JP4607507B2

JP4607507B2 - 高比重リポタンパク質コレステロールのためのワンステップ・アッセイ

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Publication number: JP4607507B2
Application number: JP2004210211A
Authority: JP
Inventors: ジョンディマグノセオドア; チャールズアータートーマス
Original assignee: オルソ−クリニカルダイアグノスティクス，インコーポレイティド
Priority date: 2003-07-17
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2024-07-16
Also published as: EP1498732A2; EP1498732B1; CA2474952A1; JP2005049346A; EP1498732A3; US20050037504A1

Description

リポタンパク質は、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、又はカイロミクロン（ＣＭ）に分類されうる。ＨＤＬは、動脈壁を含む組織に蓄積されたコレステロールを除去し、そしてそれを肝臓に戻すことによる保護機能を果たすことは、周知である。従って、ＨＤＬ中のコレステロール、別名高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬＣ）が、様々なタイプの動脈硬化症、例えば冠状動脈硬化症に関する否定的なリスク因子であり、そして血中ＨＤＬＣレベルは動脈硬化症の予見のための有用な指数である。

溶液アッセイは、血中ＨＤＬＣ量を測定するために使用される従来法である。これらの方法は、分画ステップ、及び検出ステップの２ステップから成る。前記分画ステップは他のリポタンパク質からＨＤＬを引き離す一方、前記検出ステップはＨＤＬ中のコレステロールを定量する。分画法の例は、超遠心分離法、免疫化学的方法、電気泳動法、及び沈澱法を含む。慣習的な溶液法に代わるアプローチは、ポリエステル支持体上の、乾式スライドとしても知られるシングル・ステップの乾式スライド分析要素によるＨＤＬＣアッセイを実施することである。

直接のＨＤＬＣ乾式スライドの開発は、低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬＣ）、超低比重リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬＣ）及びＣＭ中のコレステロールに優先したＨＤＬＣに対する優先的な選択性を必要とする。多くの周知の溶液法は、非高比重リポタンパク質沈澱法（１、２、３、４、５）、免疫的阻害（６、７）、選択性界面活性剤（８、９、１０、１１）、カタラーゼ除去（１２）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）架橋コレステロール・エステラーゼ（１３）を含むことによってＨＤＬＣ特異性を改善することが示された。しかし、沈澱法及び選択性界面活性剤法は、シングル・ステップ乾式スライド・アッセイとして行われない、なぜなら、そのような方法に必要とされる十分なＨＤＬＣ選択性を生じないからである。他の方法は、複数の試薬の添加か、又は同様に全てを含むシングル・ステップ乾式スライド技術に沿わない分離ステップを使用する。乾式スライドアッセイにおいて十分な選択性を生じる周知のＨＤＬＣ法がないので、ＨＤＬＣ特異性を改善すべき追加の方法が求められた。

界面活性剤は、極性部分と無極性部分の間の流体接触面の性質を変えることができる界面を活性化する薬剤である。界面活性剤が選択的にタンパク質膜を崩壊させるか、又はそれらの成分を選択的に可溶化するために使用されうることは、当業者に周知である。界面活性剤の可溶化法は、ヒト、動物及び細菌の起源の幅広いクラス由来のタンパク質の精製のために、数十年の間使用されてきた（１４、１５、１６、１７）。界面活性剤の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）数が、界面活性剤の分子の親水性領域と疎水性領域の相対的強度を示し、そして水相（極性）と有機相（無極性）についての界面活性剤の相対的な親和性を特徴づける。例えば、１２．５〜１３．５に及ぶＨＬＢ数をもつポリエチレンオキサイド鎖界面活性剤が、溶液中の高比重リポタンパク質の選択的な可溶化に有効であることは、十分に証明されている（１８、１９）。

