JP2005137360A - 高比重リポタンパク質コレステロール検出のためのリパーゼの使用 - Google Patents

Abstract

【課題】高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬＣ）の判定及び定量化に有用な乾式分析要素を提供する。
【解決手段】乾式分析要素として、他のリポタンパク質のコレステロール・エステルに優先してＨＤＬのコレステロール・エステルと優先的に反応する、コレステロール・エステラーゼ活性を有するリパーゼ酵素の起源であるカンジダ・ルゴサ由来の酵母リパーゼを使用する。
【選択図】なし

Description

リポタンパク質は、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、及びカイロミクロン（ＣＭ）に分別されることができる。高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬＣ）が動脈壁を含む組織からのコレステロール蓄積の除去に関係することが知られている。従って、ＨＤＬＣは、冠状動脈硬化症のような様々なタイプの動脈硬化症に関する否定的なリスク因子として計測され、そして血中ＨＤＬＣレベルは、動脈硬化症の予知に役立つ指数である。

ＨＤＬＣコレステロールの量を測定するための従来の方法は、分画ステップと、検出ステップの２ステップから成る。分画の例は、超遠心分離法、免疫化学的方法、電気泳動法、及び沈殿法を含む。慣習的な溶液法の代わりのアプローチが、ポリエステル支持体上にコートされた、乾式多層薄膜スライドの分析要素によるＨＤＬＣアッセイを実施することである。

直接のＨＤＬＣスライドの開発は、ＬＤＬとＶＬＤＬの優先的な選択性を必要とする。非ＨＤＬ沈殿法（１、２、３、４、５）、免疫的阻害（６、７）、選択的な界面活性剤（８、９、１０）、カタラーゼ除去法（１１）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）架橋コレステロール・エステラーゼ（ＣＥＨ）（１２）を含む、多くの既知の溶液法がＨＤＬＣ特異性を改善するために示された。

しかし、沈殿法及び選択的な界面活性剤法は、乾式多層スライド・フォーマットにおける十分なＨＤＬＣ選択性をもたらさなかった。他の方法は、複数の試薬の添加か、又は全てを含むシングル・ステップの乾式スライド技術に沿わない分離ステップが使用される。薄膜フォーマットにおいて、周知のＨＤＬＣ法のどれもが十分な選択性をもたらさなかったので、ＨＤＬＣ特異性を改善するための追加の方法が追求された。

ＨＤＬＣ選択性を改善するために、知られているＨＤＬＣ法の組み合わせが乾式スライド・フォーマットに導入された。ＨＤＬＣ選択性を解決するために、乾式スライド・フォーマット中に一緒にコートされた方法は、様々な非ＨＤＬ沈殿試薬（例えば、リンタングステン酸、デキストラン硫酸塩、ポリエチレングリコール）、ＨＤＬ選択的な界面活性剤、イオン交換樹脂、ＬＤＬ複合体形成剤（カリックス［８］アレーン（１３））、及び磁性粒子（１４）の組み合わせを含む。これらの組み合わせのどれもが所望したＨＤＬＣ特異性の性能をもたらさなかったので、よりたくさんの方法が調査された。

酵素反応系列の多くに利用されるコレステロール・エステラーゼは、全てのリポタンパク質起源由来のエステルと反応する一般的なエステラーゼである。クロモバクテリウム・ビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）に由来するＣＥＨ酵素は、先に言及したＰＥＧ架橋コレステロール・エステラーゼとして、ＬＤＬＣ又はＶＬＤＬＣに優先してＨＤＬＣに対する選択性を示すことが注目された（１５）。けれども、薄膜要素性能を高めうるＨＤＬＣ選択性を示す追加のＣＥＨの起源をを見つけたいという願望が残っていた。潜在的なＣＥＨ由来の追加の選択性は、直接のＨＤＬスライドにおいて他の選択的な試薬を使って得られた不十分なＨＤＬＣ選択性を改善することに使用されることができた。

本発明の概要
本発明の目的は、ＨＤＬＣに対する選択性を示して、それによりアッセイに役立つ酵素の起源を同定することである。２番目の目的は、ＨＤＬＣスライド・アッセイにおいて機能する酵素の起源を見つけることである。サンプル中の高比重リポタンパク質コレステロールの定量化のための乾式分析要素が、界面活性剤、コレステロール・エステラーゼ、及びコレステロール・オキシダーゼの存在下、ＨＤＬＣの反応からの色素の形成による適当な波長における反射濃度の変化を計測することに基づいて本明細書中に開示される。本願発明の乾式要素は、あらゆる液体サンプル中、特に体液中のＨＤＬＣ量の測定に有用である。

