＋ｅｎｔｓ　＋５ｏｎｎｃｌｏｎａ１．　ｃｈｉｍ告ｒｊｃ　δｎ■ ａｎＮ−ｉｄｉｏ乞ｙｐｉｃ　ａｎｔ−ｊｂｃ＋ｄｉｅｓ、（７１ｄｓｓｅｓ　５３０　ａｎｄ　５３６．１４ｎｈｃ１ａｓｓｅｑ　（１ＲP ａｎｄ　３００１　ａｎｄ　２７．ｒｆｌ！ｌｐＨＣｔｉＶｅｌＶ、Ｇｒｏｕｐ　ｒ　ｉｓ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｊｏ　ａ　ｆｌｒＲｔｓｅｔｏｆｓＰｐａｒａｔｐａｎｄｄｊＱｔｌｎｃｔｐｒｃｘｌｕｃｔｓ、Ｇｒｌ’１ｌｌｐＩＴ＋９ｃｌｘｒｅＣｊｅｄｒＯＡ！＋ｅＣｎｎ（！　Ｒｕｔ　ｎｆ　５Ｐｐａｒａｔｅ　ａｎｄ　＋３ｉＲｔｉｎＣｔ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｇｒｏｕｐ　ＩＩＸ　ｊＲ山ｒｐ＋′ｒ＊ｄｔｏ　Ａ　ｔｈｉｒｄ　５ｅｐａｒａｔＩ！ａｎｄ　ｄｉｓｊｔｎｃ＝ｊ　ｐｒｒｘｌｕｒ：ｔ、、Ｇｒ（＋ｌｌｐτＶｉ■ ＣＩｉｒｐｃｔｅｄｔＯａｆｏｕｒｔｈＲＰｐａｒａｔＩ１１ａｎｄｄｉｓｔｉｎｃｔｐｒｎｄｕｃｔ、Ｇｒｏｕｐ＼’ｉｓｄｒａｗｎ　ｔＯａ　ｆｉｒｔｈ　＆Ｉｅｔ　ｔａｒ　５ｅｐａｒａｔｅ　ａｎｄ　ｄｉｓｔ［ｎｃｊ　ｐｒｎｄ＋＋ＣＥｐ＋、　Ｇｒｎｕ垂uＩＰＣＴ／ＵＳ９１／α珀９１ｉｌｌ　ｄｒａｂｎ　ＩＬＬ　ａ　ｑｉｘ［ｈ　ｓｅｔ　ｔａｒ　！Ｉｅｐａｒａｔｅ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｌｎｒｃ　ｐｒ＋＋ｄｕｒＬｓ、@ｐＣＴＲ＋＋１ｂｓ１１．１Ａｎ＋Ｔロ一２＋ＩｏｎｏｔｐｒｏνｉｄｅｔＣ１ｒｍｕｌｔ、１ｐｌ＝ｄｉｓｔｊｎｃｌｐｒ＋＋ｄｕ＋−ｔ、６ｗｉｔｈｉｎ　ａ　ｑｊｎｇｌｅ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｕｒｕｅｎＬｉｕｅ　ｃ（ｌｎｃｅｐｔ。

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｂ細胞の膜に結合した免疫グロブリンに特異的に結合するか、分泌型の免疫グロブリンには特異的に結合しない抗体調製物。２．前記免疫グロブリンはヒトＩｇＥである請求項１記載の抗体調製物。３．モノクローナルである請求項１記載の抗体調製物。４．免疫グロブリンの膜固定ペプチドにより少なくとも部分的に形成されるエピトープに特異的に結合する抗体調製物。５．前記免疫グロブリンはヒトＩｇＥである請求項４記載の抗体調製物。６．前記エピトープは免疫グロブリン鎖の膜結合領域の細胞外部分上に存在する請求項４記載の抗体調製物。７．Ｂ細胞の表面上のヒトＩｇＥに結合するが、好塩基球の表面上のヒトＩｇＥ及び分泌された可溶性ＩｇＥには結合しないモノクローナル抗体。８．ヒト抗体又は抗体断片である請求項７記載のモノクローナル抗体。９．Ｂ細胞の表面上のＩｇＥに特異的に結合するが、好塩基球の表面上のＩｇＥ及び分泌された可溶性１ｇＥに結合せず、ネズミ科動物の抗原結合領域とヒトＨ鎖定常領域とを有するキメラ抗体。１０．Ｂ細胞の表面上のヒトＩｇＥに結合するが、好塩基球の表面上のヒトＩｇＥ及び分泌された可溶性ＩｇＥには結合しないモノクローナル抗体を産生する連続的で安定なセルライン。１１．ハイブリドーマである請求項１０記載のセルライン。１２．