さらに、１４．６未満のＬＢ値をもつ非イオン性界面活性剤（２０）が、溶液中のＬＤＬを優先的に可溶化することを見出した。界面活性剤のこれらの一般的な性質は、自動分析器のためのいくつかのＨＤＬＣ溶液アッセイの開発に使用された（１０、１１）。例えば、Ｍａｔｓｕｉらは、それらのアッセイにおいてＬＤＬを選択的に可溶化するために、１３〜１４のＨＬＢ数をもつ非イオン性ポリアルキレン・オキサイド界面活性剤（参考文献１０の４頁の２〜４行目）を使用する。ＬＤＬを可溶かした後、ＬＤＬＣから誘導された過酸化物の産物を除去するために、Ｍａｔｓｕｉらはカタラーゼを使用する。次に、第２の試薬の添加が第１の反応カスケードのカタラーゼを阻害し、そして残りのＨＤＬを可溶化することによって第２の反応系列を始める。Ｍａｔｓｕｉらによるこのツーステップ除去法の使用は、シングル・ステップ乾式スライド・アッセイでは不可能である（スキーム１）。さらに、Ｍａｔｓｕｉらによって請求される界面活性剤の濃度範囲（０．０５〜３．０％、参考文献１０の４頁の１４〜１５行目）は、乾式スライド・フォーマットに沿った約５．５分間の時間枠中にＨＤＬを選択的に可溶化するには不十分である。

同様に、Ｈｉｎｏらは、約１３のＨＬＢ数をもつ非イオン性ポリアルキレン・オキサイド界面活性剤の使用を開示する。Ｍａｔｓｕｉらのように、Ｈｉｎｏらの界面活性剤の使用は、同様に乾式スライド・アッセイに適合しない（１１）。Ｈｉｎｏらは、好ましくはリポタンパク質を溶解しない０．０１〜１重量％の範囲の低濃度の界面活性剤を使用する。界面活性剤に加えて、非高比重リポタンパク質と複合体を形成する試薬が加えられる。次に、複合体を形成した非高比重リポタンパク質は、前記アッセイの検出ステップに使用される酵素と反応することができない。次に、検出ステップで使用される酵素が第２の試薬によって加えられる。それは界面活性剤のＴＲＩＴＯＮＸ−１００（ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌによって製造された洗剤）をも含む（参考文献１１の２段の６０〜６４行目）。ＨＤＬＣがコレステロール検出酵素カスケードと反応することができるようにＴＲＩＴＯＮＸ−１００（ＴＸ−１００）が複合体を形成していないＨＤＬをおそらく可溶化するのであろう（スキーム２）。このように、この溶液アッセイにおけるＨＤＬ選択性界面活性剤は、検出酵素と非ＨＤＬｓの間の相互作用への阻害作用をもつ。全ての試薬が乾式スライド要素中に一緒に含まれており、そしてＴＸ−１００が乾式スライド・フォーマット中の沈澱した非ＨＤＬ複合体を可溶化するので、乾式スライドの構造は先に記載の２試薬添加法に適合しない。

先の参考文献に記載の反応機構も、複数の試薬の添加も全てを含む乾式スライドに沿わないので、選択性界面活性剤の一般的な性質を利用する新しい方法は、乾式スライドによる直接のＨＤＬＣアッセイのために開発される必要があった。

乾式スライドのＨＤＬＣ選択性に対する様々な界面活性剤の効果は、ＨＤＬＣ選択性の他の既知のエフェクターと組み合わせて評価された。ＨＤＬＣ選択性を改善するために乾式スライド中に選択性界面活性剤と一緒にコートされた試薬は、様々な非ＨＤＬ沈澱剤（例えば、リンタングステン酸、デキストラン硫酸塩、ポリエチレングリコール）の組み合わせ、イオン交換樹脂、ＬＤＬ複合体形成剤（カリックス［８］アレーン（２１））、磁性粒子（２２）、及びＨＤＬ選択性コレステロール・エステラーゼ（ＣＥＨ）酵素源を含む。