本発明の他の目的は、その上に少なくとも１種類の試薬層を持ち、かつ、上記試薬層中にカンジダ・ルゴサ由来リパーゼを含む支持体を含む高比重リポタンパク質コレステロールの存在の判定のための分析要素を提供することである。

本発明の他の目的は、先に記載のような分析要素を含む高比重リポタンパク質コレステロールの存在を判定するためのキットを提供することである。

本発明の他の目的は、その上に少なくとも１の試薬層をもち、かつ、上記試薬層中にカンジダ・ルゴサ由来リパーゼを含む支持体を提供し；高比重リポタンパク質を含むかもしれないサンプルと、支持体とを接触させ；そして高比重リポタンパク質コレステロールを検出することを含む、高比重リポタンパク質コレステロールの存在について生物学的サンプルをアッセイする方法を提供することである。

より特に、１の態様において、本発明は、以下の：
（ｉ）透過性展開層、
（ｉｉ）流体を上記透過性展開層と接触させる１以上の追加の層、及び
（ｉｉｉ）支持体、
を含むＨＤＬＣの測定及び定量化に有用な乾式分析要素に関し、
ここで、少なくとも１層中に、上記要素が、高比重リポタンパク質を可溶化する界面活性剤、非ＨＤＬに対する沈澱試薬、カンジダ・ルゴサ由来の酵母リパーゼ、コレステロール・オキシダーゼ、並びに指示薬色素及び上記要素とＨＤＬＣを含むと疑われている流体の接触による上記色素のスペクトル吸収又は反射濃度の検出可能な変化を生じる酵素カスケードによって生成されたＨ₂０₂と反応する西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを含み、かつ、ここで、上記染料、上記酵素、上記界面活性剤、及び上記非ＨＤＬ沈殿試薬が、同じ層の中に一緒に存在するか、又は上記要素の別々の層の中にいずれかの組み合わせか若しくは別個に存在することがスライド・アッセイに有用である。

本発明者らは、カンジダ・ルゴサ由来の酵母リパーゼが他のリポタンパク質のコレステロールエステルに優先してＨＤＬＣのコレステロールエステルと優先的に反応するコレステロール・エステラーゼ活性をもつリパーゼ酵素の起源であることを発見した。直接のＨＤＬＣ乾式スライド・フォーマットにおいてこの酵素の起源によって観察されたＨＤＬＣ選択性は、多くの他のスクリーニングされたコレステロール・エステラーゼの起源によって示された選択性の不足に比べて例外的であった。このコレステロール・エステラーゼのＨＤＬＣ選択性は、第３の選択性機構をアッセイに加える。前記コレステロール・エステラーゼ由来の追加の選択性は、全体としてのアッセイの総合的な選択性を大いに改善して、有効な直接のＨＤＬＣスライド・アッセイを有することを可能にする。この増強がなければ、非ＨＤＬＣリポタンパク質からの干渉によって総合的な選択性、及びそれによるアッセイの正確度は不十分である。