ＩｇＥ担持Ｂ細胞には結合するが好塩基球及び分泌された可溶性ＩｇＥには結合しない抗体のＬ鎖又はＨ鎖の可変領域をコードする機能的に再構成された遺伝子を含む単離されたＤＮＡ。１３．ヒトＬ鎖又はＨ鎖の定常領域をコードするＤＮＡに結合された請求項１２記載のＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。１４．請求項１３記載のＤＮＡ構築物でトランスフェクトされ、キメラ抗体を分泌するミエローマ細胞。１５．ＩｇＥ担持Ｂ細胞に結合するか好塩基球及び分泌された可溶型のＩｇＥには結合しない抗体のパラトープに対して特異的なモノクローナル抗イディオタイプ抗体。１６．ネズミ科動物由来の抗原結合領域とヒト由来の定常領域を有するキメラ抗体である、請求項１５記載のパラトープ特異的抗イディオタイプ抗体。１７．請求項１６記載の抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片。１８．ＩｇＥ担持Ｂ細胞に結合するが、好塩基球及び分泌された可溶性ＩｇＥには結合しない抗体に結合した細胞毒素を含む免疫毒素。１９．前記細線毒素は細胞障害性ステロイド、ゲロニン、アブリン、リシン、シュードモナス属毒素、ジフテリア毒素、ポークウィード抗ウィルスペプチド、トリカセカム、放射性核種及び膜溶解酵素から選ばれる請求項１８記載の免疫毒素。２０．ＩｇＥ産生Ｂリンパ球に結合するがマスト細胞、好塩基球及び分泌された可溶性ＩｇＥには結合しない第１の特異的結合剤と、細胞障害性細胞のレセプターに結合する第２の特異的結合剤とを含む二特異的分子。２１．二特異的抗体である請求項２０記載の二特異的分子。２２．Ｂ細胞の表面上のＩｇＥの膜結合領域の細胞外部分に対応するアミノ酸配列を有するペプチド。２３．【配列があります】のアミノ酸配列を有する請求項２２記載のペプチド及び該ペプチドの免疫学的性質を実質的に変化させないその修飾物。２４．請求項２３記載のペプチドと反応するモノクローナル抗体又は抗体断片。２５．Ｃε４エクソン、εｍ１エクソン及びεｍ２エクソンのスプライシング以外のｍＲＮＡスプライシングに起因するε免疫グロブリン膜固定ペプチド。２６．請求項２５記載のペプチドをコードするヌクレオチド断片。２７．ＧＬＡＧＧ・ＳＡＱＳＱ・ＲＡＰＤＲ・ＶＬＣＨＳ・ＧＱＱＱＧ・ＬＰＲＡＡ・ＧＧＳＶＰ・ＨＰＲＣＨ・ＣＧＡＧＲ・ＡＤＷＰＧ・ＰＰの配列を有するペプチド部分及び免疫学的性質が実質的に変化しないその修飾物。２８．ＧＡＡＶＰ・ＬＳＨＡＡ・ＧＥＡＰＤ・ＬＰＲＬＨ・ＱＲＰＰＡ・ＰＲＬＧＲ・ＧＨＳＲＳ・ＴＲＰＳＦ・ＦＳＡＳＡの配列を有するペプチド部分及び免疫学的性質か実質的に変化しないその修飾物。２９．請求項２７又は２８記載のペプチド部分をコードするヌクレオチド断片。３０．【配列があります】で示される配列又は同一のペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ断片。３１．【配列があります】で示される配列又は同一のペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ断片。３２．請求項２７又は２８記載のペプチドに対するモノクローナル抗体。３３．ヒト型又はネズミ科動物／ヒトキメラ型である請求項３２記載のモノクローナル抗体及び抗体断片。３５．請求項３２記載の抗体に対する抗イディオタイプ抗体。