本発明者は、シングル・ステップＨＤＬＣ乾式スライド・アッセイにＨＤＬＣ選択性を与えるのに有用である２種類の界面活性剤を見出した。これらの界面活性剤は、リポタンパク質と、コレステロール・エステラーゼとの反応におけるＨＤＬＣ選択性を与える。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおいてこれらの界面活性剤によって観察されるＨＤＬ選択性は、他のスクリーニングされた界面活性剤源によって示された選択性の不足と比べて珍しい。なぜなら、前記の開示された２種類の界面活性剤が、ポリアニオン−非ＨＤＬリポタンパク質複合体の存在下においてそれらの選択性の維持を明らかにしたからである。ＨＤＬ選択性をもつこれらの界面活性剤は、ポリアニオン沈澱物とＨＤＬ選択性コレステロール・エステラーゼと一緒に使用される時、第３の選択性メカニズムを前記アッセイに付加する。これらの界面活性剤からの追加の選択性は、アッセイの総合的な選択性を大いに改善して、そして機能的なシングル・ステップの直接のＨＤＬＣ乾式スライド・アッセイを有することを可能にさせる。この増強なしに、前記アッセイの総合的な選択度及び正確度は、非高比重リポタンパク質コレステロールからの干渉により不十分である。

本発明の概要
本発明の対象は、シングル・ステップアッセイを使用した高比重リポタンパク質中のコレステロールの定量化を提供するための方法である。多層分析要素が使用され、ここで、少なくとも１層はリンタングステン酸を含み、そしてもう１層が高比重リポタンパク質に選択的に作用し、かつ、ポリアニオン−非高比重リポタンパク質複合体を可溶化しない界面活性剤を含む。本発明において、多層分析要素を、高比重リポタンパク質コレステロールを含むかもしれないサンプルと接触させる。非ＨＤＬは沈澱させられて、そしてＨＤＬは展開層で可溶化される。そして、ＣＥＨは可溶化ＨＤＬコレステロール・エステルと反応して、コレステロールを形成する。最後に、高比重リポタンパク質中のコレステロールが検出され、そして定量化される。

他の態様において、界面活性剤は、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６、ＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０、又はその混合物から選ばれる。
他の態様において、乾式スライドの層中に存在するリンタングステン酸の量は、好ましくは１〜５ｇ／ｍ²の量で存在する。
他の態様において、乾式スライドの層中に存在する界面活性剤の量は、好ましくは３〜８ｇ／ｍ²の量で存在する。

本発明の詳細な説明
直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおいて、ＨＤＬに対して優れた選択性を示す２種類のＨＤＬ選択性界面活性剤が発見された。いくつかの界面活性剤をＨＤＬＣ選択性についてスクリーニングしたが（表１）、しかし２種類の界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６（ＫＡＯＣｏｒｐ．によって製造されたポリオキシエチレン誘導体）及びＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０（ＫＡＯＣｏｒｐ．によって製造されたポリオキシエチレン誘導体）だけがシングル・ステップの直接のＨＤＬＣ乾式スライド・アッセイのために必要とされるＨＤＬＣ選択性のレベルを有した。ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６とＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０の優れたＨＤＬ特異性は、直接のＨＤＬＣ乾式スライドに不可欠である。なぜなら、現在知られているＨＤＬ特定方法が、乾式スライド・アッセイに必要な十分なＨＤＬＣ特異性を提供しないからである。様々な界面活性剤を評価するために使用された乾式スライドの一例を実施例１に示すが、しかし、酵素及び他の反応成分の配置は乾式スライド内の種々の位置に配置され、そして種々の異なる材料が様々な層に使用されうる。

ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６とＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０のＨＤＬ選択性は、２つの異なる手段：血清ベースの試験液中の純粋なヒトＨＤＬとＬＤＬからの動力学的応答の比較、及び患者サンプルを用いた正確度比較を使用した他の界面活性剤の性能に対してそれらの性能を比較することによって説明された。図１〜４の７５ｍｇ／ｄＬのヒトＨＤＬ液と比較した７５ｍｇ／ｄＬのヒトＬＤＬ液の動力学は、ＨＤＬ選択性界面活性剤のＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６に対する応答よりも、非選択性界面活性剤のＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐ（ＫＡＯＣｏｒｐ．によって製造されたポリオキシエチレン・ラウリル・エーテル）に対する応答の方がより大きいことを示した。類似の非選択性又は部分的な選択性が他の界面活性剤で観察され、そしてそれを表２に要約する。