本発明の詳細な説明
直接のＨＤＬＣ乾式スライド・フォーマットにおいて、非ＨＤＬＣリポタンパク質由来のエステルに優先してＨＤＬＣ由来のエステルに対して選択性を示す、コレステロール・エステラーゼ活性をもつリパーゼ酵素が発見された。いくつかのエステラーゼ及びリパーゼの起源をＨＤＬＣ選択性についてスクリーニングし、そしてＨＤＬＣ特異的コレステロール・エステラーゼの起源は、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されているリパーゼＩＩ Ｆ／Ｄ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．１３、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ））であった（カタログ番号７０ ６５５１−０１）。この評価に使用された薄膜要素の好ましい・フォーマットは、実施例１に示されるが、しかし酵素及び他の反応性成分の位置は、上記薄膜要素中の種々の位置に配置され、そして種々の様々な材料が様々な層に使用されうる。２つの異なる手段：純粋なヒトＨＤＬ及び純粋なヒトＬＤＬ試験液からの動力学的応答の比較、並びに整った患者サンプルとの患者正確度の比較を使って、７つの他の酵素起源（表２）に対してカンジダ・ルゴサ由来リパーゼの性能を比較することによって、この酵素起源のＨＤＬＣ選択性を説明した。１５０ｍｇ／ｄＬのヒトＨＤＬ液と比較して、１５０ｍｇ／ｄＬのヒトＬＤＬ液の動力学は、ＨＤＬＣ特異的ＨＤＬＣエステラーゼ（図２−カンジダ・ルゴサ由来リパーゼ−）に対する応答よりも、非特異性ＨＤＬＣエステラーゼ（図１−ブタ膵臓ＣＥＨ）に対して非常に大きな応答を示す。表２に要約された他のエステラーゼ及びリパーゼの起源で類似の非選択性が観察された。前記データは、ＨＤＬＣ乾式スライド・フォーマットによりスクリーニングされたエステラーゼ及びリパーゼの起源が、カンジダ・ルゴサ由来リパーゼ酵素よりも、ＨＤＬＣ反応性と比較してより高いＬＤＬＣ反応性を有することを示す。

乾式分析要素及びその使用は、米国特許番号第４，１２３，５２８号；同第４，７８６，６０５号；同第３，９９２，１５８号；同第４，２５８，００１号；同第４，６７０，３８１号；及び欧州特許出願番号０５１ １８３号；同第０６６ ６４８号を含む非常に多数の刊行物に記載されている。本発明の要素の層は、自立できるが、しかし好ましくは、これらの層は好適な、大きさの安定してる、化学的に不活発な支持体上に配置される。好まれる支持体は、意図された検出の方式と適合すべきである。有用な支持体材は、これだけに制限されることなく、紙、金属、ホイル、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、及びセルロースエステルを含む。

酵素と反応して発色することができる色素が、本願発明の要素の少なくとも１の層の中に存在する。本願発明の好ましい態様において、過酸化水素と反応し、発色することができるロイコ色素が使用される。前記発色は、肉眼により、光の特定の波長に反応するように選ばれた光ダイオードにより、又は吸収、反射、又は蛍光スペクトル法を使って当業者に知られる他の光学的な検出システムにより、光学的に検出することができる。本願発明の好ましい態様において、反射率計が色素の発色の検出、及び定量のために使用される。

本願発明の要素は、製造、流体の展開、及び吸収と不要な放射を助けるように、当該技術分野で知られている幅広い種類の添加剤を適当な層の中に含むことができる。

本発明の要素は、グラビア、カーテン、ホッパー、及び他のコーティング技術を含む本技術分野で説明される慣習的なコーティング手順及び装置を使って準備されることができる。前記要素は、あらゆる所望の幅の伸ばされたテープ、シート、スライド、又はチップを含む、種々のフォーマットに構成されることができる。工程は、手作業であるか又は自動化されているかもしれない。

本明細書中に使用されるとき、「サンプル」は、着目の被分析物を含むかもしれない全ての物質を表す。サンプルは、体液、例えば全血、又は赤血球、白血球、血小板、血清及び血漿を含む全血成分、腹水、尿、脳脊髄液、並びに着目の被分析物を含むかもしれない他の肉体構成要素であるかもしれない。場合により、サンプルは、水、土、及び植物から得られる。

本発明の有効性及び利点を、続く実施例によってさらに説明する。実施例は、説明することを意図しており、本発明の範囲及び本質を制限することはない。

実施例１
ＨＤＬＣ特異的コレステロール・エステラーゼを含む多層薄膜要素の例

薄膜要素でスクリーニングされたコレステロール・エステラーゼ酵素の起源
表１の酵素コードで使用される用語「Ｅ．Ｃ．」。それは国際生化学・分子生物学会議（ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会の推奨に基づき、そしてそれはＥＣ（酵素委員会）番号が提供された各々のタイプの特徴づけされた酵素を説明する。

カンジダ・ルゴサ由来リパーゼ、並びにスクリーニングされた他のエステラーゼ及びリパーゼ酵素のＨＤＬＣ選択性（カンジダ・ルゴサ由来リパーゼに対し正規化した；より低い数字が低い選択性を示している）が表２で示される。

カンジダ・ルゴサ由来リパーゼは、ヒトＨＤＬ及びＬＤＬ試験液で判断される場合、ＨＤＬＣリポタンパク質に対してより相当に選択的であり、そして周知のコレステロールの酸素カスケードで使用される他の酵素に見られない独特な特異性の特性を有する。患者正確度試験の結果は、ＨＤＬＣ選択性に関するヒトＨＤＬとＬＤＬ試験液と類似した傾向を示す。非特異性ブタ膵臓エステラーゼに関する相関性は、カンジダ・ルゴサ由来リパーゼよりはるかに悪い。ＨＤＬＣ選択性の欠如は、相関性プロットの非常に平坦な傾きをもたらし、かつ、データによって大量の散乱を示す。乾式スライドにおけるカンジダ・ルゴサ由来リパーゼによる、ＶＩＴＲＯＳ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＨＤＬＣ沈殿法に対する相関性は、ブタ膵臓エステラーゼよりはるかに優れている。非ＨＤＬリポタンパク質コレステロールへの交差反応性は、ブタ膵臓エステラーゼに関する非常に不十分である相関性の原因となる。カンジダ・ルゴサ由来リパーゼがＨＤＬＣ特異性を示すので、非ＨＤＬリポタンパク質コレステロールの交差反応性は大いに低減されて、ＨＤＬＣ正確度が高められる。他のスクリーニングされたエステラーゼ及びリパーゼの起源についての患者正確度の結果は、カンジダ・ルゴサ由来リパーゼによるものより悪い相関性を生じた。酵素の起源についての相関性の結果は、表３に要約される。これらの結果は、カンジダ・ルゴサ由来リパーゼが、他のエステラーゼ及びリパーゼ起源では観察されないＨＤＬＣ特異性を示すというヒトＨＤＬ及びＬＤＬ試験液から至った結論を支持する。

表３は、直接のＨＤＬＣスライドと、ＶＩＴＲＯＳ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＨＤＬＣ沈殿法の間の相関性の結果を示す。

カンジダ・ルゴサ由来リパーゼＨＤＬＣ特異性の発見は、他のエステラーゼ及びリパーゼ起源を上回る乾式スライド要素の総合的なＨＤＬＣ特異性を改善する。現在知られているＨＤＬＣ特異的な方法が乾式スライド・フォーマットにおいて十分なＨＤＬＣ特異性を提供しないため、ＨＤＬＣ特異性の改良が必要である。この発見なしには不可能であろう酵素カスケードにおける特異性のこの追加の増強は、乾式スライド要素に好適な性能を与える。

本明細書中の全ての引用物を、本明細書中に援用する。それ故に、本発明が以下の請求項の範囲内にある全ての修飾を含むことに留意すべきである。特に、当業者は、液体ベースのアッセイ・システムにカンジダ・ルゴサ由来リパーゼをどのように使用するか同様に理解するであろう。

非特異的ブタ膵臓ＣＥＨによるヒトＨＤＬ及びＬＤＬ試験液に対する動力学的応答を示す。 特異的カンジダ・ルゴサ由来リパーゼによるヒトＨＤＬ及びＬＤＬ試験液に対する動力学的応答を示す。 直接のＨＤＬＣスライドにおける非選択的なブタ膵臓ＣＥＨを使った患者正確度のプロットを示す。 直接のＨＤＬＣスライドにおけるＨＤＬＣ選択的なカンジダ・ルゴサ由来リパーゼを使った患者正確度のプロットを示す。

Claims (3)

1. 高比重リポタンパク質コレステロールの存在の判定及び定量化のための分析要素であって、少なくとも１層の試薬層をその上に有する支持体を含み、当該試薬層中にカンジダ・ルゴサ由来リパーゼが含有される前記要素。
2. 請求項１に記載の分析要素を含む高比重リポタンパク質コレステロールの存在の判定及び定量化のためのキット。
3. 高比重リポタンパク質コレステロールの存在に関する生物学的サンプルのアッセイ方法であって、以下のステップ：
   ｉ） 少なくとも１層の試薬層をその上に有する支持体であって当該試薬層中にカンジダ・ルゴサ由来リパーゼが含有されるものを提供し；
   ｉｉ） 上記支持体を、高比重リポタンパク質を含む可能性のあるサンプルと接触させ；そして
   ｉｉｉ） 上記高比重リポタンパク質コレステロールを検出し、そして定量する、
   を含む前記方法。

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