乾式分析要素又は乾式スライド、そしてその使用は、米国特許番号第４，１２３，５２８号；同第４，７８６，６０５号；同第３，９９２，１５８号；同第４，２５８，００１号；同第４，６７０，３８１号；及び欧州特許出願番号第０５１１８３号；同第０６６６４８号を含む多数の刊行物中に記載されている。本発明の要素の層は、自立しているかもしれないが、しかし、好ましくは、これらの層は好適な大きさが安定していて、化学的に不活発な支持体上に配置される。支持体の選択は、意図された検出方式と適合すべきである。有用な支持体材料は、これだけに制限されることなく、紙、金属、ホイル、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート及びセルロース・エステルを含む。

直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおいて、優れたＨＤＬ選択性界面活性剤を使っただけで達成されたＨＤＬＣ選択性のレベルは、シングル・ステップ・アッセイを目標とした正確度を達成するのに十分ではなかった。ＨＤＬＣ選択性のさらなる改善を達成するために、ＨＤＬ選択性界面活性剤をリンタングステン酸（ＰＴＡ）沈澱と組み合わせることが望ましいことが分かった。ＨＤＬＣ選択性を達成するための古典的な方法であるＰＴＡは、非ＨＤＬを沈澱させることによってＨＤＬＣ選択性を促進する。ＰＴＡの添加により、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６及びＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０の両者は、類似したＨＤＬＣ選択性を示した一方で、他の界面活性剤は、わずかなＨＤＬＣ選択性を示すか、又は全くＨＤＬＣ選択性を示さなかった（表４）。例えば、表４において、ＰＴＡを伴うＥＭＵＬＧＥＮＡ−６０（ＫＡＯＣｏｒｐ．によって製造されたポリオキシエチレン誘導体）及びＥＭＵＬＧＥＮ１０９ＰのＨＤＬＣ選択性は非特異的界面活性剤のＴＸ−１００のそれと類似しており、ＥＭＵＬＧＥＮＡ−６０とＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐの両者がＨＤＬＣ選択性をもたないことを示唆した。対照的に、ＥＭＵＬＧＥＮ２２０（ＫＡＯＣｏｒｐ．によって製造されたポリオキシエチレン・セチル・エーテル）は、ＰＴＡの存在下、中程度のＨＤＬＣ選択性を示す。

ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６及びＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０のさらなる独特な特徴は、ＰＴＡによって沈澱させた非ＨＤＬと、それらの親和性である。どちらの界面活性剤もＰＴＡ−ＭｇＣｌ₂−非ＨＤＬ複合体を再溶解しない。溶液法において界面活性剤のＨＬＢ数が特定のタンパク質を可溶化するその能力の良好な指標であることが証明されたが、直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおいて、ＨＬＢ数は不十分な指標である。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおいて、界面活性剤のＨＬＢ数（表１）と、選択的にＨＤＬを溶解する一方で、ＰＴＡ−ＭｇＣｌ₂−非ＨＤＬ複合体を崩壊させないその能力の間に相関性がないことが示された（相関係数＝０．０１７）。対照的に、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６及びＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０の固有なＨＤＬ選択性と、ＰＴＡにより沈澱させた非ＨＤＬ複合体の可溶化の欠如は、シングル・ステップの直接のＨＤＬＣ乾式スライド・アッセイの実現性に関与する必要不可欠な性質である。

本明細書中に使用されるとき、「サンプル」は、着目の被分析物を含む可能性があるあらゆる物質を表す。サンプルは、体液、例えば全血、又は赤血球、白血球、血小板、血清及び血漿を含む全血成分、腹水、尿、脳脊髄液、及び着目の被分析物を含む可能性がある他の肉体構成成分でありうる。場合により、サンプルは、水、土及び植物から得られる。

酵素と反応して発色することができる色素が、本願発明の要素の多層の少なくとも１層の中に存在する。前記色素は、与えられたサンプル中のＨＤＬＣの存在及び量の指示薬として機能する。本願発明の好ましい態様において、過酸化水素及びペルオキシダーゼと反応して発色することができるロイコ色素が使用される。前記発色は、肉眼により、特定の波長の光に反応するように選ばれた光ダイオードにより、又は吸収、反射若しくは蛍光スペクトル法を使った当業者に知られる他の光学的な検出システムにより光学的に検出されうる。本願発明の好ましい態様において、反射率計が色素の発色を検出し、そして定量するために使用される。

本願発明の要素は、製造、流体の展開、並びに吸収及び不要な放射を助けるように、当該技術分野で知られている多種多様な添加剤を適当な層の中に含むことができる。

本発明の要素は、グラビア、カーテン、ホッパー、及び他のコーティング技術を含む本技術分野で説明される慣習的なコーティング手順及び装置を使用して準備することができる。前記要素は、あらゆる所望の幅の伸ばされたテープ、シート、スライド、又はチップを含む、種々のフォーマットに構成されることができる。工程は、手作業であるか、又は自動化されているかもしれない。

以下の実施例は、説明することを意図しており、本発明の範囲を制限しない。

実施例１
それらのＨＤＬ選択性を評価するために、いくつかの界面活性剤を乾式スライドで評価した。以下のものは、評価過程に使用した多層分析要素又は乾式スライドの例である。

実施例２
表１は、直接のＨＤＬＣ乾式スライドでスクリーニングした界面活性剤を詳細に示す。

実施例３
純粋なヒトＨＤＬ及びＬＤＬを含む血清ベースの試験液を、乾式スライド・アッセイによりＨＤＬ特異性ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６界面活性剤及び非ＨＤＬ特異性ＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐ界面活性剤と反応させた。各々の反応に関する動力学的応答を記録し、図１〜４に示した。

実施例４
純粋なヒトＨＤＬ及びＬＤＬを含む血清ベースの試験液に対する各々の界面活性剤の動力学的応答を計測し、比較することによって、表１の各々の界面活性剤のＨＤＬ選択性をスクリーニングした。そして前記結果をＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６に対して正規化し、低い正規化数は低いＨＤＬＣ選択性を示す。

表２に示したとおり、ＨＤＬＣ乾式スライドによってスクリーニングした界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６及びＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０は、他のスクリーニングした界面活性剤よりも、ＨＤＬ反応性に比べて低いＬＤＬ反応性しかもたない。さらに、ヒトＨＤＬ及びＬＤＬ試験液で評価した場合、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６及びＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０は、ＬＤＬよりＨＤＬに対してはるかに選択的であることが示される。さらに、これらの界面活性剤は、周知のコレステロール酸素カスケードに使用される他の界面活性剤で見られない独特な特異性特性をもつ。

実施例５
ＨＤＬＣ濃度を変えた患者サンプルの血清を用いた分取サンプル比較、別名患者正確度試験を使ってＨＤＬＣ選択性のさらなる試験を行った。直接のＨＤＬＣ乾式スライド・アッセイによってＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐ、ＥＭＵＬＧＥＮ２２０、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６、及びＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０のＨＤＬ選択性を評価した。図５〜８に示されるように、乾式スライドアッセイから得た結果を、ＶＩＴＲＯＳＭａｇｎｅｔｉｃＨＤＬＣ沈澱法による結果と比較した。次に、直接のＨＤＬＣスライド・アッセイから得た結果を、ＶＩＴＲＯＳＭａｇｎｅｔｉｃＨＤＬＣ沈澱法から得た結果と相関させて、表３に記録した。界面活性剤に関する相関結果は、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６とＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０が他の界面活性剤で観察されないＨＤＬ特異性をに示すというヒトＨＤＬ及びＬＤＬ試験液から至った結論を支持する。

実施例６
直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおける各々の界面活性剤のＨＤＬＣ選択性に対するＰＴＡの効果を試験するために、ＰＴＡを上記スライドのＭｇＣｌ₂及び界面活性剤層に加えた。純粋なヒトＨＤＬ及びＬＤＬを含む血清ベースの試験液を、界面活性剤のＨＤＬＣ選択性を試験するために使用した。これらのＰＴＡ添加コーティングに起因する各々の界面活性剤のＨＤＬＣ選択性を、表４に見られる。リポタンパク質を完全に溶解することが知られている一般的な界面活性剤、ＴＸ−１００を、対照として加えた。次に、ＨＤＬ選択性の結果を、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６のデータに対して正規化した（２４）。低い正規化数は、ＨＤＬＣに対する低い選択性を示している。

ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６とＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０を含む処方は、ＰＴＡにより同じＨＤＬＣ選択性を示したのに対して、試験した他の界面活性剤は、ＰＴＡの添加によりわずかなＨＤＬＣ選択性を示すか、又は全くＨＤＬＣ選択性を示さなかった。

実施例７
同様に、表４はヒトＨＤＬ及びＬＤＬ直線性系列を使用して、ＰＴＡコーティングのありとなしで各々の界面活性剤のＨＤＬＣ選択性を比較する。ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６、ＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０、及びＥＭＵＬＧＥＮ２２０を含む乾式スライドは、全てがＰＴＡの添加による選択性のいくらかの増強を示した。対照的に、ＥＭＵＬＧＥＮＡ−６０とＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐは、ＰＴＡの添加による選択性の増強を示さなかった。

実施例８
ＰＴＡコーティングのありとなしでの各々の界面活性剤のＨＤＬＣ選択性を比較する、実施例７のものと同様の比較を、患者サンプルを使って同様に実施した。患者正確度は、ＰＴＡ添加乾式スライド対ＶＩＴＲＯＳＭａｇｎｅｔｉｃＨＤＬＣ沈澱法による、非選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐ及びＥＭＵＬＧＥＮ２２０と、ＨＤＬ選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６及びＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０の使用を比較をプロットする（図９〜１２）。表５は、ＰＴＡを含むコーティングに関する直接のＨＤＬＣスライドと、ＶＩＴＲＯＳＭａｇｎｅｔｉｃＨＤＬＣ沈澱法の間の相関結果を表す。ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６とＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０の両者がＨＤＬＣ選択性を示すのに対して、他の界面活性剤はわずかなＨＤＬＣ選択性しか示さないか、又は全くＨＤＬＣ選択性を示さない。患者サンプルを使用した結果は、ヒトＨＤＬ及びＬＤＬ試験液によって見出された結果（実施例７）と同様であった。なぜなら、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６、ＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０及びＥＭＵＬＧＥＮ２２０の全てがＰＴＡの添加によりＨＤＬＣ選択性のいくらかの増強を示したからである。

実施例９
これらの界面活性剤が、溶液中、並びに乾式スライド・アッセイにおいて非ＨＤＬリポタンパク質と、ＰＴＡ及びＭｇＣｌ₂の複合体を残したままで、ＨＤＬを選択的に可溶化することを証明するために、ＰＴＡ−ＭｇＣｌ₂−非ＨＤＬ沈澱複合体（４）を沈澱させて、分離するために古典的技術を使用した。沈澱物を遠心沈澱によってまとめて、洗浄し、次にＮａＣＩ、１％のＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６、又は１％のＴＸ−１００中に再懸濁した。ＮａＣＩ処理は濁った懸濁液のままであったのに対して、ＴＸ−１００処理は完全に透明になった。しかし、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６溶液はわずかに透明になったが、しかしほとんど濁ったままだった。これらの３つの処理物を、先に記載されたＰＴＡ／ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６コーティングに似たコート上で分析した。動力学を図１３に示す。スライドへの適用より前にＬＤＬが再溶解されたことを確認した、ＴＸ−１００処理非ＨＤＬ沈澱物の動力学は非常に迅速である。ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６とＮａＣｌ処理サンプルの両方は、非常にゆっくりだが、非常に似通った動力学を示す。これは、非ＨＤＬが沈澱したままであり、ゆっくりとしか再溶解されないことを裏付ける。ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６サンプルの動力学は、ＮａＣｌサンプルよりわずかに速く、非ＨＤＬ沈殿物の非常にわずかな再溶解がＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６界面活性剤の存在下、溶液中又は直接のＨＤＬＣ乾式スライド中で生じているという仮説を裏付ける。

実施例１０
以下に示される、本発明の好ましい態様において、乾式スライド・フォーマットで使用した界面活性剤は、ＨＤＬ選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６、又はＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０のいずれかである。

表６は、好ましい態様による直接のＨＤＬＣ乾式スライドと、ＶＩＴＲＯＳＭａｇｎｅｔｉｃＨＤＬＣ沈澱法による患者サンプルの間の相関結果を示す。患者正確度試験の結果（表６）は、先に示した好ましい態様において、ＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０よりもＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６の方が上記処方により高い選択性をもたらすことを示す。スライド構造体中の増強及び活性試薬の最適化により、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６及びＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０の両者に関して観察された選択性は、先に示されたもの（図９〜１２、及び表５）よりもこのフォーマットによる方が良好である。

実施例１１
乾式スライド中に前記発見物の組み込みによって、正確で、厳密な、かつ、迅速なＨＤＬＣアッセイを開発した。以下に示した本発明の他の好ましい態様において、乾式スライド・フォーマットで使用した界面活性剤は、ＨＤＬ選択性界面活性剤のＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６である。

ＨＤＬの選択性界面活性剤として７ｇ／ｍ²のＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６を使用し、ＨＤＬの選択性コレステロール・エステル加水分解酵素としてカンジダ・ルゴサ由来リパーゼ又はＤｅｎｋａＣＥＨを使用し、そして−０２マトリックスとしてＩＭｎＡｇ又はＰＥＧを使用した、先に好ましいスライド構造と記載された処方及びフォーマットを使って直接のＨＤＬＣ乾式スライドを作製した。ＶＩＴＲＯＳＭａｇｎｅｔｉｃＨＤＬＣ沈澱法に対する正確度、及びプールされた精度を、３０点の患者サンプルを使って評価した。結果は表７にある。その結果は、このアッセイが許容される正確度と精度を有し、かつ、溶血患者サンプルからの顕著な干渉を受けないことを示す。

リンタングステン酸の不存在下、非特異性ＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐ界面活性剤を用いたヒトＨＤＬ及びＬＤＬ含有試験液に関する動力学的応答を示す。リンタングステン酸の存在下、非特異性ＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐ界面活性剤を用いたヒトＨＤＬ及びＬＤＬ含有試験液に関する動力学的応答を示す。リンタングステン酸の不存在下、ＨＤＬ特異性ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６を用いたヒトＨＤＬ及びＬＤＬ含有試験液に関する動力学的応答を示す。リンタングステン酸の存在下、ＨＤＬ特異性ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６を用いたヒトＨＤＬ及びＬＤＬ含有試験液に関する動力学的応答を示す。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおける非選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐの使用による患者正確度プロットを示す。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおける非選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮ２２０の使用による患者正確度プロットを示す。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおけるＨＤＬ選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６の使用による患者正確度プロットを示す。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおけるＨＤＬ選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０の使用による患者正確度プロットを示す。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおけるリンタングステン酸の存在下での非選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮ１０９Ｐの使用による患者正確度プロットを示す。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおけるリンタングステン酸の存在下での非選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮ２２０の使用による患者正確度プロットを示す。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおけるリンタングステン酸の存在下でのＨＤＬ選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６の使用による患者正確度プロットを示す。直接のＨＤＬＣ乾式スライドにおけるリンタングステン酸の存在下でのＨＤＬ選択性界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０の使用による患者正確度プロットを示す。リンタングステン酸及びＭｇＣｌ₂によって沈澱させ、ＮａＣｌ、ＴＲＩＴＯＮＸ−１００及びＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６により再懸濁させ、そしてＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６界面活性剤を含むコーティングによって試験した非ＨＤＬに関する動力学的応答を示す。

Claims

シングル・ステップ・アッセイによる高比重リポタンパク質中のコレステロールの定量方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも１層がリンタングステン酸を含み、そして少なくとも１層が、ＥＭＵＬＧＥＮＢ−６６（商標）（ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル）、ＥＭＵＬＧＥＮＡ−９０（商標）（ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル）及びその混合物から成る群から選ばれる、高比重リポタンパク質に選択的に作用し、かつ非高比重リポタンパク質の沈澱した複合体を可溶化しない界面活性剤を含む多層分析要素を提供し；
（ｂ）上記多層分析要素を、高比重リポタンパク質コレステロールを含む可能性があるサンプルと接触させ；そして
（ｃ）高比重リポタンパク質コレステロールを検出及び定量すること、
を含む、方法。
前記リンタングステン酸が１〜５ｇ／ｍ²の量で存在する、請求項１に記載の方法。
前記界面活性剤が３〜８ｇ／ｍ²の量で存在する、請求項１に記載の方法。